Пристрій для збудження люмінесценції від інтегрованих електродних чипів за допомогою катодних і біполярних імпульсів

Реферат: Пристрій для досліджень з використанням електрохемілюмінесценції, виконаний у вигляді електродного чипа, який містить як електроди щонайменше один анод і один катод, що розміщені на загальній основі в картриджі. Обидва анод і катод виконані з провідного матеріалу та (або) високодомішкового напівпровідника, при цьому катод покритий фінішним ізолюючим шаром, анод покритий фінішним провідним або ізолюючим шаром. UA 93081 U (12) UA 93081 U UA 93081 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель відноситься до пристроїв за допомогою яких молекули, що генерують випромінювання люмінесценції, вимірюються кількісно у наднизьких концентраціях у водних розчинах. Областю використання корисної моделі є вимірювання біологічних молекул у пробах, взятих від людей або тварин під час обстеження їх стану здоров'я. Корисна модель описує новий пристрій для таких аналізів. ПЕРЕДУМОВИ КОРИСНОЇ МОДЕЛІ У даний час існує настійна необхідність у швидких, чутливих і кількісних технологіях діагностики. Такі технології широко застосовні у господарському використанні, включаючи суспільне здоров'я, дослідження, сільське господарство, охорону навколишнього середовища, ветеринарну медицину та окремі галузі промислового виробництва. Підвищення чутливості, швидкості, надійності, стабільності і зниження вартості аналізів є чинниками, які після реалізації їх у діагностичних технологіях можуть знайти застосування в абсолютно нових областях. Вудьяка технологія, в якій задовільно вирішені такі вимоги, матиме у діагностиках майбутнього важливе місце і великий ринковий потенціал. Вельми висока чутливість може бути отримана за допомогою певних діагностичних приладів, але вони достатньо дорогі. З іншого боку деякі засоби можуть бути достатньо дешевими, наприклад імунохроматографія, проте вони не можуть бути застосовані до виключно кількісних застосувань для запитів ринку. Існує велика кількість різних засобів аналізу, які використовують у практиці діагностики: наприклад, радіоактивні методи дослідження, імуносорбентний аналіз з ферментною міткою (ELISA), колориметричний аналіз, та аналізи, засновані на флуоресценції та хемілюмінесценції, включаючи як анодну, так і катодну (індуковану гарячими електронами) електрохемілюмінесценцію (EXЛ). Індукована гарячими електронами EXЛ детально описана у патенті [US 6251690, Kulmala S., та ін…]. Кожен з цих засобів грає свою роль щодо сукупності таких характеристик, як чутливість, надійність, стабільність, швидкість та ціна. Відмінності між засобами відображають залежність їх від фізичних обмежень або переваг. Так, недолік застосувань, заснованих на радіоактивному складі, полягає у розпаді з часом радіоактивної мітки та додаткової вартості радіоактивних відходів з точки зору безпеки та впливу на навколишнє середовище. Застосування у діагностиці найбільш чутливих досліджень обмежується складною природою тестів і приладів, і лише фахівці можуть виконувати такі дослідження. Складність дослідження зазвичай прямо пропорційна ціні приладу і (або) тесту. У контексті складності приладів можна згадати засоби анодної електрохемілюмінесценції, яка набуває зростаючої популярності: приладом є складний лабораторний робот, поводження з яким вимагає знання справи, а процес вимірювань включає неодноразові промивання і підготовчі етапи. Це чинники, які збільшують вартість дослідження, а також призводять до зростання об'єму відходів і, отже, роблять цей метод неможливим для потреб малих лабораторій, лікарських кабінетів тощо (дослідження лежачих хворих або в пунктах надання допомоги). Комерційно вигідні засоби, засновані на принципах ідентифікації та вимірювання аналізованої речовини у сумішах з так званими речовинами-маркерами. У вимірюваннях, що засновані на унікальних властивостях біологічних молекул, як в імунохімічних дослідженнях, вимірюваний аналіт (X) може бути селективно абсорбований з суміші молекул на зв'язуючі антитіла у твердій фазі, а потім зв'язані молекули вимірюють за допомогою іншого маркованого антитіла, що селективно зв'язується з (X). Речовинами-маркерами можуть бути радіоактивні ізотопи, ферменти, молекули, що поглинають світло, флуоресціюють або фосфоресціюють, хелати деяких металів і т. ін., які зв'язані ковалентними зв'язками з антитілом. І навпаки, очищений (X) може бути маркований, а кількість невідомого немаркованого зразка (X) може бути виміряна шляхом реакції порівняння. Дослідження ДНК і PHK також можуть бути засновані на селективному скріпленні (біологічна спорідненість). На основі таких самих принципів можуть бути проведені багато інших хімічних і біохімічних досліджень. Для зниження вартості і (або) збільшення точності вимірювань у теперішній час має місце тенденція одночасного вимірювання у зразку декількох різних параметрів. Однією з можливостей є використання маркерів, флуоресціюючих або фосфоресціюючих (що світяться) на різних довжинах хвиль, або що мають різний час висвічення флуоресценції. Різні принципи і засоби вимірювань, які можуть бути використані в імунодіагностиці, описані