Антитіло, яке специфічно зв’язується з р-кадгерином
Номер патенту: 95775
Опубліковано: 12.09.2011
Автори: Гріггс Девід Уілльям, Бойл Мелані, Маццарелла Річард Аллен, Касперсон Джеральд Фрайєс, Тілє Баррет Річард, Бернер Морін Джері, Моффат Марк Аллен, Боєр Крістофер Тодд, Хед Річард Девід, Мінтер Ральф Реймонд, Джой Уілльям Дін, Ванарсдейл Тодд Лі
Формула / Реферат
1. Виділене антитіло або його антигензв’язувальна частина, які зв’язуються з Р-кадгерином з КD 50 нМ або менше і містять домен VH і домен VL, де домен VH містить:
a) CDR1 VH, як вказано у SEQ ID NO:24;
b) CDR2 VH, як вказано у SEQ ID NO:25; і
с) CDR3 VH, як вказано у будь-якій з SEQ ID NO:26-37 і 91-256;
і де домен VL містить:
d) CDR1 VL, як вказано у SEQ ID NO:38;
e) CDR2 VL, як вказано у SEQ ID NO:39; і
f) CDR3 VL, як вказано у будь-якій з SEQ ID NO:40-47 і 257-319.
2. Антитіло або його антигензв’язувальна частина за п. 1, де домен VH містить послідовність, як вказано у будь-якій з SEQ ID NO:1-13 і 320-325, і де домен VL містить послідовність, як вказано у будь-якій з SEQ ID NO:14-23 і 326-331.
3. Антитіло або його антигензв’язувальна частина за п. 2, де домен VH містить послідовність, як вказано у будь-якій з SEQ ID NO:13, 320, 321 і 322.
4. Антитіло або його антигензв’язувальна частина за п. 2, де домен VL містить послідовність, як вказано у будь-якій з SEQ ID NO:22, 326, 327 і 328.
5. Антитіло або його антигензв’язувальна частина, які зв’язуються з Р-кадгерином з КD 50 нМ або менше, де домен VH містить будь-яку з SEQ ID NO:13, 320, 321 і 322, і де домен VL містить будь-яку з SEQ ID NO:22, 326, 327 і 328.
6. Антитіло або його антигензв’язувальна частина за п. 1, де антитіло вибране з групи, яка складається з:
a) антитіла або його антигензв’язувальної частини, які містять домен VH, як вказано у SEQ ID NO:13, і домен VL, як вказано у SEQ ID NO:22;
b) антитіла або його антигензв’язувальної частини, які містять домен VH, як вказано у SEQ ID NO:320, і домен VL, як вказано у SEQ ID NO:326;
c) антитіла або його антигензв’язувальної частини, які містять домен VH, як вказано у SEQ ID NO:321, і домен VL, як вказано у SEQ ID NO:327; і
d) антитіла або його антигензв’язувальної частини, які містять домен VH, як вказано у SEQ ID NO:322, і домен VL, як вказано у SEQ ID NO:328.
7. Антитіло або його антигензв’язувальна частина за п. 6, що містять домен VH, як вказано у SEQ ID NO:321, і домен VL, як вказано у SEQ ID NO:327.
8. Антитіло за будь-яким з пп. 1-7, яке являє собою молекулу IgG, IgM, IgE, IgA або IgD, або одержане з них.
9. Антитіло за п. 8, де IgG являє собою IgG1, де константна ділянка важкого ланцюга містить SEQ ID NO:344, і де константна ділянка легкого ланцюга містить SEQ ID NO:345, за умови, що С-кінцевий залишок лізину з SEQ ID NO:344 необов'язково відщеплений.
10. Фармацевтична композиція, що містить антитіло або антигензв’язувальну частину за пп. 1-9 і фармацевтично прийнятний носій.
11. Антитіло за п. 1, що містить амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, для якої використовується ген сімейства VH-3 людини.
12. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка містить:
а) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг антитіла за будь-яким з пп. 1-9 і 11, де вказаний важкий ланцюг, будучи скомбінованим з легким ланцюгом вказаного антитіла, утворює антитіло, що специфічно зв’язується з Р-кадгерином; або
b) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує легкий ланцюг антитіла за будь-яким з пп. 1-9 і 11, де вказаний легкий ланцюг, будучи скомбінованим з важким ланцюгом вказаного антитіла, утворює антитіло, що специфічно зв’язується з Р-кадгерином.
13. Виділена молекула нуклеїнової кислоти за п. 12, що має нуклеотидну послідовність, як вказано у будь-якій з SEQ ID NO:80, 89, 332, 333, 334, 338, 339 і 340.
Текст
1. Виділене антитіло або його антигензв’язувальна частина, які зв’язуються з Ркадгерином з КD 50 нМ або менше і містять домен VH і домен VL, де домен VH містить: a) CDR1 VH, як вказано у SEQ ID NO:24; b) CDR2 VH, як вказано у SEQ ID NO:25; і с) CDR3 VH, як вказано у будь-якій з SEQ ID NO:26-37 і 91-256; і де домен VL містить: d) CDR1 VL, як вказано у SEQ ID NO:38; e) CDR2 VL, як вказано у SEQ ID NO:39; і f) CDR3 VL, як вказано у будь-якій з SEQ ID NO:4047 і 257-319. 2. Антитіло або його антигензв’язувальна частина за п. 1, де домен VH містить послідовність, як вказано у будь-якій з SEQ ID NO:1-13 і 320-325, і де домен VL містить послідовність, як вказано у будьякій з SEQ ID NO:14-23 і 326-331. 2 (19) 1 3 95775 4 для якої використовується ген сімейства VH-3 людини. 12. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка містить: а) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг антитіла за будь-яким з пп. 1-9 і 11, де вказаний важкий ланцюг, будучи скомбінованим з легким ланцюгом вказаного антитіла, утворює антитіло, що специфічно зв’язується з Ркадгерином; або b) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує легкий ланцюг антитіла за будь-яким з пп. 1-9 і 11, де вказаний легкий ланцюг, будучи скомбінованим з важким ланцюгом вказаного антитіла, утворює антитіло, що специфічно зв’язується з Ркадгерином. 13. Виділена молекула нуклеїнової кислоти за п. 12, що має нуклеотидну послідовність, як вказано у будь-якій з SEQ ID NO:80, 89, 332, 333, 334, 338, 339 і 340. За даною заявкою заявляється пріоритет попередньої заявки США №60/675311, зареєстрованої 26 квітня 2005 року, яка наведена тут у повному об'ємі шляхом посилання. Даний винахід стосується антитіл і їх антигензв'язувальних частин, які зв'язують Р-кадгерин. Також винахід стосується молекул нуклеїнових кислот, що кодують такі антитіла і антигензв'язувальні частини, способів одержання антитіл і антигензв'язувальних частин проти Р-кадгерину, композицій, що містять такі антитіла і антигензв'язувальні частини, і способів використання антитіл, антигензв'язувальних частин і композицій. Кадгерини являють собою суперсімейство трансмембранних глікопротеїнів, що регулюють міжклітинну адгезію у ході розвитку і підтримки гомеостазу тканин (Gumbiner J. Cell. Biol., 148:399404 (2000); Yagi, et al., Genes Dev., 14:1169-1180 (2000)). Внутрішньоклітинні домени кадгерину взаємодіють з цитоплазматичними білками, такими як катеніни і р120, які формують основу прикріплення кадгерину до актинового цитоскелету. Кадгерини мають п'ять позаклітинних доменів, що зв'язують 2+ Са , і невеликий цитоплазматичний домен, який є високо консервативним серед класичних кадгеринів. Члени сімейства класичних кадгеринів включають Р-кадгерин, Е-кадгерин і N-кадгерин. Вважають, що молекули клітинної адгезії, такі як кадгерини, грають важливу роль у клітинних контактах ракових і метастатичних клітин (Furukawa, et al., Microscopy Res.Technique38 (4):343-352 (1997)). Експресія Р-кадгерину у звичайних дорослих тканинах є низькою і, в основному, обмежується міоепітеліальними клітинами і базальними шарами багатошарового епітелію (Shimoyama, et al., Cancer Res. 49:2128-33 (1989)). Експресія Ркадгерину підвищується при запальних захворюваннях кишечнику, таких як хвороба Крона і коліт (Hardy, et al., Gut 50:513-519 (2002)). У наш час значна сукупність даних також свідчить, що порушена експресія Р-кадгерину пов'язана з клітинною проліферацією і з пухлинами товстої кишки, молочної залози, легенів, щитовидної залози і шийки матки (Gamallo, Modern Pathology, 14:650-654, (2001); і Stefansson, et al., J. Clin. Oncol. 22(7):1242 1252 (2004)). Було описано, що Р-кадгерин людини являє собою антиген, розпізнаваний моноклональним антитілом NCC-CAD-299, яке утворюється проти плоскоклітинного раку жіночих зовнішніх статевих органів (Shimoyama, et al., Cancer Res., 49:2128-2133 (1989)). Припускають, що регуляція опосередковуваної Р-кадгерином адгезії і внутрішньоклітинної передачі сигналів приводить до зниженої проліферації і виживання пухлинних клітин in vivo. Відповідно, у зв'язку з центральною роллю, яку Р-кадгерин, очевидно, грає у клітинній проліферації і розвитку солідної пухлини, бажано одержати антитіла проти Р-кадгерину, які здатні забезпечити сприятливий терапевтичний вплив на пацієнтів з різними видами раку. В одному з аспектів даний винахід стосується антитіла проти Р-кадгерину або його антигензв'язу вальної частини, де антитіло або його антигензв'язувальна частина володіють принаймні однією з декількох функціональних властивостей, як описано нижче в А)-K). А) Наприклад, в одному з варіантів здійснення антитіла або їх антигензв'язувальна частина володіють більш високою афінністю зв'язування Ркадгерину (KD(P)), ніж Е-кадгерину (KD(E)). В одному з варіантів здійснення антитіла або їх антигензв'язувальна частина за даним винаходом мають величину KD(E)/KD(P), що перевищує або дорівнює 1,5. В іншому варіанті здійснення антитіла або їх антигензв'язувальна частина за даним винаходом мають величину KD(E)/KD(P), що перевищує або дорівнює 2, що перевищує або дорівнює 3, що перевищує або дорівнює 5, що перевищує або дорівнює 10, що перевищує або дорівнює 20, що перевищує або дорівнює 50, що перевищує або дорівнює 100, що перевищує або дорівнює 200, що перевищує або дорівнює 500, або, що перевищує або дорівнює 1000. Як правило, верхньої межі для KD(E)/KD(P) не існує, оскільки величина KD(E) може бути дуже невеликою, наприклад, 0. Однак, у практичних цілях верхня межа для величини KD(E)/KD(P) може становити 1×10. Такі величини Ко для Р-кадгерину і для Е-кадгерину можна вимірювати будь-яким способом, відомим фахівцям у даній галузі, наприклад, за допомогою ELISA, RIA, 5 проточної цитометрії або поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, BIACORE™. B) В іншому варіанті здійснення антитіло або його частина зв'язують Р-кадгерин з величиною KD 1000 нМ або менше, як виміряно поверхневим плазмонним резонансом. В іншому варіанті здійснення антитіло або ділянка зв'язують Р-кадгерин з величиною KD, що складає менш ніж 500 нМ, менш ніж 100 нМ, менш ніж 50 нМ, менш ніж 20 нМ, менш ніж 10 нМ, менш ніж 1 нМ, менш ніж 500 пМ або менш ніж 100 пМ, як виміряно поверхневим плазмонним резонансом. Як правило, нижньої межі для величини KD не існує. Однак, у практичних цілях нижню межу можна передбачити такою, що дорівнює приблизно іпМ. C) В іншому варіанті здійснення антитіло або його частина мають швидкість зворотної реакції (kзвор.) для Р-кадгерину, що складає менш ніж або -1 дорівнює 0,01 секунда , як виміряно поверхневим плазмонним резонансом. Наприклад, у деяких варіантах здійснення антитіло або частина мають величину kзвор. для Р-кадгерину, що складає менш -1 -1 ніж 0,005 секунда , менш ніж 0,004 секунда , -1 -1 менш ніж 0,003 секунда , менш ніж 0,002 секунда -1 або менш ніж 0,001 секунда . Як правило, нижньої межі для величини kзвор. не існує. Однак, у практичних цілях нижню межу можна передбачити такою, -7 -1 що дорівнює приблизно 1×10 секунда . D) В іншому варіанті здійснення антитіло проти Р-кадгерину або його частина володіють величиною ІС50 100 нМ або менше, як виміряно за допомогою аналізу залежної від Р-кадгерину адгезії клітин. В іншому варіанті здійснення вказана ІС50 складає менш ніж 50 нМ, менш ніж 40 нМ, менш ніж 20 нМ, менш ніж 10 нМ, менш ніж 1 нМ, менш ніж 500 пМ, менш ніж 200 пМ, менш ніж 100 пМ або менш ніж 10 пМ, як виміряно за допомогою аналізу залежної від Р-кадгерину адгезії клітин. Як правило, нижньої межі для величини ІС50, як виміряно за допомогою аналізу залежної від Ркадгерину адгезії клітин, не існує. Однак, у практичних цілях нижню межу можна передбачити такою, що дорівнює приблизно 1 пМ. E) В іншому варіанті здійснення антитіло проти Р-кадгерину або його частина володіють величиною ІС50 100 нМ або менше, як виміряно за допомогою аналізу залежної від Р-кадгерину агрегації клітин. В іншому варіанті здійснення вказана ІС50 складає менш ніж 50 нМ, менш ніж 40 нМ, менш ніж 20 нМ, менш ніж 10 нМ, менш ніж 1 нМ, менш ніж 500 пМ, менш ніж 200 пМ, менш ніж 100 пМ або менш ніж 1 пМ, як виміряно за допомогою аналізу залежної від Р-кадгерину агрегації клітин. Як правило, нижньої межі для величини ІС50, як виміряно за допомогою аналізу залежної від Ркадгерину агрегації клітин, не існує. Однак, у практичних цілях нижню межу можна передбачити такою, що дорівнює приблизно 1 пМ. F) В іншому варіанті здійснення антитіло проти Р-кадгерину або його частина підвищують розпад шароподібного утворення у 2 рази або більше в аналізі розпаду шароподібного утворення, що залежить від Р-кадгерину, при порівнянні з контрольним зразком без наявності IgG. В іншому варіанті здійснення антитіло проти Р-кадгерину або його 95775 6 частина підвищують розпад шароподібного утворення в аналізі розпаду шароподібного утворення, що залежить від Р-кадгерину, принаймні у 3, принаймні у 4, принаймні у 6, принаймні у 10 або принаймні у 15 разів у порівнянні з контрольним зразком без наявності IgG. G) В іншому варіанті здійснення антитіло проти Р-кадгерину або його частина конкурують за зв'язування Р-кадгерину з антитілом, вибраним з групи, яка складається з 194-е06; 194-а02; 194b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194e01; g-194-e06; 129-1c4; і g-129-1c4. H) В іншому варіанті здійснення антитіло проти Р-кадгерину або його частина перехресно конкурують за зв'язування Р-кадгерину з антитілом, вибраним з групи, яка складається з 194-е06; 194а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g194-e01; g-194-e06,129-1c4; і g-129-1c4. І) В іншому варіанті здійснення антитіло проти Р-кадгерину або його частина зв'язуються з тим же епітопом Р-кадгерину, що і антитіло, вибране з групи, яка складається з 194-е06; 194-а02; 194b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194e01; g-194-e06; 129-1c4; і g-129-1c4. J) В іншому варіанті здійснення антитіло проти Р-кадгерину або його частина зв'язуються з Ркадгерином практично з тією ж величиною KD, що і антитіло, вибране з групи, яка складається з 194е06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; і g-129-1c4. K) В іншому варіанті здійснення антитіло проти Р-кадгерину або його частина зв'язуються з Ркадгерином практично з тією ж величиною kзвор., що і антитіло, вибране з групи, яка складається з 194-е06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; і g-1291c4. В іншому аспекті даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, що володіють принаймні однією з описаних раніше в А)-K) функціональних властивостей, містять домен VH, амінокислотна послідовність якого принаймні на 90 % співпадає з будь-якою з SEQ ID №№:1-13 і 320-325. В одному з варіантів здійснення амінокислотна послідовність вказаного домену VH співпадає принаймні на 91 %, принаймні на 93 %, принаймні на 95 %, принаймні на 97 %, принаймні на 99 % або 100 % з будь-якою з SEQ ID №№:1-12 і 320-325. В іншому варіанті здійснення антитіло або його частина володіють принаймні однією з описаних раніше в А)-K) функціональних властивостей, містять домен VH, який являє собою будь-яку з SEQ ID №№:1-13 і 320-325 або відрізняється від будьякої з SEQ ID №№:1-13 і 320-325 наявністю при 7 наймні однієї консервативної амінокислотної заміни. Наприклад, домен VH може відрізнятися від будь-якої з SEQ ID №№; 1-13 і 320-325 на 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 консервативних амінокислотних замін. В іншому варіанті здійснення будь-яка з цих консервативних амінокислотних замін може відбуватися в областях CDR1,CDR2 і/або CDR3. В іншому аспекті даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, що володіють принаймні однією з описаних раніше в А)-К) функціональних властивостей, містять домен VL, амінокислотна послідовність якого принаймні на 90 % співпадає з будь-якою з SEQ ID №№: 1423 і 326-331. В одному з варіантів здійснення амінокислотна послідовність вказаного домену VL співпадає принаймні на 91 %, принаймні на 93 %, принаймні на 95 %, принаймні на 97 %, принаймні на 99 % або 100 % з будь-якою з SEQ ID №№: 1423 і 326-331. В іншому варіанті здійснення антитіло або його частина володіють принаймні однією з описаних раніше в А)-K) функціональних властивостей і містять домен VL, який являє собою будь-яку з SEQ ID №№: 14-23 і 326-331 або відрізняється від будьякої з SEQ ID №№; 14-23 і 326-331 наявністю принаймні однієї консервативної амінокислотної заміни. Наприклад, домен VL може відрізнятися від будь-якої з SEQ ID №№:14-23 і 326-331 на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 консервативних амінокислотних замін. В іншому варіанті здійснення будь-яка з цих консервативних амінокислотних замін може відбуватися в областях CDR1, CDR2 і/або CDR3. В іншому аспекті даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, що володіє принаймні однією з описаних раніше в А)К) функціональних властивостей, де амінокислотна послідовність доменів VL і VH принаймні на 90 % співпадає з доменами VL і VH, відповідно, будьякого з антитіл 194-е06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-01 196-d10; 196-g03; 196е06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; і g-129-1c4. Наприклад, амінокислотна послідовність кожного з доменів VL і VH принаймні на 91 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % або 100 % співпадає з доменами VL і VH, відповідно, будь-якого з антитіл 194-е06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; i g-129-1c4. В іншому аспекті даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, які вибирають з групи, що складається з а) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №: 1, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:14; b) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:2, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:14; с) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:2, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:15; d) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:3, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:16; є) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:4, і домен VL, як 95775 8 вказано у SEQ ID №:17; f) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:4, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:23; g) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:5, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:18; h) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:6, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:23; і) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:7, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:23; j) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:8, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:23; k) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:9, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:23; l) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:10, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:19; m) антитіла або його ділянки, що містить домен V H, як вказано у SEQ ID №:11, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:20; n) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:12, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:21; о) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:13, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:22; р) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:320, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:326; q) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:321, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:327; r) антитіла або його ділянки, що містить домен V H, як вказано у SEQ ID №:322, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:328; s) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:323, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:329; t) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:324, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:ЗЗО; і u) антитіла або його ділянки, що містить домен VH, як вказано у SEQ ID №:325, і домен VL, як вказано у SEQ ID №:331. В іншому варіанті здійснення у випадку будьякого з антитіл або їх частин, описаних вище у групах а)-u), домени VH і/або VL можуть відрізнятися від конкретних вказаних у даній заявці SEQ ID №№ принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну. Наприклад, домени VH і/або VL можуть відрізнятися від вказаної SEQ ID № на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 консервативних амінокислотних замін. В іншому варіанті здійснення будь-яка з цих консервативних амінокислотних замін може відбуватися в областях CDR1,CDR2 і/або CDR3. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, що володіють принаймні однією з описаних раніше в А)-K) функціональних властивостей, містять домен VH, який незалежно вибирають з будь-якої з SEQ ID №№:1-13 і 320-325 або послідовності, відмінної від будь-якої з SEQ ID №№:113 і 320-325 принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну, і додатково містять домен V L, який незалежно вибирають з будь-якої з SEQ ID №№: 14-23 і 326-331, або послідовності, відмінної від будь-якої з SEQ ID №№: 14-23 і 326-331 принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну. Наприклад, кожний з доменів VH і VL може незалежно відрізнятися від будь-якої з SEQ ID 9 №№:1-13, 320-325, 14-23 і 326-331 на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 консервативних амінокислотних замін. