Точний та малобюджетний інтегрований електродний чип для цільового аналізу

Реферат: Електрохемілюмінесцентний аналітичний пристрій, в якому обидва і анод, і катод інтегровані на одній основі для електродів, що виготовлена з ізолюючого матеріалу або частково з провідного та ізолюючого матеріалу, матеріал робочого електрода є провідником або високодомішковим напівпровідником, який покритий надтонким шаром електричного ізолятора товщиною 0,5-50 нм, протилежний електрод виконаний металевим шляхом напилення або вакуумного випаровування, робочий електрод і протилежний електрод мають контактні смужки до відповідних частин чипа, таких як другий кінець електродного чипа або кути чипа, через які електроди можуть бути приєднані до електронних пристроїв збудження у складі приладу вимірювання люмінесценції, робочий електрод є катодом пристрою, протилежний електрод є анодом пристрою, під час або після закінчення прикладання імпульсів збудження аналізований зразок випромінює сигнал люмінесценції, пропорційний кількості аналізованої речовини. UA 93082 U (12) UA 93082 U UA 93082 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель відноситься до засобів для досліджень з використанням явища електрохемілюмінесценції. Корисна модель може знайти найбільше застосування у медичних цілях для проведення мікроаналізів, що персоналізуються. ПЕРЕДУМОВИ КОРИСНОЇ МОДЕЛІ У теперішній час існує настійна необхідність у швидких, чутливих і кількісних технологіях діагностики. Такі технології широко застосовні в ринкових умовах, включаючи охорону здоров'я, дослідження, сільське господарство, охорону навколишнього середовища, ветеринарну медицину і окремі галузі промислового виробництва. Підвищення чутливості, швидкості, надійності, стабільності і зниження вартості аналізів є чинниками, які після реалізації їх в діагностичних технологіях можуть знайти застосування в абсолютно нових областях. Дуже висока чутливість може бути одержана при використанні ряду діагностичних приладів, але вони дуже дорогі. З іншого боку, є засоби які можуть бути достатнє маловитратними, наприклад імунохроматографія, проте вони не застосовні до деяких потреб ринку. Будь-яка технологія, що відповідає таким вимогам, в майбутньому матиме важливе місце у діагностиці та великий ринковий потенціал. У практиці діагностики використовують велику кількість різних засобів аналізу, наприклад дослідження з використанням радіоактивності, імуносорбентний аналіз з ферментною міткою (ELISA), колориметричний аналіз, дослідження, що засновані на флуоресценції та хемілюмінесценції, що включає як анодну, так і катодну (індуковану гарячими електронами) електрохемілюмінесценцію (далі КЕХЛ). Індукована гарячими електронами електрохемілюмінесценція детально описана у патенті US 6251690 [KULMALAS., та ін.]. Кожен з цих засобів грає свою роль у сукупності таких характеристик, як чутливість, надійність, стабільність, швидкість і вартість. Відмінності між технологіями відображають залежність від фізичних обмежень або переваг методик. Наприклад, недолік застосувань радіоактивних складових полягає у розпаді з часом радіоактивної мітки і дуже високої вартості радіоактивних відходів з точки зору і безпеки, і впливу на навколишнє середовище. Застосування у діагностиці більш чутливих досліджень обмежується складністю тестів і приладів, такі дослідження можуть виконувати лише фахівці. Складність дослідження зазвичай прямо пропорційна вартості приладу і/або тесту. Щодо складності приладів можна згадати технологію анодної електрохемілюмінесценції, яка набуває зростаючої популярності: приладом є складний лабораторний робот, поводження з яким вимагає певних знань, а процес вимірювань включає багатократні промивання і підготовчі етапи. Це чинники, які збільшують вартість дослідження, а також призводять до зростання об'єму відходів і, отже, роблять цей метод неприйнятним для потреб малих лабораторій, лікарських кабінетів тощо (обстеження лежачих хворих або в пунктах надання допомоги). Комерційно вигідні способи засновані на тому принципі, що речовину, яка підлягає аналізу ідентифікують і вимірюють у сумішах з використанням так званих речовин-маркерів. У вимірюваннях, заснованих на унікальних властивостях біологічних молекул, наприклад, в імунохімічних дослідженнях, вимірюваний аналіт (X) може бути селективне сорбований з суміші молекул на пов'язані з ним антитіла у твердій фазі, а потім зв'язані молекули вимірюють за допомогою іншого маркованого антитіла, що селективне зв'язується з (X). Речовинамимаркерами можуть бути радіоактивні ізотопи, ферменти, молекули, що поглинають світло, флуоресціюють або фосфоресціюють, хелати деяких металів і т.