у книзі "Керівництво з імунного аналізу" [The Immunoassay Handbook. Edited by David Wild, Stockton Press Ltd., New York, 1994, P. 1-618]. Відомо, що органічні речовини та хелати металів успішно використовують як речовинимаркери, вони можуть збуджуватися під дією світла або електрохімічно, продукуючи люмінесценцію відповідно до специфіки маркера. Ці засоби особливо чутливі та здійсненні. Проте, через гранично малі вимірювані концентрації, існують також певні труднощі 1 UA 93081 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використання флуоресценції може бути ускладнене, серед іншого, тиндалевським, релеєвським та раманівським розсіянням. Під час аналізування речовин біологічного походження після прикладання імпульсу збудження виникає, майже без виключення, швидкорозрядна вторинна флуоресценція високого рівня. Фосфоресценція у фазі розчину може бути використана, переважно, тільки за наявності хелатів проміж іонів лантанідів і спеціально синтезованих органічних молекул. Недоліком методів збудження з використанням фотолюмінесцентних маркерів є складність приладів і висока вартість чутливих оптичних компонент. У загальному випадку, перевагою EXЛ є низька ціна електричних компонент збудження й простіша оптика. Так, порівняно з фотолюмінесценцією, можна уникнути деяких недоліків. Традиційна анодна електрохемілюмінесценція з електродами з інертних металів може бути здійснена з органічними люмінофорами у неводних розчинах з використанням відносно простого пристрою. Проте в дослідженнях біологічних властивостей, на чому зосереджені найбільші комерційні очікування, застосовують водні розчини. Майже завжди біологічні зразки поміщені в неорганічні розчини, тому вимірювальна система має працювати з водними або, принаймні, з водними міцелярними розчинами. Проте дуже обмежене число хелатів металів перехідної групи працює як ЕХЛ-маркери в анодній EXЛ у водних або міцелярних розчинах. Тому комерційно найбільш важливим застосуванням анодної EXЛ в аналітичній хімії є спосіб 2+ використання похідних Ru (bру)3 - хелату, де детектування маркера відбувається у міцелярній фазі. З літератури відомо, що міцелярні суміші через неконтрольовану складність досягнення міцелярної рівноваги завжди чутливі до різних дратуючих дій. Таким чином, EXЛ, що індукується гарячими електронами, яка не залежить від міцел, має багато значущих переваг перед анодною EXЛ. Вона може бути застосована і до засобів імунодіагностики і до засобів ДНК - гібридизації [Blackburn G., та ін., 1991, Clin. Chem. 37, 1534-1539; Kenten J., та ін. 1992, Clin. Chem. 33, 873879]. В імунних дослідженнях та ДНК- або PHK- пробах, застосованих Roche Diagnostics Ltd., використані магнітні частинки, за допомогою яких речовини-маркери поміщали на робочий електрод із золота [Massey, Richard J., та ін. US 5746974; Leland, Jonathan K., та ін. US 5705402]. Проте повторна обробка магнітолатексних частинок через багато причин утруднена, тому даний метод використовують лише у дорогих лабораторних роботах (наприклад, Elecsys 1010 та 2010), які мають складну і точну систему обробки рідини. Крім того, стаціонарний масивний робочий електрод із золота потребує тривалого очищення та підготовки до кожного аналізу [Elecsys Service Manual (Керівництво з обслуговування Elecsys), с. 70]. Виявлено, що значного поліпшення у роботі можна досягти розміщенням на робочому електроді тонкої пористої плівки і виготовленням CIPF (Conductor/Insulator/Porous Film) пристроїв [US 2009178924, Ala-Kleme та. ін.]. Проте і цей вид CIPF - пристроїв має серйозний недолік, оскільки у вимірювальному пристрої потрібні роздільні протилежні електроди і ретельна промивка між аналізами, а одна й та сама електролітична комірка, що містить протилежний електрод, повинна використовуватися неодноразово. У KEXЛ робочому електроді гарячі електрони тунелюють з найближчих частин електроду, з протилежного електроду, тобто з країв електроду у разі плоских електродів, що знаходяться на одній площині, оскільки тунелювання електронів походить з областей з найвищою вірогідністю тунелювання [Kulmala S., Suomi J. Analitica Chimica Acta 500 (2003), 21-69]. Якщо тунелювання з таких країв і навіть реєстрована люмінесценція матимуть місце, то така локальна люмінесценція не буде використана, оскільки робочий електрод в цьому винаході призначений для діагностичних цілей, а така люмінесценція не залежатиме від концентрації речовинимаркера, пов'язаної з поверхнею електроду, або принаймні, зв'язок буде ненадійним. Тому фахівець не став би й намагатися будувати електроди так, що робочий і протилежний електроди будуть виконані приблизно на одному рівні на плоскій поверхні, якщо використовується KEXЛ. Якщо ж електрони тунелюють з гострих кінців, то украй складно управляти процесом виготовлення для отримання відтворних характеристик різних електродів, що абсолютно необхідне для діагностичних чіпів. У даній корисній моделі встановлено, що можна створити повністю плоскі інтегровані робочий і протилежні електроди, які у дослідженнях біологічних властивостей мають дуже високі робочі характеристики. Це стало результатом використаних в електродах матеріалів і