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, що володіють принаймні однією з описаних раніше в А)-K) функціональних властивостей, де вказане антитіло або ділянка містять CDR3 VH, вибраний з будь-якої з SEQ ID №№:26-37 і 91-256 або послідовності, відмінної від будь-якої з SEQ ID №№:26-37 і 91-256 принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну. Наприклад, CDR3 VH може відрізнятися від будь-якої з SEQ ID №№:2637 і 91-256 на 1,2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, що володіють принаймні однією з описаних раніше в А)-K) функціональних властивостей, де вказане антитіло або антигензв'язувальна частина містять CDR3 VL, вибраний з будь-якої з SEQ ID №№:40-47 і 257-319 або послідовності, відмінної від будь-якої з SEQ ID №№:40-47 і 257-319 принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну. Наприклад, CDR3 VL може відрізнятися від будь-якої з SEQ ID №№:40-47 і 257-319 на 1, 2, 3, 4 або 5 консервативних амінокислотних замін. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, де вказане антитіло або антигензв'язувальна частина містять: CDR1 VH, як вказано у SEQ ID №:24, або послідовність, відмінну від SEQ ID №:24 принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну; CDR2VH, як вказано у SEQ ID №:25, або послідовність, відмінну від SEQ ID №:25 принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну; і CDR3 VH, що незалежно вибирають з будьякої з SEQ ID №№:26-37 і 91-256, або з послідовності, відмінної від будь-якої з SEQ ID №№:26-37 і 91-256 принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну. Наприклад, кожна з вказаних вище послідовностей CDR1, CDR2 і CDR3 VH може незалежно відрізнятися від відповідних вказаних SEQ ID №№ на 1, 2, 3, 4 або 5 консервативних амінокислотних замін. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, де вказане антитіло або антигензв'язувальна частина містять: CDR1 VL, як вказано у SEQ ID №:38, або послідовність, відмінну від SEQ ID №:38 принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну; CDR2 VL, як вказано у SEQ ID №:39, або послідовність, відмінну від SEQ ID №:39 принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну; і CDR3 VL, що незалежно вибирають з будьякої з SEQ ID №№:40-47 і 257-319, або з послідовності, відмінної від будь-якої з SEQ ID №№:40-47 і 257-319 принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну. Наприклад, кожна з вказаних вище послідовностей CDR1,CDR2 і CDR3 VL може незалежно відрізнятися від відповідних вказаних SEQ ID №№ на 1 ,2, 3, 4 або 5 консервативних амінокислотних замін. Крім того, даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, де вказане 95775 10 антитіло або антигензв'язувальна частина містять: CDR1 VH, як вказано у SEQ ID №:24; CDR2 VH, як вказано у SEQ ID №:25; CDR3 VH, вибраний з будь-якої з SEQ ID №№:26-37 і 91-256; CDR1 VL, як вказано у SEQ ID №:38; CDR2VL, як вказано у SEQ ID №:39: і CDR3 VL, вибраний з будь-якої з SEQ ID №№:40-47 і 257-319. В іншому варіанті здійснення кожна з вказаних послідовностей CDR1, CDR2 і CDR3 VH і VL може незалежно відрізнятися від конкретних вказаних вище SEQ ID №№ принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну. Наприклад, кожна з послідовностей CDR1,CDR2 і CDR3 може незалежно відрізнятися від відповідних конкретних SEQ ID №№, вказаних вище, на 1, 2, 3, 4 або 5 консервативних амінокислотних замін. Крім того, даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, де вказане антитіло або антигензв'язувальна частина містять CDR1 VH і VL, CDR2VH і VL і CDR3 VH і VL, як зустрічається у будь-якому з антитіл 194-е06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194e01; g-194-e06; 129-1c4; i g-129-1c4. Крім того, даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, що містять домен VH, який вибирають з будь-якої з SEQ ID №№:1-13 і 320-325 або який відрізняється від будь-якої з SEQ ID №№:1-13 і 320-325 на 1-10 консервативних амінокислотних замін. Крім того, даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, що містять домен VL, який вибирають з будь-якої з SEQ ID №№: 14-23 і 326-331 або який відрізняється від будь-якої з SEQ ID №№: 14-23 і 326-331 на 1-10 консервативних амінокислотних замін. Крім того, даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, що містять домен VH, який незалежно вибирають з будь-якої з SEQ ID №№:1-13 і 320-325 або послідовності, відмінної від будь-якої з SEQ ID №№:1-13 і 320-325 на 1-10 консервативних амінокислотних замін, і додатково містять домен Vl, який незалежно вибирають з будь-якої з SEQ ID №№:14-23 і 326-331 або послідовності, відмінної від будь-якої з SEQ ID №№: 14-23 і 326-331 на 1-10 консервативних амінокислотних замін. Крім того, даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, де вказане антитіло або антигензв'язувальна частина містять: CDR1VH, як вказано у SEQ ID №:24, або послідовність, відмінну від SEQ ID №:24 на 1-4 консервативних амінокислотних заміни; CDR2 VH, як вказано у SEQ ID №:25, або послідовність, відмінну від SEQ ID №:25 на 1-4 консервативних амінокислотних заміни; і CDR3 VH, що вибирають з будь-якої з SEQ ID №№:26-37 і 91-256, або з послідовності, відмінної від будь-якої з SEQ ID №№:26-37 і 91256 на 1-4 консервативних амінокислотних заміни. Крім того, даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, де вказане антитіло або антигензв'язувальна частина містять: CDR1Vl, як вказано у SEQ ID №:38, або послідовність, відмінну від SEQ ID №:38 на 1-4 консервати 11 вних амінокислотних заміни; CDR2VL, як вказано у SEQ ID №:39, або послідовність, відмінну від SEQ ID №:39 на 1-4 консервативних амінокислотних заміни; і CDR3 VL, що вибирають з будь-якої з SEQ ID №№:40-47 і 257-319, або з послідовності, відмінної від будь-якої з SEQ ID №№:40-47 і 257-319 на 1-4 консервативних амінокислотних заміни. Крім того, даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, що володіють принаймні однією з описаних раніше в А)-K) функціональних властивостей, де вказане антитіло або антигензв'язувальна частина містять: FR1 VH, як вказано у SEQ ID №:48; FR2 VH, як вказано у SEQ ID №:49; FR3 VH, вибраний з будь-якої з SEQ ID №№:50-55; FR4 VH, вибраний з будь-якої з SEQ ID №№:56 і 57; FR1 VL, вибраний з будь-якої з SEQ ID №№:58 і 59; FR2VL, вибраний з будь-якої з SEQ ID №№:60-62; FR3 VL, вибраний з будь-якої з SEQ ID №№:63-66; і FR4 VL, як вказано у SEQ ID №:67. В іншому варіанті здійснення кожна з вказаних послідовностей FR1,FR2,FR3 і FR4 VH і VL може також незалежно відрізнятися від конкретних вказаних вище SEQ ID №№ принаймні на одну консервативну амінокислотну заміну. Наприклад, кожна з послідовностей FR1,FR2,FR3 і FR4 може незалежно відрізнятися від відповідних конкретних SEQ ID №№, вказаних вище, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 консервативних амінокислотних замін. У ще одному варіанті здійснення будь-яку з послідовностей FR1,FR2,FR3 і FR4 можна піддавати мутації для співпадання з відповідною послідовністю каркасної області зародкової лінії. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується будь-якого з описаних у даній заявці антитіл, де антитіло являє собою молекулу IgG, IgM, IgE, IgA або IgD або одержане з них. Наприклад, антитіло може являти собою IgG1 або IgG2. Наприклад, в одному з варіантів здійснення IgG являє собою IgG1, де константна область важкого ланцюга містить SEQ ID №:344 і де константна область легкого ланцюга містить SEQ ID №:345, за умови, що С-кінцевий залишок лізину з SEQ ID №:344, необов'язково, розщеплений. Інший варіант здійснення стосується будь-яких описаних вище антитіл або антигензв'язу вальних частин, що являють собою фрагмент Fab, фрагмент F(ab')2, фрагмент Fv, одноланцюжковий фрагмент Fv, одноланцюжковий фрагмент VH, одноланцюжковий фрагмент VL, гуманізоване антитіло, химерне антитіло або біспецифічне антитіло. Інший варіант здійснення стосується дериватизованого антитіла або антигензв'язувальної частини, що містять будь-яке з антитіл або їх частин, як описано у даній заявці, і принаймні одну додаткову молекулу. Наприклад, принаймні одна додаткова молекула може являти собою інше антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло або димер), засіб для реєстрації, мітку, цитотоксичний засіб, фармацевтичний засіб і/або білок, або пептид, які здатні опосередковувати зв'язок антитіла або ділянки антитіла з іншою молекулою (такою як внутрішня область стрептавідину або полігістидинова мітка). Наприклад, ефективні засоби для реєстрації, за допомогою яких можна дериватизувати антитіло або антигензв'язувальну частину за винахо 95775 12 дом, включають флуоресцентні сполуки, у тому числі флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, хлорид 5-диметиламін-1нафталінсульфонілу, фікоеритрин, лантанідні люмінофори і т.п. Також антитіло можна мітити ефективними для реєстрації ферментами, такими як пероксидаза хрону, β-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза, глюкозоксидаза і т.п. В іншому варіанті здійснення антитіла або їх ділянки за даним винаходом можна також мітити біотином або заздалегідь заданим поліпептидним епітопом, розпізнаваним вторинним репортером (наприклад, парні послідовності лейцинових застібок, ділянки зв'язування для вторинних антитіл, домени зв'язування металів, епітопні мітки). У ще одному варіанті здійснення даного винаходу будь-які з антитіл або їх частин також можна дериватизувати хімічною групою, такою як поліетиленгліколь (PEG), метильною або етильною групою, або вуглецевою групою. У деяких варіантах здійснення описані у даній заявці антитіла або антигензв'язувальні частини проти Р-кадгерину прикріпляють до твердого носія. У деяких варіантах здійснення розщеплюють С-кінцевий лізин важкого ланцюга з будь-якого антитіла проти Р-кадгерину за винаходом. У різних варіантах здійснення винаходу важкі і легкі ланцюги антитіл проти Р-кадгерину можуть, необов'язково, містити N-кінцеву сигнальну послідовність. Наприклад, сигнальна послідовність важкого ланцюга може являти собою SEQ ID №:346, а сигнальна послідовність легкого ланцюга може являти собою SEQ ID №:347. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується будь-якого з антитіл або їх антигензв'язувальних частин, як описано у даній заявці, де антитіла або їх антигензв'язувальні частини належать людині. Також даний винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить будь-яке з антитіл або їх антигензв'язувальних частин, як описано вище, і фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті здійснення винахід стосується молекули виділеної нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує будьяке з антитіл або їх антигензв'язувальних частин, як описано у даній заявці. Один з конкретних варіантів здійснення стосується молекули виділеної нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, як вказано у будь-якій з SEQ ID №№:68-90 і 332-343. Крім того, винахід стосується вектора, що містить будь-яку з описаних у даній заявці молекул нуклеїнових кислот, де вектор, необов'язково, містить послідовність, що контролює експресію, яка функціонально пов'язана з молекулою нуклеїнової кислоти. Інший варіант здійснення стосується клітинихазяїна, що містить будь-який з описаних у даній заявці векторів або містить будь-яку з описаних у даній заявці молекул нуклеїнових кислот. Також даний винахід стосується окремої лінії клітин, що продукують будь-яке з антитіл або антигензв'язувальних частин, як описано у даній заявці, або продукують важкий ланцюг або легкий ланцюг яко 13 го-небудь з вказаних антитіл або вказаних антигензв'язувальних частин. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу одержання антитіла проти Ркадгерину або його антигензв'язувальної частини, де спосіб включає культивування у прийнятних умовах будь-яких описаних у даній заявці клітинхазяїнів або клітинних ліній і виділення вказаного антитіла або антигензв'язувальної ділянки. Також даний винахід стосується трансгенної тварини, яка не є людиною, або трансгенної рослини, що містить будь-яку з описаних у даній заявці нуклеїнових кислот, де трансгенна тварина, яка не є людиною, або трансгенна рослина експресує вказану нуклеїнову кислоту. Крім того, даний винахід стосується способу виділення антитіла або його антигензв'язувальної ділянки, які зв'язуються з Р-кадгерином, де спосіб включає стадію виділення антитіла з трансгенної тварини, яка не є людиною, або трансгенної рослини, як описано у даній заявці. Також даний винахід стосується способу лікування патологічного росту клітин у ссавця за необхідності цього, де спосіб включає стадію введення вказаному ссавцеві будь-якого з антитіл або їх антигензв'язувальних частин, або будь-якої з фармацевтичних композицій, як описано у даній заявці. Крім того, даний винахід стосується способу лікування патологічного росту клітин у ссавця за необхідності цього за допомогою антитіла або його антигензв'язувальної ділянки, що зв'язується з Ркадгерином, де спосіб включає стадії введення вказаному ссавцеві ефективної кількості будь-якої з описаних у даній заявці молекул нуклеїнових кислот у прийнятних умовах, що дозволяють експресію вказаних молекул нуклеїнових кислот. В іншому варіанті здійснення спосіб лікування патологічного росту клітин додатково включає введення визначеної кількості однієї або декількох речовин, вибраних з протипухлинних засобів, протиангіогенних засобів, інгібіторів передачі сигналів і антипроліферативних засобів, де ці кількості разом ефективні у лікуванні вказаного патологічного росту клітин. У конкретних варіантах здійснення вказаний патологічний ріст клітин є раковим. Крім того, даний винахід стосується способу зниження залежної від Р-кадгерину агрегації клітин, де спосіб включає контактування клітин з будь-яким з описаних у даній заявці антитіл або їх антигензв'язу вальних частин або з будь-якою з описаних у даній заявці фармацевтичних композицій. В іншому аспекті даний винахід стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини, що містить амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, для якої використовується ген сімейства VH-3 людини. Наприклад, в одному з варіантів здійснення ген сімейства VH-3 людини являє собою VH-3-23. В іншому аспекті даний винахід стосується будь-якого з антитіл або їх антигензв'язу вальних частин, як описано у даній заявці, де вказане антитіло або антигензв'язувальна частина являє собою антитіло людини. В іншому аспекті вказане 95775 14 антитіло або антигензв'язувальна частина являють собою рекомбінантне антитіло людини. Також винахід стосується способу одержання антитіла проти Р-кадгерину або його антигензв'язувальної частини, де спосіб включає стадії синтезу фагової бібліотеки антитіл людини, скринінгу бібліотеки за допомогою Р-кадгерину або його антигенної частини, виділення фагу, що зв'язує Ркадгерин, і одержання антитіла з фагу. ВИЗНАЧЕННЯ І ЗАГАЛЬНІ СПОСОБИ Доки у даній заявці не вказано інакше, наукові і технічні терміни, що використовуються у зв'язку з даним винаходом, мають значення, які звичайно мають на увазі фахівці у даній галузі. Крім того, доки по контексту не потрібно інакше, терміни в однині включають в себе множину, а терміни у множині включають в себе однину. Загалом, номенклатура, що використовується у межах опису і використовується при описі у даній заявці способів культивування клітин і тканин, молекулярної біології, імунології, мікробіології, генетики і хімії білків та нуклеїнових кислот, а також гібридизації є такою, що добре відома і звичайно використовується у даній галузі. Як правило, способи і процедури за даним винаходом здійснюють відповідно до загальноприйнятих способів, добре відомих у даній галузі, і як описано у різних загальних і більш конкретних посиланнях, процитованих і вказаних протягом усього даного опису, доти, доки не вказано інакше. Див., наприклад, Sambrook, et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory.Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); і Coligan, et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003), описи яких наведені тут повністю за допомогою посилання. Ферментативні реакції і способи очищення здійснюють відповідно до вказівок виробника, як звичайно виконують у даній галузі або як описано у даній заявці. Номенклатура, що використовується у межах опису і використовується при описі у даній заявці лабораторних процедур і способів аналітичної хімії, хімії органічного синтезу і медичної, і фармацевтичної хімії є такою, яка добре відома і звичайно використовуються у даній галузі. Для хімічного синтезу, хімічного аналізу, фармацевтичного препарату, складу, доставки, а також лікування пацієнтів використовують загальноприйняті способи. Відомо, що основна структурна одиниця антитіла містить тетрамер. Кожний тетрамер складається з двох однакових пар поліпептидних ланцюгів, де кожна пара має один "легкий" (приблизно 25 кДа) і один "важкий" ланцюг (приблизно 50-70 кДа). Амінокінцева ділянка кожного ланцюга містить варіабельну область приблизно від 100 до 120 або більше амінокислот, яка, в основному, відповідальна за розпізнавання антигену. Карбоксикінцева ділянка кожного ланцюга визначає константну область, яка, в основному, від 15 повідальна за ефекторну функцію. Легкі ланцюги, що є людськими, поділяють на легкі ланцюги каппа і лямбда. Важкі ланцюги поділяють на мю, дельта, гамма, альфа або епсилон, і вони визначають ізотип антитіла як IgM, IgD, IgG, IgA і IgE, відповідно. У легких і важких ланцюгах варіабельна і константна області з'єднані за допомогою ділянки "J", що складається приблизно з 12 або більше амінокислот, де важкий ланцюг також включає ділянку "D" приблизно з 3 або більше амінокислот. Загалом, див. Fundamental Immunology.Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed.Raven Press, N.Y. (1989)) (наведено тут повністю шляхом посилання для всіх цілей). Варіабельні області кожної пари важкий/легкий ланцюги (VH і VL) формують ділянку зв'язування антитіла. Таким чином, наприклад, ціле антитіло IgG має дві ділянки зв'язування. За винятком біфункціональних або біспецифічних антитіл, дві ділянки зв'язування є однаковими. Варіабельні області важкого і легкого ланцюгів володіють однаковою загальною структурою з відносно консервативних каркасних областей (FR), з'єднаних трьома гіперваріабельними ділянками, які також називають ділянками, що визначають комплементарність, або CDR. Термін "варіабельний" стосується того факту, що серед антитіл послідовність визначених ділянок варіабельних доменів значною мірою відрізняється, і вони використовуються для зв'язування і специфічності кожного конкретного антитіла відносно його конкретного антигену. Однак, варіабельність розподілена серед варіабельних доменів антитіл нерівномірно, а сконцентрована у CDR, які розділені більш високо консервативними FR.CDR з двох ланцюгів кожної пари вирівняні за допомогою FR, що дозволяє зв'язуватися з конкретним епітопом. З N-кінця у напрямі до С-кінця і легкий, і важкий ланцюги містять домени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. Співвіднесення амінокислот з кожним доменом відбувається відповідно до визначень Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987and1991)) або Chothia & Lesk J., Моl. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia, et al., Nature 342:878-883 (1989), описи яких наведені тут повністю шляхом посилання. Доки не вказано інакше, наведені нижче терміни потрібно розуміти як такі, що володіють наступними значеннями: Доки конкретно не вказано інакше, термін "Ркадгерин" стосується Р-кадгерину людини, який являє собою інтегральний білок мембрани і є членом класичного кадгеринового сімейства трансмембранних глікопротеїнів, що регулюють міжклітинну адгезію. Клонування і секвенування Ркадгерину людини було описано, наприклад, Shimoyama, et al., J.Cell Biol.109 (4 Pt 1), 1787-1794 (1989), опис якого наведений тут повністю шляхом посилання. Мають на увазі, що термін "Ркадгерин" включає рекомбінантний Р-кадгерин людини і рекомбінантні химерні форми Ркадгерину, які можна одержувати загальноприйнятими способами рекомбінантної експресії або купувати комерційно доступні (R&D Systems861-PC100). 