Антитіло, яке специфічно зв’язується з гліпіканом 3 (gpc3)

1. Антитіло, яке специфічно зв’язується з гліпіканом 3 (GPC3), яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2, 3, що включає амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124, 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, що включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 143, 144 і 158, відповідно. 2. Антитіло, яке специфічно зв’язується з гліпіканом 3 (GPC3), вибране з: (1) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 84, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; (2) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 85, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; (3) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 86, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; (4) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 87, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; (5) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 88, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; (6) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 89, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає аміно UA (21) a200602628 (22) 08.07.2005 (24) 11.04.2011 (86) PCT/JP2005/013103, 08.07.2005 (31) 2004-203637 (32) 09.07.2004 (33) JP (46) 11.04.2011, Бюл.№ 7, 2011 р. (72) НАКАНО КІЙОТАКА, JP, ЙОСІНО ТАКЕСІ, JP, НЕЗУ ДЗУН-ІТІ, JP, ЦУНОДА ХІРОЮКІ, JP, ІГАВА ТОМОЮКІ, JP, КОНІСІ ХІРОКО, JP, ТАНАКА МЕГУМІ, JP, ЗУГО ІЗУМІ, JP, КАВАІ СІГЕТО, JP, ІСІГУРО ТАКАХІРО, JP, КІНОСІТА ЯСУКО, JP (73) ЧУГАІ СЕЙЯКУ КАБУСІКІ КАЙСЯ, JP (56) EP A1 1541680, 15.06.2005. EP A1 1548442, 29.06.2005. EP A1 1541686, 15.06.2005. EP A1 1411118, 21.04.2004. WO A2 03100429, 04.12.2003. MIDORIKAWA Y ET AL: "GLYPICAN-3, OVEREXPRESSED IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA, MODULATES FGF2 AND BMP-7 SIGNALING" INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, NEW YORK, NY, US, vol. 103, no. 4, 10 February 2003 (2003-02-10), pages 455-465, XP001159615 ISSN: 0020-7136. SUNG Y-K ET AL: "Glypican-3 is overexpressed in human hepatocellular carcinoma" CANCER SCIENCE, JAPANESE CANCER ASSOCIATION, TOKYO, JP, vol. 94, no. 3, March 2003 (2003-03), pages 259-262, XP002261241 ISSN: 1347-9032. CAPURRO M ET AL: "Glypican-3: a novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma" GASTROENTEROLOGY, ELSEVIER, PHILADELPHIA, PA, US, vol. 125, no. 1, July 2003 (2003-07), pages 89-97, XP009020918 ISSN: 00165085. LAGE H ET AL: "Expression of a glypican-related 62kDa antigen is decreased in hepatocellular carcinoma in correspondence to the grade of tumor differentiation" VIRCHOWS ARCHIV, SPRINGER INTERNATIONAL, BERLIN, DE, vol. 438, no. 6, 21 2 (19) 1 3 кислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; або (7) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 90, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92. 3. Антитіло, яке специфічно зв’язується з гліпіканом 3 (GPC3), вибране з: (1) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 174, 144 і 158, відповідно; (2) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 175, 144 і 158, відповідно; (3) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 176, 144 і 158, відповідно; (4) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 177, 144 і 158, відповідно; (5) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включаютьамінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 178, 144 і 158, відповідно; (6) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 179, 144 і 158, відповідно; (7) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 180, 144 і 158, відповідно; (8) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 181, 144 і 158, відповідно; 94019 4 (9) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включають CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 182, 144 і 158, відповідно; (10) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 183, 144 і 158, відповідно; (11) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 184, 144 і 158, відповідно; (12) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 185, 144 і 158, відповідно; (13) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 186, 144 і 158, відповідно; (14) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 187, 144 і 158, відповідно; або (15) антитіла, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які включають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 188, 144 і 158, відповідно. 4. Антитіло, яке специфічно зв’язується з гліпіканом 3 (GPC3), яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з: (1) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 191; (2) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 192; (3) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 193; (4) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 194; 5 94019 6 (5) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 195; (6) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 196; (7) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 197; (8) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 198; (9) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 199; (10) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 200; (11) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 201; (12) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 202; (13) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 203; (14) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 204; і (15) варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 205; і варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з: (1) варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 84; (2) варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 85; (3) варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 86; (4) варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 87; (5) варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 88; (6) варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 89; і (7) варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 90. 5. Антитіло за будь-яким з пп. 1-4, яке являє собою гуманізоване антитіло. 6. Антитіло за будь-яким з пп. 1-5 для застосування при лікуванні раку. 7. Антитіло за п. 6 для застосування при лікуванні гепатоми. 8. Інгібітор росту клітин, експресуючих GPC3, який містить як активний інгредієнт антитіло за будьяким з пп. 1-5. 9. Полінуклеотид, який кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла за п. 5. 10. Полінуклеотид за п. 9, який включає будь-яку з послідовностей, описаних в SEQ ID NO: 57 і 77-83. 11. Полінуклеотид, який кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла за п. 5. 12. Полінуклеотид за п. 11, який включає будь-яку з послідовностей, описаних в SEQ ID NO: 67 і 91. 13. Вектор, який включає полінуклеотид за будьяким з пп. 9-12. 14. Клітина-хазяїн, що містить вектор за п. 13. 15. Спосіб отримання антитіла, який включає: (а) культивування клітини-хазяїна за п. 14, (b) виділення антитіла з культури (а), і (с) очищення антитіла. 16. Пептид, який складається з амінокислотних залишків 546-551 гліпікану 3, який використовується як антиген для одержання антитіла за будьяким з пп. 1-4. Галузь винаходу Даний винахід відноситься до антитіла проти гліпікану 3, до інгібітору клітинного росту і до протиракового засобу, які містять антитіло як активний інгредієнт. Опис спорідненої галузі Гліпікан 3 (GPC3) є членом гліпіканового сімейства гепарансульфатпротеогліканів, які присутні на клітинній поверхні. Це дозволяє передбачити, що GPC3 бере участь в клітинному розподілі при розвитку або рості ракових клітин, однак його функція ще не цілком ясна. Було виявлено, що певний тип антитіл, що зв'язуються з GPC3, інгібує клітинний ріст за допомогою антитілозалежної клітинноопосередкованої цитотоксичності (ADCC) і комплементзалежної цитотоксичності (CDC) (міжнародна патентна зая вка WO 2003/000883). Крім того, вважають, що GPC3 розщеплюється in vivo і надходить в кров у вигляді секретованої форми GPC3, отже, рак можна діагностувати за допомогою антитіл, здатних зв'язуватися з секретованою формою GPC3 (міжнародні патентні заявки-WO 2004/022739, WO 03/100429 і WO 2004/018667). Для розробки протиракового засобу на основі цитотоксичної активності антитіла переважно, щоб використовуване антитіло володіло високою ADCC-активністю або CDC-активністю. Відповідно, потрібне антитіло проти GPC3, яке володіє високою цитотоксичністю, як антитіло, що розпізнає GPC3. Метою даного винаходу є надання антитіла проти GPC3, яке володіє більш високою ADCC 7 активністю і CDC-активністю, ніж традиційне антитіло. Короткий опис винаходу Авторам даного винаходу вдалося отримати антитіло з більш високою цитотоксичністю, ніж у традиційного антитіла проти гліпікану 3. Крім того, автори аналізували епітопи такого антитіла, і їм вдалося визначити ділянки GPC3, які розпізнаються антитілом з високою цитотоксичною активністю. В одному аспекті даний винахід пропонує антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить ділянки CDR 1, 2 і 3 за будь-яким з пунктів (1)-(12): (1) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 123, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 124, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 125; (2) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 109, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: ПО, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 111; (3) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 106, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 107, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану вSEQ ID NO: 108; (4) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 132, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 133, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 134; (5) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 106, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 135, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 136; (6) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 126, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 127, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 128; (7) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 129, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 130, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 131; (8) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 103, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 104, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 105; (9) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 118, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 121, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 122; (10) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 115, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 116, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 117; (11) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 112, CDR2, що має 94019 8 амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 113, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 114; або (12) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 118, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 119, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 120. В іншому аспекті даний винахід пропонує антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3 за будьяким з пунктів (1)-(13): (1) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 143, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (2) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 143, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 145; (3) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 140, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 141, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 142; (4) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 167, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 168, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 169; (5) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 170, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 171; (6) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 159, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 160, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 161; (7) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 162, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 147, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 163; (8) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 164, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 165, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 166; (9) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 137, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 138, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 139; (10) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 155, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 156, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 157; (11) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 149, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID 9 NO: 150, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 151; (12) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 146, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 147, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 148; або (13) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 152, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 153, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 154. Переважно, антитіло даного винаходу вибране з групи, яка складається з антитіл за будь-яким з пунктів (1)-(13): (1) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 143, 144 і 158, відповідно; (2) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 109, ПО і 111, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 143, 144 і 145, відповідно; (3) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, ті, що мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 106, 107 і 108, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 140, 141 і 142, відповідно; (4) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 132, 133 і 134, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 167, 168 і 169, відповідно; (5) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 106, 135 і 136, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 170, 144 і 171, відповідно; (6) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 126, 127 і 128, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 159, 160 і 161, відповідно; (7) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 129, 130 і 131, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 162, 147 і 163, відповідно; 94019 10 (8) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 129, 130 і 131, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 164, 165 і 166, відповідно; (9) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 103, 104 і 105, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 137, 138 і 139, відповідно; (10) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 118, 121 і 122, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 155, 156 і 157, відповідно; (11) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 115, 116 і 117, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 149, 150 і 151, відповідно; (12) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, ті, що мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 112, 113 і 114, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 146, 147 і 148, відповідно; і (13) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 118, 119 і 120, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 152, 153 і 154, відповідно. В іншому аспекті даний винахід пропонує антитіло, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга за будь-яким з пунктів (1)-(7): (1) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 84; (2) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 85; (3) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 86; (4) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 87; (5) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 88; (6) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 89; або 11 (7) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 90. В іншому аспекті даний винахід пропонує антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92. Переважно, антитіло даного винаходу вибране з групи, яка складається з антитіл за будь-яким з пунктів (1)-(7): (1) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 84, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; (2) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 85, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; (3) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 86, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; (4) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 87, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; (5) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 88, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; (6) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 89, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92; і (7) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 90, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92. В іншому аспекті даний винахід пропонує антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3 за будьяким з пунктів (1)-(15): (1) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 174, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (2) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 175, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (3) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 176, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; 94019 12 (4) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 177, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (5) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 178, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (6) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 179, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (7) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 180, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (8) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 181, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (9) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 182, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (10) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 183, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (11) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 184, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (12) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 185, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (13) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 186, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; (14) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 187, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158; або (15) CDR1, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 188, CDR2, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 144, і CDR3, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 158. В іншому аспекті даний винахід пропонує антитіло, вибране з групи, яка складається з антитіл пунктів (1)-(15): (1) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, 13 які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 174, 144 і 158, відповідно; (2) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, ті, що мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 175, 144 і 158, відповідно; (3) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 176, 144 і 158, відповідно; (4) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 177, 144 і 158, відповідно; (5) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 178, 144 і 158, відповідно; (6) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 179, 144 і 158, відповідно; (7) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 180, 144 і 158, відповідно; (8) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 181, 144 і 158, відповідно; (9) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 182, 144 і 158, відповідно; (10) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабель 94019 14 ну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 183, 144 і 158, відповідно; (11) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, ті, що мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 184, 144 і 158, відповідно; (12) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 185, 144 і 158, відповідно; (13) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 186, 144 і 158, відповідно; (14) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 187, 144 і 158, відповідно; і (15) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 188, 144 і 158, відповідно. У наступному аспекті даний винахід пропонує антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з варіабельних ділянок (1)-(15): (1) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 191; (2) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 192; (3) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 193; (4) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 194; (5) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 195; (6) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 196; (7) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 197; (8) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 198; 15 (9) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 199; (10) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 200; (11) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 201; (12) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 202; (13) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 203; (14) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 204; і (15) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 205. В іншому аспекті даний винахід пропонує антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з варіабельних ділянок (1)-(15): (1) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 191; (2) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 192; (3) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 193; (4) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 194; (5) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 195; (6) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 196; (7) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 197; (8) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 198; 94019 16 (9) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 199; (10) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 200; (11) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 201; (12) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 202; (13) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 203; (14) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 204; і (15) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 205; і варіабельна ділянка важкого ланцюга, вибрана з групи, яка складається з варіабельних ділянок (1)-(7): (1) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 84; (2) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 85; (3) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 86; (4) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 87; (5) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 88; (6) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 89; і (7) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 90. Варіабельна ділянка важкого ланцюга (Н), варіабельна ділянка легкого ланцюга (L) і амінокислотна послідовність CDR 1, 2 і 3, а також номери SEQ ID NO наведені в таблиці нижче. 17 94019 18 19 94019 20 21 Крім того, в даному винаході описується антитіло, яке володіє активністю, еквівалентною активності описаного вище антитіла, і має описану вище амінокислотну послідовність, в якій один або декілька амінокислотних залишків заміщені, видалені або додані і/або вставлені. Переважно, антитіло даного винаходу являє собою гуманізоване антитіло. Так, в іншому аспекті даний винахід пропонує гуманізоване антитіло, здатне зв'язуватися з гліпіканом 3. 94019 22 У наступному аспекті даний винахід пропонує антитіло, здатне зв'язуватися з пептидом, що складається з послідовності амінокислотних залишків 524-563 гліпікану 3. Переважно, антитіло даного винаходу здатне зв'язуватися з пептидом, що складається з послідовності амінокислотних залишків 537-563 гліпікану 3. Більш переважно, антитіло даного винаходу не зв'язується з пептидом, що складається з послідовності амінокислотних залишків 550-563 гліпікану 3. 23 Переважно, антитіло здатне зв'язуватися з пептидом, що складається з послідовності амінокислотних залишків 544-553 гліпікану 3, або з пептидом, що складається з послідовності амінокислотних залишків 546-551 гліпікану 3. У наступному аспекті даний винахід пропонує антитіло, здатне зв'язуватися з епітопом, з яким може зв'язуватися вторинне антитіло, де згадане вторинне антитіло включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, що має амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, відповідно, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 143, 144 і 158, відповідно. А саме, антитіло даного винаходу може конкурувати з вторинним антитілом за зв'язування з GPC3. У переважному втіленні антитіло даного винаходу може зв'язуватися з гліпіканом 3 і володіє високою CDC-активністю по відношенню до клітин, що експресують гліпікан 3, і/або високою ADCCактивністю по відношенню до клітин, що експресують гліпікан 3. В іншому аспекті даний винахід пропонує полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга або варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла даного винаходу. Переважно, полінуклеотид даного винаходу має послідовність, описану в SEQ ID NO: 11-21, 33-43, 55-59, 65-70 і 77-83. У наступному аспекті даний винахід пропонує інгібітор клітинного росту і протираковий засіб, що містять як активний інгредієнт антитіло даного винаходу. Переважно, протираковий засіб даного винаходу використовують для лікування гепатоми. У наступному аспекті даний винахід пропонує пептид, який містить послідовність амінокислотних залишків 524-563 гліпікану 3, послідовність амінокислотних залишків 537-563 гліпікану 3, послідовність амінокислотних залишків 544-553 гліпікану 3 або послідовність амінокислотних залишків 546551 гліпікану 3. Короткий опис малюнків На Фіг. 1 показана зв'язуюча активність антитіла проти GPC3 в клітині СНО, клітині СНО, що експресує повнорозмірні GPC3, HepG2 і HuH-7, виміряна за допомогою проточної цитометрії. М1Е7 (суцільна лінія) і M11F1 (пунктирна лінія) використовують в концентрації 5 мкг/мл, відповідно. На Фіг. 2 наведена таблиця, що демонструє результати класифікації по епітопам, отримані за допомогою конкурентного аналізу ELISA. Міра конкурентного інгібування зв'язування біотинільованого антитіла проти GPC3 приведена в процентах. Епітопи поділяють на 5 груп, від а до є, відповідно до характеру конкурентного інгібування. На Фіг. 3 приведені результати вестернблотингу, які показують, з яким фрагментом розчинної форми корового білка GPC3 зв'язується антитіло проти GPC3: з N-кінцевим фрагментом розміром 40 кДа або з С-кінцевим фрагментом розміром 30 кДа. Було виявлено, що L9G11 зв'язується з N-кінцевим фрагментом, а M3С11 зв'язується з С-кінцевим фрагментом. 