відповідної товщини шару розчину електроліту над електродами, а також геометричної форми самих електродів. Це призвело також до абсолютно нової властивості електродів, яка послужила подальшому поліпшенню в роботі електродів порівняно із сучасним рівнем. Було встановлено, що описана конструкція з електродами з деяких матеріалів дозволяє використовувати біполярні імпульси для збудження люмінесценції, тобто катод і анод можуть мінятися своїм положенням, займаючи його по черзі або після деякої послідовності імпульсів. Це дозволяє використовувати поверхню обох електродів в цілях діагностики. Наприклад, 2 UA 93081 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імпульси світла з одного електроду можна порівнювати з такими з іншого електроду, а така система служить як внутрішній стандарт або дві аналізовані речовини можуть бути виміряні одночасно. Відповідно до даної корисної моделі досягнуте помітне кількісне та якісне поліпшення EXЛ електродів, що ілюструють пункти 1-8 патентної формули. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фіг. 1. Схематична діаграма електродного чіпу (Ε-чіп), що містить ізолюючу основу (1), на якій виконаний робочий електрод, покритий тонкою ізолюючою плівкою (2), що сформована, наприклад, шляхом вакуумного випаровування чи напилення і (або) нанесення шару атомів, та протилежний електрод (3), також виконаний шляхом вакуумного випаровування або напилення, і плівка з ізолюючого полімеру (товщиною близько 100 нм або більше) чи адгезивна стрічка (4), яка захищає частини протилежного електроду за винятком області, що обрана бути частиною електролітичної комірки, яка вступає у контакт з Е-чіпом, коли він занурений у розчин електроліту до рівня (5), що потрібний при вимірюваннях KEXЛ. Фіг. 2. Схематична діаграма великого Е-чіпу, що містить силіконову або алюмінієву смугу (1), яку спочатку покрили оксидною плівкою товщиною 4 нм, потім покрили шляхом друкування товстою плівкою полімеру (товщина близько 100 нм та більше) або адгезивною стрічкою (2) всі області, за винятком областей робочого електроду (3), тобто залишивши три області робочого електроду з 4 нм-оксидним покриттям. На товстій ізолюючій плівці (2) розміщений протилежний електрод (4), який виконаний або шляхом друкування провідною фарбою, такою як вуглецева паста, чи срібляста фарба чи провідний полімер, або шляхом вакуумного випаровування чи напилення металу. Остаточний рівень розчину електроліту відмічений позицією (5). Електронний контакт до робочого електроду розташований позаду зразка, а до протилежного електроду - через контактну накладку (6). Фіг. 3. Калібрувальні криві для хелату тербію (III). Хелат Tb(III) з 2,6-6ic[N,Nбіс(карбоксіметил)амінометил]-4-бензоілфенол) був використаний у якості моделі хелатів Tb(III) (див. Приклад 1). (а) Крива, отримана при використанні Е-чіпу, представленого на Фіг. 1, де області робочого і протилежного електроду спочатку виконані вакуумним випаровуванням алюмінію через маску, потім електроди окислені у повітрі й поверх областей протилежного електроду нанесена срібляста паста шляхом фарбування через маску або трафаретним друкуванням заштриховані кружки. (b) Крива, отримана при використанні Е-чіпу, як в (а), де поверх шару сріблястої фарби додатково нанесений або надрукований шар вуглецевої пасти незаштриховані кружки. (с) Крива, отримана при використанні Е-чіпу як на Фіг. 2, де великий силіконовий чіп спочатку покрили термічно отриманою оксидною плівкою товщиною 4 нм, потім приклеїли на електрод адгезивну стрічку з трьома отворами для області робочого електроду і виготовили протилежний електрод спочатку нанесенням сріблястої фарби через маску, а потім нанесенням додаткового шару вуглецевої пасти - заштриховані трикутники. (d) Крива, отримана при використанні Е-чіпу як на Фіг. 1, де області робочого та протилежного електродів спочатку виготовили вакуумним випаровуванням алюмінію через маску, потім електроди оксидували в атмосфері кисню при кімнатній температурі і поверх областей електродів нанесли надтонкий шар полімеру шляхом струминного друкування або, як в даному випадку, занурюючи в розчинений органічний полімер, такий як розчинений в толуолі полістирол - заштриховані квадрати. Фіг. 4. Калібрувальна крива для імунного аналізу гетерогенного тіреотропного гормону (далі - hTSH) з використанням стандартних зразків (а) (заштриховані квадрати) і з використанням зразків цілісної крові (b) (заштриховані кружки). hTSH-стандарти готували на зразку гепарінізованої цілісної крові. Вимірювання проводили з використанням мембрани стандартного Labmaster CIPF-пристрою [Labmaster Ltd., Turku, Фінляндія], що містить всі необхідні для імунного аналізу реагенти у сухому стані поверх робочого електроду та областей протилежного електроду у виді Е-чіпу, представленого на Фіг. 1 (див. Приклад 2). Фіг. 5. Дослідження вірусної PHK. Вимірювання проводили з використанням стандартної мембрани Labmaster CIPF-пристрою, що містить всі необхідні для гібридизації реагенти у сухому стані поверх робочого електроду та областей протилежного електроду у виді Е-чіпу як показано на Фіг. 2 (див. Приклад 3). Фіг. 6. Калібрувальна крива імунного