95775 16 У межах даної заявки, доки конкретно не вказано інакше, термін "Е-кадгерин" стосується Екадгерину людини, який являє собою інтегральний білок мембрани і є членом класичного кадгеринового сімейства трансмембранних глікопротеїнів, що регулюють міжклітинну адгезію. Е-кадгерин описаний, наприклад, у Takeichi, Science, 251:1451-1455 (1991), опис якого наведений тут повністю шляхом посилання. Мають на увазі, що термін "Е-кадгерин" включає рекомбінантний Екадгерин людини і рекомбінантні химерні форми Е-кадгерину, які можна одержувати загальноприйнятими способами рекомбінантної експресії або купувати комерційно доступні (R&D648-EC-100). Термін "поліпептид" включає природні або штучні білки, фрагменти білків і поліпептидні аналоги білкової послідовності. Поліпептид може бути мономерним або полімерним. Термін "виділений білок", "виділений поліпептид" або "виділене антитіло" стосується білка, поліпептиду або антитіла, яке внаслідок свого походження або джерела одержання (1) не зв'язане з природно з'єднаними з ним компонентами, які супроводжують його в його природному стані, (2) вільне від інших білків з того ж виду, (3) експресується клітиною з іншого виду або (4) не зустрічається у природі. Таким чином, поліпептид, що синтезується хімічно або синтезується у клітинній системі, відмінній від клітини, з якої він походить у природних умовах, "відділяють" від природно зв'язаних з ним компонентів. Також білок можна одержувати у вигляді такого, що практично не містить природно зв'язаних компонентів за допомогою виділення з використанням добре відомих у даній галузі способів очищення білків. Приклади виділених антитіл включають антитіло проти Р-кадгерину, яке було очищене афінним способом з використанням Р-кадгерину, а також антитіло проти Р-кадгерину, яке було синтезоване за допомогою лінії клітин in vitro. Білок або поліпептид є "практично чистим", "практично гомогенним" або "практично очищеним", якщо принаймні приблизно від 60 до 75 % зразка характеризується як поліпептид одного виду. Поліпептид або білок може бути мономерним або мультимерним. Як правило, практично чистий поліпептид або білок може містити приблизно 50 %, 60 %, 70 %, 80 % або 90 % мас/мас, зразка білка, більш звичайно, приблизно 95 %, а переважно може бути чистим більш, ніж на 99 %. Чистота або гомогенність білка може бути показана множиною добре відомих у даній галузі способів, таких як електрофорез білкового зразка у поліакриламідному гелі з подальшим одержанням зображення єдиної поліпептидної смуги після забарвлювання гелю з використанням добре відомої у даній галузі фарби. Для визначеної мети можна забезпечувати більш високе розрізнення з використанням HPLC або інших способів, добре відомих у даній галузі для очищення. У межах даної заявки термін "поліпептидний фрагмент" стосується поліпептиду, що має амінокінцеву або карбоксикінцеву делецію, але де інша амінокислотна послідовність ідентична відповідним положенням у природній послідовності. У де 17 яких варіантах здійснення довжина фрагментів складає принаймні 5,6, 8 або 10 амінокислот. В інших варіантах здійснення довжина фрагментів складає принаймні 14, принаймні 20, принаймні 50 або принаймні 70, 80, 90, 100, 150 або 200 амінокислот. У межах даної заявки термін "аналог" або "поліпептидний аналог" стосується поліпептиду, що містить ділянку, яка практично співпадає з визначеною контрольною амінокислотною послідовністю і практично володіє тією ж функцією або активністю, що і контрольна амінокислотна послідовність. Як правило, поліпептидні аналоги містять консервативну амінокислотну заміну (або вставку, або делецію) відносно контрольної послідовності. Довжина аналогів може складати принаймні 20 або 25 амінокислот, або довжина може складати принаймні 50,60,70,80,90,100,150 або 200 амінокислот або більше, а часто аналоги можуть бути такими ж довгими, як і повнорозмірний поліпептид. Деякі варіанти здійснення винаходу включають антитіла з поліпептидних фрагментів або з поліпептидних аналогів з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 замінами відносно амінокислотної послідовності зародкової лінії. Керуючись цим описом, фахівці у даній галузі можуть легко одержувати фрагменти або аналоги антитіл або молекул імуноглобулінів. У визначених варіантах здійснення амінокислотні заміни в антитілі проти Р-кадгерину або в його антигензв'язувальній частині є такими, які: (1) знижують чутливість до протеолізу, (2) знижують чутливість до окиснення, (3) змінюють афінність зв'язування для формування білкових комплексів, а також (4) додають або модифікують інші фізикохімічні або функціональні властивості таких аналогів, але при збереженні специфічного зв'язування з Р-кадгерином. Аналоги можуть містити різні заміни відносно природної пептидної послідовності. Наприклад, у природній послідовності, наприклад, у ділянці поліпептиду, розташованій поза межами домену(ів), що формує міжмолекулярні контакти, можна здійснювати одиничні або множинні амінокислотні заміни, переважно, консервативні амінокислотні заміни. Також у формуючому міжмолекулярні контакти домені(ах) можна здійснювати амінокислотні заміни, здатні поліпшити активність поліпептиду. Консервативна амінокислотна заміна не повинна істотно змінювати структурні характеристики вихідної послідовності; наприклад, заміна амінокислоти не повинна змінювати антипаралельну β-складчасту структуру, що утворює домен зв'язування імуноглобуліну, який знаходиться у вихідній послідовності, або не повинна порушувати інші типи вторинної структури, що характеризує вихідну послідовність. Загалом, в антипаралельній β-складчастій структурі не використовують гліцин і пролін. Приклади визнаних у даній галузі вторинних і третинних структур поліпептидів описані у Proteins.Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C.Branden and J.Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); і Thornton, et al., Nature, 95775 18 354:105 (1991), наведених тут повністю шляхом посилання. У межах даної заявки термін "антитіло" є синонімом імуноглобуліну, і його потрібно розуміти так, як загальноприйнято у даній галузі. Зокрема, термін "антитіло" не обмежений яким-небудь конкретним способом одержання антитіла. Наприклад, термін "антитіло" включає в себе, але ними не обмежується, рекомбінантні антитіла, моноклональні антитіла і поліклональні антитіла. У межах даної заявки термін "антигензв'язувальна частина" антитіла (або просто "ділянка антитіла") стосується одного або декількох фрагментів антитіла, що зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, Р-кадгерином). Було показано, що антигензв'язувальна функція антитіла може бути здійснена фрагментами повнорозмірного антитіла. Приклади зв'язувальних фрагментів, що входять у термін "антигензв'язувальна частина" антитіла, включають (і) фрагмент Fab, моновалентний фрагмент, що складається з доменів VL, VH, CL і СH1; (іі) фрагмент F(ab')2, бівалентний фрагмент, що містить два фрагменти Fab, які з'єднані дисульфідним містком у шарнірній області; (ііі) фрагмент Fd, що складається з доменів VH і СH1; (iv) фрагмент Fv, що складається з доменів VL і VH одного плеча антитіла, (ν) фрагмент dAb (Ward, et al., Nature, (1989) 341:544-546), що складається з домену VH; і (vi) окрему гіперваріабельну ділянку (CDR). Крім того, хоча два домени фрагмента Fv, VL і VH, кодуються окремими генами, їх можна з'єднувати з використанням рекомбінантних способів за допомогою синтетичного лінкеру, що дозволяє одержувати їх у вигляді єдиного білкового ланцюга, в якому ділянки VL і VH об'єднують у пару для формування моновалентних молекул (відомих як одноланцюжковий Fv (scFv)); див., наприклад, Bird, et al., Science (1988) 242:423-426 і Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85:58795883 (1988)). Мається на увазі, що такі одноланцюжкові антитіла також входять у термін "антигензв'язувальна частина" антитіла. Також включені інші форми одноланцюжкових антитіл, такі як димери. Димери являють собою бівалентні, біспецифічні антитіла, в яких домени VH і VL експресуються на одному поліпептидному ланцюгу, але з використанням лінкеру, що є дуже коротким, щоб дозволити об'єднання у пару двох доменів на одному і тому ж ланцюгу, тим самим змушуючи домени утворювати пари з комплементарними доменами іншого ланцюга і формуючи дві антигензв'язувальних ділянки (див., наприклад, Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:64446448 (1993); Poljak, et al., Structure, 2:11211123(1994)). Крім того, антитіло або його антигензв'язувальна частина можуть бути частиною більш великих молекул імуноадгезії, сформованих ковалентною або нековалентною взаємодією антитіла або ділянки антитіла з одним або декількома іншими білками або пептидами. Приклади таких молекул імуноадгезії включають використання внутрішньої області стрептавідину для одержання тетрамерної молекули scFv (Kipriyanov, et al., Human Antibodies and Hybridomas, 6:93-101 (1995)) і використання 19 цистеїнового залишку, маркерного пептиду і Скінцевої полігістидинової мітки для одержання бівалентних і біотинільованих молекул scFv (Kipriyanov, et al., Моl. Immunol., 31:1047-1058 (1994)). Інші приклади включають випадки, коли одна або декілька CDR антитіла ковалентно або нековалентно включені у молекулу, роблячи її імуноадгезивною, такою, що специфічно зв'язується з цікавлячим антигеном, таким як Р-кадгерин. У таких варіантах здійснення CDR можна включати як частину більш великого поліпептидного ланцюга, можна ковалентно зв'язувати з іншим поліпептидним ланцюгом або можна включати нековалентним способом. Ділянки антитіла, такі як фрагменти Fab і F(ab')2, можна одержувати з цілих антитіл з використанням загальноприйнятих способів, таких як розщеплення цілих антитіл папаїном або пепсином, відповідно. Крім того, антитіла, частини антитіл і молекули імуноадгезії можна одержувати з використанням загальноприйнятих способів рекомбінантної ДНК, як описано у даній заявці. Якщо "антитіло" згадують у даній заявці відносно даного винаходу, то потрібно розуміти, що також можна використовувати його антигензв'язувальну частину. Антигензв'язувальна частина конкурує з цілим антитілом за специфічне зв'язування. Див., загалом, Fundamental Immunology.Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed.Raven Press, N.Y. (1989)) (наведене тут повністю шляхом посилання для всіх цілей). Антигензв'язувальні частини можна одержувати способами рекомбінантної ДНК або ферментативним або хімічним розщепленням цілих антитіл. У деяких варіантах здійснення антигензв'язувальні частини включають фрагменти Fab, Fab', F(ab')2,Fd, Fv, dAb і гіперваріабельні ділянки (CDR), одноланцюжкові антитіла (scFv), химерні антитіла, димери і поліпептиди, які містять принаймні ділянку антитіла, достатню для надання поліпептиду специфічного зв'язування антигену. У варіантах здійснення з однією або декількома ділянками зв'язування ділянки зв'язування можуть співпадати одна з одною або можуть відрізнятися. У межах даної заявки термін "антитіло людини" означає будь-яке антитіло, в якому послідовності варіабельних і константних доменів являють собою послідовності людини. Термін включає антитіла з послідовностями, одержаними на основі генів людини, але які були змінені, наприклад, для зниження можливої імуногенності, збільшення афінності, усунення цистеїнів, здатних викликати небажане зсідання, і т.д. Також термін включає такі антитіла, які одержують рекомбінантно у клітинах, що не є людськими, здатних забезпечувати невластиве клітинам людини глікозилування. Ці антитіла можна одержувати множиною способів, як описано нижче. У межах даної заявки термін "химерне антитіло" означає антитіло, що містить ділянки з двох або більше різних антитіл, у тому числі антитіл з різних видів. Наприклад, одну або декілька CDR химерного антитіла можна одержувати з антитіла людини проти Р-кадгерину. В одному з прикладів CDR з антитіла людини можна об'єднувати з CDR з антитіла, що не є людським, наприклад, мишачого або щурячого. В іншому прикладі всі CDR мож 95775 20 на одержувати з антитіл людини проти Ркадгерину. У ще одному прикладі CDR з більш ніж одного антитіла людини проти Р-кадгерину можна об'єднувати у химерне антитіло. Наприклад, химерне антитіло може містити CDR1 з легкого ланцюга першого антитіла людини проти Р-кадгерину, CDR2 з легкого ланцюга другого антитіла людини проти Р-кадгерину і CDR3 з легкого ланцюга третього антитіла людини проти Р-кадгерину, a CDR з важкого ланцюга можуть бути одержані з одного або декількох інших антитіл проти Р-кадгерину. Крім того, каркасні області можна одержувати з одного з антитіл проти Р-кадгерину, з якого одержують одну або декілька CDR, або з одного або декількох різних антитіл людини. Крім того, мають на увазі, що термін "химерне антитіло" включає будь-яке з вказаних вище поєднань, де поєднання містять антитіла людини і антитіла, що не є людськими. У межах даної заявки термін "гуманізоване антитіло" стосується антитіл з джерела, що не є людським, де амінокислотні залишки, характерні для послідовностей антитіл з видів, що не є людськими, замінені на залишки, які знаходяться у відповідних положеннях в антитілах людини. Вважають, що цей процес "гуманізації" знижує імуногенність одержуваного антитіла у людини. Розуміють, що антитіла з джерела, що не є людським, можна гуманізувати з використанням добре відомих у даній галузі способів. Див., наприклад, Winter, et al., Immunol. Today, 14:43-46 (1993). Цікавляче антитіло можна конструювати способами рекомбінантної ДНК для заміщення СНІ, СН2, СН3, шарнірних доменів і/або каркасного домену відповідною послідовністю людини. Див., наприклад, WO92/02190 і патенти США №№5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 і 5777085. У межах даної заявки термін "гуманізоване антитіло" включає у своє значення химерні антитіла людини і антитіла з приєднаними CDR. Химерні антитіла людини за винаходом включають VH і VL антитіла з виду, що не є людським, і домени СH і CL антитіла людини. Антитіла з приєднаними CDR за винаходом одержують у результаті заміни CDR з VH і VL антитіла людини на CDR з VH і VL, відповідно, з антитіла тварини, відмінної від людини. У межах даної заявки термін "ELISA" стосується твердофазового імуноферментного аналізу. Цей аналіз добре відомий фахівцям у даній галузі. Приклади цього аналізу можна знайти у Vaughan, T.J., et al., Nat. Biotech., 14:309-314 (1996), а також у прикладі 7 даної заявки. У межах даної заявки термін "поверхневий плазмонний резонанс" стосується оптичного явища, яке дозволяє аналізувати біоспецифічні взаємодії у режимі реального часу за допомогою реєстрації змін концентрацій білків у біосенсорній матриці, наприклад, з використанням системи BIACORE (Pharmacia Biosensor АВ, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Для додаткових описів див. Jonsson et al., Ann. Biol. Clin., 51:19-26 (1993); Jonsson, et al., Biotechniques, 11:620-627 (1991); Jonsson, et al., J. Моl. Recognit, 8:125-131 (1995); і Johnsson, et al., Anal. Biochem., 198:268277 (1991). 21 Термін "KD" стосується рівноважної константи афінності зв'язування для конкретної взаємодії антитіло-антиген. Вказують, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, якщо KD≤1 мМ, переважно - ≤100 нМ, а найбільш переважно - ≤10 нМ. Константу афінності зв'язування KD можна вимірювати поверхневим плазмонним резонансом, наприклад, з використанням системи BIACORE™, як описано у прикладі 6. Термін "kзвор." стосується константи швидкості дисоціації для конкретної взаємодії антитілоантиген. Константу швидкості дисоціації kзвор. можна вимірювати поверхневим плазмонним резонансом, наприклад, з використанням системи BIACORE™, як описано у прикладі 6. У межах даної заявки термін "аналіз залежної від Р-кадгерину адгезії клітин" стосується аналізу, що використовується для вимірювання здатності антитіла проти Р-кадгерину блокувати адгезію клітин до рецептора Р-кадгерину, зафіксованого на твердому носії. Наприклад, цей тип аналізу можна здійснювати фіксуванням Р-кадгерину на твердому носії, такому як пластмаса. Потім клітинам з надекспресією Р-кадгерину дозволяють прикріплятися до твердого носія за допомогою взаємодій Ркадгерин-Р-кадгерин. Потім можна кількісно визначати величину адгезії за наявності і за відсутності антитіла проти Р-кадгерину. Адгезію як функцію концентрації антитіла можна потім використовувати для визначення величини ІС50. У прикладі 3 представлені додаткові подробиці аналізу залежної від Р-кадгерину адгезії клітин, який використовували для вимірювання величин ІС50 для антитіл проти Р-кадгерину. У межах даної заявки термін "аналіз залежної від Р-кадгерину агрегації клітин" стосується аналізу для вимірювання здатності антитіла проти Ркадгерину блокувати агрегацію клітин, які експресують на своїй поверхні Р-кадгерин. Наприклад, у цьому типі аналізу можна використовувати лінію клітин, які надекспресують Р-кадгерин, де клітини вміщують у суспензію і дозволяють формувати скупчення, що залежать від Р-кадгерину. Потім аналіз агрегації використовують для кількісного визначення здатності антитіла проти Р-кадгерину запобігати цій агрегації, що проводиться за допомогою вимірювання розміру клітинних скупчень, які утворюються у присутності і за відсутності антитіла. Розмір скупчення клітин як функцію концентрації антитіла проти Р-кадгерину потім можна використовувати для визначення величини IC50. У прикладі 4 представлені додаткові подробиці аналізу залежної від Р-кадгерину агрегації клітин, який використовували для вимірювання величин ІС50 для декількох антитіл проти Р-кадгерину. У межах даної заявки термін "аналіз залежного від Р-кадгерину розпаду шароподібного утворення" стосується аналізу для вимірювання здатності антитіла проти Р-кадгерину порушувати заздалегідь утворені, залежні від Р-кадгерину скупчення клітин. За допомогою вимірювання зменшення розміру скупчень як функції концентрації антитіла можна визначати величину ІС50. У прикладі 5 представлені додаткові подробиці аналізу залежного від Р-кадгерину розпаду шароподібного 95775 22 утворення, який використовували для вимірювання величин iС50 для антитіл проти Р-кадгерину. У межах даної заявки термін "молекулярна вибірність" стосується афінності зв'язування антитіла відносно специфічного антигену, що перевищує афінність для спорідненого антигену. Наприклад, антитіла за даним винаходом можуть бути вибірні відносно Р-кадгерину у порівнянні з Е-кадгерином, що означає, що афінність зв'язування антитіла для Р-кадгерину принаймні у 2 рази вища, наприклад, у 4 рази або у 10 разів, або у 50 разів, або у 100 разів або більше, ніж для Е-кадгерину. Такі величини афінності зв'язування можна вимірювати з використанням загальноприйнятих способів, відомих фахівцям у даній галузі. Термін "епітоп" включає будь-яку білкову детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з імуноглобуліном або рецептором Т-клітин або до іншої взаємодії з молекулою. Як правило, детермінанти епітопів складаються з хімічно активних поверхневих груп молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги вуглеводів або цукрів, і, як правило, володіють специфічними характеристиками тривимірної структури, а також специфічними характеристиками заряду. "Епітоп" може бути "лінійним" або "конформаційним". У лінійному епітопі всі ділянки взаємодії між білком і взаємодіючою молекулою (такою як антитіло) розташовані лінійно вздовж основної амінокислотної послідовності білка. У конформаційному епітопі ділянки взаємодії розташовані у поперечному напрямі відносно амінокислотних залишків білка, відділених один від одного. Після визначення бажаного епітопу на антигені можна одержувати антитіла проти цього епітопу, наприклад, з використанням описаних у даному винаході способів. Альтернативно, у ході процесу відкриття одержання і характеризація антитіл можуть приводити до доповнення інформації про бажані епітопи. Потім на основі цієї інформації можна проводити конкурентний скринінг антитіл на предмет зв'язування з одним і тим же епітопом. Спосіб досягнення цього полягає у проведенні досліджень перехресного конкурування для знаходження антитіл, що конкурентно зв'язуються одне з одним, тобто антитіла конкурують за зв'язування з антигеном. Високопродуктивний спосіб "сортування" антитіл на основі їх перехресного конкурування описаний у міжнародній патентній публікації №WO 03/48731. У межах даної заявки термін "конкурує" відносно антитіла означає, що перше антитіло або його антигензв'язувальна частина конкурує за зв'язування з другим антитілом або його антигензв'язувальною частиною, де зв'язування першого антитіла з його спорідненим епітопом у присутності другого антитіла помітно знижується у порівнянні зі зв'язуванням першого антитіла за відсутності другого антитіла. Альтернативно, може існувати, але необов'язково, випадок, коли зв'язування другого антитіла з його епітопом у присутності першого антитіла також помітно знижується. Тобто перше антитіло може інгібувати зв'язування другого антитіла з його епітопом за відсутності інгібування другим антитілом зв'язування першого антитіла з його відповідним епітопом. Однак, якщо кожне 23 антитіло значно інгібує зв'язування іншого антитіла з його спорідненим епітопом або лігандом, в однаковій, більшій або меншій мірі, то вказують, що антитіла "перехресно конкурують" одне з одним за зв'язування з їх відповідним епітопом(ами). У даний винахід входить і конкурування, і перехресне конкурування антитіл. Незалежно від механізму, яким відбувається таке конкурування або перехресне конкурування (наприклад, стерична перешкода, конформаційна зміна або зв'язування зі спільним епітопом або його ділянкою і т.п.), фахівець у даній галузі на основі представлених у даній заявці вказівок розуміє, що таке конкурування і/або перехресне конкурування антитіл входить і може бути ефективним для описаних у даній заявці способів. У межах даної заявки термін "використовує" відносно конкретного гена означає, що амінокислотна послідовність конкретної ділянки в антитілі одержана безпосередньо з цього гена у ході дозрівання В-клітини. Наприклад, вираз "амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга, для якої використовується ген сімейства VH3 людини" стосується випадку, коли область VH антитіла одержана з ділянок гена сімейства VH-3 у ході дозрівання В-клітини. У В-клітинах людини існує більше 30 різних функціональних генів варіабельної області важкого ланцюга, з яких утворюються антитіла. Таким чином, використання конкретного гена варіабельної області важкого ланцюга є показовим для переважного зв'язувального фрагмента при взаємодії антитіло-антиген відносно сумісних властивостей зв'язування з антигеном і функціональної активності. Як розуміють, аналіз використання гена забезпечує тільки обмежене уявлення про структуру антитіла. Оскільки Вклітини людини випадковим чином утворюють транскрипти V-D-J важкого або V-J легкого каппаланцюга, то відбувається множина вторинних процесів, у тому числі, без обмежень, соматична гіпермутація, n-додавання і подовження CDR3. Див., наприклад, Mendez et al., Nature Genetics15:146156(1997). У межах даної заявки додержуються загальноприйнятого використання двадцяти загальноприйнятих амінокислот і їх скорочених позначень. nd Див. Immunology-A Synthesis (2 Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), наведене тут повністю шляхом посилання. У межах даної заявки термін "полінуклеотид" означає полімерну форму нуклеотидів довжиною принаймні 10 основ, рибонуклеотидів або дезоксинуклеотидів, або модифіковану форму кожного типу нуклеотиду. Термін включає одно- і двохланцюжкові форми. У межах даної заявки термін "ізольований полінуклеотид" означає полінуклеотид геномного, кДНК або синтетичного походження або їх визначеного поєднання, де внаслідок свого походження "ізольований полінуклеотид" (1) не зв'язаний з усіма або з частиною полінуклеотидів, з якими "ізольований полінуклеотид" спостерігають у природі, (2) функціонально зв'язаний з полінуклеотид ом, з яким він не зв'язаний у природі, або (3) не зустрі 95775 24 чається у природі у вигляді частини більш великої послідовності. У межах даної заявки термін "природні нуклеотиди" включає дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди. У межах даної заявки термін "модифіковані нуклеотиди" включає нуклеотиди з модифікованими або заміщеними групами цукрів і т.