д., які ковалентними зв'язками з'єднуються з антитілом. І навпаки, очищений (X) можна маркувати, а об'єм невідомого немаркованого зразка (X) можна досліджувати шляхом реакції порівняння. Дослідження ДНК і PHK також можуть бути засновані на селективному скріпленні (біологічна властивість). На основі таких же принципів можуть бути проведені багато інших хімічних і біохімічних досліджень. Для зниження вартості і/або збільшення точності вимірювань в даний час існує тенденція одночасного вимірювання у зразку декількох різних параметрів. Однією з можливостей є використання маркерів, що проявляють властивості флуоресценції або фосфоресценції на різних довжинах хвиль, або що мають різний час висвічення люмінесценції. Різні принципи і методики вимірювань, які можуть бути використані в імунодіагностиці, описані в книзі "Керівництво з імунного аналізу" ["The Immunoassay Handbook", ed. David Wild, Stockton Press Ltd., New York, 1994, 618 p.]. З рівня техніки відомо, що органічні речовини і хелати металів можуть успішно виступати як речовини-маркери, можуть збуджуватися під дією світла і, в деяких випадках, при електрохімічній дії люмінесціювати відповідно до специфіки маркера. Ці способи дуже чутливі і добре підходять до багатьох типів досліджень біологічних властивостей. Проте, через гранично малі вимірювані концентрації існують труднощі, які залежать від випадку; використання флуоресценції може бути ускладнене, окрім інших причин, 1 UA 93082 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тиндалевським, релеєвським та раманівським розсіянням. Під час аналізу біологічних матеріалів після подачі імпульсу збудження виникає, майже без виключення, швидкорозрядна сильна фонова флуоресценція. Фосфоресценція у фазі розчину може бути використана, переважно, тільки за наявності хелатів іонів лантанідів зі спеціально синтезованими органічними молекулами. Недоліком методів збудження з використанням фотолюмінісцентних маркерів є складність приладів і висока вартість чутливих оптичних компонент. У загальному випадку, перевагою ЕХЛ є низька вартість компонент устаткування для електричного збудження і простіша оптика. Порівняно з фотолюмінесценцією, можна уникнути деяких недоліків. Традиційне анодна електрохемілюмінесценції з електродами з інертного металу може бути одержана з використанням органічних люмінофорів в неводних розчинниках за допомогою відносно простих приладів. Проте, в дослідженнях біологічних властивостей, на яких сконцентровані найбільші комерційні очікування, застосовують водні розчини. Біологічні зразки вводять майже завжди в неорганічні розчини, тому вимірювальна система має працювати у водних або, у крайньому випадку, у водних розчинах міцел. Тільки вельми обмежене число хелатів металів перехідної групи працює у водних або міцелярних розчинах як ЕХЛ-маркери в анодній ЕХЛ. Тому найбільш важливим комерційним застосуванням анодної ЕХЛ в аналітичній хімії є 2+ спосіб, що використовує похідні рутеній Ru(bpy)3 - хелат, в якому визначення маркера відбувається у фазі міцели. Як відомо з літератури, суміші міцел завжди схильні до різних обурень унаслідок неконтрольованої складності рівноваги міцели. Подібні системи можуть бути також використані у вельми малих комірках детектування у капілярних системах електрофорезу [A. Auroraetal. Anal. Comm. 34 (1997), 303-395]. Індукована гарячими електронами КЕХЛ не залежить від міцел і має багато суттєвих переваг перед анодною ЕХЛ. Вона може бути використана і в способах імунного аналізу, і в способах гібридизації ДНК [Blackburn, G., та ін., 1991, CHn. Chem. 37: 1534-1539; Kenten, J., та ін. Clin. Chem. 33: 837-879]. В імунних дослідженнях і застосуваннях ДНК- і РНК-зондів, проведених фірмою Roche Diagnostics Ltd., використані магнітні частинки, за допомогою яких речовину-маркер наносять на золотий робочий електрод [Massey; Richard J. та ін. US 5746974; Leland; Jonatan K. та ін. US 5705402]. Проте, відтворюваність обробки магнітолатексних частинок здебільшого утруднена, тому даний спосіб придатний лише для дорогих лабораторних роботів (наприклад Elecsys 1010 та 2010), що мають складну і точну систему обробки рідини. Крім того, стаціонарно встановлений масивний золотий електрод потребує тривалого очищення та попередньої обробки між послідовними аналізами (Керівництво з обслуговування Elecsys, с.70). Хоча КЕХЛ виявляється чудовим методом у багатьох відносинах, його недолік в дослідженнях біологічних властивостей полягає у необхідності тривалого часу витримки для приведення взаємодіючих молекул у рівноважнийстан, що необхідний для отримання оптимальної точності аналізу. Пізніше було встановлено, що значне поліпшення результатів може бути досягнуте, якщо на робочому електроді розмістити тонку пористу плівку, і таким чином створити CIPF (Conductor/Insulator/Porous Film) - пристрій [US 2009178924 (Al), AlaKlemeetal.]