94019 24 На Фіг. 4 показані результати детекції секретованої форми GPC3 в культуральному супернатанті HepG2 за допомогою сендвіч-методу ELISA. Секретована форма добре детектується при використанні поєднання антитіл, які зв'язуються з Nкінцевим фрагментом, таким як М6В1, M18D4 або Μ19Β11, і погано детектується при використанні поєднання антитіл, які зв'язуються з С-кінцевим фрагментом, таким як М3С11, М13В3 або М3В8. На Фіг. 5 показані результати імунопреципітації культурального супернатанту HepG2 з використанням антитіла проти GPC3 і детекції секретованої форми GPC3. Середовище як контроль (лінії 1 і 3) і культуральний супернатант HepG2 (лінії 2 і 4) піддають імунопреципітації з використанням М1Е7 (лінії 1 і 2) і M10D2 (лінії 3 і 4). Секреторний GPC3 детектують з допомогою M10D2, який зв'язується з N-кінцевим фрагментом. На Фіг. 6 показані результати аналізу епітопа антитіл, який зв'язується з С-кінцевим фрагментом GPC3, методом вестерн-блотингу з використанням гібридного білка С-кінцевого пептиду GPC3 і GST. Коровий білок розчинної форми GPC3 (лінія 1), GST (лінія 2), GC-1 (лінія 3), GC-2 (лінія 4), GC-3 (лінія 5), GC-4 (лінія 6) і GC-5 (лінія 7) піддають SDS-електрофорезу у відновлювальних умовах і детекції методом вестерн-блотингу з використанням М3С11 і M11F1. На Фіг. 7 показані результати вимірювання активності CDC мишаче-людського химерного антитіла проти GPC3 на клітинах СНО, які експресують GPC3. На Фіг. 8 показані результати вимірювання активності ADCC мишаче-людського химерного антитіла проти GPC3 на клітинах СНО, які експресують GPC3 і HepG2. На Фіг. 9 показані результати вимірювання активності ADCC GC33 на клітинній лінії людської гепатоми, НuН-7, з використанням ефекторних клітин мишачого кісткового мозку. На Фіг. 10 показані результати вимірювання протипухлинної активності антитіла GC33 на мишачій моделі з трансплантованою гепатомою людини. На Фіг. 11 показані результати вимірювання активності CDC мишаче-людського химерного антитіла GC33 на клітинах СНО, які експресують GPC3. На Фіг. 12 показані результати вимірювання активності ADCC мишаче-людського химерного антитіла GC33 на HepG2. На Фіг. 13 показані послідовності GPC3, що містяться в білках, гібридизованих з GST (GC-4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 і 14), отримані для аналізу епітопа GC33. На Фіг. 14 показані результати вестернблотингу з використанням GC33 після розділення GST, GC-7, 8, 9, 11, 12, 13 і 14 методом SDS-PAGE у відновлювальних умовах. На Фіг. 15 показані результати вимірювання зв'язуючої активності гуманізованого GC33 по відношенню до GPC3 методом ELISA. На Фіг. 16 приведена таблиця антитіл, в яку включені ізотипи і результати ELISA, BIAcore, FACS, епітопного аналізу і імунопреципітації для 25 клонів, отриманих з мишей, імунізованих розчинною формою GPC3. На Фіг. 17 приведена таблиця антитіл, в яку включені ізотипи і результати ELISA, FACS і епітопного аналізу для клонів, отриманих з мишей, імунізованих GC-3. На Фіг. 18 показані результати вимірювання зв'язуючої активності модифікованих антитіл по відношенню до корового білка розчинної форми GPC3 методом ELISA. Gly34, який знаходиться в CDR1 варіабельної ділянки L-ланцюга гуманізованого GC33, замінюють будь-яку з 17 амінокислот, відмінних від Cys і Met. На Фіг. 19 показані результати вимірювання активності CDC мишаче-людських химерних антитіл GC33, М3С11 і М1Е7 на клітинах СНО, експресуючих повнорозмірний GPC3. На Фіг. 20 показані результати вимірювання активності ADCC мишаче-людських химерних антитіл GC33, М3С11 і М1Е7 на клітинній лінії гепатоми людини SK-03, що експресують повнорозмірний GPC3. Докладний опис винаходу Антитіло Даний винахід пропонує антитіла, описані в нижченаведених пунктах (1)-(X1). (I) Антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO, приведених в будь-якому з нижченаведених пунктів (1)-(12): Серед антитіл, описаних в пунктах (1)-(12), переважні антитіла, описані в пунктах (1)-(8), більш переважні антитіла, описані в пунктах (1)-(5), і особливо переважне антитіло, описане в пункті (1). Антитіла, описані в пунктах (1)-(8), розпізнають С-кінцевий пептид гліпікану 3 (пептид, який містить 374-580 амінокислоти гліпікану 3); і використовуються як терапевтичні антитіла. Крім того, антиті 94019 26 ла, описані в пунктах (9)-(12), розпізнають Nкінцевий пептид гліпікану 3 (пептид, який містить 1-373 амінокислоти гліпікану 3); і використовуються як діагностичні антитіла. (II) Антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO, приведених в будь-якому з нижченаведених пунктів (1)-(13): Серед антитіл, описаних в пунктах (1)-(13), переважні антитіла, описані в пунктах (1)-(8), більш переважні антитіла, описані в пунктах (1)-(5), і особливо переважне антитіло, описане в пункті (1). Антитіла, описані в пунктах (1)-(8), розпізнають С-кінцевий пептид гліпікану 3 (пептид, який містить 374-580 амінокислоти гліпікану 3); і використовуються як терапевтичні антитіла. Крім того, антитіла, описані в пунктах (9)-(13), розпізнають Nкінцевий пептид гліпікану З (пептид, який містить 1-373 амінокислоти гліпікану 3); і використовуються як діагностичні антитіла. (III) Антитіло, вибране з групи, яка складається з антитіл, описаних в нижченаведених пунктах (1)(13): (1) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 143, 144 і 158 (GC33), (2) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 109, ПО і 111, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 143, 144 і 145 (M11F1), 27 (3) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 106, 107 і 108, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 140, 141 і 142 (М3В8), (4) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, ті, що мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 132, 133 і 134, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і З, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 167, 168 і 169 (GC199), (5) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 106, 135 і 136, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 170, 144 і 171 (GC202), (6) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 126, 127 і 128, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 159, 160 і 161 (GC179), (7) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 129, 130 і 131, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 162, 147 і 163 (GC194 (1)), (8) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 129, 130 і 131, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 164, 165 і 166 (GC194 (2)), (9) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 103, 104 і 105, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 137, 138 і 139 (М13В3), (10) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 118, 121 і 122, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 155, 156 і 157 (L9G11), (11) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 115, 116 і 117, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 149, 150 і 151 (М6В1), (12) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, 94019 28 які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 112, 113 і 114, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 146, 147 і 148 (М5В9), (13) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, ті, що мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 118, 119 і 120, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і З, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 152, 153 і 154 (M10D2). Серед антитіл, описаних в пунктах (1)-(13), переважні антитіла, описані в пунктах (1)-(8), більш переважні антитіла, описані в пунктах (1)-(5), і особливо переважне антитіло, описане в пункті (1). Антитіла, описані в пунктах (1)-(8), розпізнають С-кінцевий пептид гліпікану 3 (пептид, який містить 374-580 амінокислоти гліпікану 3); і використовуються як терапевтичні антитіла. Крім того, антитіла, описані в пунктах (9)-(13), розпізнають Nкінцевий пептид гліпікану З (пептид, який містить 1-373 амінокислоти гліпікану 3); і використовуються як діагностичні антитіла. (IV) Антитіло, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, описану в будь-якому з нижченаведених пунктів (1)-(7): (1) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a), (2) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 85 (GC33 VH ver.c), (3) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 86 (GC33 VH ver.f), (4) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver.h), (5) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 88 (GC33 VH ver.i), (6) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 89 (GC33 VH ver.j), і (7) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k). Серед антитіл, описаних в пунктах (1)-(7), особливо переважні антитіла, описані в пунктах (2)(7). (V) Антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a). (VI) Антитіло, вибране з групи, яка складається з антитіл, описаних в нижченаведених пунктах (1)(7): (1) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a), і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), 29 (2) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 85 (GC33 VH ver.c), і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), (3) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 86 (GC33 VH ver.f), і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), (4) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver.h), і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), (5) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 88 (GC33 VH ver.i), і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), (6) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 89 (GC33 VH ver.j), і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), і (7) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k), і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a). Серед антитіл, описаних в пунктах (1)-(7), особливо переважні антитіла, описані в пунктах (2)(7). (VII) Антитіло, описане в будь-якому з нижченаведених пунктів (1)-(15): (1) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 174, 144 і 158, (2) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 175, 144 і 158, (3) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 176, 144 і 158, (4) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 177, 144 і 158, (5) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 178, 144 і 158, (6) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 179, 144 і 158, 94019 30 (7) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 180, 144 і 158, (8) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 181, 144 і 158, (9) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 182, 144 і 158, (10) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 183, 144 і 158, (11) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 184, 144 і 158, (12) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 185, 144 і 158, (13) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 186, 144 і 158, (14) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 187, 144 і 158, і (15) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 188, 144 і 158. Серед антитіл, описаних в пунктах (1)-(15), переважне антитіло, описане в пункті (15). (VIII) Антитіло, описане в будь-якому з нижченаведених пунктів (1)-(15): (1) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 174, 144 і 158, (2) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 175, 144 і 158, (3) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 176, 144 і 158, (4) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки 31 легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 177, 144 і 158, (5) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 178, 144 і 158, (6) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 179, 144 і 158, (7) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 180, 144 і 158, (8) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 181, 144 і 158, (9) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 182, 144 і 158, (10) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 183, 144 і 158, (11) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 184, 144 і 158, (12) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 185, 144 і 158, (13) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які ма 94019 32 ють амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 186, 144 і 158, (14) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 187, 144 і 158 і (15) антитіло, яке включає в себе варіабельні ділянки важкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 123, 124 і 125, і варіабельні ділянки легкого ланцюга, що містять CDR 1, 2 і 3, які мають амінокислотні послідовності, описані в SEQ ID NO: 188, 144 і 158. Серед антитіл, описаних в пунктах (1)-(15), переважне антитіло, описане в пункті (15). (IX) Антитіло, описане в будь-якому з нижченаведених пунктів (1)-(15): (1) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 191, (2) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 192, (3) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 193, (4) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 194, (5) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 195, (6) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 196, (7) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 197, (8) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 198, (9) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 199, (10) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 200, (11) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 201, (12) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 202, (13) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 203, (14) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 204, і (15) антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 205. 