п. У межах даної заявки термін "олігонуклеотидні зв'язки" включає такі олігонуклеотидні зв'язки, як фосфортіоатний, фосфордитіоатний, фосфорселеноатний, фосфордиселеноатний, фосфоранілотіоатний, фосфораніладатний, фосфорамідатний і т.п. див., наприклад, LaPlanche, et al., Nucl. Acids Res., 14:9081 (1986); Stec, et al., J. Am. Chem. Soc, 106:6077 (1984); Stein, et al., Nucl. Acids Res., 16:3209 (1988); Zon, et al., Anti-Cancer Drug Design, 6:539 (1991); Zon, et al., Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach, pp.87-108 (F.Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); патент США №51515Ю; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews, 90:543 (1990), описи яких наведені тут повністю шляхом посилання. За бажанням, олігонуклеотид може містити мітку для реєстрації. "Функціонально зв'язані" послідовності включають послідовності, що контролюють експресію, які прилягають до цікавлячого гена, і послідовності, що контролюють експресію, які діють у трансположенні або на відстані, контролюючи цікавлячий ген. У межах даної заявки термін "послідовність, що контролює експресію" означає полінуклеотидні послідовності, необхідні для впливу на експресію і процесинг кодуючих послідовностей, з якими вони ліговані. Послідовності, що контролюють експресію, включають послідовності ініціації транскрипції, термінації, промоторів і енхансерів; ефективні сигнали для процесингу РНК, такі як сигнали сплайсингу і поліаденілювання; послідовності, що стабілізують цитоплазматичну мРНК; послідовності, що підвищують ефективність трансляції (тобто консенсусна послідовність Козака); послідовності, що збільшують стабільність білка; і, коли необхідні, послідовності, що підвищують секрецію білка. Природа таких контролюючих послідовностей відрізняється в залежності від організму-хазяїна; у прокаріотах такі контролюючі послідовності, як правило, містять промотор, ділянку зв'язування рибосом і послідовність термінації транскрипції; в еукаріотах, як правило, такі контролюючі послідовності містять промотори і послідовність термінації транскрипції. Мають на увазі, що термін "контролюючі послідовності" включає, як мінімум, всі компоненти, присутність яких необхідна для експресії і процесингу, а також може включати додаткові компоненти, наявність яких є сприятливою, наприклад, лідерні послідовності і послідовності учасників для злиття. У межах даної заявки термін "вектор" означає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну переносити іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона була з'єднана. У деяких варіантах здійснення вектор являє собою плазміду, тобто кільцеву двохланцюжкову частину ДНК, в яку можна лігувати додаткові ділянки ДНК. У деяких варіантах здійснення вектор 25 являє собою вірусний вектор, де додаткові ділянки ДНК можна лігувати у вірусний геном. У деяких варіантах здійснення вектори здатні до автономної реплікації у клітині-хазяїні, в яку їх вводять (наприклад, бактеріальні вектори з бактеріальною ділянкою ініціації реплікації і епісомальні вектори, що належать ссавцеві). В інших варіантах здійснення вектори (наприклад, неепісомальні вектори, що належать ссавцеві) можна вбудовувати у геном клітини-хазяїна після введення у клітину-хазяїна, і таким чином їх можна реплікувати разом з геномом хазяїна. Крім того, визначені вектори здатні контролювати експресію генів, з якими вони функціонально зв'язані. У межах даної заявки такі вектори називають "рекомбінантними векторами експресії" (або просто "векторами експресії"). У межах даної заявки термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") означає клітину, в яку був введений рекомбінантний вектор експресії. Потрібно розуміти, що "рекомбінантна клітина-хазяїн" і "клітина-хазяїн" означають не тільки конкретну клітину об'єкта, але також і потомство такої клітини. Оскільки у наступних поколіннях можуть відбуватися певні зміни, обумовлені мутацією або впливами навколишнього середовища, то фактично таке потомство може бути не ідентичним батьківській клітині, однак при цьому воно включене в об'єм терміну "клітина-хазяїн" у межах даної заявки. У межах даної заявки термін "зародкова лінія" стосується нуклеотидних послідовностей генів і ділянок генів для антитіл у тому вигляді, в якому вони передаються від батьків нащадкам через гамети. Ця послідовність зародкової лінії відмінна від тих, що кодують антитіла у зрілих В-клітинах нуклеотидних послідовностей, які були змінені подіями рекомбінації і гіпермутації у ході дозрівання В-клітин. Термін "процент співпадіння послідовності" у контексті послідовностей нуклеїнових кислот означає залишки у двох послідовностях, які є однаковими при вирівнюванні на предмет максимальної відповідності. Довжина порівнюваної на предмет співпадіння послідовності може перевищувати ділянку довжиною принаймні приблизно дев'ять нуклеотидів, звичайно - принаймні приблизно 18 нуклеотидів, більш звичайно - принаймні приблизно 24 нуклеотиди, як правило -принаймні приблизно 28 нуклеотидів, більш звичайно - принаймні приблизно 32 нуклеотиди, а переважно - принаймні приблизно 36,48 або більше нуклеотидів. Існує множина відомих у даній галузі різних алгоритмів, які можна використовувати для визначення співпадіння нуклеотидних послідовностей. Наприклад, полінуклеотидні послідовності можна порівнювати з використанням FASTA, Gap або Bestfit, що являють собою програми у Wisconsin Package Version10.0,Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin.FASTA, що містить, наприклад, програми FASTA2 і FASTA3, забезпечує вирівнювання і процент співпадіння послідовностей в областях найкращого перекривання заданої і шуканої послідовностей (Pearson, Methods Enzymol., 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Моl. Biol., 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol, 95775 26 266:227-258 (1996); Pearson, J. Моl. Biol.216:11-М (1998); наведені тут повністю шляхом посилання). Доки не вказано інакше, для конкретної програми або алгоритму використовують параметри за умовчанням. Наприклад, процент співпадіння послідовностей між послідовностями нуклеїнових кислот можна визначати з використанням FASTA з її встановленими за умовчанням параметрами (довжина слова складає 6 і фактор NOPAM для матриці для кількісного підрахунку) або з використанням Gap з її встановленими за умовчанням параметрами, як надано в GCG Version 6.1, наведеній тут повністю шляхом посилання. Доки не вказано інакше, зразок для порівняння нуклеотидної послідовності включає комплементарну їй послідовність. Таким чином, зразок для порівняння нуклеїнової кислоти, що володіє визначеною послідовністю, потрібно розуміти як такий, що включає її комплементарний ланцюг з її комплементарною послідовністю. Термін "значна подібність" або "значна подібність послідовностей" відносно нуклеїнової кислоти або її ділянки означає, що при оптимальному вирівнюванні разом з відповідними нуклеотидними вставками або делеціями з іншою нуклеїновою кислотою (або її комплементарним ланцюгом) спостерігають співпадіння нуклеотидних послідовностей принаймні приблизно на 85 %, переважно принаймні приблизно на 90 %, а більш переважно - принаймні приблизно на 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % нуклеотидних основ, як визначено будьяким добре відомим алгоритмом для співпадіння послідовностей, таким як FASTA, BLAST або Gap, як описано вище. Термін "процент співпадіння послідовностей" у контексті амінокислотних послідовностей означає залишки у двох послідовностях, які є однаковими при вирівнюванні на предмет максимальної відповідності. Довжина послідовності, що порівнюється на предмет співпадіння, може перевищувати ділянку довжиною принаймні приблизно п'ять амінокислот, звичайно - принаймні приблизно 20 амінокислот, більш звичайно - принаймні приблизно 30 амінокислот, як правило - принаймні приблизно 50 амінокислот, більш звичайно - принаймні приблизно 100 амінокислот, а ще більш звичайно - приблизно 150,200 або більше амінокислот. Існує множина відомих у даній галузі різних алгоритмів, які можна використовувати для визначення співпадіння амінокислотних послідовностей. Наприклад, амінокислотні послідовності можна порівнювати з використанням FASTA, Gap або Bestfit, що являють собою програми у Wisconsin Package Version10.0,Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. Застосовно до поліпептидів термін "значне співпадіння" або "значна подібність" означає, що дві послідовності амінокислот при оптимальному вирівнюванні, такому як за допомогою програм GAP або BESTFIT з використанням встановлених за умовчанням величин розриву, як надано у програмах, володіють подібністю послідовностей принаймні на 70 %, 75 % або 80 %, переважно подібністю послідовностей принаймні на 90 % або 95 %, а більш переважно - подібністю послідовностей 27 принаймні на 97 %, 98 % або 99 %. У деяких варіантах здійснення положення залишків, які не є однаковими, відрізняються консервативними амінокислотними замінами. У межах даної заявки термін "консервативна амінокислотна заміна" стосується випадку, коли амінокислотний залишок замінений іншим амінокислотним залишком, що володіє групою R бічного ланцюга з подібними хімічними властивостями (наприклад, заряд або гідрофобність). Загалом, консервативна амінокислотна заміна практично не змінює функціональні властивості білка. У випадках, коли дві або більше амінокислотних послідовностей відрізняються одна від одної консервативними замінами, процент співпадіння послідовностей можна підвищувати, вносячи поправку на консервативний характер заміни. Способи здійснення цієї поправки добре відомі фахівцям у даній галузі. Див., наприклад, Pearson, Methods Моl. Biol., 243:307-31 (1994). Приклади груп амінокислот, що мають бічні ланцюги з подібними хімічними властивостями, включають: 1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин та ізолейцин; 2) аліфатично-гідроксильні бічні ланцюги: серин і треонін; 3) амідовмісні бічні ланцюги: аспарагін і глутамін; 4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; 5) основні бічні ланцюги: лізин, аргінін і гістидин; 6) кислі бічні ланцюги: аспарагінова кислота і глутамінова кислота; і 7) сірковмісні бічні ланцюги: цистеїн і метіонін. Наприклад, консервативні амінокислотні заміни груп можуть являти собою: валін-лейцинізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін, глутамат-аспартат і аспарагінглутамін. Альтернативно, консервативна заміна являє собою будь-яку зміну, що володіє додатною величиною у матриці логарифмічної правдоподібності РАМ250, описаній у Gonnet et al., Science256:144345 (1992), наведеному тут повністю шляхом посилання. "Помірно консервативна" заміна являє собою будь-яку зміну, що володіє від'ємною величиною у матриці логарифмічної правдоподібності РАМ250. Як правило, співпадіння послідовностей для поліпептидів визначають з використанням програмного забезпечення для аналізу послідовностей. Програмне забезпечення для аналізу білків порівнює послідовності з використанням вимірювань подібності, що співвідноситься з різними замінами, делеціями та іншими модифікаціями, у тому числі консервативними амінокислотними замінами. Наприклад, GCG містить програми, такі як "Gap" і "Bestfit", які можна використовувати з встановленими за умовчанням параметрами, як вказано у програмах, для визначення гомології послідовностей або співпадіння послідовностей між близькоспорідненими поліпептидами, такими як гомологічні поліпептиди з різних видів організмів, або між білком дикого типу і його аналогом. Див., наприклад, GCG Version 6.1 (University of Wisconsin, WI). Також поліпептидні послідовності можна порівнювати з використанням FASTA, застосовуючи встановлені за умовчанням або рекомендовані параметри, див. GCG Version 6.1.FASTA (наприклад, FASTA2 і 95775 28 FASTA3) забезпечує вирівнювання і процент співпадіння послідовностей в областях найкращого перекривання заданої і шуканої послідовностей (Pearson, Methods Enzymol., 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Моl. Biol., 132:185-219 (2000)). Іншим переважним алгоритмом при порівнянні послідовності за винаходом з базою даних, що містить велику кількість послідовностей з різних організмів, є комп'ютерна програма BLAST, особливо blastp або tblastn, з використанням встановлених за умовчанням параметрів, як надано разом з програмами. Див., наприклад, Altschul, et al., J. Моl. Biol., 215:403-410 (1990); Altschul, et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997). Як правило, довжина поліпептидних послідовностей, що порівнюються на предмет гомології, складає принаймні приблизно 16 амінокислотних залишків, звичайно - принаймні приблизно 20 залишків, більш звичайно - принаймні приблизно 24 залишків, як правило - принаймні приблизно 28 залишків, а переважно - приблизно більш ніж 35 залишків. При пошуку бази даних, що містить послідовності з великої кількості різних організмів, є переважним проводити порівняння амінокислотних послідовностей. У межах даної заявки терміни "мітка" або "мічений" стосуються включення іншої молекули в антитіло. В одному з варіантів здійснення мітка являє собою маркер, що піддається виявленню, наприклад, включення міченої радіоактивною міткою амінокислоти або приєднання до поліпептиду біотинільованих молекул, які можна виявляти міченим авідином (наприклад, стрептавідином, що володіє флуоресцентним маркером або ферментативною активністю, які можна реєструвати оптичними або колориметричними способами). В іншому варіанті здійснення мітка або маркер можуть являти собою терапевтичний засіб, наприклад, кон'югат лікарського засобу або токсин. У даній галузі відомі і можуть бути використані різні способи мічення поліпептидів і глікопротеїнів. Приклади міток для поліпептидів включають в себе, але ними не обмежуються, наступне: радіоактивні ізото3 14 15 35 пи або радіонукліди (наприклад, Н, С, N, S, 90 99 111 125 131 Y, Тс, Іn, І, І), флуоресцентні мітки (наприклад, FITC, родамін, лантанідні люмінофори), ферментні мітки (наприклад, пероксидаза хрону, β-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза), хемілюмінесцентні маркери, біотинільовані групи, заздалегідь визначені поліпептидні епітопи, розпізнавані вторинним репортером (наприклад, парні послідовності лейцинових застібок, ділянки зв'язування для вторинних антитіл, домени зв'язування металів, епітопні мітки), магнітні речовини, такі як хелати гадолінію, токсини, такі як коклюшний токсин, таксол, цитохалазин В, граміцидин D, бромід етидію, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, 1дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин, а також їх аналоги або гомологи. У деяких варіантах здійснення мітки приєднують до спейсерних груп 29 різної довжини для зменшення можливої стеричної перешкоди. "Терапевтично ефективна кількість" стосується такої кількості терапевтичного засобу, що вводиться, яка певною мірою ослаблює один або декілька симптомів захворювання, що підлягає лікуванню. Відносно лікування раку терапевтично ефективна кількість стосується такої кількості, яка надає принаймні один з наступних ефектів: зменшення розміру пухлини; інгібування (тобто уповільнення у деякій мірі, переважно, припинення) метастазування пухлини; інгібування у деякій мірі (тобто уповільнення у деякій мірі, переважно, припинення) росту пухлини, а також ослаблення у деякій мірі (або, переважно, усунення) одного або декількох симптомів, пов'язаних з раком. "Лікувати", "лікуючий" і "лікування" стосуються способу ослаблення або усунення біологічного порушення і/або супутніх йому симптомів. Відносно раку ці терміни просто означають, що очікувана тривалість життя ураженого раком індивідуума збільшена або що ослаблений один або декілька симптомів захворювання. "Контактування" стосується зведення разом антитіла або його антигензв'язувальної ділянки за даним винаходом і Р-кадгерину-мішені або його епітопу таким чином, що антитіло може впливати на біологічну активність Р-кадгерину. Таке "контактування" можна здійснювати "in vitro", тобто у пробірці, чашці Петрі або т.п. У пробірці до контактування може бути залучене тільки антитіло або його антигензв'язувальна частина і Р-кадгерин або його епітоп або до нього можуть бути залучені цілі клітини. Клітини також можна підтримувати або вирощувати у планшетах для культивування клітин і у такому оточуючому середовищі приводити у контакт з антитілами або їх антигензв'язувальними ділянками. У цьому контексті здатність конкретного антитіла або його антигензв'язувальної частини впливати на зв'язане з Р-кадгерином захворювання, тобто ІС50 для антитіла, можна визначати до спроби використати антитіло in vivo у більш складних живих організмів. У випадку клітин, що знаходяться поза організмом, для контактування Ркадгерину з антитілами або їх антигензв'язувальними частинами існує множина способів, і вони добре відомі фахівцям у даній галузі. Доки не вказано інакше, у межах даної заявки "патологічний ріст клітин" стосується клітинного росту, що не залежить від звичайних регуляторних механізмів (наприклад, втрата контактного інгібування), у тому числі патологічного росту звичайних клітин і росту патологічних клітин. Це включає в себе, але ним не обмежується, патологічний ріст: пухлинних клітин (пухлин), що проліферують внаслідок експресії мутантної тирозинкінази або надекспресії рецептора тирозинкінази; доброякісних і злоякісних клітин при інших проліферативних захворюваннях, при яких відбувається патологічна активація тирозинкінази; будь-яких пухлин, що проліферують за допомогою рецептора тирозинкіназ; будь-яких пухлин, що проліферують внаслідок патологічної активації серин/треонінкінази; доброякісних і злоякісних клітин при інших проліферативних захворюваннях, при яких відбувається пато 95775 30 логічна активація серин/треонінкінази; пухлин, доброякісних і злоякісних, що експресують активований онкоген Ras; пухлинних клітин, доброякісних і злоякісних, в яких білок Ras активований внаслідок онкогенної мутації в іншому гені; доброякісних і злоякісних клітин при інших проліферативних захворюваннях, при яких відбувається патологічна активація Ras. Приклади таких доброякісних проліферативних захворювань являють собою псоріаз, доброякісну гіпертрофію передміхурової залози, вірус папіломи людини (HPV) і рестеноз. Також "патологічний ріст клітин" стосується і включає в себе патологічний ріст доброякісних і злоякісних клітин, обумовлений активністю ферменту фарнезилпротеїнтрансферази. У даній заявці терміни "патологічний ріст клітин" і "гіперпроліферативне захворювання" використовують взаємозамінно. "In vitro" стосується процедур, що виконуються у штучному оточуючому середовищі, такому як, наприклад, без обмежень, пробірка або культуральне середовище. "In vivo" стосується процедур, що виконуються у живому організмі, такому як, без обмежень, миша, щур або кролик. На фіг. 1 представлені послідовності амінокислот і нуклеїнових кислот з SEQ ID №№: 1-347. Антитіла проти Р-кадгерину людини Даний винахід стосується виділених антитіл людини або їх антигензв'язувальних частин, які зв'язуються з Р-кадгерином людини. Переважно, антитіла людини являють собою рекомбінантні антитіла проти Р-кадгерину людини, що володіють спорідненістю до Р-кадгерину, яка перевищує спорідненість до Е-кадгерину. У різних аспектах винахід стосується таких антитіл і антигензв'язувальних частин, і їх фармацевтичних композицій, а також нуклеїнових кислот, рекомбінантних векторів експресії і клітин-хазяїнів для одержання таких антитіл і антигензв'язувальних частин. Також винахід стосується способів застосування антитіл і антигензв'язувальних частин за даним винаходом для виявлення Р-кадгерину або для інгібування активності Р-кадгерину людини, in vitro або in vivo. Відомі амінокислотні і нуклеотидні послідовності Р-кадгерину з декількох видів, включаючи людину (див., наприклад, унікальний ідентифікатор №ΝΜ_001793.3). Р-кадгерин людини або його антигенні частини можна одержувати відповідно до способів, добре відомих фахівцям у даній галузі, або їх можна купувати у комерційних виробників (наприклад, R&D Systems861-PC-100). У визначених варіантах здійснення антитіла за даним винаходом являють собою IgG, позначені як: 194-е06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; і g129-1c4. Як більш детально описано у прикладі 1, використовували високопродуктивний скринінг бібліотеки фагового дисплею scFv для виявлення 129-1c4 scFv, який потім перетворювали в IgG.129-1c4 являє собою ведуче антитіло, що виявляється у ході початкового скринінгу фагового дисплею, і є батьківським антитілом для лінії, з 31 якої одержували деякі інші антитіла за даним винаходом. Деякі з таких одержаних антитіл позначені як 194-е06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; а також 200-h06 і являють собою оптимізовані антитіла батьківської лінії 129-1с4. Антитіло