. У традиційній електрохімії електроди іноді встановлюють на одній площині, але теоретично це не працює в електрохімії гарячих електронів, оскільки КЕХЛ випромінюється тільки із зовнішніх країв робочого електроду (катода), найближчого до електроду протилежного знаку (анода). Проте при проведенні випробувань було виявлено, що з ряду причин в електролітичній комірці з достатньо великим об'ємом розчину електроліту КЕХЛ випромінюється рівномірно зі всієї робочої поверхні електроду, навіть якщо протилежні електроди розміщені на одній площині в електродному чіпі (інтегровані електродні чіпи, ІЕ-чіпи), який зазвичай виготовляють з ізолюючого матеріалу, такого як скло, кераміка або органічні полімери. Фірма Labmaster Ltd. (Турку, Фінляндія) працювала зі своїми діагностичними смужками майже десять років, і отримане ними рішення являє вже застарілий прилад, що містить єдиний шматок силікону, що покритий оксидом і поміщений у пластик, та невід'ємну багатоцільову мембрану для введення зразків і реагентів для досліджень біологічних властивостей [US 2009178924б, Ala-Klemeetal]. Основний недоліком цих смужок є те, що всі вимірювання проводяться в інструментальній комірці, яка, щоб уникнути накладення результатів, повинна бути ретельно вимита і вичищена перед кожним вимірюванням, проблематичним є також псування вбудованого у прилад протилежного електроду. Дана корисна модель пропонує засоби побудови повністю одноразових картриджів з виключно точними і відтворними електродами, які забезпечать точність результатів аналізу на практиці. Ця корисна модель розкриває розроблені до тонкощів і точні способи виготовлення ІЕ 2 UA 93082 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чіпів з силікону та інших ізолюючих матеріалів, а також може бути використана спільно з CIPFпристроями фірми Labmaster для підвищення їх якості (ІЕ-чіпи на основі силікону) або для зменшення вартості виготовлення при збереженні якості (ІЕ-чіпи на основі скла або пластика). Але важливіше те, що можна легко спроектувати і багато інших типів картриджів, які не потребують громіздких мембран для прискорення біологічних реакцій. Прості рішення по виготовленню варіантів ІЕ-чіпу на основі силікону стали справді поворотними в аспекті точності і відтворення персоніфікованих аналізів з використанням КЕХЛ. У теперішній час в цій сфері аналізів ніякий інший метод не забезпечить такі швидкі та точні результати аналізу при виключно низьких порогах виявлення, як картриджі майбутнього, що використовують пропоновані поліпшення ІЕ-чіпу. Відповідно до даної корисної моделі можна одержати значне поліпшення в чіп-пристроях [US 2009178924 (A1) Ala-Klemeetal] і, окрім цього, абсолютно нові типи високоточних одноразових КЕХЛ-картриджів, що включають ІЕ-чіпи, а також нові методи аналізу з використанням картриджів, як викладено в пп. 1-6 патентної формули. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фіг. 1. Поперечний перетин пристроїв з силікону та зі скла. Вертикальні і горизонтальні розміри не масштабовані. Фіг. 2. Форми деяких електродів, перевірені на пристроях з силікону. Чорні і білі області позначають робочий і протилежний електроди, відповідно. Сірі області відповідають ізоляції. На чіпах показаний тип електроду (WIRE, MESH, CIRC або RING), ширина протилежного електроду (200 мкм для перших трьох) і величина проміжка для протилежного електроду в MESHпристроях (показаний варіант в 1000 мкм). Фіг. 3. Полідиметилсилоксанова камера (ПДМС-камера) зразка з капілярним заповненням. Фіг. 4. IE-чіп на основі силікону з капілярно заповнюваною ПДМС-камерой (зліва) і пристрій ІЕ-чіпу з гідрофобне обмеженою краплею зразка (справа). Фіг. 5. ІЕ-чіпи на основі силікону і скла з круглим робочим електродом у середині підготовленої електролітичної комірки. Фіг. 6. Калібрувальні криві хелату Tb(III), отримані з пристроями (по порядку зверху вниз): RING 500 (33 мм шаром розчину над ІЕ-чіпом), MESH 200/1000 з гідрофобним оточенням зразка, MESH 200/1000 з ПДМС-пневмонікою, пристрій на основі скла з 3 мм шаром розчину над ІЕ-чіпом. Фіг. 7. Криві імунних досліджень гетерогенного TSH з використанням ІЕ-чіпів на основі з силікону і на основі зі скла з областями комірок у гідрофобному оточенні і використанням мембранних плівок при додаванні реагентів, (а) ІЕ-чіпи на основі з силікону, заштриховані квадрати. (b) ІЕ-чіпи на основі зі скла, не заштриховані кружки. Триразові вимірювання при кожній концентрації. Фіг. 8. Крива імунного дослідження гетерогенного TSH з використанням ІЕ-чіпів і ПДМСкришки. Фіг. 9. Крива зондового дослідження вірусної PHK на ІЕ-чіпах на основі силікону. Фіг. 10. Окремі конфігурації ІЕ-чіпів для різних типів картриджів, вироблених на силіконі (а) і на склі (b). ДОКЛАДНИЙ ОПИС КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Відповідно до даної корисної моделі, кожного разу, коли проводяться імунні дослідження або ДНК - гібридизація з використанням пористої плівки на поверхні IE-чіпу (CIPF-IE-чіп пристрій), різні аналізи з