аналізу hTSH з використанням стандартних зразків. Електроди Е-чіпу виготовлені з алюмінію та покриті тонкою полістирольною плівкою. Для збудження були застосовані біполярні імпульси (див. Приклад 4). Фіг. 7. Картридж одноразового Е-чіпу, складений з Е-чіпу та кришки з полідиметилсилоксану (ПДМС). (1) Опорна основа Е-чіпу, наприклад скло, пластик або силікон. (2) Робочий електрод, 3 UA 93081 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 покритий, наприклад оксидом алюмінію з будь-яким додатковим шаром (по вибору) або альтернативно оксидом силікону виставленою під цією областю з дотриманням товщини ізолюючого шару. (3) Протилежний електрод (у разі алюмінію або силікону переважно покритий вуглецевою пастою). (4) ПДМС кришка. (5) Камера у ПДМС кришці для інкубації та (або) вимірювання. (6) Камера для додавання реагенту та зразка (відкривається вгору). (7) Мікроканали, що живлять камеру для інкубації та (або) вимірювання. (8) Мікроканали випуску повітря. Фіг. 8. Результати імунного аналізу hTSH з використанням стандартних зразків (див. Приклад 5). (а) Покритий оксидом алюмінію робочий електрод (заштриховані кружки). (б) Покритий оксидом силікону робочий електрод (заштриховані квадрати). ДОКЛАДНИЙ ОПИС КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Визначення Робочий електрод - електрод, що збуджує люмінесценцію, коли електрони проходять через ізолюючу плівку на провідному матеріалі (так званий звичайний катод). Протилежний електрод - другий електрод в KEXЛ комірці. У КЕХЛ, як правило, використовують провідний матеріал, зазвичай метал. У даній корисній моделі матеріал з великим питомим опором, подібним вуглецевій пасті, може також покривати металеву основу. Корисна модель привносить нові властивості у КЕХЛ систему. Е-чіп - ЕХЛ-електрод, в якому обидва анод і катод розташовані на одній основі (підтримуючому матеріалі), що поєднує анод і катод в одне ціле. Планарний Е-чіп - ЕХЛ-електрод, в якому анод і катод розміщені практично на одному рівні близько один до одного. Катодний імпульс - електричний імпульс, що передає робочому електроду негативну полярність електролітичної комірки. Анодний імпульс - електричний імпульс, що передає робочому електроду позитивну полярність електролітичної комірки. Послідовність біполярних імпульсів чи біполярна пульсація можлива лише у КЕХЛ, що використовує обрані електроди за цим винаходом. Біполярна пульсація означає, що полярність робочого електроду і протилежного електроду міняється або після кожного імпульсу, або після серії імпульсів. CIPF - робочий електрод, покритий тонкою пористою плівкою, який використовують для прискорення біологічної реакції на електроді. Відповідно до цієї корисної моделі можна проводити різні аналізи з використанням простих і дешевих пристроїв також добре, як і з використанням більш складних пристроїв, коли б не проводився реальний імунний аналіз або гібридизація ДНК з пористими плівками на поверхні Ечіпу (CIPF-E-чіп пристрій). Таким чином, одержане значне удосконалення більш ранніх CIPFпристроїв, вимірювальний інструмент та вимірювальний картридж достатньо дешеві для індивідуальних аналізів і повністю доступні. До того ж не відбуватиметься ніяких накладок між аналізами, а виготовлення картриджів CIPF-E-чіпів стане більш легким, якщо не потрібно вводити в картридж окремо робочі та протилежні електроди. Ця корисна модель не обмежується використанням пористої плівки, хоча кращі характеристики отримані на електродах саме з пористою плівкою. Без пористої плівки може лише збільшитися час, необхідний для біологічної реакції. Звичайні матеріали робочого електроду KEXЛ (силікон і алюміній) утворюють на анодах оксидну плівку, тому не можуть бути використані як аноди у KEXЛ-комірках. Для цього є дві причини. По-перше, анодне окислення дуже швидко припиняє струм у комірці після декількох імпульсів збудження. По-друге, анодне окислення викликає сильну електролюмінесценцію, відому з літератури як гальванолюмінесценція [S. Ikonopisov, Electrochimica Acta, 20 (1975) 783793]. Встановлено також, що вказаної проблеми можна уникнути, якщо виконати анод з алюмінію або силікону і нанести на нього вуглецеву пасту. Таким чином, спрощення виготовлення дешевих Е-чіпів полягає у виготовленні електродів шляхом вакуумного випаровування алюмінію або силікону на ізолюючу основу, таку як скло або смуги пластика, після чого анодну частину системи електродів виконують шляхом друкування чи фарбування під остаточне покриття фарбою на основі вуглецевої пасти. По-друге, менш переважним був спосіб виготовлення верхнього шару зі сріблястої фарби. Срібло випаровується на аноді, але зазвичай можна підтримувати анодний струм протягом необхідного для вимірювання часу, якщо плівка срібла має достатню товщину. Третій встановлений в експерименті здійсненний шлях вирішення проблеми полягає у покритті частин і аноду, і катоду в Е-чіпі органічним полімером, який дає суцільну плівку. Це 4 UA 93081 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дуже важливе, оскільки такий тип електродів порушує електрохемілюмінесценцію у хелатах лантанідів, і можливо також в інших люмінофорах. При здійсненні цієї