g-129-1c4 являє собою варіант зародкової лінії батьківського антитіла 129-1с4, де визначені амінокислоти у каркасних областях доменів VH і VL змінені мутацією для співпадіння з такими у каркасних областях зародкової лінії. Будь-яке з вказаних вище антитіл також можна зробити таким, що належить до зародкової лінії, таким чином, щоб послідовності каркасних областей співпадали з каркасними послідовностями зародкової лінії, як в g-129-1c4. Наприклад, в одному з варіантів здійснення даного винаходу антитіла g-194b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01, g195-e11, g-200-h06 і g-194-e06 являють собою варіанти зародкової лінії 194-b09, 194-g09, 196-g03, 196-h02, 194-e01, 195-e11, 200-h06 і 194-е06, відповідно. Конкретні амінокислоти, які змінювали мутацією для одержання варіантів зародкової лінії, очевидні фахівцям у даній галузі внаслідок порівняння послідовностей антитіла зародкової лінії і антитіла, що не належить до зародкової лінії. Як зазначено нижче, конкретні амінокислотні послідовності антитіл за даним винаходом описані у таблицях 1-3 і на фіг. 1. Антитіла за даним винаходом одержували зі значним зміщенням у бік використання сімейства генів VH3 варіабельних областей важкого ланцюга. Зокрема, батьківське антитіло 129-1с4 одержане з частини гена варіабельної області VH3-23. У Вклітинах людини існує більше 30 різних функціональних генів варіабельних областей важкого ланцюга, за допомогою яких одержують антитіла. Таким чином, зміщення вказує на переважний зв'язувальний фрагмент при взаємодії антитіл оантиген відносно сумісних властивостей зв'язування з антигеном і функціональної активності. Як розуміють, аналіз використання генів забезпечує тільки обмежене уявлення про структуру антитіл. Оскільки В-клітини людини випадковим чином утворюють транскрипти V-D-J важкого або V-J легкого каппа-ланцюга, то відбувається множина вторинних процесів, у тому числі, без обмежень, соматична гіпермутація, n-додавання і подовження CDR3. Див., наприклад, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) і опубліковану патентну заявку США №2003-0070185, зареєстровану 19 лютого 2002 року. Відповідно до подальшого дослідження структури антитіл за даним винаходом заздалегідь визначені амінокислотні послідовності антитіл одержували з кДНК, одержаних з клонів. Крім того, N-кінцеві амінокислотні послідовності одержували за допомогою секвенування білка. На фіг. 1 представлені нуклеотидні і амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів для деяких антитіл за даним винаходом. Кожне з вказаних вище конкретних антитіл може бути описане за допомогою послідовностей їх варіабельних доменів важкого (VH) і легкого (VL) ланцюгів, як вказано у таблицях 1 і 2. Конкретні 95775 32 послідовності, позначені цими SEQ ID №№, подані на фіг. 1. Як вказано у таблицях 1 і 2, відповідні послідовності амінокислот і ДНК VH і VL для описаних вище антитіл вказані за допомогою SEQ ID №№:l-23,68-90 і 320-343. Таблиця 1 Антитіла проти Р-кадгерину людини Антитіло 194-е06 194-а02 194-b09 195-е11 194-g09 196-h02 194-e01 196-d10 196-g03 196-е06 195-a09 198-a09 200-h06 129-1c4 Ідентифікатор послідовності (SEQ IED №) VH VL АміноАміноДНК ДНК кислота кислота 1 68 14 81 2 69 14 81 2 69 15 82 3 70 16 83 4 71 17 84 4 71 23 90 5 72 18 85 6 73 23 90 7 74 23 90 8 75 23 90 9 76 23 90 10 77 19 86 11 78 20 87 12 79 21 88 Таблиця 2 Антитіла проти Р-кадгерину людини, приведені до стану зародкової лінії Антитіло g-194-b09 g-194-g09 g-196-g03 g-196-h02 g-194-e01 g-194-e06 g-129-1c4 Ідентифікатор послідовності (SEQ ID №) VH VL АміноАміноДНК ДНК кислота кислота 320 332 326 338 321 333 327 339 322 334 328 340 323 335 329 341 324 336 330 342 325 337 331 343 13 80 22 89 Додаткові антитіла і антигензв'язу вальні частини за даним винаходом також можуть бути описані як такі, що містять різні послідовності CDR і FR, які приводять до варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів антитіл, вказаних у таблицях 1 і 2. Відповідно, SEQ ID №№, що відповідають різним послідовностям CDR і FR антитіл за даним винаходом, вказані у таблиці 3. Крім того, в областях CDR3 важкого і легкого ланцюгів батьківського антитіла 129-1с4 також здійснювали множину вибраних випадковим чином мутацій, що приводять до поліпшеної афінності до Ркадгерину, яка знаходиться у діапазоні від 10- до 417-кратного поліпшення, як виміряно аналізом конкурування за епітоп (див. приклад 8). SEQ ID №№ цих мутантних послідовностей CDR3 VH і VL 33 95775 (SEQ ID №№:91-256 і 257-319) також включені у наведену нижче таблицю 3. Таблиця 3 SEQ ID №№: 24 25 26-37, 91-256 38 39 40-47, 257-319 48 49 50-55 56, 57 58, 59 60-62 63-66 67 Опис VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 VH FR1 VH FR2 VH FR3 VH FR4 VL FR1 VL FR2 VL FR3 VL FR4 Способи одержання антитіл Бібліотеки фагового дисплею Антитіла або антигензв'язувальні частини за даним винаходом можна одержувати відповідно до декількох відомих у даній галузі способів. Наприклад, способи фагового дисплею можна використовувати для забезпечення бібліотек, що містять сукупність антитіл з різною спорідненістю до Р-кадгерину. Потім ці бібліотеки можна скринувати для виявлення і виділення антитіл з бажаною спорідненістю до Р-кадгерину. Наприклад, рекомбінантні антитіла проти Ркадгерину людини за даним винаходом можна виділяти скринінгом рекомбінантної комбінаторної бібліотеки антитіл. Переважно, бібліотека являє собою бібліотеку фагового дисплею scFv, що одержують з використанням кДНК VL і VH людини, які одержують з мРНК, що виділяються з В-клітин людини. Способи одержання і скринінгу таких бібліотек відомі у даній галузі. Набори для одержання бібліотек фагового дисплею є комерційно доступними (наприклад, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, номер у каталозі №27-9400-01; і набір фагового дисплею Stratagene SurfZAPTM, номер у каталозі №240612). Також існують інші способи і реактиви, які можна використовувати для одержання і скринінгу бібліотек дисплею антитіл (див., наприклад, патент США №5223409; публікації РСТ №№WO92/18619, WO91/17271, WO92/20791, WO92/15679, WO93/01288, WO92/01047 і WO92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay, et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85 (1992); Huse, et al., Science, 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); Griffiths, et al., EMBO J., 12:725-734 (1993); Hawkins, et al., J. Моl. Biol, 226:889-896 (1992); Clackson, et al., Nature.352:624-628 (1991); Gram, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580 (1992); Garrad, et al., Bio/Technology, 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom, et al., Nuc.Acid Res, 19:4133-4137 (1991); Barbas, et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA, 88:7978-7982 (1991); і Griffiths, et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994); які 34 наведені тут повністю шляхом посилання). Інший спосіб одержання бібліотеки антитіл для використання у способах фагового дисплею включає стадії імунізації тварини, яка не є людиною, яка містить ділянки імуноглобулінів людини, за допомогою Р-кадгерину або його антигенної частини для виклику імунної реакції, виділення у імунізованих тварин клітин, які продукують антитіла; виділення з одержаних клітин РНК, що кодує важкі і легкі ланцюги антитіл за винаходом, зворотної транскрипції РНК для одержання кДНК, ампліфікації кДНК з використанням праймерів і вставляння кДНК у вектор фагового дисплею таким чином, щоб антитіла експресувалися у фагу. Для одержання таких сукупностей необхідно іморталізувати В-клітини від імунізованої тварини. Переважно, первинні В-клітини можна безпосередньо використовувати як джерело ДНК. Суміш кДНК, які одержують з В-клітин, наприклад, одержаних з селезінок, використовують для одержання бібліотеки експресії, наприклад, бібліотеки фагового дисплею, що трансфікується в Е. соlі. У кінцевому результаті, у бібліотеці виявляють клони, що володіють бажаною величиною афінності зв'язування антигену, а ДНК, яка кодує відповідальний за таке зв'язування продукт, виділяють і обробляють для звичайної рекомбінантної експресії. Також бібліотеки фагового дисплею можна конструювати з використанням заздалегідь оброблених послідовностей нуклеотидів і подібним чином піддавати скринінгу. Як правило, кДНК, що кодують важкі і легкі ланцюги, надають окремо або у зв'язаному вигляді для формування аналогів Fv для продукції у фаговій бібліотеці. Потім фагову бібліотеку скринують на предмет антитіл з найвищою афінністю до Р-кадгерину, і з відповідного клону виділяють генетичний матеріал. Додаткові стадії скринінгу можуть підвищувати афінність вихідного антитіла, що виділяється. В одному з варіантів здійснення для виділення і одержання антитіл проти Р-кадгерину людини, що володіють бажаними характеристиками, антитіло проти Р-кадгерину людини, як описано у даній заявці, спочатку використовують для відбору послідовностей важких і легких ланцюгів людини з подібною активністю зв'язування відносно Ркадгерину, застосовуючи способи одержання відбитків епітопу, описані у публікації РСТ №WO 93/06213, яка наведена тут повністю шляхом посилання. Переважно, бібліотеки антитіл, що використовуються у даному способі, являють собою бібліотеки scFv, що одержують і скринують, як описано у публікації РСТ №WO92/01047, McCafferty, et al., Nature, 348:552-554 (1990); і Griffiths, et al., EMSO J.12:725-734 (1993), всі з яких наведені тут повністю шляхом посилання. Бібліотеки антитіл scFv можна скринувати з використанням Р-кадгерину людини як антигену. Фагову бібліотеку скринують на предмет антитіл з найвищою афінністю до Р-кадгерину, і виділяють генетичний матеріал з відповідного клону. Додаткові стадії скринінгу можуть підвищувати афінність вихідного антитіла, що виділяється. Потім, після відбору вихідних доменів VL і VH людини, можна здійснювати експерименти "змішу 35 вання і порівняння", в яких різні пари початково вибраних ділянок VL і VH скринують на предмет зв'язування Р-кадгерину для відбору переважних поєднань пар VL/VH· Ці експерименти зі змішування і порівняння також можна здійснювати після того, як ділянки VL і VH були випадковим чином змінені мутацією для оптимізації зв'язування, як описано нижче. Крім того, для подальшого поліпшення якості антитіла ділянки VL і VH з переважної пари(пар) VL/VH можна випадковим чином змінювати мутацією, переважно, у ділянці CDR3 VH і/або VL, у процесі, аналогічному до процесу соматичних мутацій in vivo, який відповідальний за дозрівання афінності антитіл у ході природної імунної реакції. Наприклад, таке дозрівання афінності in vitro можна здійснювати ампліфікуванням доменів VH і VL з використанням праймерів для PCR, які комплементарні CDR3 VH або CDR3 VL, відповідно, де праймери були "доповнені" у визначених положеннях випадковою сумішшю з чотирьох нуклеотидних основ таким чином, що одержувані продукти PCR кодують ділянки VH і VL, у ділянки CDR3 VH і/або VL яких були введені випадкові мутації. Ці змінені випадковою мутацією ділянки VH і VL можна повторно скринувати на предмет зв'язування з Ркадгерином, і можна відбирати послідовності, які володіють високою афінністю і низькою швидкістю зворотної реакції для Р-кадгерину. Як описано раніше, деякі послідовності CDR3 VH і VL за даним винаходом, які були змінені випадковою мутацією і володіли поліпшеною афінністю, вказані за допомогою SEQ ID №№:91-256 і 257-319. Після скринінгу і виділення антитіла проти Ркадгерину за винаходом з рекомбінантної бібліотеки дисплею імуноглобулінів нуклеїнові кислоти, що кодують вибране антитіло, можна виділяти з упаковки дисплею (наприклад, з геному фагу) і субклонувати в інші вектори експресії загальноприйнятими способами рекомбінантної ДНК. За бажанням, нуклеїнову кислоту можна додатково обробляти для одержання інших форм антитіла за даним винаходом, як описано нижче. Для експресії рекомбінантного антитіла людини, що виділяється скринінгом комбінаторної бібліотеки, ДНК, що кодує антитіло, клонують у рекомбінантний вектор експресії і вводять у клітину-хазяїна, як описано нижче. Імунізація В іншому варіанті здійснення антитіла проти Ркадгерину людини можна одержувати за допомогою імунізації трансгенної тварини, яка не є людиною, що містить у своєму геномі деякі або всі ділянки важких і легких ланцюгів імуноглобуліну людини з антигеном Р-кадгерину. Наприклад, тварина, яка не є людиною, може являти собою тварину XENOMOUSE™. (Abgenix, Inc., Fremont, СА). Миші XENOMOUSE™ являють собою сконструйовані лінії мишей, що містять великі фрагменти ділянок важкого ланцюга і легкого ланцюга імуноглобуліну людини і є дефектними щодо продукції мишачих антитіл. Див., наприклад, Green, et al., Nature Genetics, 7:13-21 (1994) і патенти США №№5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598, 6130364, 6162963 і 6150584. Див. також WO 91/10741, WO 94/02602, 95775 36 WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 і WO 00/037504. Описані у цих документах способи можна змінювати, як описано у патенті США №5994619, який наведений тут повністю шляхом посилання. У патенті США №5994619 описані способи одержання нових клітин і клітинних ліній внутрішньоклітинної маси, що культивується, (СІСМ), які одержують від свиней і корів, і трансгенних клітин СІСМ, в які була вставлена гетерологічна ДНК. Трансгенні клітини СІСМ можна використовувати для одержання клонованих трансгенних ембріонів, зародків і потомства. Також у патенті '619 описані способи одержання трансгенних тварин, здатних передавати гетерологічну ДНК своїм нащадкам. Приклади тварин, що не є людиною, які можна використовувати у цих способах, включають щурів, овець, свиней, кіз, велику рогату худобу, курчат і коней. Миші XENOMOUSE™ продукують подібну до тієї, що належить дорослій людині, сукупність антитіл, що повністю є людськими, а також продукують антигенспецифічні антитіла людини. У деяких варіантах здійснення миші XENOMOUSE™ містять приблизно 80 % сукупності генів V антитіла людини внаслідок введення фрагментів ділянок важкого ланцюга людини і ділянок легкого ланцюга каппа у конфігурації зародкової лінії, величиною у мільйон пар основ, у штучну хромосому дріжджів (YAC). В інших варіантах здійснення миші XENOMOUSE™ додатково містять приблизно всі ділянки легкого ланцюга лямбда людини. Див. Mendez, et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp.Med., 188:483-495 (1998) і WO 98/24893, описи яких наведені тут повністю шляхом посилання. У деяких варіантах здійснення тварина, яка не є людиною, що містить гени імуноглобулінів людини, являє собою тварин, які володіють "мініділянками" імуноглобулінів людини. У способі мініділянок екзогенну ділянку Ig імітують за допомогою включення окремих генів з ділянки Ig. Таким чином, один або декілька генів VH, один або декілька генів DH, один або декілька генів JH, константний домен мю і другий константний домен (переважно, константний домен гамма) формують у вигляді конструкта для введення тварині. Цей спосіб описаний у патентах США №№5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 і 5643763, наведених тут повністю шляхом посилання. Потім тварин, що не є людиною, як описано вище, можна імунізувати антигеном Р-кадгерину, як описано нижче, в умовах, що дозволяють продукцію антитіл. У тварин виділяють клітини, що продукують антитіла, а з виділених клітин, що продукують антитіла, або з іморталізованої клітинної лінії, одержаної з таких клітин, виділяють нуклеїнові кислоти, які кодують важкі і легкі ланцюги цікавлячого антитіла проти Р-кадгерину. Потім ці нуклеїнові кислоти конструюють з використанням способів, відомих фахівцям у даній галузі, і, як додатково описано нижче, для зниження кількості послідовності, що не є людською, тобто для гума 37 нізування антитіла для ослаблення імунної реакції у людини. У деяких варіантах здійснення антиген Ркадгерину може являти собою виділений і/або очищений Р-кадгерин. У деяких варіантах здійснення антиген Р-кадгерину являє собою Ркадгерин людини. В інших варіантах здійснення антиген Р-кадгерину може являти собою клітину, що експресує або надекспресує Р-кадгерин. В інших варіантах здійснення антиген Р-кадгерину являє собою рекомбінантний білок, щоекспресується за допомогою рекомбінантного способу у дріжджах, клітинах комах, бактеріях, таких як Е. соli, або інших джерелах. Імунізацію тварин можна проводити будь-яким відомим у даній галузі способом. Див., наприклад, Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual. New York:Cold Spring Harbor Press (1990). Способи імунізації тварин, які не є людиною, таких як миші, щурі, вівці, кози, свині, велика рогата худоба і коні, добре відомі у даній галузі. Див., наприклад, Harlow and Lane, вище, і патент США №5994619. Наприклад, антиген Р-кадгерину можна вводити разом з ад'ювантом для стимуляції імунної реакції. Приклади ад'ювантів включають повний або неповний ад'ювант Фрейнда, RIBI (дипептиди мурамілу) або ISCOM (імуностимулюючі комплекси). Такі ад'юванти можуть захищати поліпептид від швидкого диспергування за допомогою його ізоляції у місцевому відкладенні, або вони можуть містити речовини, що стимулюють організм-хазяїн секретувати фактори, які є хемотаксичними для макрофагів та інших компонентів імунної системи. Переважно, у випадку введення поліпептиду схема імунізації включає два або більше введень поліпептиду, що проводяться протягом декількох тижнів. Наприклад, після імунізації трансгенної тварини за допомогою Р-кадгерину, як описано вище, у імунізованої трансгенної тварини можна виділяти первинні клітини (наприклад, В-клітини селезінки або периферичної крові) і можна виявляти окремі клітини, що продукують антитіла, які специфічні до бажаного антигену. Потім з кожної окремої клітини виділяють поліаденільовану мРНК і проводять полімеразну ланцюгову реакцію зі зворотною транскрипцією (RT-PCR), використовуючи смислові праймери для відпалу з послідовностями варіабельних областей (наприклад, вироджені праймери, що розпізнають більшість або всі ділянки FR1 генів варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів людини, а також антисмислові праймери для відпалу з послідовностями константної області або з'єднувальної області). Потім кДНК варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів клонують і експресують у будь-якій прийнятній клітині-хазяїні, наприклад, мієломній клітині, у вигляді химерних антитіл з відповідними константними областями імуноглобулінів, такими як константні домени важкого ланцюга і константні домени або . Див. Babcook, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:784348, (1996), наведену тут повністю шляхом посилання. Потім антитіла проти Р-кадгерину можна виявляти і виділяти, як описано у даній заявці. Рекомбінантні способи одержання антитіл 95775 38 Антитіло або частину антитіла за винаходом можна одержувати рекомбінантною експресією генів легкого і важкого ланцюгів імуноглобуліну у клітині-хазяїні. Наприклад, для рекомбінантної експресії антитіла клітину-хазяїна трансфікують одним або декількома рекомбінантними векторами експресії, що несуть фрагменти ДНК, які кодують імуноглобулінові легкі і важкі ланцюги антитіла таким чином, що легкі і важкі ланцюги експресуються у клітині-хазяїні і, переважно, секретуються у середовищі, в якому культивують клітинихазяїни, де з такого середовища можна виділяти антитіла. Для одержання генів важкого і легкого ланцюгів антитіла, для вбудовування цих генів у рекомбінантні вектори експресії і для введення векторів у клітини-хазяїни використовують загальноприйняті способи рекомбінантної ДНК, такі як способи, описані у Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M., et al., (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) і у патенті США №4816397, описи яких наведені тут повністю шляхом посилання. Мутації і модифікації Для експресії антитіл проти Р-кадгерину за даним винаходом фрагменти ДНК, що кодують ділянки VH і VL, можна спочатку одержувати з використанням будь-якого з вказаних вище способів. Також у послідовності ДНК можна вводити різні мутації, делеції і/або додатки з використанням способів, відомих фахівцям у даній галузі. Наприклад, мутагенез можна здійснювати з використанням загальноприйнятих способів, таких як мутагенез, що опосередковується PCR, при якому змінені мутацією нуклеотиди вбудовують у праймери для PCR таким чином, що продукт PCR містить бажані мутації, або сайт-направлений мутагенез. Наприклад, одним з типів замін, які можна здійснювати, є заміна в антитілі одного або декількох цистеїнів, які можуть бути хімічно реакційноздатні, на інший залишок, такий як, без обмежень, аланін або серин. Наприклад, це може бути заміна неканонічного цистеїну. Заміну можна проводити у CDR або каркасній області варіабельного домену або у константному домені антитіла. У деяких варіантах здійснення цистеїн є канонічним. Також антитіла можна змінювати мутацією у варіабельних доменах важкого і/або легкого ланцюгів, наприклад, для зміни зв'язувальної властивості антитіла. Наприклад, мутацію можна здійснювати в одній або декількох ділянках CDR для збільшення або зменшення величини KD антитіла відносно Р-кадгерину, збільшення або зменшення величини кзвор або зміни специфічності зв'язування антитіла. Способи сайт-направленого мутагенезу добре відомі у даній галузі. Див., наприклад, Sambrook, et al., and Ausubel, et al., вище, наведений тут повністю шляхом посилання. Наприклад, як більш детально описано у прикладі 8, множина варіантів послідовностей CDR3 VH і VL з батьківської 129-1с4 була одержана відповідно до описаних вище способів і вказана як SEQ ID №№:91-256 (варіанти CDR3 VH) і SEQ ID №№:257319 (варіанти CDR3 VL) на фіг.1. 