використанням простих і недорогих пристроїв можна виконати також добре як і з більш складними пристроями. Отже, якщо використовувати достатньо дешеві для проведення персоніфікованого мікроаналізу вимірювальні прилади і вимірювальний картридж, можна значно удосконалити більш ранні CIPF-пристрої, виготовляючи їх повністю одноразовими. Тоді не відбуватиметься накладення результатів аналізів, а виготовлення картриджів для CIPF-IE-чіпів стане набагато простіше, оскільки у картридж не доведеться роздільно вводити робочий і протилежний електроди. До того ж, при виготовленні великої партії матеріали для електродів дешеві, і виробництво або ІЕ-чіпів окремо, виробництво картриджів для CIPF-IE-чіпів та інших типів картриджів стає простим і відносно легким. Дана корисна модель розкриває різні варіанти типів CIPF-IE-пристроїв і картриджів з CIPFIE-чіпами, та інших типів IE-картриджів. У цій корисній моделі протилежний електрод виготовлений, наприклад, на поверхні робочого електроду на силіконовому чіпі, а камера комірки зразка утворена на чіпі шляхом прикріплення до електродного чіпу кришки, сформованої литвом з ПДМС. Таким чином утворюється зручна для використання повністю інтегрована комірка зразка для КЕХЛ, яка будучи повністю одноразовою, виключає ризик перемішування зразків, що важливо в індивідуальних медичних аналізах. Через високу оптичну 3 UA 93082 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 прозорість в широкому діапазоні довжин хвиль 240-1100 нм, а також електроізоляційні властивості та хімічну інертність до водних реагентів ПДМС є ідеальним матеріалом для пристроїв оптичного детектування. Розкрита також альтернативна схема розміщення зразка з використанням шаблонів гідрофобних плівок. Оскільки пневмоніка ПДМС легко формується в об'ємі при відливанні у форму, приєднання покриття ПДМС до КЕХЛ-чіпу є надзадачею при виготовленні з урахуванням масштабів чіпу або пластини. З іншого боку, модифікація гідрофобної поверхні є простим етапом обробки для масштабу пластини, рельєфну розмітку легко здійснити одним етапом фотолітографії. Модифікація гідрофобної поверхні також спрощує проведення досліджень біологічних властивостей з використанням пористих мембран на ІЕ-чіпах, які скорочують період витримки і дуже прискорюють дослідження. КЕХЛ-пристрої, що розглядаються, виконані з використанням у якості робочого електроду термічно оксидованого силікону та протилежних електродів з тонкої платинової плівки, з якими досягається субнаномолярна чутливість до хелатів Tb(III), використаним як модельна аналізована речовина (аналіт). У пристрої, в якому робочим електродом є скло з напиленою на його тонкою алюмінієвою плівкою, що покрита тонким шаром осаджуваного алюмінію (ALD), показана здійсненність осаджуваних електродів на ізолюючому матеріалі. Щодо рівня техніки корисна модель має значні переваги щодо CIPF-пристроїв, призначених для окремих досліджень, забезпечуючи можливість виробництва досить дешевих, але високоточних, кількісних і швидких тестів і тест-картриджів, які вельми необхідні на ринку діагностичних пристроїв на додаток до менш точних пристроїв, виготовлених трафаретним друком або іншими способами друку з менш якісних матеріалів. Приклад 8 розкриває різні рішення для різних типів картриджів спеціального призначення. Справжні інновації найлегше зрозуміти на основі практичних прикладів. Надалі запропоновану корисну модель пояснюють приклади і пов'язані з ними креслення і діаграми. ПРИКЛАД 1. Виготовлення пристроїв з ІЕ-чіпами і калібрувальні графіки Тb(III)-маркера. Виготовлення пристрою з силікону. Пристрій з робочим електродом з покритого оксидом силікону виготовляли з пластини 2 кремнію n-типа з питомим опором 0,005-0,018 Ом/см і орієнтацією (1 1 1). Пластину очищали послідовно спочатку складом SC-1 (розчин NH4OH/H2O2 при 80 °C) і розведеним HF, потім складом SC-2 (розчин HCl/Н2О при 80 °C). Після цього платину оксидували вологими протягом 90 хв. при 950 °C з отриманням захисної плівки оксиду товщиною 380 нм. Потім оксид розмітили з використанням стандартної оптичної літографії та піддали вологому травленню для виділення областей робочого електроду та подальшій RCA-очистці зануренням у HF, яка тривала до повного видалення оксиду. Після цього на робочому електроді шляхом сухого окислення в 10 % кисню при 850 °C був утворений тонкий шар оксиду, який забезпечує тунелювання електронів. За 20 хвилин наросло приблизно 4 нм оксиду. Після фотолітографії розпилюванням нанесли 50 нм платини з отриманням рельєфного шаблону. Електричний контакт до протилежного електроду з платини був утворений з'єднаними паралельно контактними накладками на фронтальній частині пластини, а контакт до робочого електроду з силікону проходив через тильну сторону. Контакт на тильній стороні може бути покращений шляхом вологого травлення вільної від оксиду