корисної моделі, по-перше, виготовляють електрод звичайними методами, прийнятими для KEXЛI, як з алюмінію, так і з силікону (як з блоку, так і з плівки), товсту (> 100 нм) ізолюючу плівку виготовляють шляхом друкування або фарбування обраних анодних областей ізолюючою фарбою. Це супроводжується друкуванням анодів на ізолюючих плівках провідною фарбою або фарбуванням вуглецевою пастою, сріблястою чи іншою металевою фарбою або провідним полімером. Дана корисна модель вносить значні поліпшення до рівня техніки, оскільки завдяки доступності виготовлення зручних, дешевих смужок і картриджів для швидких кількісних тестів такі пристрої призначені в основному для застосування у необхідних випадках. Запропоновані Е-чіпи можна використовувати разом з пористою плівкою CIPF або без неї як простий різновид смужок або паличок. Мініатюрні варіанти представлених Е-чіпів можуть бути легко об'єднані у картриджі, виготовлені з пластику, ПДМС тощо, які дозволять у разі необхідності використовувати мембрани CIPF-пристроїв, але також легко можна представити картриджі інших типів на основі конструкції та матеріалів, що рекомендуються у цій корисній моделі. Частиною даної корисної моделі є також можливість використання у деяких комбінаціях конструкцій і матеріалів представлених Е-чіпів біполярних пульсацій. Удосконалення полягає в тому, що об'єднані області електродів (аноду та катоду) виконують функції робочого електроду на деяких стадіях біполярних пульсацій і, таким чином, дослідження біологічних властивостей можна проводити на поверхні всіх частин мережі електродів в області діючої комірки Е-чіпу. Далі корисну модель пояснюють приклади і пов'язані з ними креслення та діаграми. Приклади демонструють, що просту конструкцію можна включити у більш складні пристрої у якості робочого люмінесцентного блоку. Такі картриджі можна виробляти різними шляхами, вони можуть включати ємності, канали та порожнини. ПРИКЛАД 1. Виготовлення різних типів Е-чіпів та вимірювання калібрувальних графіків Tb(III) - маркерів. Е-чіпи виду, що зображені на Фіг. 1, виготовлені таким чином: спочатку з полістиролу нарізали смужки розміром 12,0 мм  75,0 мм, потім на області електроду шляхом випаровування через маску наносили шар хрому та шар іншого металу, чистого на 99,99 % алюмінію. Алюміній залишали для окислення на 24 години при кімнатній температурі, після чого області протилежного електроду через маску фарбували маленьким пензликом, імітуючи трафаретний друк, сріблястою фарбою [Bison Electro G-22, Bison Ltd., Нідерланди]. При цьому, щоб неозброєним оком у темному приміщенні спостерігати дуже чітку світлову емісію від всіх областей робочого електроду при катодному збудженні 0,0001 M розчину хелату Tb(III) у 0,05 M буфері тетраборат натрію, що містить 0,001 M пероксиді сульфат, дотримували співвідношення поверхонь областей електродів (робочій/протилежній) як 5:1. Ці види Е-чіпів були використані для отримання результатів Фіг. 3 (а), заштриховані кружки. Проблемою цього типу протилежних електродів є їх повільне руйнування як анодів під час вимірювань. Проте ця проблема може бути вирішена шляхом додавання поверх шару сріблястої фарби шару фарби з вуглецевої пасти [Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA]. Отримані з цими електродами результати представлені на Фіг. 3 (b), незаштриховані кружки. Результати на Фіг. 4 (а) і (b) також отримані з E-чіпами цих видів. Третє рішення щодо запобігання руйнування алюмінієвих анодів під час вимірювань полягало у зануренні Е-чіпів (за винятком самих верхніх їх областей) на дуже короткий час у толуол, що містив 0,1 мг/мл полістиролу з подальшим випаровуванням толуолу. Результати, отримані з Е-чіпами такого виду, представлені на Фіг. 3 (с), заштриховані квадрати. Великий Ε-чіп, представлений на Фіг. 2, виготовлений наступим чином. Оксидовані пластини 2 ++ кремнію Si (питомий опір 0,01-0,023 Ом/см , р допований бором, орієнтація , товщиною 525+/-25 мкм, виробництво Okmetic Oyj) промили RCA, який зазвичай використовують у промисловості, і помістили у піч при 700°C, де атмосфера складалася з 95 % азоту й 5 % кисню. Температуру підняли до 850°C, збільшили парціальний тиск кисню: 90 % азоту та 10 % кисню, та інкубували протягом 33 хвилин, після чого пластини витримали протягом 30 хвилин у струмі чистого азоту, знизили температуру до 700°C в атмосфері чистого азоту та вийняли пластини з печі. Потім пластини закріпили на основі та розрізали програмно-керованою діамантовою дисковою пилою на смужки Si необхідного розміру. Після цього на верхній частині E-чіпу закріпили пластикову адгезивну стрічку, залишивши відкритими області трьох робочих електродів (Фіг. 2), області протилежного електроду через маску закрасили сріблястою фарбою Bison [Bison Electro G-22, Bison Inc. Netherlands]. Після повного висихання першого шару срібла сріблясту фарбу через маску покрили вуглецевою пастою [Creative Materials 110-04 Carbon Ink, 5 UA 93081 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Tyngsboro, MA, USA]. Отримані з цими електродами результати представлені на Фіг. 3 (с), заштриховані трикутники. Результати на Фіг. 5 також отримані з Е-чіпами