33 Серед антитіл, описаних в пунктах (1)-(15), переважне антитіло, описане в пункті (15). (X) Антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з варіабельних ділянок легкого ланцюга, описаних в нижченаведених пунктах (1)-(15): (1) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 191, (2) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 192, (3) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 193, (4) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 194, (5) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 195, (6) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 196, (7) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 197, (8) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 198, (9) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 199, (10) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 200, (11) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 201, (12) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 202, (13) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 203, (14) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 204, і (15) варіабельна ділянка легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 205, і варіабельна ділянка важкого ланцюга, вибрана з групи, яка складається з варіабельних ділянок важкого ланцюга, описаних в нижченаведених пунктах (1)-(7): (1) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 84, (2) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 85, (3) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 86, 94019 34 (4) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 87, (5) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 88, (6) варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 89, і Серед описаних вище антитіл переважне антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 205, і варіабельна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 90. (XI) Антитіло, що має описану в будь-якому з наведених вище пунктів (І)-(Х) амінокислотну послідовність, в якій одна або декілька амінокислот заміщені, видалені, додані і/або вставлені, і яке володіє активністю, еквівалентною активності антитіла, описаного в будь-якому з пунктів (І)-(Х). У даному винаході фраза "активність, еквівалентна активності антитіла, описаного в будьякому з пунктів (І)-(Х)" означає еквівалентність зв'язувальної активності антитіла по відношенню до людського гліпікану 3, або цитотоксичну активність по відношенню до клітини, що експресує людський гліпікан 3 (наприклад, HepG2 або рекомбінантні клітини СНО, що експресують людський гліпікан 3, і інш.). Гуманізоване антитіло Одним переважним втіленням антитіла відповідно до даного винаходу є гуманізоване антитіло, яке зв'язується з гліпіканом 3. Гуманізоване антитіло можна отримати відомим способом. Гуманізоване антитіло також згадується як видозмінене людське антитіло, яке отримують шляхом пересадження ділянки, що визначає комплементарність (CDR) антитіла ссавця, відмінного від людини, наприклад, мишачого антитіла, в CDR людського антитіла. Для отримання таких антитіл також використовуються загальні методи рекомбінантних ДНК (див. Європейську патентну заявку ЕР 125023 і міжнародну патентну заявку WO 96/02576). Наприклад, якщо CDR отримують з мишачого антитіла, послідовність ДНК, яку конструюють для з'єднання CDR мишачого антитіла з каркасною ділянкою (FR) людського антитіла, синтезують методом ПЛР з використанням декількох олігонуклеотидів як праймерів, які отримують так, щоб фрагменти перекривалися один з одним по обох кінцях CDR і FR (див. спосіб, описаний в міжнародній патентній заявці WO 98/13388). Вибирають каркасну ділянку людського антитіла, яка при з'єднанні з CDR дозволяє отримати гіперваріабельну ділянку з бажаним антигензв'язувальним центром. За необхідності амінокислоту в каркасній ділянки варіабельної ділянки антитіла можна замінити так, щоб гіперваріабельна ділянка видозміненого людського антитіла могла утворити відповідний антигензв'язувальний центр (Sato, До. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856). С-ділянку людського антитіла можна використати як С-ділянку химерного антитіла або гумані 35 зованого антитіла, наприклад, С1, С2, С3, і С4 можна використати як складові частини Ηланцюга, а С і С, можна використати як складові частини L-ланцюга. С-ділянку людського антитіла також можна модифікувати, щоб поліпшити стабільність антитіла або полегшити його отримання. Для гуманізації можна використати будь-який ізотип людського антитіла, наприклад, IgG, IgM, IgA, IgE i IgD, переважно IgG, більш переважно lgG1 або IgG3 і особливо переважно lgG1. У даному винаході lgG1 ефективно, якщо антитіло використовується як протираковий засіб, тобто володіє високою цитотоксичною активністю (Chemical immunology, 65: 88 (1997)). Крім того, після отримання гуманізованого антитіла амінокислоту у варіабельній (наприклад, в FR) або константній ділянки можна замінити іншою амінокислотою. Походження CDR в гуманізованому антитілі особливо не обмежується, і CDR може бути отриманий від будь-якої тварини. Наприклад, можна використати послідовність, отриману з мишачого антитіла, щурячого антитіла, кролячого антитіла, верблюжого антитіла або т. п. Переважно використати послідовність CDR мишачого антитіла. Як правило, при гуманізації антитіла важко зберегти агоністичну активність первинного антитіла. Однак в даному винаході успішно отримують гуманізоване антитіло, що володіє агоністичною активністю, еквівалентною активності вихідного мишачого антитіла. Оскільки антигенність гуманізованого антитіла в організмі людини меншає, його можна використати для введення людині в терапевтичних цілях. Переважні приклади гуманізованого антитіла проти гліпікану 3 даного винаходу включають в себе, наприклад, антитіло, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, описану в SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a), SEQ ID NO: 85 (GC33 VH ver.c), SEQ ID NO: 86 (GC33 VH ver.f), SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver.h), SEQ ID NO: 88 (GC33 VH ver.i), SEQ ID NO: 89 (GC33 VH ver.j) або SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k), або антитіло, яке містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, описану в SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a). Особливо переважні приклади антитіл включають в себе антитіло, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, описану в SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a), SEQ ID NO: 85 (GC33 VH ver.c), SEQ ID NO: 86 (GC33 VH ver.f), SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver.h), SEQ ID NO: 88 (GC33 VH ver.i), SEQ ID NO: 89 (GC33 VH ver.j) або SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k), і варіабельну ділянку легкого ланцюга, описану в SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a). Крім того, переважний приклад гуманізованого антитіла проти гліпікану 3 включає в себе антитіло, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 90, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 205. Переважне втілення антитіла згідно з даним винаходом являє собою антитіло, яке зв'язується з епітопом, з яким зв'язується антитіло, описане в будь-якому з нижченаведених пунктів (1)-(8): 94019 36 (1) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 62, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 73 (GC33), (2) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 26, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 48 (M11F1), (3) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 25, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 47 (М3В8), (4) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 60, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 71 (GC199), (5) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 61, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 72 (GC202), (6) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 63, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 74 (GC179), (7) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 64, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 75 (GC194(l)), i (8) антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 64, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 76 (GC194 (2)). Більш переважне антитіло, що зв'язується з епітопом, з яким зв'язується антитіло, описане в будь-якому з пунктів (1)-(5), і особливо переважне антитіло, що зв'язується з епітопом, з яким зв'язується антитіло, описане в пункті (1). Використовують антитіло, яке зв'язується з епітопом, з яким зв'язується будь-яке з вищезгаданих антитіл, оскільки воно володіє особливо високою цитотоксичністю. Антитіло, описане в будь-якому з пунктів (1)(7), зв'язується з ділянкою від 524-ої амінокислоти до 580-ої амінокислоти людського гліпікану 3. Особливо, воно зв'язується з ділянкою від 524-ої амінокислоти до 563-ої амінокислоти. Антитіло, описане в будь-якому з пунктів (1)-(5), зв'язується з ділянкою від 537-ої амінокислоти до 563-ої амінокислоти людського гліпікану 3. Антитіло, описане в пункті (1), зв'язується з ділянкою від 544-ої 37 амінокислоти до 553-ої амінокислоти людського гліпікану 3. Особливо, воно зв'язується з ділянкою від 546-ої амінокислоти до 551-ої амінокислоти. Антитіла, що розпізнають вищезгадані епітопи, володіють високою цитотоксичністю, отже, їх можна використати для лікування таких захворювань, як рак. Особливо, можна використати антитіло, яке зв'язується з ділянкою від 546-ої амінокислоти до 551-ої амінокислоти, оскільки воно володіє високою цитотоксичністю. Відповідно, даний винахід включає в себе антитіла, які зв'язуються з епітопом на ділянки від 524-ої амінокислоти до 580-ої амінокислоти людського гліпікану 3, переважно на ділянки від 524-ої амінокислоти до 563-ої амінокислоти, більш переважно на ділянки від 537-ої амінокислоти до 563-ої амінокислоти, ще більш переважно на ділянки від 544-ої амінокислоти до 553-ої амінокислоти, особливо переважно на ділянки від 546-ої амінокислоти до 551-ої амінокислоти. Інше переважне втілення даного винаходу являє собою антитіло, яке розпізнає ділянку від 524ої амінокислоти до 563-ої амінокислоти людського гліпікану 3 і не розпізнає ділянку від 537-ої амінокислоти до 563-ої амінокислоти. Інше переважне втілення даного винаходу являє собою антитіло, яке розпізнає ділянку від 537ої амінокислоти до 563-ої амінокислоти людського гліпікану 3 і не розпізнає ділянку від 550-ої амінокислоти до 563-ої амінокислоти. Аналіз епітопа, який розпізнається антитілом, можна провести відомим в даній галузі способом, наприклад, методом вестерн-блотингу, який описується нижче в прикладах. Антитіло, яке розпізнає вищезгадані ділянки як епітопи, можна отримати відомим в даній галузі способом. Наприклад, воно може бути отримане шляхом отримання пептиду, що має амінокислотну послідовність цільової ділянки на основі амінокислотної послідовності людського гліпікану 3, з подальшим отриманням антитіла з використанням даного пептиду як імуногену, або шляхом отримання антитіла звичайним способом і визначення епітопа, який розпізнає отримане антитіло, з подальшим вибором антитіла, яке розпізнає цільовий епітоп. Переважним прикладом антитіла проти гліпікану 3 є антитіло, що володіє високою ADCCактивністю, або антитіло, що володіє високою CDC-активністю по відношенню до клітини, що експресу є гліпікан 3. Фраза "висока ADCC-активність" або "висока CDC-активність" в даному описі означає, що антитіло даного винаходу має більш високу ADCCактивність або більш високу CDC-активність, ніж відоме антитіло проти гліпікану 3. Відомі антитіла проти гліпікану 3 включають в себе, наприклад, М3С11 і М1Е07, описані в міжнародній патентній заявці WO 2004/22739. ADCC-активність або CDC-активність можна виміряти за допомогою відомого в даній галузі методу. Наприклад, її можна виміряти по вивільненню хрому. Конкретні умови аналізу вивільнення хрому для вимірювання ADCC-активності особливо не обмежуються, однак, наприклад, її можна 94019 38 вимірювати, використовуючи умови, описані нижче в прикладах. Приклади клітин, які експресують гліпікан 3, включають в себе, наприклад, клітинну лінію гепатоми, таку як HepG2, клітинну лінію СНО, що містить ген, який кодує гліпікан 3 і т. п. Для вимірювання ADCC-активності переважно використати клітинну лінію HepG2, а для вимірювання CDCактивності переважно використати рекомбінантну клітинну лінію СНО, експресуючу GPC3. Рекомбінантну клітинну лінію СНО, яка експресує GPC3, можна отримати будь-яким способом, в тому числі, її можна отримати, наприклад, за способом, описаним нижче в прикладах. Якщо антитіло проти гліпікану 3 використовують як протираковий засіб, переважно, щоб воно володіло таким же рівнем ADCC-активності, що і антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 62, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 73 (GC33). Якщо антитіло проти гліпікану 3 використовують як протираковий засіб, переважно, щоб воно володіло таким же рівнем CDC-активності, що і антитіло, яке включає в себе варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 62, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, описану в SEQ ID NO: 73 (GC33). Крім того, даний винахід включає в себе антитіло, що володіє високою зв'язуючою активністю по відношенню до гліпікану 3. У даному винаході зв'язуючу активність антитіла по відношенню до гліпікану 3 можна виміряти відомим в даній галузі способом. Наприклад, її можна виміряти методом поверхневого плазмового резонансу з використанням ВІАсоrе. А саме, білок гліпікан 3 іммобілізують на сенсорному чипі для взаємодії з антитілом, і взаємодію антитіла і гліпікану 3 розраховують як константу швидкості реакції виходячи з результатів вимірювання. Крім того, для вимірювання зв'язуючої активності можна використати твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA), імуноферментний аналіз (ЕІА), радіоімунологічний аналіз (RIA) або імунофлуоресцентний аналіз. Наприклад, у випадку імуноферментного аналізу зразок, що містить антитіло, яке аналізується, наприклад, культуральний супернатант клітини, яка продукує антитіло, що аналізується, або очищене антитіло, додають в планшет, заздалегідь покритий антигеном, з яким зв'язується антитіло, що аналізується. Потім додають вторинне антитіло, мічене ферментом, таким як лужна фосфатаза, після чого планшети інкубують і промивають. Потім додають субстрат ферменту, такий як п-нітрофенілфосфат, і вимірюють поглинання, по якому розраховують антигензв'язувальну активність. Верхній кордон зв'язуючої активності особливо не обмежується. Однак, наприклад, верхня межа може знаходитися в інтервалі, який визначається технічними можливостями з точки зору фахівця в даній галузі. Потрібно розуміти, що по мірі вдосконалення технології технічно можливий інтервал буде розширюватися. 