39 Також мутацію можна здійснювати у каркасній області або константному домені для підвищення часу напівжиття антитіла проти Р-кадгерину. Див., наприклад, публікацію РСТ №WO 00/09560, наведену тут повністю шляхом посилання. Також мутацію у каркасній області або константному домені можна здійснювати для зміни імуногенності антитіла, забезпечення ділянки для ковалентного або нековалентного зв'язування з іншою молекулою або для зміни таких властивостей, як зв'язування комплементу, зв'язування FcR або залежна від антитіла, опосередковувана клітинами цитотоксичність (ADCC). За винаходом окреме антитіло може мати мутації у будь-якій одній або декількох CDR або каркасних областях варіабельного домену або у константному домені. У способі, відомому як "приведення до стану зародкової лінії" визначені амінокислоти у послідовностях VH і VL можна змінювати мутацією для співпадання з амінокислотами, які зустрічаються у природі у послідовностях VH і VL зародкової лінії. Зокрема, амінокислотні послідовності каркасних областей у послідовностях VH і VL можна змінювати мутацією для співпадання з послідовностями зародкової лінії для зниження ризику розвитку імуногенності при введенні антитіла. Послідовності ДНК зародкової лінії для генів VH і VL людини відомі у даній галузі (див., наприклад, базу даних послідовностей зародкової лінії людини "Vbase"; див. також Kabat, Ε. Α., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest.Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, публікація NIH №91-3242; Tomlinson, et al., (1992) J. Моl. Biol. 227:776-798; і Cox, et al., Eur.J. Immunol. 24:827-836 (1994); змісти кожної з яких в явній формі наведені тут повністю шляхом посилання). Інший тип амінокислотної заміни, яку можна здійснювати, являє собою усунення можливих ділянок протеолізу в антитілі. Такі ділянки можуть виникати у CDR або каркасній області варіабельного домену або у константному домені антитіла. Заміна залишків цистеїну і усунення ділянок протеолізу можуть знижувати ризик гетерогенності у продукті антитіла і таким чином підвищувати його гомогенність. Інший тип амінокислотної заміни проводять для видалення пар аспарагін-гліцин, що формують можливі ділянки дезамідування, за допомогою зміни одного або обох залишків. В іншому прикладі можна розщеплювати С-кінцевий лізин важкого ланцюга антитіла проти Р-кадгерину за винаходом. У різних варіантах здійснення винаходу важкі і легкі ланцюги антитіл проти Р-кадгерину можуть, необов'язково, містити N-кінцеву сигнальну послідовність, таку як послідовності, вказані у SEQ ID №№:346 і 347. Після одержання фрагментів ДНК, що кодують ділянки VH і VL за даним винаходом, ці фрагменти ДНК можна додатково обробляти загальноприйнятими способами рекомбінантної ДНК, наприклад, перетворювати гени варіабельних областей у гени повнорозмірних ланцюгів антитіла, у гени фрагментів Fab або у ген scFv. При цих обробках фрагмент ДНК, що кодує VH або VL, функціонально зв'язують з іншим фрагментом ДНК, що кодує інший білок, такий як константна область антитіла 95775 40 або гнучкий лінкер. Як використовують у даному контексті, термін "функціонально зв'язаний" призначений для позначення того, що два фрагменти ДНК з'єднані таким чином, що амінокислотні послідовності, які кодуються двома фрагментами ДНК, залишаються в одній рамці зчитування. Виділену ДНК, що кодує ділянку VH, можна перетворювати у ген повнорозмірного важкого ланцюга за допомогою функціонального зв'язування ДНК, що кодує VH, з іншою молекулою ДНК, що кодує константні області важкого ланцюга (СН1, СН2 і СН3). Послідовності генів константної області важкого ланцюга людини відомі у даній галузі (див., наприклад, Kabat, Ε. Α., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., U.S.Department of Health and Human Services, публікація NIH №91-3242), а фрагменти ДНК, що містять ці ділянки, можна одержувати загальноприйнятою ампліфікацією за допомогою PCR. Константна область важкого ланцюга може являти собою константну область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD, але найбільш переважно, вона являє собою константну область IgG1 або IgG2. Послідовність константної області IgG1 може являти собою будь-який з різних алелів або алотипів, які, як відомо, зустрічаються у різних індивідуумів, наприклад, Gm(1), Gm(2), Gm(3) і Gm(17). Ці алотипи відображають виникаючу у природі амінокислотну заміну у константних областях IgG1. Наприклад, константна область важкого ланцюга IgG1 може являти собою SEQ ID №:344. У випадку гена фрагмента Fab важкого ланцюга ДНК, що кодує VH, можна функціонально зв'язувати з іншою молекулою ДНК, що кодує тільки константну область важкого ланцюга СН1. Константну область важкого ланцюга СН1 можна одержувати з будь-якого з генів важкого ланцюга. Виділену ДНК, що кодує ділянку VL, можна перетворювати у ген повнорозмірного легкого ланцюга (а також у ген Fab легкого ланцюга) за допомогою функціонального зв'язування ДНК, що кодує VL, з іншою молекулою ДНК, що кодує константну область легкого ланцюга, CL. Послідовності генів константної області легкого ланцюга людини відомі у даній галузі (див., наприклад, Kabat, Ε. Α., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., U.S.Department of Health and Human Services, публікація NIH №91-3242), а фрагменти ДНК, що містять ці ділянки, можна одержувати загальноприйнятою ампліфікацією за допомогою PCR. Константна область легкого ланцюга може являти собою константну область каппа або лямбда. Константна область каппа може являти собою будь-який з різних апелів, які, як відомо, зустрічаються у різних індивідуумів, наприклад, Inv(1), Inv(2) і Inv(3). Константну область лямбда можна одержувати з будь-якого з трьох генів лямбда. Наприклад, константна область легкого ланцюга IgG1 може являти собою SEQ ID №:347. Для одержання гена scFv фрагменти ДНК, що кодують VH і VL, функціонально зв'язують з іншим фрагментом, що кодує гнучкий лінкер, наприклад, кодує амінокислотну послідовність (Gly4-Ser)3 таким чином, що послідовності VH і VL можуть експресуватися у вигляді безперервного одноланцю 41 жкового білка, де ділянки VL і VH з'єднані гнучким лінкером (див., наприклад, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883 (1988); McCafferty, et al., Nature, 348:552-554 (1990)). Одноланцюжкове антитіло може бути моновалентним, якщо використовують тільки один VH і VL, бівалентним, якщо використовують два VH і VL, або полівалентним, якщо використовують більше двох VH і VL. Можна одержувати біспецифічні або полівалентні антитіла, що зв'язуються специфічно з Р-кадгерином та іншою молекулою. В іншому варіанті здійснення можна одержувати злите антитіло або імуноадгезивну речовину, які містять всі або ділянку антитіла проти Ркадгерину за винаходом, зв'язані з іншим поліпептидом. В іншому варіанті здійснення з поліпептидом зв'язані тільки варіабельні домени антитіла проти Р-кадгерину. В іншому варіанті здійснення домен VH антитіла проти Р-кадгерину зв'язаний з першим поліпептидом, тоді як домен VL антитіла проти Р-кадгерину зв'язаний з другим поліпептидом, який об'єднаний з першим поліпептидом таким чином, що домени VH і VL можуть взаємодіяти один з одним, утворюючи антигензв'язувальну частину. В іншому варіанті здійснення домен VH відділений від домену VL лінкером таким чином, що домени VH і VL можуть взаємодіяти один з одним. Потім антитіло VH-лінкер-VL зв'язують з цікавлячим поліпептидом. Крім того, можна одержувати злиті антитіла, в яких два (або більше) одноланцюжкових антитіла зв'язані одне з одним. Це є ефективним при бажанні одержати двовалентне або полівалентне антитіло на одному поліпептидному ланцюгу або при бажанні одержати біспецифічне антитіло. В інших варіантах здійснення можна одержувати інші модифіковані антитіла з використанням молекул нуклеїнових кислот, що кодують антитіло проти Р-кадгерину. Наприклад, "каппа-тіла" (III, et al., Protein Eng.10:949-57 (1997)), "міні-тіла" (Martin, et al., EMBO J., 13:5303-9 (1994)), "димери" (Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:64446448 (1993)) або "Janusins" (Traunecker, et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) і Traunecker, et al., Int. J. Cancer, (Suppl.) 7:51-52 (1992)) можна одержувати з використанням загальноприйнятих способів молекулярної біології відповідно до вказівок в описі. Біспецифічні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти можна одержувати множиною способів, у тому числі злиттям гібридом або зв'язуванням 1 фрагментів Fab . Див., наприклад, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990), Kostelny, et al., J. Immunol, 148:1547-1553 (1992). Крім того, біспецифічні антитіла можна формувати у вигляді "димерів" або "Janusins". У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло зв'язується з двома різними епітопами Р-кадгерину. У деяких варіантах здійснення описані вище модифіковані антитіла одержують з використанням одного або декількох варіабельних доменів або ділянок CDR з наданого у даній заявці антитіла проти Ркадгерину людини. Вектори і клітини-хазяіни 95775 42 Для експресії антитіл і антигензв'язувальних частин за винаходом ДНК, що одержують, як описано вище, які кодують частини або повнорозмірні легкі і важкі ланцюги, вбудовують у вектори експресії таким чином, що гени виявляються функціонально зв'язаними з послідовностями, які контролюють транскрипцію і трансляцію. У цьому контексті термін "функціонально зв'язаний" призначений для позначення того, що ген антитіла лігований у вектор таким чином, що контролюючі транскрипцію і трансляцію послідовності у векторі виконують призначену ним функцію регуляції транскрипції і трансляції гена антитіла. Вектор експресії і контролюючі експресію послідовності вибирають, щоб вони були сумісні з використовуваною для експресії клітиноюхазяїном. Вектори експресії включають плазміди, ретровіруси, аденовіруси, аденоасоційовані віруси (AAV), віруси рослин, такі як вірус мозаїки цвітної капусти, вірус тютюнової мозаїки, косміди, YAC, епісоми, що одержують з EBV, і т.п. Ген антитіла лігують у вектор таким чином, що контролюючі транскрипцію і трансляцію послідовності у векторі виконують призначену ним функцію регуляції транскрипції і трансляції гена антитіла. Вектор експресії і контролюючі експресію послідовності вибирають, щоб вони були сумісні з використовуваною для експресії клітиноюхазяїном. Ген легкого ланцюга антитіла і ген важкого ланцюга антитіла можна вставляти в окремі вектори. У переважному варіанті здійснення обидва гени вставляють в один і той же вектор експресії. Гени антитіла вставляють у вектор експресії загальноприйнятими способами (наприклад, лігуванням комплементарних ділянок рестрикції у фрагменті гена антитіла і векторі або лігуванням тупих кінців у випадку відсутності ділянок рестрикції). Зручним вектором є вектор, що кодує функціонально повну послідовність СH або CL імуноглобуліну людини разом з відповідними ділянками рестрикції, які сконструйовані таким чином, що будь-яку послідовність VH або VL можна легко вставляти і експресувати, як описано вище. У таких векторах сплайсинг звичайно відбувається між донорською ділянкою сплайсингу у вставленій ділянці J і акцепторною ділянкою сплайсингу, що передує домену С людини, а також у ділянках сплайсингу, що виникають в екзонах СH людини. Поліаденілювання і термінація транскрипції відбуваються у природних ділянках хромосом, розташованих нижче кодуючих ділянок. Також рекомбінантний вектор експресії може кодувати сигнальний пептид, що сприяє секреції ланцюга антитіла з клітини-хазяїна. Ген ланцюга антитіла можна клонувати у вектор таким чином, що сигнальний пептид виявляється зв'язаним в одній рамці зчитування з амінокінцевою ділянкою ланцюга імуноглобуліну. Сигнальний пептид може являти собою сигнальний пептид імуноглобуліну або гетерологічний сигнальний пептид (тобто сигнальний пептид з білка, що не належить до імуноглобулінів). Крім генів ланцюгів антитіла, рекомбінантні вектори експресії за винаходом містять регуляторні 43 послідовності, що контролюють експресію генів ланцюгів антитіла у клітині-хазяїні. Фахівці у даній галузі розуміють, що схема вектора експресії може залежати від таких факторів, як вибір клітинихазяїна, що підлягає трансформації, бажаний рівень експресії білка і т.п. Переважні регуляторні послідовності для експресії у клітину-хазяїна ссавця включають в себе вірусні елементи, що приводять до експресії білка у клітинах ссавців на високих рівнях, наприклад, промотори і/або енхансери, що одержують з ретровірусних LTR, цитомегаловірусу (CMV) (наприклад, промотор/енхансер CMV), вірус мавпи 40 (SV40) (наприклад, промотор/енхансер SV40), аденовірусу (наприклад, основний пізній промотор аденовірусу (AdMLP)), поліоми, а також такі сильні промотори ссавців, як природні промотори імуноглобулінів і актину. Для додаткового опису вірусних регуляторних елементів і їх послідовностей див., наприклад, патент США №5168062, патент США №4510245 і патент США №4968615. Способи експресії антитіл у рослинах, включаючи опис промоторів і векторів, а також трансформації рослин, відомі у даній галузі. Див., наприклад, патент США №6517529, наведений тут повністю шляхом посилання. Також у даній галузі добре відомі способи експресії поліпептидів у бактеріальних клітинах або клітинах грибів, наприклад, дріжджових клітинах. Крім генів ланцюгів антитіла і регуляторних послідовностей, рекомбінантні вектори експресії за винаходом можуть містити додаткові послідовності, такі як послідовності, що регулюють реплікацію вектора у клітинах-хазяїнах (наприклад, ділянки ініціації реплікації), і гени маркерів, що селектуються. Ген маркера, що селектується, сприяє селекції клітин-хазяїнів, в які був введений вектор (див., наприклад, патенти США №№4399216, 4634665 і 5179017, наведені тут повністю шляхом посилання). Наприклад, звичайно ген маркера, що селектується, надає стійкість до лікарських засобів, таких як G418, гігроміцин або метотрексат, у клітині-хазяїні, в яку був введений вектор. Переважні гени маркерів, що селектуються, включають ген дигідрофолат-редуктази (DHFR) (для використання у dhfr-клітинах-хазяїнах разом з селекцією/ампліфікацією метотрексату), ген неоміцин-фосфотрансферази (для селекції G418) і ген глутамат-синтетази. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують антитіла проти Р-кадгерину, і вектори, що містять ці молекули нуклеїнових кислот, можна використовувати для трансфекції прийнятної клітини-хазяїна ссавців, рослин, бактерій або дріжджів. Трансформацію можна здійснювати будь-яким відомим способом для введення полінуклеотидів у клітинухазяїна. Способи введення гетерологічних полінуклеотидів у клітини ссавців добре відомі у даній галузі і включають трансфекцію, опосередковувану декстраном, осадження фосфатом кальцію, трансфекцію, опосередковувану полібреном, злиття протопластів, електропорацію, введення полінуклеотиду(ів) у ліпосоми і пряму мікроін'єкцію ДНК в ядра. Крім того, молекули нуклеїнових кислот можна вводити у клітини ссавців за допомогою вірусних векторів. Способи трансформації клітин 95775 44 добре відомі у даній галузі. Див., наприклад, патенти США №№4399216, 4912040, 4740461 і 4959455, наведені тут повністю шляхом посилання. Способи трансформації рослинних клітин добре відомі у даній галузі, включаючи, наприклад, трансформацію, опосередковувану Agrobacterium, біолістичну трансформацію, пряму ін'єкцію, електропорацію і вірусну трансформацію. Також у даній галузі добре відомі способи трансформації бактеріальних і дріжджових клітин. Лінії клітин ссавців, доступні як клітини-хазяїни для експресії, добре відомі у даній галузі і включають множину іморталізованих клітинних ліній, доступних в Американській колекції типових культур (АТСС). Наприклад, вони включають в себе клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітини NSO, клітини SP2, клітини НЕК-293Т, клітини NIH-3T3, клітини HeLa, ембріональні клітини нирки хом'ячка (ВНК), клітини нирки африканської зеленої мавпи (COS), клітини гепатоцелюлярної карциноми людини (наприклад, Hep G2), клітини А549 і множину інших ліній клітин. Особливо переважні лінії клітин вибирають, визначаючи, які з клітинних ліній володіють експресією на високому рівні. Інші лінії клітин, які можна використовувати, являють собою лінії клітин комах, наприклад, клітини Sf9 або Sf21. У випадку введення рекомбінантних векторів експресії, що кодують гени антитіла, у клітини-хазяїни ссавців антитіла одержують за допомогою культивування клітин-хазяїнів протягом періоду часу, достатнього для надання можливості експресії антитіла у клітинах-хазяїнах або, більш переважно, для секреції антитіла у культуральне середовище, в якому вирощують клітини-хазяїни. Антитіла можна виділяти з культурального середовища з використанням загальноприйнятих способів очищення білків. Рослинні клітини-хазяїни включають в себе, наприклад, Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурудзу, пшеницю, картоплю і т.п. Бактеріальні клітини-хазяїни включають види Е. соli і Streptomyces. Дріжджові клітини-хазяїни включають Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae і Pichia pastoris. Крім того, експресію антитіл за винаходом у продукуючих клітинних лініях можна підвищувати з використанням множини відомих способів. Наприклад, загальноприйняті способи підвищення експресії у визначених умовах являють собою системи експресії глутамін-синтетази (система GS) і гена DHFR. Клітинні клони з високою експресією можна виявляти з використанням загальноприйнятих способів, таких як клонування серійним розведенням і спосіб мікрокрапель. Система GS описана в європейських патентах №№0216846, 0256055, 0323997 і 0338841. Ймовірно, антитіла, що експресуються різними лініями клітин або у трансгенних тваринах, відрізняються одне від одного різним глікозилуванням. Однак, всі антитіла, які кодуються наданими у даній заявці молекулами нуклеїнових кислот або які містять надані у даній заявці послідовності амінокислот, є частиною даного винаходу незалежно від глікозилування антитіл. Трансгенні тварини і рослини 45 Також антитіла проти Р-кадгерину за винаходом можна одержувати трансгенно за допомогою розмноження ссавця або рослини, які є трансгенними відносно цікавлячих послідовностей важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну, і одержання з них антитіла у придатній для виділення формі. Застосовно до трансгенної продукції у ссавцях антитіла проти Р-кадгерину можна одержувати в і виділяти з молока кіз, корів або інших ссавців. Див., наприклад, патенти США №№5827690, 5756687, 5750172 і 5741957, наведені тут повністю шляхом посилання. У деяких варіантах здійснення трансгенних тварин, що не є людиною, які містять ділянки імуноглобулінів людини, імунізують Ркадгерином або його імуногенною частиною, як описано вище. Способи одержання антитіл у рослинах описані, наприклад, у патентах США №№6046037 і 5959177, наведених тут повністю шляхом посилання. У деяких варіантах здійснення трансгенні тварини, що не є людиною, або рослини одержують введенням загальноприйнятими трансгенними способами у тварину або рослину однієї або декількох молекул нуклеїнових кислот, що кодують антитіло проти Р-кадгерину або його антигензв'язувальну частину за винаходом. Див. Hogan і патент США №6417429, вище. Трансгенні клітини, що використовуються для одержання трансгенної тварини, можуть являти собою ембріональні стовбурові клітини або соматичні клітини, або запліднену яйцеклітину. Трансгенні організми, що не є людиною, можуть бути химерними, нехимерними гетерозиготами і нехимерними гомозиготами. Див., наприклад, Hogan et al., Manipulating the Mouse n Embryo:A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson, et al., Mouse Genetics and Transgenics:A Practical Approach, Oxford University Press (2000); і Pinkert, Transgenic Animal Technology:A Laboratory Handbook, Academic Press (1999), всі з яких наведені тут повністю шляхом посилання. У деяких варіантах здійснення трансгенні тварини, що не є людиною, містять заданий розрив і заміну за допомогою націленого конструкта, що кодує цікавлячий важкий ланцюг і/або легкий ланцюг. Антитіла проти Р-кадгерину можна одержувати у будь-якій трансгенній тварині. У переважному варіанті здійснення тварини, що не є людиною, являють собою мишей, щурів, овець, свиней, кіз, велику рогату худобу або коней. Трансгенні тварини, що не є людиною, експресують вказані поліпептиди, що кодуються, у крові, молоці, сечі, слині, слізній рідині, слизу та інших рідинах організму. Переключення класу Клас (наприклад, IgG, IgM, IgE, IgA або IgD) і підклас (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4) антитіл проти Р-кадгерину можна визначати будьяким відомим у даній галузі способом. Як правило, клас і підклас антитіла можна визначати з використанням антитіл, специфічних до конкретного класу і підкласу антитіла. Такі антитіла є комерційно доступними. Клас і підклас можна визначати за допомогою ELISA або Вестерн-блотингом, а також іншими способами. Альтернативно, клас і підклас можна визначати секвенуванням всіх або частини 95775 46 константних доменів важкого і/або легкого ланцюгів антитіл, порівнянням їх амінокислотних послідовностей з відомими амінокислотними послідовностями різного класу і підкласу імуноглобулінів і визначенням класу і підкласу антитіл. Антитіла проти Р-кадгерину за даним винаходом можуть являти собою молекулу IgG, IgM, IgE, IgA або IgD. Наприклад, антитіла проти Р-кадгерину можуть являти собою IgG, що належить до підкласу IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. В одному з варіантів здійснення антитіла проти Р-кадгерину можуть мати константну область важкого