цього виду. ПРИКЛАД 2. Виготовлення Е-чіпів для імунного аналізу гетерогенного TSH з використанням стандартних зразків і зразків цілісної крові. Для імунного аналізу гетерогенного TSH використовували Е-чіпи, подібні зображеним на Фіг. 1. При цьому для формування лунки навколо електродної області робочі електроди покрили адгезивною стрічкою та занурили у розчин (300 мкл), що складався з 0,1 M MES, 0,03 M H3BO3, 0,5 мМ К-цитрату, 0,025 % глутаральдегіду, 0,05 % бичачого гамма-глобуліну та 10 нг/мл антитіла (МІТ0406 MOAB анти-hTSH Medix Biotech Inc. USA). Після інкубації у такому розчині протягом двох годин при кімнатній температурі покриваючий розчин видалили, а лунки двічі промили промивальним розчином (50 мМ Tpic-HCL, pH 7,8, що містив 0,9 % NaCl, 0,09 % NaN3 та 0,05 % Tween 20). Потім лунки насичили додаванням 300 мкл розчину (50 мМ Trizma base, 0,1 % BSA, 0,1 % NaN3, 0,1 % Tween 20, рН 7,5 скоректоване H2SO4), видалили з області навкруги електроду адгезивну стрічку і залишили висихати протягом 2,5 годин при 30°C. Марковане антитіло (моноклональний анти-hTSH, клон 5404, 5,5 мг/мл, Medix Biohemica Oy Ab) готували шляхом реакції похідних ізотіоцианату хелату тербію (III) (Тb-2,6-біс[N,Nбіс(карбоксіметил)амінометил]-4-бензоілфенол хелат) у 80-кратному молярному надлишку при рН 9,5 протягом ночі при кімнатній температурі. Для відділення кон'югату білкової фракції від надлишку реагенту колонку діаметром 1 см на 5,5 см наповнили Сефадексом G-50, а наступні 52 см - Сефарозой 6В. Для покриття області електроду тестовою смужкою до стрічкової рамки з отвором 5 8 2 прикріпили пористу плівку (товщиною 6-11 нм, 1  10 -6  10 пор/см , Whatman). Марковане антитіло (0,5 мкл, 80 мкг/мл) у 50 мМ Tpic-HCL буферу, рН 7.7, що містило 0,05 % NaN3, 0,9 % NaCl, 0,5 % BSA, 0,05 % бичачого гамма-глобуліну та 0,01 % Tween 20, піпетували на мембрану та залишили висихати протягом ночі при кімнатній температурі. Стандартні зразки (TSH у концентраціях 0,1; 1,0; 10,0 та 100 мМЕ/л) готували в тестових пробірках шляхом розбавлення стандартного розчину TSH (Wallac, DELFIA, hTSH kit, 324 мМЕ /мл TSH) розчином (50 мМ Trizma base, 0,05 % NaN3, 0,9 % NaCl, 0,5 % BSA, 1 мМ CaCl2 * H2O, рН 7,7 скоректований HCl). Мембрану з рамкою прикріпили до смужки подовженою частиною рамки (яка також покрита шаром клею). Зразок в об'ємі 3,5 мкл (стандартні зразки або зразки гепаринізованої цілісної крові) піпетували на пористу мембрану тестової смужки. Зразок розчинив марковане антитіло і швидко заповнив всю область електроду, утворивши дуже тонкий шар рідини між мембраною та областю електроду. Через 5 хвилин імунна реакція була проведена і мембранну рамку витягнули уручну. Тестову смужку перенесли у промивально/вимірювальну комірку електрохемілюмінометру. Комірку 4 рази заповнювали та 3 рази аспірували комбінованим промивально/вимірювальним розчином (50 мM Na2B4O7, 0,1 % NaN3, 0,003 % Tween 20, рН 7,9 скореговане H2SO4). Після останнього заповнення виміряли EXЛI (частота імпульсів 10 Гц, заряд в імпульсі 20 мкКл, тривалість імпульсу 250 мкс, 60 імпульсів, напруга 25 В) на люмінесцентному пристрої, що описаний у патенті US 6251690. Після вимірювання комірку аспірували та видалили Si-смужку. Криві відгуку від стандартних зразків і зразків гепаринізованої цілісної крові при однакових концентраціях наведені на Фіг. 4(а), заштриховані кружки, і на Фіг. 4 (b), заштриховані квадрати, відповідно. ПРИКЛАД 3. Використання Е-чіпів для дослідження проби вірусної PHK. 120-нт PCR-фрагмент був ампліфікований з використанням вірусної PHK як мішень [Lonnrot et al., J. Med. Vir. 56 (1999), 378-84]. CNS - патогени = патогени Центральної Нервової Системи. У централізованих діагностичних лабораторіях ця область є діагностичною мішенню у рутинних аналізах ентеро- та ріновірусів, які є небезпечними патогенами для респіраторної та центральної нервової системи. Захоплюючий зонд (С-зонд, TTA-GCC-GCA-TTC-AGG-GGG-CGA-AAA-Aa-C6-NH2, MedProbe As), комплементарний до послідовності 5 - кінця пікорна - PHK, був іммобілізований на електродах, покритих оксидом силікону (Ε-чіп, Фіг. 2, Приклад 3). У С-зонді за поли-А-хвостом слідував специфічний праймер, до якого міг прикріплятися залишок денатурованої PCR. Захоплюючий зонд був приєднаний до силанізованої силіконової поверхні (APTES) шістьма вуглець-аліфатичними вуглецевими групами і кінцевою аміногрупою через реагент дисукцинімідил суберат (DSS-реагент) відповідно до інструкцій виробника. Зонд-детектор (NH2-X)4-GA-AAC-ACG-GAC-ACC-CAa-AGT-A) був маркований похідними ізотіоцианату хелату тербію Tb(III) (Tb-2,6-6ic[N,N-біс(карбоксиметил)амінометил]-4бензоілфенол хелат) шляхом витримки зонду з 80-кратним молярним надлишком хелату у 0,5 M 6 UA 93081 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буфері карбонат натрію (рН 9,5). Після витримки протягом ночі марковану пробу очищали на колонці Сефадекса G50 (NAP-5 column, GE Healthcare). Дослідження гибрідізації людського ентеро- й ріновірусів проводили таким чином. Після RTPCR- ампліфікації зразок ДНК (зразок PCR в розведенні 1: 50; 1: 100 та 1: 1000, 20 мкл) був денатурований додаванням 180 мкл 50мМ/л NaОН (5 