39 Далі, в даному винаході амінокислота, що підлягає дезамідуванню, або сусідня амінокислота, може бути замінена на іншу амінокислоту, наприклад, для придушення дезамідування з метою збільшення стабільності антитіла. Підлягаюча дезамідуванню амінокислота включає в себе аспарагін і глутамін, переважно аспарагін. Амінокислота, що знаходиться по сусідству з аспарагіном, особливо не обмежується і може бути будь-якою амінокислотою. Відомо, що послідовність аспарагін-гліцин є особливо чутливою до дезамідування, отже, переважно, щоб по сусідству з аспарагіном знаходився гліцин. Амінокислота, що використовується для заміни, особливо не обмежується і може являти собою будь-яку амінокислоту, відмінну від аспарагіну і глутаміну. Переважно, дана амінокислота відрізняється від валіну і проліну. Отже, в даному винаході, якщо відбувається дезамідування антитіла, переважно замінити амінокислоту на амінокислоту, відмінну від аспарагіну, глутаміну, валіну і проліну. Придушення дезамідування шляхом заміни амінокислоти можна провести, наприклад, за способом, описаним в міжнародній патентній заявці WO 03/057881. Переважно, щоб після заміни амінокислоти з метою придушення дезамідування зберігалася антигензв'язувальна активність, яка була присутньою до заміни. Інше втілення стабілізації антитіла включає в себе заміну глутамінової кислоти на іншу амінокислоту. У даному винаході також було виявлено, що, якщо 6-а амінокислота важкого ланцюга антитіла являє собою глутамінову кислоту, антитіло можна значною мірою стабілізувати шляхом заміни глутамінової кислоти на глутамін. Відповідно, даний винахід також відноситься до способу стабілізації антитіла шляхом заміни глутамінової кислоти в 6-ому положенні важкого ланцюга антитіла на глутамін. Нумерація амінокислот в антитілі відома фахівцям в даній галузі (наприклад, Kabat, Ε. A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services 1983). Антитіло даного винаходу може являти собою кон'юговане антитіло, тобто антитіло може бути зв'язане з різними молекулами, такими як молекули поліетиленгліколю (PEG), радіоактивних речовин і токсинів. Таке кон'юговане антитіло можна отримати шляхом хімічної модифікації отриманого раніше антитіла. Способи модифікації антитіл відомі в даній галузі. Антитіло даного винаходу включає в себе таке кон'юговане антитіло. Антитіло даного винаходу також може являти собою біспецифічне антитіло (див., наприклад, Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374). Біспецифічне антитіло може розпізнавати гліпікан 3 і інший антиген, або воно може розпізнавати різні епітопи на молекулі GPC3. Крім того, антитіло даного винаходу може нести певний білок, гібридизований з N- або С-кінцем антитіла (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 12741281). Білок для гібридизації з антитілом може бути відповідно вибраний фахівцем в даній галузі. Антитіло даного винаходу також включає в себе антитіло з підвищеною цитотоксичністю. Приклади антитіл з підвищеною цитотоксичністю вклю 94019 40 чають в себе антитіло, що втратило фукозу, антитіло, яке містить розділяючий N-ацетилглюкозамін (GlcNAc), приєднаний до його вуглеводного ланцюга, і антитіло, що володіє зміненою зв'язуючою активністю по відношенню до рецептору Fc, отримане шляхом заміщення однієї або декількох амінокислот в ділянки Fc. Такі антитіла з підвищеною цитотоксичністю можна отримати відомим в даній галузі способом. Спосіб отримання антитіла Антитіло, яке зв'язується з гліпіканом 3, можна отримати відомим в даній галузі способом. Наприклад, гібридому, що продукує моноклональне антитіло, можна отримати, як зазначено нижче, використовуючи в основному відомий метод. Тобто гібридому можна отримати шляхом імунізації ссавця традиційним способом, з використанням як сенсибілізуючого антигена білка гліпікану 3 або клітини, що експресують гліпікан 3. Отриманий таким чином імуноцит гібридизують з відомою батьківською клітиною, використовуючи звичайний метод гібридизації клітин, і потім за допомогою традиційного методу скринінгу відбирають клітини, що продукують моноклональні антитіла. Конкретно, моноклональне антитіло можна отримати таким чином. Спочатку отримують білок гліпікан 3 на основі генної/амінокислотної послідовностей гліпікану 3, описаних в SEQ ID NO: 3 і 4, який використовують як сенсибілізуючий антиген для отримання антитіла. Більш конкретно, генну послідовність, що кодує гліпікан 3, вставляють у відому векторну систему експресії, отриманим вектором трансформують відповідну клітинухазяїна і потім цільовий людський білок гліпікан 3 виділяють з клітини-хазяїна або з культурального супернатанту відомим способом. Потім даний очищений білок гліпікан 3 використовують як сенсибілізуючий антиген. Альтернативно, як сенсибілізуючий антиген можна використати пептидний фрагмент гліпікану 3. В даному випадку пептидний фрагмент можна отримати також шляхом хімічного синтезу відповідно до амінокислотної послідовності людського гліпікану 3. Епітоп молекули гліпікану 3, який розпізнається антитілом проти гліпікану 3 даного винаходу, не обмежується конкретним епітопом. Антитіло проти гліпікану 3 може розпізнавати будь-який епітоп, якщо епітоп присутній на молекулі гліпікану 3. Відповідно, для отримання антитіла проти гліпікану 3 даного винаходу як антиген можна використати будь-який фрагмент, який містить епітоп, присутній на молекулі гліпікану 3. Ссавець, якого імунізують сенсибілізуючим антигеном, особливо не обмежується, однак його переважно вибирають з точки зору сумісності з батьківською клітиною, що використовується для гібридизації клітин. Наприклад, звичайно використовують гризунів, таких як миші, щури і хом'яки, кроликів або мавп. Імунізацію тварин сенсибілізуючим антигеном проводять відомим способом. Наприклад, імунізацію проводять за загальним способом, в якому сенсибілізуючий антиген вводять ссавцеві внутрішньочеревинно або підшкірно. А саме, сенсибілізуючий антиген розбавляють відповідною кількіс 41 тю, або суспендують у відповідній кількості PBS (забуференого фосфатом фізіологічного розчину), фізіологічного розчину і т. п., при необхідності продукт змішують з відповідною кількістю стандартного ад'юванту, такого як повний ад'ювант Фрейнда, і потім розчин емульгують і вводять ссавцеві декілька разів через кожні 4-21 днів. Для імунізації сенсибілізуючим антигеном також можна використати відповідний носій. Ссавця імунізують за описаним вище способом і потім підтверджують, що в сироватці присутній підвищений рівень цільового антитіла. Потім у ссавця беруть імуноцити і піддають їх клітинній гібридизації. Особливо переважним імуноцитом є спленоцит. Як батьківська клітину-партнера для гібридизації з вищезгаданим імуноцитом використовують клітину мієломи ссавця. Приклади клітинної лінії мієломи, що переважно використовуються в даному винаході, включають в себе різні відомі клітинні лінії, такі як Р3 (Р3х63 Ag8.653) (J.Immnol. (1979) 123, 1548-1550), Р3х63 Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, С Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) і R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979)277, 131-133). Гібридизацію вищезазначених імуноцитів з клітинами мієломи в основному можна провести за допомогою відомого способу, наприклад, способу Kohler and Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). Більш конкретно, вищезазначену клітинну гібридизацію проводять в звичайному поживному розчині для культивування в присутності, наприклад, речовини, що прискорює гібридизацію клітин. Як речовину, що прискорює гібридизацію клітин, використовують, наприклад, поліетиленгліколь (PEG), гемаглютинуючий японський вірус (HVJ). При бажанні, для додаткового збільшення ефективності гібридизації можна додати допоміжний засіб, такий як диметилсульфоксид. Можна вибрати відповідне співвідношення імуноцитів і мієломних клітин. Наприклад, переважно, щоб число імуноцитів було в 1-10 разів вище, ніж число мієломних клітин. Культуральний розчин, що використовується для вищезазначеної гібридизації клітин, включає в себе, наприклад, культуральний розчин RPMI1640 або культуральний розчин MEM, відповідний для вирощування вищезазначеної мієломної клітинної лінії, або інший звичайний культуральний розчин, що використовується для даного типу клітинної культури. Крім того, в поєднанні з даним розчином можна використати сироваткову добавку, таку як фетальна теляча сироватка (FCS). Гібридизацію клітин проводять таким чином. Заздалегідь визначену кількість вищезазначених імуноцитів і мієломних клітин ретельно перемішують у вищезазначеному культуральному розчині, додають нагрітий приблизно до 37°С розчин PEG (наприклад, зі середньою молекулярною масою 94019 42 приблизно від 1000 до 6000) (загальна концентрація від 30 до 60% (мас./об.)), потім розчин перемішують і отримують цільову гібридну клітину (гібридому). Після цього додають відповідний культуральний розчин і декілька разів проводять стадію видалення супернатанту шляхом центрифугування, щоб видалити реагент для гібридизації клітин або інший реагент, що несприятливо впливає на ріст гібридоми. Отриману таким чином гибридому відбирають шляхом культивування гібридоми в стандартному селекційному культуральному розчині, такому як культуральний розчин HAT (культуральний розчин, що містить гіпоксантин, аміноптерин і тимідин). Культивацію у вищезазначеному культуральному розчині HAT продовжують протягом періоду часу, достатнього для того, щоб клітини, відмінні від клітин цільової гібридоми (негібридизовані клітини), загинули (звичайно від декількох днів до декількох тижнів). Потім за допомогою стандартного методу лімітуючих розведень відбирають моноклон гібридоми, який продукує цільове антитіло. У додання до способу імунізації відмінної від людини тварини антигеном з метою отримання гібридоми, цільове людське антитіло, що володіє зв'язуючою активністю по відношенню до гліпікану 3, також можна отримати шляхом сенсибілізації людського лімфоциту гліпіканом 3 in vitro і гібридизації сенсибілізованого лімфоцита з клітиною мієломи людини, здатною до постійного ділення (див. JP-B-1-59878). В іншому способі, щоб отримати клітини, які продукують антитіло проти гліпікану 3, антиген гліпікан 3 вводять трансгенній тварині, що містить весь набір генів людських антитіл, потім отримані клітини іморталізують, і людське антитіло проти гліпікану 3 отримують з іморталізованих клітин, що продукують антитіло проти гліпікану 3 (див. міжнародні патентні заявки WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 і WO 94/02602). Отриману таким чином гібридому, яка продукує моноклональне антитіло, можна культивувати пасажами в стандартному культуральному розчині, або її можна зберігати протягом тривалого часу в рідкому азоті. Одним з прикладів способу, що використовується для отримання моноклонального антитіла з гібридоми, є культивування гібридоми і отримання моноклонального антитіла з культурального супернатанту за допомогою стандартного методу. Інший спосіб включає в себе введення гібридоми ссавцеві, сумісному з гібридомою, щоб забезпечити її проліферацію, і отримання моноклонального антитіла з асциту. Перший спосіб підходить для отримання антитіла високої чистоти, тоді як останній спосіб підходить для отримання великих кількостей антитіл. Можна також отримати рекомбінантне антитіло з використанням методу генної інженерії, шляхом клонування гена антитіла з гібридоми, вставки гена у відповідний вектор, введення вектора в хазяїна з подальшим продукуванням хазяїном рекомбінантного антитіла (наприклад, див. Vandamme, А. М. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990). 43 Конкретно, мРНК, що кодує варіабельну (V) ділянку антитіла проти гліпікану 3, виділяють з гібридоми, що продукує антитіло проти гліпікану 3. мРНК виділяють відомим способом, таким як метод ультрацентрифугування з гуанідином (Chirgwin, J. Μ. et al., Biochemistry (1979) 18, 52945299), або метод AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), і отримують спільну РНК, а потім цільову мРНК отримують за допомогою набору для виділення мРНК (Pharmacia) або т. п. Крім того, мРНК можна безпосередньо отримати за допомогою набору для виділення мРНК QuickPrep (Pharmacia). кДНК V-ділянки антитіла синтезують, використовуючи зворотну транскриптазу і отриману описаним вище способом мРНК. кДНК можна синтезувати, використовуючи набір для синтезу одноланцюжкової кДНК із зворотною транскриптазою AMV (SEIKAGAKU CORPORATION) або т. п. Для синтезу і ампліфікації кДНК можна також використати, наприклад, набір 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech), метод 5'-RACE з використанням ПЛР (Frohman, Μ. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932). Цільовий фрагмент ДНК виділяють з отриманого продукту ПЛР і потім лігують з ДНК-вектором. Рекомбінантний вектор отримують з продукту, потім вектор вводять в Е. соlі або т. п. і проводять відбір колоній, отримуючи в результаті цільовий рекомбінантний вектор. Потім визначають нуклеотидну послідовність цільової ДНК за допомогою відомого методу, такого як дидезоксинуклеотидний метод обриву ланцюга. Після отримання ДНК, що кодує V-ділянку цільового антитіла проти гліпікану 3, її вставляють у вектор експресії, який містить ДНК, що кодує константну ділянку (С-ділянка) цільового антитіла. Щоб отримати антитіло проти гліпікану 3, що використовується в даному винаході, ген антитіла вставляють у вектор експресії так, щоб ген експресувався під управлінням ділянки, регулюючої експресію гена, що включає в себе, наприклад, енхансер і промотор. Потім клітину-хазяїна трансформують вектором експресії, щоб забезпечити експресію антитіла хазяїном. Ген антитіла можна експресувати шляхом роздільного введення у вектор експресії полінуклеотиду, що кодує Η-ланцюг, або полінуклеотиду, що кодує L-ланцюг, з подальшою одночасною трансформацією клітини-хазяїна векторами, або шляхом введення в один вектор експресії полінуклеотидів, що кодують Η-ланцюг і L-ланцюг, з подальшою трансформацією клітини-хазяїна вектором (див. міжнародну патентну заявку WO 94/11523). Полінуклеотид В іншому аспекті даний винахід пропонує полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга або варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла даного винаходу. Переважно, полінуклеотид даного винаходу має нуклеотидну послідовність, описану в будь-якій з SEQ ID NO: 11-21, 3343, 55-59, 65-70 і 77-83. Даний винахід також охоплює полінуклеотид, який гібридизується з вищеза 94019 44 значеним полінуклеотидом в жорстких умовах і кодує антитіло, що володіє активністю, еквівалентною активності антитіла даного винаходу. Полінуклеотид даного винаходу особливо не обмежується, за умови, що він кодує антитіло даного винаходу. Він являє собою полімер, що складається з сукупності нуклеотидів, таких як дезоксирибонуклеїнові кислоти (ДНК) або рибонуклеїнові кислоти (РНК). Він може містити основу, відмінну від тієї, що зустрічається в природі. Полінуклеотид даного винаходу можна використати для отримання антитіла за допомогою методу генної інженерії. Крім того, полінуклеотид даного винаходу можна використати як зонд для відбору антитіла, функціонально еквівалентного антитілу даного винаходу. Тобто полінуклеотид, що кодує антитіло даного винаходу, або його фрагмент, можна використати як зонд для отримання ДНК, якій гібридизується з даним полінуклеотидом в жорстких умовах і кодує антитіло, що володіє активністю, еквівалентною активності антитіла даного винаходу, за допомогою таких методів, як метод гібридизації, метод ампліфікації генів (наприклад, ПЛР). Така ДНК також включена в полінуклеотид даного винаходу. Методи гібридизації (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) добре відомі фахівцям в даній галузі. Приклади умов гібридизації включають в себе, наприклад, умови низької жорсткості. До умов низької жорсткості відносяться, наприклад, наступні умови: 42°С, 0,1xSSC і 0,1% SDS, переважно, 50°С, 0,1xSSC і 0,1% SDS, якщо промивання проводять після гібридизації. Більш переважні приклади умов гібридизації включають в себе, наприклад, умови високої жорсткості. До умов високої жорсткості відносяться, наприклад, наступні умови: 65°С, 5xSSC і 0,1% SDS. У вказаних умовах можна чекати, що при більш високій температурі буде відбуватися ефективне утворення полінуклеотиду, що володіє більш високою мірою гомології. До того ж, існує декілька факторів, які впливають на точність гібридизації, наприклад, температура і концентрація солі, і шляхом відповідного підбору даних факторів фахівці в даній галузі можуть досягнути схожої точності. Антитіло, функціональне еквівалентне антитілу даного винаходу, що кодується, полінуклеотидом, отриманим таким методом гібридизації і методом ампліфікації генів, володіє високою мірою гомології з антитілом з точки зору амінокислотної послідовності. Антитіло даного винаходу також включає в себе антитіло, функціональне еквівалентне антитілу даного винаходу, і володіє високою мірою гомології відносно амінокислотної послідовності антитіла. Висока міра гомології означає, як правило, щонайменше, 50% або більш високу ідентичність, переважно, 75% або більш високу ідентичність, більш переважно, 85% або більш високу ідентичність, і ще більш переважно, 95% або більш високу ідентичність, на амінокислотному рівні. Щоб визначити гомологію поліпептидів, можна використати алгоритм, описаний в літературі (Wilbur, W. J. and Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730). 45 Даний винахід також пропонує вектор, що містить полінуклеотид даного винаходу. Такий вектор можна використати для отримання антитіла даного винаходу. Якщо як хазяїн використовується Е. coli, вектор даного винаходу, наприклад, особливо не обмежується, поки він має "оrі" для ампліфікації в Е. coli з метою отримання і ампліфікації вектора у великій кількості в Е. coli (наприклад, JM109, DH5, HB101 або XLlBlue), і містить маркерний ген для селекції трансформованих Е. coli (наприклад, ген стійкості до лікарського засобу, який можна ідентифікувати за допомогою лікарського засобу, такого як ампіцилін, тетрациклін, канаміцин або хлорамфенікол). Приклади вектора включають в себе вектори серії МІ3, вектори серії pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script i т. п. Крім того, для субклонування і витягання кДНК нарівні з описаними вище векторами можна використати pGEM-T, pDIRECT і рТ7. Як вектор даного винаходу переважно використати вектор експресії. Наприклад, вектор експресії, призначений для використання в Е. coli, повинен мати характеристики, вказані для ампліфікації в Е. coli. Крім того, якщо як клітина-хазяїн використовують Е. coli, наприклад, JM109, DH5, HB101 або XLl-Blue, вектор обов'язково повинен містити промотор, наприклад, промотор lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), промотор araB (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), промотор Т7 або т. п., який забезпечує ефективну експресію цільового продукту в Е. coli. Приклади такого вектора включають в себе pGEX-5X-l (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP, pET (в цьому випадку хазяїном переважно є BL21, який експресує РНК-полімеразу Т7) і т. п., а також вектори, описані вище. Вектор також може містити сигнальну послідовність для секреції поліпептиду. Якщо поліпептид продукується в периплазмі Е. coli, як сигнальну послідовність для секреції поліпептиду можна використати сигнальну послідовність pelB (Lei S. P. et al., J. Bacteriol (1987) 169, 4379). Введення вектора в клітину-хазяїна можна здійснювати, наприклад, з використанням хлориду кальцію і методом електропорації. Як вектор даного винаходу, на додаток до Е. coli, можна використати, наприклад, вектори експресії, отримані з ссавців (наприклад, pcDNAS (Invitrogen) і pEGF-BOS (Nucleic Acids Res. (1990) 18(17), p5322), pEF і pCDMS), вектори експресії, отримані з клітин комах (наприклад, "бакуловірусна система експресії Bac-to-BAC" (GIBCO BRL) і pBacPAKS), вектори експресії, отримані з рослин (наприклад, рМН1 і рМН2), вектори експресії, отримані з вірусів тварин (наприклад, pHSV, pMV і pAdexLcw), вектори експресії, отримані з ретровірусів (наприклад, pZIPneo), вектори експресії, отримані з дріжджів (наприклад, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNVll і SP-Q01), і вектори експресії, отримані з Bacillus subtilis (наприклад, pPL608 і pKTHSO). Для експресії в тваринній клітині, такій як клітина СНО, клітина COS, клітина NIH3T3 і т. п., вектор обов'язково повинен містити промотор, необхідний для експресії в клітині, наприклад, 94019 46 промотор SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), промотор MMTV-LTR, промотор EFloc (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), промотор CMV або т. п., і, більш переважно, він повинен містити маркерний ген (такий як ген стійкості до лікарського засобу, який можна ідентифікувати за допомогою лікарського засобу, такого як неоміцин або G418), що допомагає відбирати трансформовані клітини. Приклади вектора, що має такі характеристики, включають в себе, наприклад, рМАМ, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV і рОРІЗ. Далі, щоб забезпечити стабільну експресію гена і одночасно збільшення числа піків гена в клітині, в клітину СНО з дефіцитом в шляху синтезу нуклеїнових кислот вводять вектор (наприклад, рСНОІ і інш.), що містить ген DHFR, щоб заповнити дефіцит, і ампліфікують його з метотрексатом (МТХ). Щоб забезпечити тимчасову експресію гена, трансформацію проводять з використанням вектора (такого як pcD), що містить ділянку ініціації реплікації SV40, і з використанням клітини COS, що містить на хромосомі ген, що забезпечує експресію антигену SV40 Т. Як ділянку ініціації реплікації можна використати ділянку ініціації з вірусу поліоми, аденовірусу, вірусу бичачої папіломи (BPV) і т. п. Щоб забезпечити збільшення числа піків гена в системі клітини-хазяїна, вектор експресії може включати в себе, як маркер селекції, ген аміноглікозидтрансферази (ΑΡΗ), ген тимідинкінази (ТК), ген ксантингуанінфосфорибозилтрансферази Е. coli (Ecogpt), ген дигідрофолатредуктази (dhfr) і т. п. Щоб отримати антитіло даного винаходу, вектор вводять в клітину-хазяїна. Клітина-хазяїн, в яку вводять вектор, особливо не обмежується, однак вона включає в себе, наприклад, Е. coli або будьяку тваринну клітину. Наприклад, клітину-хазяїна можна використати як систему продукування для продукування або експресії антитіла даного винаходу. Що стосується системи продукування, що використовується для отримання поліпептиду, існує система продукування in vitro і система продукування in vivo. У системі продукування in vitro використовуються еукаріотичні і прокаріотичні клітини. Як еукаріотичні клітини можна використати, наприклад, тваринні клітини, рослинні клітини або грибкові клітини. Відомі тваринні клітини включають в себе клітини ссавців, такі як клітини СНО (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), клітини COS, клітини 3Т3, клітини мієломи, клітини нирок детинчат хом'яків (ВНК), клітини HeLa і клітини Vero, клітини амфібій, такі як яйцеклітини Xenopus (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), або клітини комах, такі як Sf9, Sf21 і Тn5. У даному винаході переважно використовують клітини CHO-DG44, CHO-DXB11, COS7, ВНК. Для забезпечення широкомасштабної експресії з тваринних клітин переважно використати клітини СНО. Введення вектора в клітинухазяїна можна здійснити, наприклад, з використанням фосфату кальцію, DEAE-декстрану, катіонного рибозомного DOTАР (Boehringer Mannheim), методу електропорації, методу ліпофекції або т. п. 47 З рослинних клітин як систему продукування білків використовують, наприклад, клітини Nicotiana tabacum, які можуть бути піддані калюсному культивуванню. Приклади грибкових клітин включають в себе клітини дріжджів, наприклад, що відносяться до роду Saccharomyces, більш конкретно, Saccharomyces cerevistae і Saccharomyces pombe, і гіфоміцетів, наприклад, що відносяться до роду Aspergillus, більш конкретно, Aspergillus niger. У випадку прокаріотичних клітин можна використати систему продукування із застосуванням бактерійної клітини. Приклади бактерійних клітин включають в себе Escherichia coli (Е. coli), такі як JM109, DH5 і НВ101, і Bacillus subtilis. Отримання рекомбінантного антитіла Антитіло даного винаходу можна отримати шляхом культивування вищезгаданих клітинхазяїв. Антитіло можна отримати шляхом культивування in vitro клітини, трансформованої цільовим полінуклеотидом. Культивування можна провести за допомогою відомого методу. Культуральне середовище для тваринних клітин включає в себе, наприклад, DMEM, MEM, RPMI 1640 і IMDM. Середовище може бути доповнене сироваткою, такою як FBS або фетальна теляча сироватка (FCS), або можна використати середовище, що не містить сироватки. рН в процесі культивування переважно знаходиться в інтервалі від 6 до 8. Культивування звичайно проводять приблизно при 30-40°С протягом приблизно 15-200 годин, за необхідності, зі зміною середовища, при аерації і струшуванні. З іншого боку, системи для отримання поліпептиду in vivo включають в себе, наприклад, систему продукування, в якій використовується тварина, і систему продукування, в якій використовується рослина. Цільовий полінуклеотид вводять в таку тварину або рослину, і в організмі тварини або рослини продукується поліпептид, який потім витягують. Термін "клітина-хазяїн" в даному описі охоплює таку тварину і рослину. У випадку використання тварини доступні системи продукування із застосуванням ссавця або комахи. Як ссавців можна використати кіз, свиней, овець, мишей і велику рогату худобу (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Також можна використати трансгенного ссавця. Наприклад, цільовий полінуклеотид отримують у вигляді гібридного гена з геном, що кодує поліпептид, який в природі продукується в молоці, наприклад, козячий казеїн р. Потім фрагмент ДНК, що містить даний гібридний ген, вводять в ембріон кози і ембріон трансплантують козі. Цільове антитіло можна отримати з молока трансгенної кози, народженої козою, що отримала ембріон, або її нащадка. Для збільшення кількості продукованого молока, що містить антитіло, трансгенній козі за необхідності можна дати гормон. (Ebert, Κ. Μ. et al., Bio/Technology (1994) 12,699-702). Як комаху, наприклад, можна використати шовковичного шовкопряда. У випадку використання шовковичного шовкопряду, його інфікують бакуловірусом, в який вбудований полінуклеотид, що кодує цільове антитіло. Цільове антитіло можна 94019 48 отримати з рідини організму шовковичного шовкопряду (Susumu, Μ. et al., Nature (1985) 315, 592594). Як рослину можна використати, наприклад, тютюн. При використанні тютюну полінуклеотид, що кодує цільове антитіло, вставляють у вектор експресії для рослини, наприклад, pMON 530, а потім вектор вводять в бактерію, таку як Agrobacterium tumefaciens. Потім тютюн, такий як Nicotiana tabacum, інфікують бактерією і в результаті з листя тютюну отримують цільове антитіло (Julian, К. -С. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138). Отримане таким чином антитіло можна виділити з внутрішнього або зовнішнього (культуральне середовище і т. п.) середовища клітини-хазяїна і потім його можна очистити практично до чистого стану і однорідного антитіла. Виділення і очищення антитіла можна провести за допомогою методу виділення і очищення, який звичайно використовується для очищення поліпептидів. Наприклад, поліпептиди можна виділяти і очищати будь-якими методами, включаючи колонкову хроматографію, фільтрацію, ультрафільтрацію, висолювання, осадження розчинником, екстракцію розчинником, перегонку, імунопреципітацію, електрофорез на SDS-поліакриламідному гелі, гель-електрофорез, ізоелектричне фокусування, діалізи, перекристалізацію, а також їх поєднання. Приклади хроматографічних методів включають в себе, наприклад, афінну хроматографію, іонообмінну хроматографію, гідрофобну хроматографію, гель-фільтрацію, хроматографію на зверненій фазі, адсорбційну хроматографію (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Вказані хроматографічні методи можна провести з використанням рідинної хроматографії, такої як ВЕРХ і FPLC (fast-protein liquid chromatography рідинна експрес-хроматографія білків). Приклади колонок, що використовуються для афінної хроматографії, включають в себе колонку з білком А або колонку з білком G. Прикладом колонки з білком А є Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia). Крім того, до або після очищення, у міру необхідності, антитіло можна модифікувати, або можна частково видалити пептиди, шляхом використання відповідного ферменту, що модифікує білки. Фермент, який модифікує білки, що використовується для даної мети, включає в себе, наприклад, трипсин, хімотрипсин, лізилендопептидазу, протеїнкіназу, глюкозидазу. Діагностичний метод В іншому аспекті даний винахід пропонує метод діагностики захворювання, такого як рак, шляхом детекції білка GPC3 в зразку, що аналізується за допомогою антитіла даного винаходу. Детекція, що використовується в даному описі, включає в себе кількісну детекцію і некількісну детекцію. Некількісна детекція включає в себе, наприклад, просто визначення присутності білка GPC3, визначення присутності конкретної або більшої кількості білка GPC3, порівняння кількості білка GPC3 з його кількістю в іншому зразку (на 49 приклад, в контрольному зразку). Кількісна детекція включає в себе визначення концентрації білка GPC3, визначення кількості білка GPC3. Зразок, що аналізується, особливо не обмежується, поки він являє собою зразок, який може містити білок GPC3, однак переважно він являє собою зразок, взятий у живого організму, такого як ссавець, і більш переважно він являє собою зразок, взятий у людини. Конкретні приклади зразка, що аналізується можуть включати в себе, наприклад, кров, інтерстиціальну рідину, плазму, позасудинну рідину, мозкову рідину, синовіальну рідину, плевральну рідину, сироватку, лімфатичну рідину, слину, переважно кров, сироватку і плазму. Крім того, термін "зразок даного винаходу, що аналізується" також включає в себе зразок, отриманий із зразка, що аналізується, такий як культуральний розчин клітин, зібраних від живого організму. Вид раку, що діагностується, особливо не обмежується, і конкретні приклади можуть включати в себе рак печінки, рак підшлункової залози, рак легені, рак товстої кишки, рак молочної залози, рак простати, лейкоз і лімфому, переважно рак печінки. Детектований GPC3 особливо не обмежується і може являти собою або повнорозмірний GPC3, або його фрагмент. Якщо детектують фрагмент GPC3, він може являти собою або N-кінцевий фрагмент, або С-кінцевий фрагмент, однак N-кінцевий фрагмент є переважним. Крім того, білок GPC3 може являти собою GPC3 з доданим гепарансульфатом або коровий білок GPC3. Метод детекції білка GPC3, що міститься в аналізованому зразку, особливо не обмежується, однак детекцію переважно проводять імунологічним методом з використанням антитіла проти GPC3. Приклади імунологічних методів включають в себе, наприклад, радіоімунологічний аналіз, імуноферментний аналіз, імунофлуоресцентний аналіз, імунолюмінесцентний аналіз, імунопреципітацію, турбідиметричний імунологічний аналіз. Переважно використати імуноферментний аналіз, особливо переважно, твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) (наприклад, сендвіч-метод ELISA). Вищезгаданий імунологічний аналіз, такий як ELISA, можна провести відомим в даній галузі методом. Загальний метод детекції з використанням антитіла проти GPC3 включає в себе іммобілізацію антитіла проти GPC3 на підкладці, додання зразка, що аналізується, інкубацію підкладки, щоб забезпечити зв'язування антитіла проти GPC3 з білком GPC3, промивання підкладки і детекцію зв'язування білка GPC3 з підкладкою за допомогою антитіла проти GPC3 в зразку, що аналізується. Зв'язування антитіла проти GPC3 з білком GPC3 звичайно протікає в буфері. Буфери, що використовуються в даному винаході, включають в себе, наприклад, фосфатний буфер, Tris-буфер. Інкубацію проводять в звичайних умовах, наприклад, при температурі від 4°С до кімнатної, протягом 1-24 годин. Промивання після інкубації можна провести будь-яким методом, який не супроводжується інгібуванням зв'язування білка GPC3 з антитілом проти GPC3, з використанням, напри 94019 50 клад, буфера, що містить поверхнево-активну речовину, таку як Tween 20. У способі детекції білка GPC3 даного винаходу крім зразка, що аналізується на білок GPC3, може бути присутнім контрольний зразок. Контрольні зразки включають в себе зразки негативного контролю, які не містять білка GPC3, і зразки позитивного контролю, які містять білок GPC3. У цьому випадку білок GPC3 в зразку, що аналізується можна детектувати шляхом порівняння результатів, отриманих з використанням зразка негативного контролю, який не містить білок GPC3, з результатами, отриманими з використанням зразка позитивного контролю, який містить білок GPC3. Білок GPC3, що міститься в зразку, який аналізується, також можна кількісно визначити шляхом отримання результатів детекції контрольних зразків і зразка, що аналізується, у вигляді числових значень і порівняння отриманих числових значень. Переважним втіленням детекції зв'язування білка GPC3 з підкладкою за допомогою антитіла проти GPC3 є метод, в якому використовується антитіло проти GPC3, мічене детектованою міткою. Наприклад, білок GPC3 можна детектувати шляхом приведення в контакт зразка, що аналізується, з антитілом проти GPC3, іммобілізованим на підкладці, промивання підкладки і потім детекції GPC3 за допомогою міченого антитіла, яке специфічно зв'язується з білком GPC3. Антитіло проти GPC3 можна мітити за допомогою загальновідомого методу. Приклади відомих в даній галузі детектованих міток включають в себе флуоресцентний барвник, фермент, кофермент, хемілюмінесцентну речовину або радіоактивну речовина. Конкретні приклади можуть включати в себе радіоактивні ізотопи (32Р, 14С, 125І, 3Н, 131І і т. п.), флуоресцеїн, родамін, дансилхлорид, умбеліферон, люциферазу, пероксидазу, лужну фосфатазу, -галактозидазу, -глюкозидазу, пероксидазу хрону, глюкоамілазу, лізозим, сахаридоксидазу, мікропероксидазу, біотин і т. п. У випадку використання біотину як детектованої мітки переважно додавати мічене біотином антитіло і потім авідин, кон'югований з ферментом, таким як лужна фосфатаза. Конкретно, розчин, що містить антитіло проти GPC3, додають до підкладки, такої як планшет, щоб іммобілізувати на ній антитіло проти GPC3. Після промивання планшет блокують, наприклад, з допомогою БСА, щоб запобігти неспецифічному зв'язуванню білка. Планшет знов промивають і зразок, що потім аналізується додають до планшета. Після інкубації планшет промивають і потім додають мічене антитіло проти GPC3. Після інкубації у відповідних умовах планшет промивають і потім детектують мічене антитіло проти GPC3, що залишилося на планшеті. Білок можна детектувати відомим в даній галузі методом. Наприклад, якщо антитіло мітять радіоактивною речовиною, білок можна детектувати за допомогою рідинного сцинтиляційного аналізу або методом РІА. Якщо антитіло мітять ферментом, білок можна детектувати шляхом додання субстрату і детекції ферментативної зміни субстрату, такої як розвиток забарвлення, за допомогою пристрою зчитування абсорбції. 51 Якщо антитіло мітять флуоресцентною речовиною, білок можна детектувати з допомогою флуориметра. Особливо переважним втіленням методу детекції білка GPC3 даного винаходу є метод, в якому використовується антитіло проти GPC3, мічене біотином і авідином. Конкретно, розчин, що містить антитіло проти GPC3, додають до підкладки, такої як планшет, щоб іммобілізувати на ній антитіло проти GPC3. Після промивання планшет блокують, наприклад, за допомогою БСА, щоб запобігти неспецифічному зв'язуванню білка. Планшет знов промивають і потім зразок, що аналізується, додають до планшета. Після інкубації планшет промивають і потім додають антитіло проти GPC3, мічене біотином. Після інкубації у відповідних умовах планшет промивають і потім додають авідин, кон'югований з ферментом, таким як лужна фосфатаза або пероксидаза. Після інкубації планшет промивають і потім додають субстрат ферменту, кон'югованого з авідином. Потім білок GPC3 детектують по ферментативній зміні субстрату як індикатора. Іншим втіленням методу детекції білка GPC3 даного винаходу є метод, в якому використовується первинне антитіло, яке специфічно зв'язується з білком GPC3, і вторинне антитіло, яке специфічно зв'язується з первинним антитілом. Наприклад, зразок, що аналізується, приводять в контакт з антитілом проти GPC3, іммобілізованим на підкладці, підкладку інкубують, промивають і пов'язаний білок GPC3 після промивання детектують за допомогою первинного антитіла проти GPC3 і вторинного антитіла, яке специфічно зв'язується з первинним антитілом. У цьому випадку вторинне антитіло переважно мітять детектованою міткою. Конкретно, розчин, що містить антитіло проти GPC3, додають до підкладки, такої як планшет, щоб іммобілізувати на ній антитіло проти GPC3. Після промивання планшет блокують, наприклад, за допомогою БСА, щоб запобігти неспецифічному зв'язуванню білка. Планшет знов промивають і потім, зразок, аналізується, додають до планшета. Після інкубації планшет промивають і потім додають первинне антитіло проти GPC3. Після інкубації у відповідних умовах планшет промивають і потім додають вторинне антитіло, яке специфічно зв'язується з первинним антитілом. Після інкубації у відповідних умовах планшет промивають і потім детектують вторинне антитіло, що залишилося на планшеті. Вторинне антитіло можна детектувати вищезазначеним методом. Фармацевтична композиція В іншому аспекті даний винахід пропонує фармацевтичну композицію, що містить антитіло даного винаходу. Фармацевтичну композицію, що містить антитіло даного винаходу, використовують для лікування і/або профілактики захворювання, пов'язаного з проліферацією клітин, такого як рак, і особливо її використовують для лікування і/або профілактики раку печінки. Якщо антитіло даного винаходу використовують у вигляді фармацевтичної композиції, антитіло може бути введене до складу лікарської форми відомим в даній галузі способом. Наприклад, фармацевтичну композицію 94019 52 можна вводити парентерально шляхом ін'єкції стерильного розчину або суспензії у воді, або іншого фармацевтично прийнятного розчину. Наприклад, антитіло можна ввести до складу лікарської форми шляхом змішування його відповідним чином з фармацевтично прийнятним носієм або розчинником, таким як стерильні вода, фізіологічний розчин, рослинна олія, емульгатор, суспензія, поверхнево-активна речовина, стабілізатор, флаворант, ексципієнт, носій, консервант, зв'язуючий засіб, з отриманням стандартної лікарської форми, відповідної загальноприйнятим вимогам застосування лікарських засобів (Drug Implementation). Кількість активних інгредієнтів в даних препаратах вибирають так, щоб забезпечити введення відповідної дози у вказаному інтервалі. Стерильну композицію для ін'єкцій можна отримати з використанням такого носія, як дистильована вода для ін'єкцій, відповідно до загальних положень по застосуванню лікарських засобів. Приклади водного розчину для ін'єкцій включають в себе, наприклад, фізіологічний розчин, розчин глюкози і інші ізотонічні рідини, що включає в себе домішки, такі як D-сорбіт, D-маноза, D-маніт і хлорид натрію. Їх можна використати в поєднанні з відповідним солюбілізатором, таким як спирт, особливо етанол, багатоатомний спирт, такий як пропіленгліколь і поліетиленгліколь, і неіонна поверхнево-активна речовина, така як полісорбат 80 (ТМ) і НСО-50. Кунжутну олію або соєву олію можна використати як маслянисту рідина в поєднанні з бензилбензоатом або бензиловим спиртом як солюбілізатором. Вона може входити до складу композиції разом з буфером, таким як фосфатний буфер або натрій-ацетатний буфер, знеболюючим засобом, таким як прокаїну гідрохлорид, стабілізатором, таким як бензиловий спирт або фенол, або антиоксидантом. Отриманим розчином для ін'єкції звичайно заповнюють відповідну ампулу. Переважно використовують парентеральне введення, конкретні приклади якого включають в себе ін'єкцію, трансназальне введення, транспульмональне введення, черезшкірне введення і т. п. Композицію для ін'єкції можна вводити системно або місцево шляхом внутрішньовенної ін'єкції, внутрішньом'язової ін'єкції, внутрішньочеревинної ін'єкції, підшкірної ін'єкції або т. п. У залежності від віку пацієнта і симптомів захворювання вибирають відповідний спосіб введення. Наприклад, одна доза фармацевтичної композиції, що містить антитіло або полінуклеотид, що кодує антитіло, може бути вибрана з інтервалу від 0,0001 мг до 1000 мг на кг маси тіла. Альтернативно, наприклад, доза може бути вибрана з інтервалу від 0,001 мг до 100000 мг/організм пацієнта, хоча вона не завжди обмежується вказаними числовими значеннями. Дозу і спосіб введення вибирає фахівець в даній галузі в залежності від маси тіла і віку пацієнта і симптомів захворювання. Всі патенти і посилання, що цитуються в даному описі, включені в нього як посилання. Весь зміст, розкритий в описі і малюнках патентної заявки Японії № 2004-203637, по відношенню до якої 53 дана заявка заявляє пріоритет, включений в даний опис як посилання. Приклади Даний винахід буде описаний більш детально з посиланням на приведені нижче приклади. Однак даний винахід не обмежується даними прикладами. Приклад 1 кДНК-клонування людського гліпікану 3 (GPC3) Повнорозмірну кДНК, що кодує людський GPC3, ампліфікують методом ПЛР, використовуючи набір Advantage 2 (CLONTECH) і одноланцюжкову кДНК, отриману звичайним методом з клітинної лінії раку товстої кишки, Сасо2, як матриці. Більш конкретно, 50 мкл реакційної суміші, що містить 2 мкл кДНК, отриманої з Сасо2, 1 мкл смислового праймера (GATATCATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT: SEQ ID NO: 1), 1 мкл антисмислового праймера (GCTAGCTCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC: SEQ ID NO: 2), 5 мкл 10х буфера для ПЛР Advantage 2, 8 мкл суміші dNTP (1,25 мМ) і 1,0 мкл полімеразної суміші Advantage піддають 35 циклам, що включають в себе 94°С протягом 1 хвилини, 63°С протягом 30 секунд і 68°С протягом 3 хвилин. Ампліфікований продукт реакції ПЛР вставляють у вектор ТА, pGEM-T Easy, використовуючи pGEM-T Easy Vector System I (Promega). Послідовність підтверджують з допомогою ДНК-секвенатора АВІ 3100. Таким чином, виділяють кДНК, що кодує повнорозмірний людський GPC3. Послідовність, описана в SEQ ID NO: 3, відповідає нуклеотидній послідовності гена людського GPC3, а послідовність, описана в SEQ ID NO: 4, відповідає амінокислотній послідовності людського білка GPC3. Приклад 2 Отримання розчинної форми GPC3 Отримують імунний білок для утворення антитіла проти GPC3, розчинну форму білка GPC, в якій видалена гідрофобна ділянка на С-кінцевій стороні (амінокислоти 564-580). Використовуючи як матрицю кДНК повнорозмірного людського GPC3, проводять реакцію ПЛР з використанням антисмислового праймера (ATA GAA ТТС САС CAT GGC CGG GAC CGT GCG 3: SEQ ID NO: 5) і смислового праймера, до якого додають послідовність розпізнавання ЕсоRI і послідовність Козака (ΑΤΑ GGA ТСС CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT 3: SEQ ID NO: 6). Фрагмент, отриманий внаслідок реакції ПЛР (1711 п.