тильної сторони пластини і напиленням на неї приблизно 100 нм алюмінію, хоча це не є необхідним. Схематично поперечний перетин пристрою WIRE-типу з силікону показаний у верхній частині Фіг. 1. Виготовлення пристрою зі скла. Пластину зі скла Пірекс (Pyrex) спочатку очистили складом SC-I та для формування робочих електродів і як основу під шаблон для платини напилили на неї шар алюмінію товщиною 400 нм. Після цього за допомогою стандартної оптичної літографії обкреслили області протилежного електроду і з цих областей, щоб сформувати рельєфну структуру у фоторезисті, шляхом вологого травлення майже на 100 % видалили алюміній, напилили платину і сформували рельєфний шаблон, підтриманий підведеним резистом. Потім за допомогою літографії і вологого травлення обкреслили робочі електроди з алюмінію і, використовуючи ALD з водного розчину триметилалюмінію, нанесли плівку алюмінієвого оксиду товщиною 4 нм. Цей шар і контактні накладки шляхом фотолітографії і травлення видалили з платинового протилежного електроду. Травлення проводили лужним розчином проявника фоторезисту протягом двох хвилин понад потрібний для прояву, що легко витримав шаблон фоторезисту. Після закінчення фоторезист видалили. Електричні контакти виконали і на робочому і на протилежному електродах за допомогою відповідних контактних накладок на фронтальній 4 UA 93082 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поверхні пластини. Схематично поперечний перетин пристрою зі скла показаний у нижній частині Фіг. 1. Геометрія електроду та ПДМС струминна техніка (пневмоніка) Досліджували декілька геометричних форм електродів на пристроях з силікону та зі скла. Деякі конструкції з силікону представлені на Фіг. 2. Чорним кольором на кресленні зображено робочий електрод з силікону, який забезпечення тунелювання електронів покритий діелектриком (діоксидом кремнію); області без кольору представляють металізацію протилежного електроду платиною; сірі області зображають товстий захисний шар електричної ізоляції. Конструкція електродів включає прості дроти, що проходять упоперек робочий електрод (Фіг. 2, WIRE), пучки проводів, що проходять упоперек робочого електроду (Фіг. 2, MESH), круглі протилежні електроди в області робочого електроду (Фіг. 2, CIRC) та кільцеподібний протилежний електрод, що цілком оточує круглий робочий електрод (Фіг. 2, RING). Ширина протилежного електроду мінялася, як і щільність ліній в MESH-конструкціях. У всіх конструкціях між робочим і протилежним електродами залишали заповнений товстим шаром ізолюючого оксиду зазор не менше 100 мкм. Подібна геометрія була випробувана на пристроях з скла. Форму для відливання ПДМС виготовляли з пластини кремнію шляхом утворення на її поверхні методами стандартної фотолітографії структур SU-8. Для цих пристроїв використовували шар SU-8 50 товщиною 50 мкм або шар SU-8 100 товщиною 350 мкм. Для створення товщих чи багаторівневих структур можна використовувати безліч шарів SU-8. Після закінчення форму покрили плівкою не липкого тефлоноподібного флуорополімеру з плазми CHF3 товщиною 30 нм яку отримали шляхом іонного травлення Oxford PlasmaLab-80+ при 3 швидкості потоку 100 см /хв. і потужності 50 Вт. Це забезпечило легше видалення отвержденної ПДМС з форми та продовження терміну служби форми без погіршення зв'язуючих властивостей ПДМС. ПДМС чіп з пневмонікою був виготовлений із силіконового еластомеру Sylgard 184 (основа та отверждаючий агент змішані в співвідношенні 10: 1) у формі для відливання в чашці Петрі. Потім вологі ПДМС дегазували у вакуумі. Після витримки ПДМС у вакуумі протягом 2 годин при 50 °C видалили з форми, розрізали на окремі чіпи та приєднали до КЕХЛ-електродного чіпу. Для поліпшення з'єднання і ПДМС-чіп з пневмонікою і КЕХЛ-електродний чіп спочатку обробили кисневою плазмою в реакторі Technics Plasma TePla-400 протягом 30 с. потоком кисню зі 3 швидкістю 800 см /хв. при потужності 800 W. Така плазмова обробка додала ПДМС-поверхні гідрофільність, дозволяючи заповнити камеру зразка за допомогою капілярних сил. Геометрія ПДМС-кришки показана на Фіг. 3. Впускний канал на одному кінці чіпу використовують для наповнення камери шляхом занурення кінця чіпу у розчин зразка, тоді як під час наповнення по множині каналів виходить повітря. Маленькі опори підтримують купол ПДМС камери. У даній конструкції опори рівномірно розподілені по камері пневмоніки, без відповідної оптимізації з урахуванням геометрії робочого електроду або протилежного електроду. ПДМС-кришка покриває в КЕХЛ-чіпі тільки область електроду, залишаючи відкритими електричні контактні накладки. Гідрофобна оболонка зразка. Гідрофобна оболонка зразка на КЕХЛ-електродних чіпах утворена шляхом розміщення в області навколо електродів гідрофобної плівки флуорополімеру. Після маскування областей робочого і протилежного електроду та електричних