хвилин при 37°C) та нейтралізували додаванням 200 мкл нейтралізуючого буферу (6  SCC, 0,3 % Tween 20, 20мМ/л лимонної кислоти). Потім 10 мкл цього нейтралізованого зразка та 10 мкл зонду, маркованого хелатом Tb (0,6 нг/мкл, 50 мМ/л Tpic-HCL буферу, рН 7,8, 600 мМ/л NaCl, 1 % Triton  100 та 1 % блокуючого реагенту (Roche) внесли до нової пробірки і після перемішування 3,5 мкл розчину нанесли на тестову смужку. Тестова смужка містила мембрану з рамкою, як у Прикладі 2. Через 5 хвилин при температурі навколишнього середовища реакція зупинилася і після видалення мембрани з верхньої частини силіконового чіпу, тестову смужку промили 3 рази та виміряли KEXЛ, з використанням РііА-ридера. Крива розведення зразка представлена на Фіг. 5. Концентрація ампліфійованого зразка PCR оцінена у 40 нг/мкл. ПРИКЛАД 4. Виготовлення Е-чіпів з електродами з алюмінію з оксидним покриттям і з такими самими електродами, додатково покритими тонкою плівкою полістиролу, для імунного аналізу гетерогенного TSH з використанням стандартних зразків. На першому етапі Е-чіпи з електродами, що одержані випаровуванням алюмінію на шматочок скла (12,0 мм  75,0 мм), були виготовлені аналогічно описаним в Прикладі 1 для випадку зі смужками полістиролів, після чого їх витримали протягом нетривалого часу в ультразвуковій ванні у розчині бензолу (0,1 мг/мл) і поволі виймали з розчину полістиролу. При випаровуванні бензолу поверх електродів утворилася тонка плівка полістиролу. Покриття полістиролу було видалене в групі Е-чіпів, які використовують у біполярних вимірюваннях. Спочатку для імунного аналізу гетерогенного hTSH використовували Е-чіпи, виготовлені без фінішної плівки полістиролу (як у Прикладі 2). Вимірювання проводили так, що полярність електродів змінювалася відповідно до перемикання по схемі (подача двох полярностей на електроди, подача електричних імпульсів, вихід для перемикання полюсів на електродах, вхід у середнє положення) через кожні 10 імпульсів збудження, всього проведено 60 циклів збудження. Зареєстрована інтенсивність KEXЛ у часі була низькою, але сигнал слабо відповідав концентрації hTSH (Фіг. 4 (а)), заштриховані квадрати. Після використання Е-чіпів, покритих тонкою плівкою полістиролу, отримали набагато кращі результати (Фіг. 4 (b), заштриховані кружки), зросли і фонове випромінювання, і випромінювання маркерів. Кращі результати можна отримати, якщо покрити електроди органічним матеріалом, можливо навіть більш підходящим полімером і оптимізованою товщиною плівки. ПРИКЛАД 5. Виготовлення картриджу ПДМС-Е-чіпу для імунного аналізу гетерогенного TSH з використанням розчинів стандартного зразка. ПДМС-чіп з пневмонікою був виготовлений з силіконового еластомеру Sylgard 184, при змішуванні базового та загущаючого агентів у співвідношенні 10: 1, у формі для відливання в чашці Петрі. Потім вологий ПДМС дегазували у вакуумі та витримували протягом 2 годин при 50°C. Після витримки ПДМС витягнули з форми, розрізали на окремі чіпи та приєднали до КЕХЛ-Е-чіпів. Їх з'єднання було покращене шляхом обробки ПДМС-чіпу з пневмонікою та КЕХЛЕ-чіпу кисневою плазмою у реакторі Techniks Plasma TePla-400 протягом 30 сек. при швидкості потоку кисню 800 м/с і потужності 800 Вт. Плазмова обробка додала поверхні ПДМС гідрофільність, забезпечивши заповнення камери зразка капілярними силами. У ПДМС-кришці зліва є маленькі камери введення (Фіг. 7), в яких знаходяться всі необхідні реагенти у сухому стані перед аналізом. Впускні канали на одному кінці камери входу у чіпі використовують для заповнення комбінованої камери інкубації та вимірювання за рахунок капілярних сил і гідростатичного тиску, при цьому безліч випускних каналів під час заповнення камери дозволяють виходити повітрю. Маленькі опори підтримують ПДМС-купол камери. У цьому прикладі опори рівномірно розподілені по камері пневмоніки. Висота порожнини для інкубації та вимірювання складала 0,35 мм. ПДМС-кришка покривала лише область електроду КЕХЛ-чіпу, залишаючи відкритими накладки електричних контактів. Загальна товщина ПДМСкришки складала 5,0 мм. Спочатку скляний чіп розміром 19,0 мм  10,0 мм піддали нетривалому плазмовому травленню, а потім шляхом вакуумного випаровування алюмінію через маску утворили на чіпі шар алюмінію товщиною 0,5 мм, виготовивши таким чином обидві електродні області (2 та 3 на Фіг. 7). Область, обрана як катод (2), була оксидована в атмосфері кисню при кімнатній температурі, а на область, обрану як анод (3), через маску нанесли вуглецеву пасту (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA). 