ланцюга, вказану за допомогою SEQ ID №:344, і константну область легкого ланцюга, вказану за допомогою SEQ ID №:345. В одному з аспектів винахід стосується способу перетворення класу або підкласу антитіла проти Р-кадгерину в інший клас або підклас. У деяких варіантах здійснення з використанням добре відомих у даній галузі способів виділяють молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує VL або VH, яка не містить послідовностей, що кодують CL або СH. Потім молекулу нуклеїнової кислоти функціонально зв'язують з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує CL або СH з імуноглобуліну бажаного класу або підкласу. Це можна здійснювати з використанням вектора або молекули нуклеїнової кислоти, що містить ланцюг CL або СH, як описано вище. Наприклад, клас антитіла проти Ркадгерину, що початково був IgM, можна переключити на IgG. Крім того, переключення класу можна використовувати для перетворення одного підкласу IgG в інший, наприклад, IgG1 в IgG2. Інший спосіб одержання антитіла за винаходом, що містить бажаний ізотип, включає стадії виділення нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг антитіла проти Р-кадгерину, і нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг антитіла проти Р-кадгерину, виділення послідовності, що кодує ділянку VH, лігування послідовності VH і послідовності, що кодує константний домен важкого ланцюга бажаного ізотипу, експресії гена легкого ланцюга і конструкта важкого ланцюга у клітині і одержання антитіла проти Ркадгерину бажаного ізотипу. Деімунізовані антитіла В іншому аспекті винаходу антитіла або їх антигензв'язу вальні частини можна деімунізувати для зниження їх імуногенності з використанням способів, описаних, наприклад, у публікаціях РСТ №№WO 98/52976 і WO 00/34317 (які наведені тут повністю шляхом посилання). Дериватизовані і мічені антитіла Антитіло проти Р-кадгерину або антигензв'язувальні частини за винаходом можна дериватизувати або зв'язувати з іншою молекулою (наприклад, іншим пептидом або білком). Як правило, антитіла або їх частини дериватизують таким чином, що дериватизація або мічення не впливають несприятливим чином на зв'язування Р-кадгерину. Відповідно, мають на увазі, що антитіла і ділянки антитіл за винаходом включають початкові і модифіковані форми антитіл проти Р-кадгерину людини, описані у даній заявці. Наприклад, антитіло або частину антитіла за винаходом можна функціонально зв'язувати (хімічним зв'язуванням, гене 47 тичним злиттям, нековалентним зв'язком або іншим способом) з однією або декількома іншими молекулами, такими як інше антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло або димер), засіб для реєстрації, мітка, цитотоксичний засіб, фармацевтичний засіб і/або білок або пептид, які здатні опосередковувати зв'язок антитіла або частини антитіла з іншою молекулою (наприклад, внутрішня область стрептавідину або полігістидинова мітка). Один з типів дериватизованого антитіла одержують за допомогою зшивання двох або більше антитіл (однакового типу або різного типу, наприклад, для одержання біспецифічних антитіл). Прийнятні засоби для зшивання включають засоби, які є гетеробіфункціональними, володіючи двома різними реакційноздатними групами, розділеними відповідним спейсером (наприклад, складний ефір м-малеімідобензоїл-N-гідроксисукциніміду), або є гомобіфункціональними (наприклад, суберат дисукцинімідилу). Такі лінкери доступні в Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Інший тип дериватизованого антитіла являє собою мічене антитіло. Ефективні засоби для реєстрації, за допомогою яких можна дериватизувати антитіло або антигензв'язувальну частину за винаходом, включають флуоресцентні сполуки, у тому числі флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, хлорид 5-диметиламін-1нафталінсульфонілу, фікоеритрин, лантанідні люмінофори і т.п. Також антитіло можна мітити ефективними для реєстрації ферментами, такими як пероксидаза хрону, β-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза, глюкозоксидаза і т.п. Якщо антитіло мітять ферментом, що піддається виявленню, то його виявляють додаванням додаткових реагентів, що використовуються ферментом для продукування продукту реакції, який можна реєструвати. Наприклад, коли присутній засіб у вигляді пероксидази хрону, то додавання пероксиду водню і діамінобензидину приводить до забарвленого продукту реакції, що піддається реєстрації. Також антитіло можна мітити біотином і виявляти непрямим вимірюванням зв'язування авідину або стрептавідину. Також антитіло можна мітити заздалегідь заданим поліпептидним епітопом, що розпізнається вторинним репортером (наприклад, парними послідовностями лейцинових застібок, ділянками зв'язування для вторинних антитіл, доменами зв'язування металів, епітопними мітками). У деяких варіантах здійснення мітки приєднують за допомогою спейсерних ділянок різної довжини для зниження можливої стеричної перешкоди. Також антитіло проти Р-кадгерину можна дериватизувати хімічною групою, такою як поліетиленгліколь (PEG), метильна або етильна група, або вуглеводна група. Ці групи ефективні для поліпшення біологічних характеристик антитіла, наприклад, для збільшення часу напівжиття у сироватці. Афінність зв'язування антитіл проти Ркадгерину з Р-кадгерином Афінність зв'язування (KD) і швидкість дисоціації (kзвор.) антитіла проти Ркадгерину або його антигензв'язувальної частини відносно Р-кадгерину можна визначати відомими у даній галузі способами. Афінність зв'язування можна вимірювати за допомогою ELISA, RIA, проточ 95775 48 ної цитометрії або поверхневого плазмонного резонансу, наприклад BIACORE™. Швидкість дисоціації можна вимірювати поверхневим плазмонним резонансом. Переважно, афінність зв'язування і швидкість дисоціації вимірюють поверхневим плазмонним резонансом. Більш переважно, афінність зв'язування і швидкість дисоціації вимірюють з використанням BIACORE™. Чи володіє антитіло практично такою ж величиною KD, що і антитіло проти Р-кадгерину, можна визначати з використанням відомих у даній галузі способів. Такі способи визначення KD і kзвор. можна використовувати у ході стадії початкового скринінгу, а також у ході подальших стадій оптимізації. Виявлення епітопів Р-кадгерину, розпізнаваних антитілами проти Р-кадгерину Винахід стосується антитіл проти Р-кадгерину людини, що зв'язуються з Р-кадгерином і конкурують або перехресно конкурують за і/або зв'язуються з тим же епітопом, що і будь-яке з антитіл, описаних у таблицях 1 або 2. Зв'язується антитіло з тим же епітопом або перехресно конкурує за зв'язування з антитілом проти Р-кадгерину за даним винаходом можна визначати з використанням відомих у даній галузі способів. В одному з варіантів здійснення антитілу проти Р-кадгерину за винаходом дозволяють зв'язуватися з Р-кадгерином у насичуючих умовах, а потім вимірюють здатність антитіла, що тестується, зв'язуватися з Р-кадгерином. Якщо антитіло, що тестується, здатне зв'язуватися з Ркадгерином у той же час, що і антитіло проти Ркадгерину, отже, антитіло, що тестується, зв'язується з епітопом, відмінним від епітопу для антитіла проти Р-кадгерину. Однак, якщо антитіло, що тестується, не здатне в один і той же час зв'язуватися з Р-кадгерином, отже, антитіло, що тестується зв'язується з тим самим епітопом, епітопом, що перекривається, або епітопом, який розташований безпосередньо близько від епітопу, що зв'язується антитілом проти Р-кадгерину людини. Цей експеримент можна проводити з використанням ELISA, RIA, BIACORE™ або проточної цитометрії. У переважному варіанті здійснення експеримент проводять з використанням ELISA. Інгібування активності Р-кадгерину антитілом проти Р-кадгерину Антитіла проти Р-кадгерину, що інгібують активність Р-кадгерину, можна виявляти з використанням множини аналізів. Наприклад, аналіз агрегації клітин забезпечує спосіб вимірювання клітинної агрегації, що залежить від Ркадгерину. У цьому типі аналізу використовують лінію клітин, що надекспресують Р-кадгерин, де клітини вмішують у суспензію і дозволяють утворювати скупчення, що залежать від Р-кадгерину. Потім аналіз агрегації використовують для кількісного визначення здатності антитіла проти Ркадгерину запобігати цій агрегації за допомогою вимірювання розміру клітинних скупчень, що утворюються за наявності і за відсутності антитіла. Потім розмір скупчення клітин як функцію концентрації антитіла проти Р-кадгерину можна використовувати для визначення величини ІС50. У прикладі 4 представлені додаткові подробиці аналізу залежної від Р-кадгерину агрегації, використаного 49 для вимірювання величин ІС50 для декількох антитіл проти Р-кадгерину. Також для вимірювання здатності антитіла проти Р-кадгерину блокувати адгезію клітин до рецептора Р-кадгерину, зафіксованого на твердому носії, можна використовувати аналізи клітинної адгезії. Наприклад, цей тип аналізу можна проводити за допомогою фіксування Р-кадгерину на твердому носії, такому як пластмаса. Потім клітинам, що надекспресують Р-кадгерин, дозволяють прикріплятися до твердого носія за допомогою взаємодій Р-кадгерин-Р-кадгерин. Після цього можна кількісно визначати ступінь адгезії за наявності і за відсутності антитіла проти Р-кадгерину. Потім величину адгезії як функцію концентрації антитіла використовують для визначення величини ІС50. У прикладі 3 представлені додаткові подробиці аналізу залежної від Р-кадгерину адгезії клітин, який використовували для вимірювання величин ІС50 для антитіл проти Р-кадгерину. Інгібування активності Р-кадгерину також можна вимірювати з використанням аналізу залежного від Р-кадгерину розпаду шароподібного утворення. Цей тип аналізу вимірює здатність антитіла проти Р-кадгерину руйнувати заздалегідь утворені клітинні скупчення, що залежать від Р-кадгерину. Величину ІС50 можна визначати за допомогою вимірювання зменшення розміру скупчень як функції концентрації антитіла. У прикладі 5 представлені додаткові подробиці аналізу залежного від Ркадгерину розпаду шароподібного скупчення, який використовували для вимірювання величин ІС50 для антитіл проти Р-кадгерину. Описані вище способи і аналізи для визначення інгібування активності Р-кадгерину різними антитілами або їх антигензв'язувальними частинами можна використовувати у ході стадії початкового скринінгу, а також у ході подальших стадій оптимізації. Молекулярна вибірність Вибірність антитіл проти Р-кадгерину за даним винаходом відносно інших кадгеринів, таких як Екадгерин, можна визначати з використанням добре відомих у даній галузі способів. Наприклад, вибірність можна визначати з використанням Вестернблотингу, проточної цитометрії, ELISA, імунопреципітації або RIA. У прикладі 7 представлені додаткові подробиці аналізу ELISA, який використовували для вимірювання вибірності специфічних антитіл відносно Р-кадгерину у порівнянні з Екадгерином. Описані вище способи і аналізи для визначення вибірності різних антитіл або їх антигензв'язувальних частин відносно Р-кадгерину можна використовувати у ході стадії початкового скринінгу, а також у ході подальших стадій оптимізації. Фармацевтичні композиції і введення Також даний винахід стосується фармацевтичної композиції для лікування патологічного клітинного росту у ссавця, у тому числі людини, яка містить кількість антитіла проти Р-кадгерину або його антигензв'язувальної частини, як описано у даній заявці, яка ефективна для лікування патологічного клітинного росту, а також містить фармацевтично прийнятний носій. 95775 50 Антитіла і антигензв'язувальні частини за даним винаходом можна включати у фармацевтичні композиції, прийнятні для введення індивідууму. Як правило, фармацевтична композиція містить антитіло або антигензв'язувальну частину за винаходом і фармацевтично прийнятний носій. У межах даної заявки "фармацевтично прийнятний носій" означає всі без виключення розчинники, диспергуючі середовища, покриття, протибактеріальні і протигрибкові засоби, ізотонічні засоби та засоби, що затримують всмоктування, і т.п., які є фізіологічно сумісними. Деякі приклади фармацевтично прийнятних носіїв являють собою воду, фізіологічний розчин, забуферений фосфатом фізіологічний розчин, декстрозу, гліцерин, етанол і т.п., а також їх поєднання. У багатьох випадках переважно включати у композицію ізотонічні засоби, наприклад, цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт, сорбіт, або хлорид натрію. Додаткові приклади фармацевтично прийнятних речовин являють собою зволожувачі або невеликі кількості допоміжних речовин, таких як зволожувачі або емульгатори, консерванти або буферні речовини, які підвищують термін зберігання або ефективність антитіла. Композиції за даним винаходом можуть знаходитися у множині форм, наприклад, рідкій, напівтвердій і твердій лікарських формах, таких як рідкі розчини (наприклад, розчини, що вводяться ін'єкцією та інфузією), дисперсії або суспензії, таблетки, пілюлі, порошки, ліпосоми і супозиторії. Переважна форма залежить від передбачуваного способу введення і терапевтичного застосування. Як правило, переважні композиції знаходяться у вигляді розчинів, що вводяться ін'єкцією або інфузією, наприклад, композиції, подібні до композицій, які використовують для пасивної імунізації людини. Переважним способом введення є парентеральний (наприклад, внутрішньовенний, підшкірний, внутрішньочеревинний, внутрішньом'язовий). У переважному варіанті здійснення антитіло вводять внутрішньовенною інфузією або ін'єкцією. В іншому переважному варіанті здійснення антитіло вводять внутрішньом'язовою або підшкірною ін'єкцією. Препарати для ін'єкції можуть знаходитися у вигляді стандартної лікарської форми, наприклад, в ампулах або контейнерах, що містять множину доз, за наявності або за відсутності консерванту, що додається. Композиції можуть знаходитися у вигляді таких форм, як суспензії, розчини або емульсії у масляних або водних носіях, а також можуть містити засоби, що сприяють складанню, такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі засоби. Альтернативно, активний інгредієнт може знаходитися у вигляді порошку для складання з прийнятним носієм, наприклад, стерильною апірогенною водою, перед використанням. Як правило, терапевтичні композиції повинні бути стерильними і стабільними в умовах виробництва і зберігання. Композицію можна складати у вигляді розчину, мікроемульсії, дисперсії, ліпосоми або іншої заданої структури, прийнятної для високої концентрації лікарського засобу. Стерильні розчини, що вводяться ін'єкцією, можна одержувати включенням антитіла проти Р-кадгерину у необ 51 хідній кількості у відповідний розчинник разом з одним або поєднанням описаних вище інгредієнтів, за необхідності, з подальшою стерилізацією фільтруванням. Як правило, дисперсії одержують включенням активної сполуки у стерильний носій, що містить основне дисперсне середовище та інші необхідні інгредієнти з числа тих, що вказані вище. У випадку стерильних порошків для одержання стерильних розчинів, що вводяться ін'єкцією, переважними способами одержання є сушіння у вакуумі і ліофілізація, що приводять до одержання порошку активного інгредієнта разом з будь-яким додатковим бажаним інгредієнтом з його заздалегідь стерилізованого фільтруванням розчину. Належну текучість розчину можна підтримувати, наприклад, з використанням такого покриття, як лецитин, за допомогою забезпечення необхідного розміру частинок у випадку дисперсії і за допомогою використання поверхнево-активних речовин. Тривале всмоктування композицій, що вводяться ін'єкцією, можна забезпечувати включенням у композицію засобу, що уповільнює всмоктування, наприклад, солей моностеарату і желатину. Антитіла або ділянки антитіл за даним винаходом можна вводити множиною відомих у даній галузі способів, хоча для багатьох варіантів терапевтичного застосування переважним способом/схемою введення є підшкірне, внутрішньом'язове введення або внутрішньовенна інфузія. Як розуміє фахівець у даній галузі, спосіб і/або схема введення відрізняються в залежності від бажаних результатів. У визначених варіантах здійснення композиції антитіла за даним винаходом можна одержувати разом з носієм, що запобігає швидкому вивільненню антитіла, наприклад, у вигляді препарату з контрольованим вивільненням, включаючи імплантати, трансдермальні пластири і системи доставки у мікрокапсулах. Можна використовувати біорозкладані, біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, складні поліортоефіри і полімер молочної кислоти. Як правило, фахівцям у даній галузі відома множина способів одержання таких складів. Див., наприклад, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, наведену тут повністю шляхом посилання. Також у композиції можна включати додаткові активні сполуки. У визначених варіантах здійснення інгібуюче антитіло проти Р-кадгерину за винаходом складають разом з і/або вводять разом з одним або декількома додатковими терапевтичними засобами. Ці засоби включають, без обмежень, антитіла, що зв'язують інші мішені, протипухлинні засоби, антиангіогенні засоби, інгібітори передачі сигналу, антипроліферативні засоби, хіміотерапевтичні засоби або пептидні аналоги, що інгібують Р-кадгерин. Для таких варіантів сумісної терапії можуть бути необхідні більш низькі дози інгібуючого антитіла проти Р-кадгерину, а також засобів, які спільно вводяться, що відповідно дозволяє уникати можливої токсичності або ускладнень, пов'язаних з різними варіантами монотерапії. 95775 52 Композиції за винаходом можуть містити "терапевтично ефективну кількість" або "профілактично ефективну кількість" антитіла або антигензв'язувальної ділянки за винаходом. "Терапевтично ефективна кількість" стосується кількості, яка ефективна при дозах і протягом періодів часу, необхідних для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість антитіла або антигензв'язувальної частини може відрізнятися в залежності від таких факторів, як стан захворювання, вік, стать і маса індивідуума, а також здатність антитіла або частини антитіла викликати у індивідуума бажану реакцію. Також терапевтично ефективна кількість являє собою кількість, при якій терапевтично сприятливі ефекти перевершують які-небудь токсичні або несприятливі ефекти антитіла або антигензв'язувальної частини. "Профілактично ефективна кількість" стосується кількості, яка ефективна при дозах і протягом періодів часу, необхідних для досягнення бажаного профілактичного результату. Як правило, оскільки профілактичну дозу використовують для індивідуумів до розвитку або на ранній стадії захворювання, то профілактично ефективна кількість може бути меншою, ніж терапевтично ефективна кількість. Схеми введення доз можна пристосовувати для забезпечення оптимальної бажаної реакції (наприклад, терапевтичної або профілактичної реакції). Наприклад, можна вводити разову ударну дозу, можна вводити декілька окремих доз протягом певного часу або дозу можна пропорційно знижувати або підвищувати, як вказується потребою терапевтичної ситуації. Особливо ефективним є складання композицій для парентерального введення в одиничній дозованій формі для полегшення введення і рівномірності дози. У межах даної заявки одинична дозована форма стосується фізично відокремлених форм, придатних як разові дози для індивідуумів, які підлягають лікуванню, що належать до ссавців; кожна форма містить заздалегідь визначену кількість активної сполуки, розраховану для надання бажаного терапевтичного впливу, разом з необхідним фармацевтичним носієм. Опис стандартних лікарських форм за винаходом обумовлений і безпосередньо залежить від а) унікальних характеристик антитіла проти Ркадгерину або його частини і конкретного терапевтичного або профілактичного ефекту, якого потрібно досягти, а також (b) обмежень, властивих даній області складання такого антитіла для лікування сприйнятливості у індивідуумів. Приклад необмежувального діапазону для терапевтично або профілактично ефективної кількості антитіла або частини антитіла за винаходом складає від 0,025 до 50 мг/кг, більш переважно від 0,1 до 50 мг/кг, більш переважно - 0,1-25, від 0,1 до 10 або від 0,1 до 3 мг/кг. У деяких варіантах здійснення препарат містить 5 мг/мл антитіла у буфері з 20 мМ цитрату натрію, рН 5,5, 140 мМ NaCl і 0,2 мг/мл полісорбату 80. Потрібно зазначити, що величини доз можуть відрізнятися в залежності від виду і тяжкості стану, що підлягає полегшенню. Крім того, потрібно розуміти, що для кожного конкретного індивідуума конкретні схеми 53 введення доз з плином часу потрібно регулювати відповідно до потреб індивідуума і професійного рішення індивідуума, який вводить або контролює введення композицій, і що вказані у даній заявці діапазони доз призначені тільки для прикладу і не призначені для обмеження об'єму або застосування на практиці заявленої композиції. В іншому аспекті даний винахід стосується наборів, що містять антитіло проти Р-кадгерину або антигензв'язувальну частину за винаходом або композицію, яка містить таке антитіло або частину. Крім антитіла або композиції, набір може містити діагностичні або терапевтичні засоби. Також набір може містити інструкції для застосування у способі діагностики або лікування. У переважному варіанті здійснення набір містить антитіло або композицію, що містить його, а також діагностичний засіб, який можна використовувати в описаному нижче способі. В іншому переважному варіанті здійснення набір містить антитіло або композицію, що містить його, і один або декілька терапевтичних засобів, які можна використовувати в описаному нижче способі. Використовувані способи діагностики Антитіла проти Р-кадгерину або їх антигензв'язувальні частини можна використовувати у способах діагностики для виявлення Р-кадгерину у біологічному зразку in