контактних накладок фоторезистом, на КЕХЛ-електродні чіпи за допомогою того самого плазмового процесу, що згаданий вище стосовно нанесення на форму SU-8, нанесли флуорополімер і виконали рельєфний шаблон в ацетоні. Так електроди залишилися непокритими і гідрофільними, тоді як навколишні області залишилися високо гідрофобними. КЕХЛ-вимірювання Тb(III)-маркера. У якості модельного маркера використовували розчин халату Tb(III) 2,6-бис[N,Nбіс(карбоксіметил)амінометил]-4-бензоілфенол. Вимірювання КЕХЛ виконували в утримувачі зразка з трубкою фотопомножувача для оптичного детектування і оптичним інтерференційним фільтром на довжині хвилі 550 нм і смугою пропускання 40 нм, для пропускання всієї лінії спектру, випромінюваною хелатом Tb(III). Фронтальні і тильні електричні контакти були виконані в утримувачі зразка для взаємодії КЕХЛ-чіпу з вбудованим імпульсним генератором. Статичні електричні імпульси подавалися на електроди чіпу з частотою 20 Гц, а дані люмінесценції вимірювали на послідовності з 1000 імпульсів. Для подальшого поліпшення селективності оптичне детектування проводили з розділенням у часі, інтегруючи люмінесценцію протягом 6 мс після 50 мкс затримки після закінчення імпульсу. Пристрої з ПДМС-пневмонікою (Фіг. 4, зліва) були заповнені розчином зразка шляхом занурення впускного кінця чіпу в краплю розчину 5 UA 93082 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зразка на поверхні скляної пластини. ПДМС-камера швидко наповнювалася під впливом капілярних сил, і повне заповнення можна було легко проконтролювати візуально. Повний об'єм зразка був обмежений об'ємом ПДМС-камери (близько 15 мкл на камери пневмоніки заввишки 50 мкм). Зразки з гідрофобною оболонкою піпетували прямо на електродний чіп, поки у межах гідрофобного кільця не була сформована добре окреслена майже півсферична крапля (Фіг. 4, справа). Для аналізу використовували 100 мкл розчину зразка, на Фіг. 6 представлені калібрувальні графіки маркера хелату Tb(III), отримані з використанням варіантів ІЕ-чіпу. ПРИКЛАД 2. Імунні дослідження гетерогенного TSH з використанням ІЕ-чіпів на силіконі і на склі. Використані ІЕ-чіпи представлені на Фіг. 5 (зліва). Області електродів ІЕ-чіпів покрили при розміщенні на них гідрофобного кільця. Покриваючий розчин (150 мкл) складався з 0,1 MMES, 0,03 MH3BO3, 0,5 мМ К-цитрату, 0,025 % глутаральдегіду, 0,05 % бичачого гама-глобуліну та 10 мкг/мл антитіла (МІТ0406 MOAB анти hTSH Medix Biotech Inc. USA). Після витримки ІЕ-чіпів у покриваючому розчині в закритій пластиковій ємкості протягом 2 годин при кімнатній температурі покриваючий розчин аспірували і лунки ІЕ-чіпів двічі промили промивальним розчином (50 мМ Tpic-HCL, pH 7,8, що містив 0,9 % NaCl, 0,09 % NaN3 та 0,05 % Tween 20. Потім лунки насищали додаванням 300 мкл розчину (50 мМ Trizma основи, 0,1 % BSA, 0,1 % NaN3, 0,1 % Tween 20, рН 7,5, скоректований H 2SO4). Після насичення ІЕ-чіпи висушували протягом 2,5 годин при 30 °C. Марковане антитіло (моноклональний анти-hTSH, клон 5404, 5,5 мг/мл, Medix Biochemica OyAb) було приготоване за допомогою реакції похідних ізотіоцианата хелата Tb (III) (Тb-2,6бис[N,N-біс(карбоксиметил)амінометил]-4-бензоілфенол) в 80-кратному молярному надлишку при рН 9,5 протягом ночі при кімнатній температурі. Для відділення кон'югату білкової фракції від надлишку реагенту колонку діаметром 1 см наповнили на 5,5 см Ceфaдeкcoм G-50, а подальші 52 см - Сефарозой 6В. 5 Імунні дослідження проводили з використанням пористої плівки товщиною 6-11 нм, 1 × 10 8 2 6 × 10 пор/см , Whatman). Марковане антитіло (0,5 мкл, 80 Тріс-НСІ-буфер, рН 7,7, що містило 0,05 % NaN3, 0,9 % NaCl, 0,5 % BSA, 0,05 % бичачого гама-глобуліну та 0,01 % Tween 20, піпетували на зразок мембрани розміром 10 мм × 10 мм та залишили для висушування при кімнатній температурі протягом ночі. Стандартні зразки (TSH у концентраціях 0,1, 1,0, 10,0 і 100,0 мМЕ/л) готували в тестових пробірках шляхом розбавлення стандартного розчину TSH (Wallac, DELFIA hTSH kit, 324 мМЕ/мл TSH) розчином розчинника (50 мМ Trizma основи, 0,05 % NaN3, 0,9 % NaCl, 0,5 % BSA, 1 мМ CaCl2 * H2O, рН 7,7, скоректований HCl). Для імунних досліджень зразок мембрани, що містив висушене марковане вторинне антитіло, був поміщений на область гідрофільного електроду для утворення електролітичної комірки з краплею розчину електроліту. Зразок об'ємом 4 мкл піпетували у центр пористої плівки на ІЕ-чіпі. Зразок розчинив марковане антитіло і швидко заповнив порожнину між мембраною і мережею електродів. Через 7 хв. імунохімічна реакція була достатньо близька до рівноваги і мембрану видалили пінцетом. IE-чіп промили тричі сполученим промивочно/вимірювальним розчином (50 мМ Na2B4O7, 0,1 % NaN3, 0,003 % Tween 20, рН 7,8, скоректований Na2SO4). Потім додали 100 мкл вимірювального буферу і виміряли інтенсивність КЕХЛ з розділенням