7 UA 93081 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 В цьому прикладі дослідження гормону TSH людини використане як модельне біологічне дослідження. Моноклональні первинні антитіла до TSH (захоплюючі антитіла), специфічні до αланцюга hTSH (MOAB, lot: M-21310, номер за каталогом МІТ0406, концентрація 6,87 мг/мл), були придбані у Medix Inc, CШA; вторинний моноклональний анти-hTSH, специфічний до βланцюга hTSH (клон 5404, lot SPC099, концентрація 5,5 мг/мл) - у Medix Biohemica Oy Ab, Фінляндія; калібрувальні стандарти hTSH - у Orion Diagnostica, Фінляндія; а 4морфолінетансульфоникова кислота (MES) та борна кислота - у BDH Chemicals Ltd, Poole, England та Merck, відповідно. Цитрат калію, глутаральдегід (GA), бичачий гама-глобулін, Тріс та бичачий сироватковий альбумін (BSA) виробництва Sigma. Na2B4O7 * 10 H2O та NaN3 (для аналізів) також виробництва Merck. Області, призначені для імунного аналізу, після витримки вуглецевої пасти покривали первинним антитілом таким чином. Остаточно підготовлену область електроду чіпів покрили первісним антитілом шляхом фізичної адсорбції, інкубуючи електрод у буфері, що містив 0,1 M MES, 0,3 M борної кислоти, 0,025 % бичачого гамма-глобуліну (рН 6,5) та первісного антитіла (MOAB, lot М-21310, Medix lnc., USA) 30 мкг/мл протягом 3,0 годин у мікролунці, утвореній адгезивною стрічкою з круглим отвором у центрі, трохи більшим, ніж область електролітичної комірки. Після покриття поверхню промили розчином буферу та витримали для встановлення рівноваги протягом однієї години у 0,05 M Tpic-H2SO4 буфері, рН 7,75, що містив 0,1 % бичачого сироваткового альбуміну, 0,1% Tween 20 і 0,1 % NaN3. Потім ПДМС-кришку (розміром 25 мм  14 мм, товщиною 5 мм; поз. 4 на Фіг. 7) встановили у необхідне положення щодо Е-чіпу та висушили 100 нг/мл вторинного антитіла у порожнині для першого зразка ПДМС-Е-чіпу (6 на Фіг. 7). Імунні дослідження проводили у 0,2 M борат-буфері, доведеному до рН 7,8 сірчаною кислотою. Спочатку змішали 25 мкл стандартного буферу та 175 мкл вимірювального буферу (0,2 М/л борат-H2SO4, pH 7,8, 0,1 % NaN3, 0,5 % бичачого сироваткового альбуміну, 0,05 % бичачого гамма-глобуліну, 01 % Tween 20 та 0,01 M NaN3) та додали у порожнину зразка (6, Фіг. 7). Доданий розчин спочатку розчинив сухі маркери з першої камери, а гідростатичний тиск і капілярні сили забезпечив заповнення області електролітичної комірки (5, Фіг. 7) через впускні мікроканали (7 на Фіг. 7), у той час, як повітря віддалялося через маленькі випускні канали (8 на Фіг. 7). Після 15 хвилин інкубування виміряли інтенсивність KEXЛ - результати представлені на Фіг. 8 (а), заштриховані кружки. Вимірювальна апаратура містила лічильник фотонів SR400 (Stanford Research Instruments, перелічувальну схему Nucleus MSC, саморобний кулоностатичний імпульсний генератор, корпус комірки (чорний пластик) та модуль лічильника фотонів CPM Perkin Elmer. Амплітуда імпульсів - 25 В, заряд в імпульсі 15 мкКл/імп, частота імпульсів 20 Гц, інтенсивність KEXЛ інтегрувалася по 200 циклах збудження, час затримки 0,05 мс, вікно спостереження 6,0 мс. Аналогічні вимірювання проведені з використанням Е-чіпів, виготовлені на силіконових чіпах (10  19 мм), в яких для отримання плівки оксиду товщиною 4 нм поверхня спочатку повністю була термічно оксидована за описаною вище процедурою, після чого у чіпи ввели адгезивну стрічку, залишивши відкритими області електродів і через маску шляхом нанесення вуглецевої пасти, використаної в інших прикладах, виконали аноди. Інакше кажучи, у даному прикладі імунні дослідження були проведені подібно до описаних вище, а результати представлені на Фіг. 8, заштриховані квадрати. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 60 1. Пристрій для досліджень з використанням електрохемілюмінесценції, виконаний у вигляді електродного чипа, який містить як електроди щонайменше один анод і один катод, що розміщені на загальній основі в картриджі, який відрізняється тим, що обидва, анод і катод, виконані з провідного матеріалу та (або) високодомішкового напівпровідника, при цьому катод покритий фінішним ізолюючим шаром, анод покритий фінішним провідним або ізолюючим шаром. 2. Пристрій за п. 1, який відрізняється тим, що основа для електродів виконана з ізолюючого або провідного матеріалу. 3. Пристрій за п. 1, який відрізняється тим, що обидва електроди виконані з силікону або алюмінію і їх поверхні містять надтонкий шар оксиду товщиною 0,5-50 нм. 4. Пристрій за п. 1, який відрізняється тим, що фінішний ізолюючий шар аноду і катоду виконаний з надтонкої ізолюючої плівки органічного матеріалу товщиною 0,5-20 нм. 8 UA 93081 U 5 10 5. Пристрій за п. 1, який відрізняється тим, що фінішний провідний шар аноду виконаний з плівки провідної фарби, зокрема вуглецевої пасти, сріблястої фарби чи сріблястого клею, або провідного полімеру, наприклад, шляхом друкування, струминного нанесення або фарбування, вакуумного випаровування чи напилення. 6. Пристрій за п. 1, який відрізняється тим, що картридж виконаний з пластику. 7. Пристрій за п. 1, який відрізняється тим, що анодні області чипа виконані шляхом нанесення ізолюючої плівки товщиною 100 нм та більш з наступним покриттям провідною плівкою або нанесенням провідної плівки, що одержана шляхом друкування, струминного нанесення або фарбування з використанням таких провідних фарб як вуглецева паста, срібляста фарба чи сріблястий клей, або плівки провідного полімеру, або шляхом вакуумного випаровування чи напилення додаткової металевої плівки. 8. Пристрій за п. 1, який відрізняється тим, що анод і катод мають електричні контакти для подання електричних імпульсів збудження електрохемілюмінесценції. 9 UA 93081 U 10 UA 93081 U 11 UA 93081 U Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 12