vitro або in vivo. Наприклад, антитіла проти Р-кадгерину можна використовувати у загальноприйнятому імуноаналізі, у тому числі, без обмежень, ELISA, RIA, проточній цитометрії, імуногістохімії тканин, Вестерн-блотингу або імунопреципітації. Антитіла проти Р-кадгерину за винаходом можна використовувати для виявлення Р-кадгерину у людини. Також антитіла проти Ркадгерину можна використовувати для виявлення Р-кадгерину у мишей, щурів і яванських макак. Винахід стосується способу виявлення Ркадгерину у біологічному зразку, що включає контактування біологічного зразка з антитілом проти Р-кадгерину за винаходом і виявлення антитіла, що зв'язалося. В одному з варіантів здійснення антитіло проти Р-кадгерину безпосередньо мітять міткою, що піддається виявленню. В іншому варіанті здійснення антитіло проти Р-кадгерину (перше антитіло) є неміченим, а мітять друге антитіло або іншу молекулу, здатну зв'язувати антитіло проти Р-кадгерину. Як добре відомо фахівцеві у даній галузі, друге антитіло вибирають так, щоб воно було здатне специфічно зв'язувати перше антитіло конкретного виду і класу. Наприклад, якщо антитіло проти Р-кадгерину являє собою IgG людини, то друге антитіло повинно являти собою антитіло проти IgG людини. Інші молекули, здатні зв'язуватися з антитілами, включають в себе, але ними не обмежуються, білок А і білок G, обидва з яких комерційно доступні, наприклад, у Pierce Chemical Co. Прийнятні мітки для антитіла або другого антитіла були описані раніше і включають різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні речовини, люмінесцентні речовини і радіоактивні речовини. Приклади прийнятних ферментів включають пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, βгалактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади 95775 54 прийнятних комплексів простетичних груп включають стрептавідин/біотин і авідин/біотин; приклади прийнятних флуоресцентних речовин включають умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламінфлуоресцеїн, хлорид дансилу або фікоеритрин; приклад люмінесцентної речовини включає люмінол; а приклади прийнятної радіоактивної 125 131 35 3 речовини включають І, І, S або H. В інших варіантах здійснення Р-кадгерин можна аналізувати у біологічному зразку за допомогою конкурентного імуноаналізу з використанням стандартів Р-кадгерину, мічених речовиною, що піддається виявленню, і неміченого антитіла проти Ркадгерину. У цьому аналізі поєднують біологічний зразок, мічені стандарти Р-кадгерину і антитіло проти Р-кадгерину і визначають кількість міченого стандарту Р-кадгерину, що зв'язався з неміченим антитілом. Кількість Р-кадгерину у біологічному зразку обернено пропорційна кількості міченого стандарту Р-кадгерину, що зв'язався з антитілом проти Р-кадгерину. Описані вище імуноаналізи можна використовувати для множини цілей. Наприклад, антитіла проти Р-кадгерину можна використовувати для виявлення Р-кадгерину у клітинах, що культивуються. У переважному варіанті здійснення антитіла проти Р-кадгерину використовують для визначення кількості Р-кадгерину, що продукується клітинами, які були оброблені різними сполуками. Цей спосіб можна використовувати для виявлення сполук, які регулюють рівні білка Р-кадгерину. Відповідно до цього способу, один зразок клітин протягом визначеного періоду часу обробляють сполукою, що тестується, тоді як інший зразок залишають необробленим. Якщо потрібно виміряти загальний рівень Р-кадгерину, то клітини лізують і визначають загальний рівень Р-кадгерину з використанням одного з описаних вище імуноаналізів. Для визначення ефекту сполуки, що тестується, порівнюють загальний рівень Р-кадгерину в оброблених і необроблених клітинах. Переважний імуноаналіз для вимірювання загальних рівнів Р-кадгерину являє собою проточну цитометрію або імуногістохімію. Такі способи, як ELISA, RIA, проточна цитометрія, Вестернблотинг, імуногістохімія, мічення інтегральних мембранних білків на клітинній поверхні та імунопреципітація добре відомі у даній галузі. Див., наприклад, Harlow and Lane, вище. Крім того, масштаб імуноаналізів можна пристосовувати до високопродуктивного скринінгу для тестування великої кількості сполук на предмет активації або інгібування експресії Р-кадгерину. Також антитіла проти Р-кадгерину за винаходом можна використовувати для визначення рівнів Р-кадгерину у тканині або у клітинах, які одержують з тканини. У деяких варіантах здійснення тканина являє собою уражену захворюванням тканину. У деяких варіантах здійснення способу тканину або її біоптат вирізають у пацієнта. Потім тканину або біоптат використовують в імуноаналізі для визначення, наприклад, загальних рівнів Ркадгерину або місцеположення Р-кадгерину за допомогою описаних вище способів. 55 Також антитіла за даним винаходом можна використовувати in vivo для виявлення тканин і органів, що експресують Р-кадгерин. Одна з переваг використання антитіл проти Р-кадгерину людини за даним винаходом полягає у тому, що їх можна безпечно використовувати in vivo за відсутності виклику значної імунної реакції на антитіло після введення, на відміну від антитіл з джерела, що не є людським, або гуманізованих або химерних антитіл. Спосіб включає стадії введення міченого міткою, що піддається виявленню, антитіла проти Ркадгерину або композиції, що містить їх, пацієнту за необхідності такого діагностичного тесту, а також проведення пацієнту аналізу одержання зображення для визначення розташування тканин, що експресують Р-кадгерин. Аналіз одержання зображення добре відомий у галузі медицини і включає в себе, але ними не обмежується, рентгенографію, магнітно-резонансну томографію (MRI) або комп'ютерну томографію (СТ). Антитіло можна мітити будь-якою речовиною, прийнятною для одержання зображення in vivo, наприклад, контрастною речовиною, такою як барій, який можна використовувати у рентгенографії, або магнітною контрастною речовиною, такою як хелат гадолінію, який можна використовувати для MRI або СТ. Інші мітки включають в себе, але ними не об99 межуються, радіоактивні ізотопи, такі як Тс. В іншому варіанті здійснення антитіло проти Ркадгерину є неміченим, і його зображення одержують введенням другого антитіла або іншої молекули, яка піддається виявленню і яка здатна зв'язувати антитіло проти Р-кадгерину. В одному з варіантів здійснення біоптат одержують у пацієнта для визначення того, чи експресує цікавляча тканина Р-кадгерин. Використовувані терапевтичні способи В іншому варіанті здійснення винахід стосується способу інгібування активності Р-кадгерину за допомогою введення пацієнту антитіла проти Ркадгерину за необхідності цього. Будь-яке з описаних у даній заявці антитіл або їх антигензв'язувальних частин можна використовувати терапевтично. У переважному варіанті здійснення антитіло проти Р-кадгерину являє собою людське, химерне або гуманізоване антитіло. В іншому переважному варіанті здійснення Р-кадгерин є людським, а пацієнт являє собою пацієнта людину. Альтернативно, пацієнт може являти собою ссавця, який експресує Р-кадгерин, з яким перехресно реагує антитіло проти Р-кадгерину. Антитіло можна вводити ссавцеві, який не є людиною, що експресує Р-кадгерин, з яким перехресно реагує антитіло, (наприклад, щуру, миші або яванській макаці) для ветеринарних цілей або як тваринної моделі захворювання людини. Такі тваринні моделі можуть бути ефективні для оцінки терапевтичної ефективності антитіл за даним винаходом. В іншому варіанті здійснення антитіло проти Ркадгерину або частину антитіла можна вводити пацієнту, який експресує Р-кадгерин на невідповідно високих рівнях. Антитіло можна вводити один раз, однак більш переважним є багаторазове введення. Антитіло можна вводити від трьох разів на 95775 56 добу до одного разу у кожні шість місяців або у більш тривалий період. Введення можна здійснювати за такою схемою, як три рази на добу, два рази на добу, один раз на добу, один раз кожні дві доби, один раз кожні три доби, один раз на тиждень, один раз кожні два тижні, один раз кожний місяць, один раз кожні два місяці, один раз кожні три місяці і один раз кожні шість місяців. Також антитіло можна вводити безперервно за допомогою міні-помпи. Антитіло можна вводити у слизову, букально, інтраназально, за допомогою інгаляції, внутрішньовенним, підшкірним, внутрішньом'язовим, парентеральним або внутрішньопухлинним способом. Антитіло можна вводити один раз, принаймні два рази або принаймні протягом періоду часу, доки стан лікують, тимчасово полегшують або виліковують. Як правило, антитіло вводять доти, доки присутній стан. Звичайно антитіло вводять у вигляді частини фармацевтичної композиції, як описано вище. Як правило, доза антитіла знаходиться у діапазоні від 0,1 до 100 мг/кг, більш переважно - від 0,5 до 50 мг/кг, більш переважно від 1 до 20 мг/кг, а ще більш переважно - від 1 до 10 мг/кг. Концентрацію антитіла у сироватці можна вимірювати будь-яким відомим у даній галузі способом. Також даний винахід стосується способу лікування патологічного росту клітин у ссавця, у тому числі людини, де спосіб включає введення вказаному ссавцеві терапевтично ефективної кількості антитіла проти Р-кадгерину або його антигензв'язувальної частини, як описано у даній заявці, яке є ефективним для лікування патологічного клітинного росту. В одному з варіантів здійснення цього способу патологічний ріст клітин являє собою рак, включаючи в себе, але ними не обмежуючись, мезотеліому, гепатобіліарний рак (печінки і жовчних протоків), первинну або вторинну пухлину ЦНС, первинну або вторинну пухлину головного мозку, рак легенів (NSCLC і SCLC), рак кістки, рак підшлункової залози, рак шкіри, рак голови або шиї, шкірну або внутрішньоочну меланому, рак яєчника, рак товстої кишки, рак прямої кишки, рак анальної області, рак шлунку, рак шлунковокишкового тракту (шлунковий, колоректальний і дуоденальний), рак молочної залози, рак матки, карциному фалопієвих труб, карциному ендометрію, карциному шийки матки, карциному піхви, карциному зовнішніх жіночих статевих органів, хворобу Ходжкіна, рак стравоходу, рак тонкої кишки, рак ендокринної системи, рак щитовидної залози, рак паращитовидної залози, рак надниркових залоз, саркому м'якої тканини, рак уретри, рак чоловічого статевого члена, рак передміхурової залози, рак сім'яників, хронічний або гострий лейкоз, хронічний мієлоїдний лейкоз, лімфоцитарні лімфоми, рак сечового міхура, рак нирок або сечоводу, карциному епітелію нирок, карциному ниркової миски, неоплазію центральної нервової системи (ЦНС), первинну лімфому ЦНС, неходжкінську лімфому, пухлини хребта, гліому стовбура мозку, аденому гіпофізу, рак кори надниркових залоз, рак жовчного міхура, множинну мієлому, холангіокарциному, фібросаркому, нейробластому, ретиноб 57 ластому або поєднання одного або декількох описаних вище варіантів раку. У переважному варіанті здійснення даного винаходу рак вибирають з раку легенів (NSCLC і SCLC), раку голови або шиї, раку яєчнику, раку товстої кишки, раку прямої кишки, раку анальної області, раку шлунку, раку молочної залози, раку нирок або сечоводу, карциноми епітелію нирок, карциноми ниркової миски, неоплазії центральної нервовоїсистеми (ЦНС), первинної лімфоми ЦНС, неходжкінської лімфоми, пухлин хребта або поєднання одного або декількох описаних вище варіантів раку. В іншому переважному варіанті здійснення даного винаходу рак вибирають з раку легенів (NSCLC і SCLC), раку яєчника, раку товстої кишки, раку прямої кишки, раку анальної області або поєднання одного або декількох описаних вище варіантів раку. В іншому варіанті здійснення вказаного способу вказаний патологічний ріст клітин являє собою доброякісне проліферативне захворювання, включаючи в себе, але ними не обмежуючись, псоріаз, доброякісну гіпертрофію передміхурової залози або рестеноз. Також даний винахід стосується способу лікування патологічного росту клітин у ссавця, де спосіб включає введення вказаному ссавцеві кількості антитіла проти Р-кадгерину або його антигензв'язувальної ділянки, як описано у даній заявці, яка ефективна для лікування патологічного клітинного росту, у поєднанні з протипухлинним засобом, вибраним з групи, яка складається з інгібіторів мітозу, алкілувальних речовин, антиметаболітів, інтеркалюючих антибіотиків, інгібіторів факторів росту, інгібіторів клітинного циклу, ферментів, інгібіторів топоізомерази, регуляторів біологічних реакцій, антитіл, цитотоксичних речовин, антигормонів і антиандрогенів. Також винахід стосується фармацевтичної композиції для лікування патологічного росту клітин у ссавця, у тому числі людини, яка включає кількість антитіла проти Р-кадгерину або його антигензв'язувальної частини, як описано у даній заявці, яка ефективна для лікування патологічного клітинного росту, у поєднанні з фармацевтично прийнятним носієм і протипухлинним засобом, вибраним з групи, яка складається з інгібіторів мітозу, алкілувальних речовин, антиметаболітів, інтеркалюючих антибіотиків, інгібіторів факторів росту, інгібіторів клітинного циклу, ферментів, інгібіторів топоізомерази, регуляторів біологічних реакцій, антигормонів і антиандрогенів. Також винахід стосується способу лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця, де спосіб включає введення вказаному ссавцеві терапевтично ефективної кількості антитіла проти Ркадгерину або його антигензв'язувальної частини, як описано у даній заявці, у поєднанні з протипухлинним засобом, вибраним з групи, яка складається з антипроліферативних засобів, інгібіторів кіназ, інгібіторів ангіогенезу, інгібіторів факторів росту, інгібіторів сох-І, інгібіторів сох-ІІ, інгібіторів мітозу, алкілувальних засобів, антиметаболітів, інтеркалюючих антибіотиків, інгібіторів факторів росту, 95775 58 радіоактивного випромінювання, інгібіторів клітинного циклу, ферментів, інгібіторів топоізомерази, регуляторів біологічних реакцій, антитіл, цитотоксичних засобів, антигормонів, статинів і антиандрогенів. В одному з варіантів здійснення даного винаходу протипухлинний засіб, що використовується у поєднанні з антитілом проти Р-кадгерину або його антигензв'язувальною ділянкою, а також описаними у даній заявці фармацевтичними композиціями, являє собою протиангіогенний засіб, інгібітор кіназ, інгібітор пан-кіназ або інгібітор факторів росту. Переважні інгібітори пан-кіназ включають SU11248, описаний у патенті США №6573293 (Pfizer, Inc, NY, USA). Протиангіогенні засоби включають в себе, але ними не обмежуються, наступні речовини, наприклад, інгібітор EGF, інгібітори EGFR, інгібітори VEGF, інгібітори VEGFR, інгібітори ТІЕ2, інгібітори IGF1R, інгібітори СОХ-ІІ (циклооксигенази II), інгібітори ММР-2 (матриксної металопротеїнази 2) та інгібітори ММР-9 (матриксної металопротеїнази 9). Переважні інгібітори VEGF включають в себе, наприклад, авастин (бевацизумаб), моноклональне антитіло проти VEGF з Genentech, Inc. of South San Francisco, California. Додаткові інгібітори VEGF включають СР547632 (Pfizer Inc., NY, USA), AG13736 (Pfizer Inc.), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD2171, пастку VEGF (Regeneron/Aventis), ваталаніб (також відомий як РТК-787, ZK-222584: Novartis & Schering AG), макуген (пегаптаніб октанатрію, NX1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Washington, USA); і ангіозим, синтетичний рибозим з Ribozyme (Boulder, Colorado) i Chiron (Emeryville, California), а також їх поєднання. Інгібітори VEGF, ефективні для здійснення даного винаходу на практиці, описані у патентах США №№6534524 і 6235764, обидва з яких наведені тут повністю для всіх цілей. Особливо переважні інгібітори VEGF включають СР-547632, AG13736, ваталаніб, макуген і їх поєднання. Додаткові інгібітори VEGF описані, наприклад, у WO 99/24440 (опублікованому 20 травня 1999 року), міжнародній публікації РСТ РСТ/ІВ99/00797 (зареєстрованій 3 травня 1999 року), у WO 95/21613 (опублікованому 17 серпня 1995 року), WO 99/61422 (опублікованому 2грудня 1999 року), патенті США №6534,524 (в якому описаний AG13736), патенті США №5834504 (виданому 10 листопада 1998 року), WO 98/50356 (опублікованому 12 листопада 1998 року), патенті США №5883113 (виданому 16 березня 1999 року), патенті США №5886020 (виданому 23 березня 1999 року), патенті США №5792783 (виданому 11 серпня 1998 року), патенті США №6653308 (виданому 25 листопада 2003 року), WO 99/10349 (опублікованому 4 березня 1999 року), WO 97/32856 (опублікованому 12 вересня 1997 року), WO 97/22596 (опублікованому 26 червня 1997 року), WO 98/54093 (опублікованому 3 грудня, 1998 року), WO 98/02438 (опублікованому 22 січня 1998 року), WO 99/16755 (опублікованому 8 квітня 1999 року) і WO 98/02437 (опублікованому 22 січня 1998 року), 59 всі з яких наведені тут повністю шляхом посилання. Інші антипроліферативні засоби, які можна використовувати разом з антитілами або їх антигензв'язувальними ділянками за даним винаходом, включають інгібітори ферменту фарнезилпротеїнтрансферази та інгібітори рецептора тирозинкінази PDGFr, у тому числі сполуки, описані і заявлені у наступних патентних заявках США: 09/221946 (зареєстрованій 28 грудня 1998 року); 09/454058 (зареєстрованій 2 грудня 1999 року); 09/501163 (зареєстрованій 9 лютого 2000 року); 09/539930 (зареєстрованій 31 березня 2000 року); 09/202796 (зареєстрованій 22 травня 1997 року); 09/384339 (зареєстрованій 26 серпня 1999 року); і 09/383755 (зареєстрованій 26 серпня 1999 року); а також сполуки, описані і заявлені у наступних умовних патентних заявках США: 60/168207 (зареєстрованій 30 листопада 1999 року); 60/170119 (зареєстрованій 10 грудня 1999 року); 60/177718 (зареєстрованій 21 січня 2000 року); 60/168217 (зареєстрованій 30 листопада 1999 року) і 60/200834 (зареєстрованій 1 травня 2000 року). Кожна з вказаних вище патентних заявок і умовних патентних заявок наведена тут повністю шляхом посилання. Інгібітори PDGRr включають в себе, але ними не обмежуються, речовини, описані у WO 01/40217, опублікованому 7 липня 2001 року і WO 2004/020431, опублікованому 11 березня 2004 року, змісти яких наведені тут повністю для всіх цілей. Переважні інгібітори PDGFr включають Pfizer СР-673451 і СР-868596, а також їх фармацевтично прийнятні солі. Переважні інгібітори GARF включають Pfizer AG-2037 (пелітрексол і його фармацевтично прийнятні солі). Інгібітори GARF, ефективні для здійснення даного винаходу на практиці, описані у патенті США №5608082, наведеному тут повністю для всіх цілей. Приклади ефективних інгібіторів СОХ-ІІ, які можна використовувати у поєднанні з антитілом проти Р-кадгерину або його антигензв'язувальними ділянками, як описано у даній заявці, а також описаними у даній заявці фармацевтичними композиціями, включають в себе CELEBREX™ (целекоксиб), парекоксиб, деракоксиб, АВТ-963, МК-663 (еторикоксиб), СОХ-189 (луміракоксиб), BMS 347070, RS 57067, NS-398, бекстра (валдекоксиб), паракоксиб, віокс (рофекоксиб), SD-8381, 4-метил2-(3,4-диметилфеніл)-1-(4-сульфамоїлфеніл)-1Нпірол, 2-(4-етоксифеніл)-4-метил-1-(4сульфамоїлфеніл)-1Н-пірол, Т-614, JTE-522, S2474, SVT-2016, СТ-3, SC-58125 і аркоксія (еторикоксиб). Крім того, інгібітори СОХ-ІІ описані у патентних заявках США №№10/801446 і 10/801429, змісти яких наведені тут повністю для всіх цілей. В одному з переважних варіантів здійснення протипухлинний засіб являє собою целекоксиб, як описано у патенті США №5466823, зміст якого повністю наведений тут для всіх цілей шляхом посилання. Структура целекоксибу представлена нижче: 95775 60 В одному з переважних варіантів здійснення протипухлинний засіб являє собою валекоксиб, як описано у патенті США №5633272, зміст якого повністю наведений тут для всіх цілей шляхом посилання. Структура валекоксибу представлена нижче: В одному з переважних варіантів здійснення протипухлинний засіб являє собою парекоксиб, як описано у патенті США №5932598, зміст якого повністю наведений тут для всіх цілей шляхом посилання. Структура парекоксибу представлена нижче: В одному з переважних варіантів здійснення протипухлинний засіб являє собою деракоксиб, як описано у патенті США №5521207, зміст якого повністю наведений тут для всіх цілей шляхом посилання. Структура деракоксибу представлена нижче: В одному з переважних варіантів здійснення протипухлинний засіб являє собою SD-8381, як описано у патенті США №6034256, зміст якого повністю наведений тут для всіх цілей шляхом посилання. Структура SD-8381 представлена нижче:
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюAntibody that specifically binds to p-cadherin
Автори англійськоюBauer Christopher Todd, Bourner Maureen Jeri, Boyle Melanie, Casperson Gerald Fries, Griggs David William, Head Richard David, Joy William Dean, Mazzarella Richard Allen, Minter Ralph Raymond, Moffat Mark Allen, Thiele Barrett Richard, Vanarsdale Todd Lee
Назва патенту російськоюАнтитело, которое специфически связывается с р-кадгерином
Автори російськоюБоер Кристофер Тодд, Бернер Морин Джери, Бойл Мелани, Касперсон Джеральд Фрайес, Григгс Девид Уилльям, Хед Ричард Девид, Джой Уилльям Дин, Маццарелла Ричард Аллен, Минтер Ральф Реймонд, Моффат Марк Аллен, Тиле Баррет Ричард, Ванарсдейл Тодд Ли
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/13, A61K 39/395, C07H 21/04, C07K 16/28
Мітки: р-кадгерином, яке, антитіло, зв'язується, специфічно
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/140-95775-antitilo-yake-specifichno-zvyazuehtsya-z-r-kadgerinom.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Антитіло, яке специфічно зв’язується з р-кадгерином</a>
Попередній патент: Спосіб зневоднення спирту і пристрій для його здійснення
Наступний патент: Система, спосіб та пристрій генерування збудження в діапазоні високих частот
Випадковий патент: Відцентровий сопловий розпилюючий диск