у часі на електрохемілюмінометрі. Вимірювальна установка складалася з лічильника фотонів SR 400 (Stanford Research Instruments), рахувальної схеми Nucleus MCS і саморобних генератора статичних імпульсів та відділення для клітин (чорний пластик), а також модуля лічильника фотонів CPM (Perkin Elmer). Амплітуда імпульсів складала 25 В, заряд в імпульсі 15мКл/імп, частота імпульсів - 20 Гц, КЕХЛ-інтенсивність з розділенням у часі інтегрували по 200 циклах збудження, час затримки 0,05 мс і вікно вимірювання 6,0 мс. Калібрувальні криві від стандартних зразків представлені на Фіг. 7 (а), заштриховані квадрати проведені триразові вимірювання при кожній концентрації. Погрішність виявилася нижчою 2 %, що ніколи не спостерігалося раніше в будь-яких дослідженнях біологічних властивостей з використанням КЕХЛ. Такі ж операції повторили з використанням ІЕ-чіпів на основі зі скла (Фіг. 5, справа). Отримані результати представлені на Фіг. 7 (b), незаштриховані кружки - проведені триразові вимірювання для кожної концентрації. Погрішність склала менше 2 %, що також дуже добре. ПРИКЛАД 3. Імунні дослідження гетерогенного TSH з використанням ІЕ-чіпів на основі силікону з ПДМС-кришками та стандартних зразків. Імунні дослідження проводили за аналогією з Прикладом 2 з тим виключенням, що були використані ІЕ-чіпи WIRE-типу (Фіг. 4, зліва). Іншим виключенням було те, що пористу мембрану не використовували, а марковане антитіло (0,5 мкл, 80 мкг/мл) в 0,05 M буферу тетраборат 6 UA 93082 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 H2SO4 (рН 7,7, що містило 0,1 % NaN3, 0,5 % BSA, 0,05 % бичачого гамаглобуліну та 0,01 % Tween 20) піпетували у порожнину ПДМС-кришек та залишили кришки сохнути протягом ночі при кімнатній температурі. Наступного дня ПДМС-кришки встановили у відповідні положення й щільно закріпили на кожному ІЕ-чіпі. Потім зразок розвели в 150 мкл буферу (0,05 M тетраборат - H2SO4 (рН 7,7, що містив 0,1 % NaN3, 0,5 % BSA, 0,05 % бичачого гамаглобуліну і 0,01 % Tween 20) та піпетували на впускання у прототип картриджа ПДМС-ІЕ-чіпу. Можливо, порожнина не могла бути також добре заповнена, як у разі тільки капілярних сил. Були виміряні інтенсивності КЕХЛ з розділенням у часі після 20,0 мін витримки (амплітуда імпульсів 25 В, заряд в імпульсі 15 мкКл/імп, частота імпульсів 20 Гц, інтенсивність КЕХЛ з розділенням у часі інтегрувалася по 200 циклах збудження, час затримки 0,05 мс, вікно спостереження 6,0 мс). Калібрувальна крива від стандартних зразків представлена на Фіг. 8. ПРИКЛАД 4. Зондові дослідження вірусної PHK на ІЕ-чіпі на основі силікону. Використані ІЕ-чіпи, подібні представленим в Прикладі 3, але з мініатюрними комірками у гідрофобній оболонці. Спочатку 120-нт PCR-фрагмент був ампліфійований з використанням вірусної PHK в якості мішені [Lonnrotetal., J. Med/Vir/ 56 (1999), 378-84]. У централізованих діагностичних лабораторіях ця область є діагностичною мішенню в рутинних аналізах ентеро- і риновірусів, які є небезпечними патогенами для респіраторної та центральної нервової системи. Захоплюючий зонд (С-зонд, TTA-GCC-GCA-TTC-AGG-GGG-CGA-AAA-AA-C6-NH2, Med Probe As), компліментарний до послідовності 5'- кінця пікорна-РНК, був імобілізований на силіконовому електроді з оксидним покриттям (IE-чіп, Фіг. 2, Приклад 3). У С-зонді за поли-Ахвостом слідував специфічний праймер, до якого міг прикріплятися залишок денатурованої PCR. Захоплюючий зонд був приєднаний до силанізованої силіконової поверхні (APTES) ІЕ-чіпу шістьма вуглець-аліфатичні вуглець-вуглецевими групами і кінцевою аміногрупою через реагент дисукцінімідил суберат відповідно до інструкцій виробника. Зонд-детектор (NH2-X)4-GA-AAC-ACG-GAС-ACC-CAA-AGT-A) маркований похідними ізотіоціанату хелату Tb (III) (Тb-2,6-бис[N,N-бис(карбоксиметил) амінометил1]-4-бензоілфенол) шляхом витримки проби з 80-кратним молярним надлишком хелату в 0,5 M буфері карбонат натрію (рН 9,5). Після витримки протягом ночі маркована проба була очищена на колонці Ceфaдeкca G-50 (NAP-5 column, GEHealthcare). Дослідження гібридизації людського ентеро- і риновірусів проводили таким чином. Після RTPCR ампліфікації зразок ДНК (зразок PCR в розведенні 1:50, 1:100 і 1:1000, 20мкл) був денатурований додаванням 180 мкл 50 мМ/л NAOH (5 мін при 37 °C) і нейтралізований додаванням 200 мкл нейтралізуючого буферу (6 × SCC, 0,3 %Tween 20, 20 мМ/л лимонної кислоти). Потім 10 мкл цього нейтралізованого зразка та 10 мкл зонду, маркованого халатом Tb (III) (0,6 нг/мкл, 50 мМ/л Тріс-НСІ буферу, рН7,8, 600 мМ/л NaCl, 1 % Triton × 100 і 1 % блокуючого реагенту (Roche), перенесли в нову пробірку і після перемішування 3,5 мкл отриманого розчину нанесли на мембрану в ІЕ-чіпі. Протягом 8 хвилин при температурі навколишнього середовища реакція наблизилася до рівноважної, і після видалення з ІЕ-чіпу мембрани, IE-чіп 3 рази промили та виміряли КЕХЛ (з розділенням у часі). Крива розведення зразка надана на Фіг. 9. ПРИКЛАД 5. Конструкції електродів для різних типів картриджів. Кожен картридж вимагає специфічної конструкції розміщуваного ІЕ-чіпу, з урахуванням товщини шару електроліту, а також складу електроліту і буферного розчину, що необхідні в дослідженнях. З упевненістю можна сказати, що для будь-якого типу картриджів, яким відповідає розглянута область електроду, можна вибрати адекватне рішення чіпів на основі силікону з конструкціями за прикладами Фіг. 10 (а), а на основі скла та інших ізолюючих матеріалів - за прикладами Фіг. 10 (b). На Фіг. 10 (а) дзеркально відбиваючі області виконані з металевої плівки, зокрема платини, яку використовують як протилежний електрод (білий колір на кресленні), області робочого електроду, що покриті ультратонким шаром плівки кремнію завтовшки 4 нм зображені сірим кольором. Більш темні області відповідають покриттю товстою ізолюючою плівкою/плівками. На Фіг. 10 (b) представлена пластикова плівка, необхідна для захисту чіпів при нарізуванні, але що легко видаляється з готових чіпів. Прозорі області відповідають склу, світліші з числа непрозорих областей відповідають областям робочих електродів, відповідно. Детальніше один із зразків таких ІЕ-чіпів представлений на Фіг. 5, справа. 7 UA 93082 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 20 25 30 35 40 1. Електрохемілюмінесцентний аналітичний пристрій, в якому обидва і анод, і катод інтегровані на одній основі для електродів, що виготовлена з ізолюючого матеріалу або частково з провідного та ізолюючого матеріалу, матеріал робочого електрода є провідником або високодомішковим напівпровідником, який покритий надтонким шаром електричного ізолятора товщиною 0,5-50 нм, протилежний електрод виконаний металевим шляхом напилення або вакуумного випаровування, робочий електрод і протилежний електрод мають контактні смужки до відповідних частин чипа, таких як другий кінець електродного чипа або кути чипа, через які електроди можуть бути приєднані до електронних пристроїв збудження у складі приладу вимірювання люмінесценції, робочий електрод є катодом пристрою, протилежний електрод є анодом пристрою, під час або після закінчення прикладання імпульсів збудження аналізований зразок випромінює сигнал люмінесценції, пропорційний кількості аналізованої речовини. 2. Пристрій за п. 1, в якому робочі електроди виконані з кремнію або алюмінію, їх поверхні містять надтонкий шар оксиду товщиною 0,5-50 нм, а області, вибрані як анод чипа, виготовлені шляхом нанесення на них спочатку відносно товстої ізолюючої плівки (товщиною 200 нм і більше) з подальшим покриттям провідною плівкою шляхом вакуумного випаровування або напилення додаткової плівки металу на анодні області пристрою. 3. Пристрій за будь-яким з пп. 1 або 2, в якому пориста плівка товщиною менше 100 мкм нанесена на електроди, аналізований зразок нанесений на пористу плівку/мембрану, зразок та інші реагенти, нанесені на пористу плівку/мембрану і/або катод, можуть взаємодіяти один з одним, під час або після закінчення прикладання імпульсів збудження аналізований зразок випромінює сигнал люмінесценції, пропорційний кількості аналізованої речовини. 4. Пристрій за п. 1, в якому електродний чип, що містить катод і анод, поміщений в полімерний картридж, порожнини якого можуть бути заповнені під дією капілярних сил, тиску або всмоктування, при заповненніпорожнин чипа зразком або розчиненим зразком він розчиняє всі необхідні реагенти від вхідної порожнини пристрою, під час або після закінчення прикладання імпульсів збудження аналізований зразок випромінює сигнал люмінесценції, пропорційний кількості аналізованої речовини. 5. Пристрій за п. 1, в якому електродний чип, що містить катод і анод, поміщений в полімерний картридж, порожнини якого можуть бути заповнені під дією капілярних сил, тиску або всмоктування, при заповненні порожнин чипа зразком або розчиненим зразком він розчиняє всі необхідні реагенти від вхідної порожнини пристрою, порожнину електродного чипа промивають одноразово вимірювальним буфером перед збудженням, під час або після закінчення прикладання імпульсів збудження аналізований зразок випромінює сигнал люмінесценції, пропорційний кількості аналізованої речовини. 6. Пристрій за п. 1, в якому в інтегрованому електродному чипі області катода і анода сформовані послідовним нанесенням шарів провідників, напівпровідників та ізоляторів на провідний, напівпровідний або ізолюючий матеріал таким чином, що остаточно області катода і анода не мають електричного контакту між собою і можуть бути використані для генерування електрохемілюмінесценції, індукованої гарячими електронами. 8 UA 93082 U 9 UA 93082 U 10 UA 93082 U 11 UA 93082 U 12 UA 93082 U 13 UA 93082 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 14