о.), клонують в pCXND2-Flag. Конструюють pCXND2-Flag для експресії Flag-міченого білка шляхом вставки ділянки, що забезпечує експресію гена DHFR pCHOI (Hirata et al., FEBS letter 1994; 356; 244248), в сайтНіndIII pCXN2 (Niwa et al., Gene 1991; 108; 193-199) і додання маркерної послідовності нижче за ділянку мультиклонування. Сконструйовану експресійну плазміду ДНК вводять в клітинну лінію СНО, DXB11, і клітинну лінію СНО, ефективно експресуючу розчинну форму GPC3, отримують в результаті селекції з використанням 500 мкг/мл генетицину. Проводять широкомасштабне культивування клітинної лінії СНО, ефективно експресуючої розчинну форму GPC3, використовуючи 1700-см2 ролерний флакон, і витягують культура 94019 54 льний супернатант для виділення антитіла. Культуральний супернатант наносять на колонку Fast Flow з DEAE-сефарозою (Amersham), після промивання антитіло елююють буфером, що містить 500 мМ NaCl, і піддають його афінному очищенню, використовуючи агарозний афінний гель Anti-Flag M2 (SIGMA). Елюювання проводять з використанням 200 мкг/мл пептиду FLAG. Після концентрування елюату за допомогою Centriprep-10 (Millipore), пептид FLAG видаляють гельфільтрацією з використанням Superdex 200 HR 10/30 (Amersham). І нарешті, фільтрат концентрують, використовуючи колонку Fast Flow з DEAEсефарозою, і елююють PBS (утримуючим 500 мМ NaCl), що не містить Tween 20, щоб забезпечити заміну буфера. Приклад 3 Отримання розчинної форми корового білка GPC3 GPC3 модифікують гепарансульфатом з отриманням макромолекули. Щоб в скринінгу на антитіло проти GPC3 усунути антитіло проти гепарансульфата, отримують розчинну форму корового білка GPC3, який має мутацію в ділянки зв'язування гепарансульфату, і використовують його в скринінгу. Використовуючи вищезазначену розчинну форму GPC3 (1-563) як матрицю, кДНК, в якій залишки Ser в положеннях 495 і 509 замінені на Ala, отримують шляхом збирання методом ПЛР, в якому використовуються праймери, сконструйовані так, щоб забезпечити додання His-маркера до Скінця. Отриману кДНК клонують у векторі pCXND3. pCXNDS конструюють шляхом вставки ділянки рСНОІ, що забезпечує експресію гена DHFR, в ділянку Hindlll pCXN2. Сконструйовану експресійну плазміду ДНК вводять в клітинну лінію DXB11, і клітинну лінію СНО, ефективно експресуючу розчинну форму корового білка GPC3, отримують в результаті селекції з використанням 500 мкг/мл генетицину. Проводять широкомасштабне культивування, використовуючи 1700-см2 ролерний флакон, і витягують культуральний супернатант для виділення антитіла. Культуральний супернатант наносять на колонку Fast Flow з Q-сефарозою (Amersham). Після промивання антитіло елююють фосфатним буфером, що містить 500 мМ NaCl, і піддають його афінному очищенню, використовуючи колонку Fast Flow з хелатуючою сефарозою (Amersham). Антитіло елююють градієнтом 10-150 мМ імідазолу. І нарешті, елюат концентрують, використовуючи колонку Fast Flow з Q-сефарозою, і елююють фосфатним буфером, що містить 500 мМ NaCl. Електрофорез на SDS-поліакриламідному гелі у відновлювальних умовах показує три смуги, відповідних 70 кДа, 40 кДа і 30 кДа. Результат амінокислотного секвенування за допомогою білкового секвенатора АВІ492 (Applied Biosystems) показує, що смуга 30 кДа відповідає амінокислотній послідовності GPC3, починаючи з 359-ої амінокислоти і нижче, або з 375-ої амінокислоти і нижче, дозволяючи передбачити, що GPC3 розщеплюється між Arg358 і Ser359 або між Lys374 і Val375, отже, він 55 розділяється на N-кінцевий фрагмент розміром 40 кДа і С-кінцевий фрагмент розміром 30 кДа. Приклад 4 Отримання клітинної лінії СНО, яка експресує повнорозмірний людський GPC3 Для оцінки зв'язуючої активності за допомогою проточної цитометрії отримують клітинну лінію СНО, яка експресує повнорозмірний GPC3. Змішують десять мікрограм вектора експресії, що містить ген повнорозмірного людського GPC3, і 60 мкл SuperFect (QIAGEN). Після утворення комплексу здійснюють введення гена шляхом додання його до клітинної лінії СНО, DXB11. Після культивування протягом 24 годин в СО2-інкубаторі починають селекцію, використовуючи середовище МЕМ (GIBCO BRL), що містить генетицин з кінцевою концентрацією 0,5 мг/мл і 10% FBS. Збирають отримані стійкі до генетицину колонії і проводять клонування клітин, використовуючи метод лімітуючих розведень. Кожний клітинний клон солюбілізують і підтверджують експресію повнорозмірного людського GPC3 методом вестерн-блотингу з використанням антитіла проти GPC3. Таким чином, отримують клітинну лінію зі стабільною експресією. Приклад 5 Визначення зв'язуючої активності методом ELISA Розчинну форму корового білка GPC3 розбавляють до концентрації 1 мкг/мл буфером для покриття (0,1 моль/л NaHCO3 (pH 9,6), 0,02% (мас/об.) NaN3), вносять в імунопланшет і залишають при 4°С протягом ночі, щоб завершилося покриття планшету. Після блокування планшета буфером для розбавлення (50 ммоль/л Tris-НСl (рН 8,1), 1 ммоль/л MgCl2, 150 ммоль/л NaCl, 0,05% (об./об.) Tween 20, 0,02% (мас/об.) NaN3, 1% (мас/об.) BSA) додають антитіло проти GPC3 і залишають стояти при кімнатній температурі протягом 1 години. Промивають буфером для промивання (0,05% (об./об.) Tween 20, PBS), потім додають антитіло проти мишачих IgG (ZYMED), мічене лужною фосфатазою, і залишають стояти при кімнатній температурі протягом 1 години. Промивають буфером для промивання, потім додають SIGMA 104 (SIGMA), розбавлений до концентрації 1 мг/мл субстратним буфером (50 ммоль/л NaHCO3 (pH 9,8), 10 ммоль/л MgCl2), і залишають стояти при кімнатній температурі протягом 1 години для розвитку забарвлення. Потім вимірюють поглинання (при 405 нм, довжина хвилі порівняння 655 нм) за допомогою Benchmark Plus (BIO-RAD). Приклад 6 Імунізація розчинною формою GPC3 і селекція гибридоми Оскільки людський GPC3 і мишачий GPC3 володіють високою гомологією, 94%, на амінокислотному рівні, вважається, що важко отримати антитіло проти GPC3, якщо імунізують нормальну мишу. Тому як тварину, що імунізується, використовують мишу з аутоиммунним захворюванням, мишу MRL/MpJUmmCrj-lpr/lpr, (далі згадується як миша MRL/lpr, що поставляється Charles River Japan, Inc.). Мишей починають імунізувати у віці 7 або 8 тижнів. Першу імунізацію проводять таким 94019 56 чином: отримують розчинну форму GPC3 в кількості 100 мкг/особень, емульгують, використовуючи повний ад'ювант Фрейнда (FCA, Becton Dickinson), і вводять підшкірно. Через два тижні отримують розчинну форму GPC3 в кількості 50 мкг/особень, емульгують, використовуючи неповний ад'ювант Фрейнда (FIA, Becton Dickinson), і вводять підшкірно. Потім кожний тиждень проводять додаткову імунізацію, усього 5 разів. Під час останньої імунізації двом імунізованим мишам вводять в хвостову вену розчинну форму GPC3, розбавлену PBS до 50 мкг/особень. На четвертий день після останньої імунізації селезінку видаляють і отримують клітини селезінки, які змішують з клітинами мишачої мієломи, P3-X63Ag8Ul (P3U1, отриманими від АТСС), в співвідношенні 2:1. Гібридизацію клітин проводять шляхом поступового додання PEG 1500 (Roche Diagnostic). Обережно додають середовище RPMI 1640 (GIBCO BRL), щоб розбавити PEG 1500, потім PEG 1500 видаляють центрифугуванням, клітини суспендують в середовищі RPMI 1640, що містить 10% FBS, і вносять в 96-ямковий культуральний планшет в кількості 100 мкл/ямка. На наступний день додають середовище RPMI 1640, що містить 10% FBS, домішку до середовища 1х HAT (SIGMA) і домішку для клонування гібридоми 0,5xBM-Condimed H1 Hybridoma (Roche Diagnostic) (далі згадується як середовище HAT), в кількості 100 мкл/ямка. Через 2, 3 і 5 днів половину культурального розчину замінюють на середовище HAT. Через 7 днів проводять скринінг з використанням культурального супернатанту. Скринінг проводять методом ELISA, використовуючи імунопланшет, покритий розчинною формою корового білка GPC3. Позитивний клон піддають моноклонуванню методом лімітуючих розведень. У результаті отримують 11 клонов антитіл (М3С11, М13В3, М1Е7, М3В8, M11F1, L9G11, М19В11, М6В1, M18D4, М5В9 і M10D2), які володіють сильною зв'язуючою активністю по відношенню до GPC3. Приклад 7 Визначення ізотипу і очищення антитіла проти GPC3 Ізотип визначають методом антиген-залежного ELISA з використанням набору І для визначення ізотипів імуночистих моноклональних антитіл (PIERCE). Очищення антитіл проводять таким чином. Культуральний супернатант гібридоми, культивованої із середовищем HAT, доповненим FBS (Ultra low IgG) (GIBCO BRL), адсорбують на Hi Trap ProteinG HP (Amersham) і промивають буфером для зв'язування (20мМ фосфат натрію (рН 7,0)). Антитіло елююють буфером для елюювання (0,1 Μ гліцин-НСІ (рН 2,7)). Елюат відразу нейтралізують буфером для нейтралізації (1М Tris-HCl (pH 9,0)) і діалізують проти PBS протягом дня і ночі, щоб замінити буфер. Приклад 8 Визначення зв'язуючої активності методом ELISA Щоб оцінити зв'язуючу активність отриманого раніше антитіла проти GPC3, визначають залежне від концентрації зв'язування антитіла з імунопланшетом, що містить іммобілізовану розчинну форму корового білка GPC3. Додають серії 3-кратних 57 розбавлень (всього 12 розбавлень) очищеного антитіла з концентрацією 10 мкг/мл і як вторинне антитіло додають антитіло проти мишачих IgG. Розвиток забарвлення здійснюють з використанням SIGMA 104. Оскільки міра розвитку забарвлення залежить від часу розвитку забарвлення, аналізують дані, отримані точно через 1 годину. Кожне антитіло дає залежний від концентрації розвиток забарвлення. Будують графік залежності розвитку забарвлення від концентрації антитіла і за допомогою аналізуючого програмного забезпечення, GraphPad Prism, отримують аппроксимовану криву. Визначають значення ЕС50 для антитіла і використовують його як показник зв'язуючої активності. Значення ЕС50 для всіх клонів приведені на Фіг. 16. Приклад 9 Визначення зв'язуючої активності за допомогою проточної цитометрії Клітини роз'єднують з допомогою імМ EDTA рН 8,0 (GIBCO)/PBS і суспендують в буфері FACS (1% FBS/PBS) в концентрації 1х10б клітин/мл. Суспензію вносять в фільтрувальний планшет Multiscreen-HV (Millopre) в кількості 100 мкл/ямка і супернатант видаляють центрифугуванням. Додають антитіло проти GPC3, розбавлене до відповідної концентрації, і залишають взаємодіяти на льоду протягом 30 хвилин. Клітини промивають один раз буфером FACS, додають FITC-мічене антитіло проти мишачих IgG і залишають взаємодіяти на льоду протягом 30 хвилин. Після завершення реакції клітини центрифугують при 500 об./хв. протягом 1 хвилини і супернатант видаляють. Клітини суспендують в 400 мкл буферу FACS і аналізують методом проточної цитометрії. Як проточний цитометр використовують EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter). Область живих клітин вибирають по гістограмі з прямим і бічним розсіюванням. Як показано на Фіг. 1, антитіло проти GPC3 (М3С11, M11F1) добре зв'язується з клітиною СНО, що експресує GPC3, і не зв'язується з батьківською клітиною СНО, вказуючи на те, що антитіло специфічно зв'язується з GPC3, презентованим на клітинній мембрані. Крім того, антитіло володіє зв'язуючою активністю по відношенню до клітинної лінії гепатоми, HepG2 (отриманої від АТСС) і HuH-7 (отриманої від Health Science Research Resources Bank), дозволяючи передбачити, що антитіло може специфічно розпізнавати гепатому. Визначена методом проточної цитометрії зв'язуюча активність клонів, отриманих від мишей, імунізованих розчинною формою GPC3, приведена на Фіг. 16, де вказані Х-значення гістограми для концентрації антитіла 5 мкг/мл. Приклад 10 Класифікація по епітопах за допомогою конкурентного аналізу ELISA Отримані антитіла класифікують по епітопах за допомогою конкурентного аналізу ELISA. Антитіла біотинілюють, використовуючи набір для мічення біотином (Roche). Розчинну форму корового білка GPC3 розбавляють буфером для покриття до концентрації 1 мкг/мл, вносять в планшет в кількості 100 мкл/ямка і витримують при 4°С протягом ночі, щоб на планшеті утворилося покриття. 94019 58 На наступний день проводять блокування шляхом додання 200 мкл субстратного буфера. Планшет залишають при 4°С протягом ночі або довше, додають антитіло проти GPC3 в кількості 100 мкл/ямка і залишають взаємодіяти при кімнатній температурі протягом 1 години. Після цього, не промиваючи планшет, додають 10 мкл міченого біотином антитіла проти GPC3 в концентрації 10 мкг/мл і залишають взаємодіяти ще на 1 годину. Планшет промивають 3 рази буфером для промивання по 300 мкл/ямка. Кон'югат АР-стрептавідин (ZYMED) розбавляють в 1000 разів буфером для розбавлення, додають в кількості 100 мкл/ямка і залишають взаємодіяти при кімнатній температурі протягом 1 години. Планшет промивають 5 разів буфером для промивання по 300 мкл/ямка. SIGMA 104 розбавляють до концентрації 1 мг/мл субстратним буфером і додають в кількості 100 мкл/ямка. Після інкубації при кімнатній температурі протягом 1 години вимірюють поглинання (при 405 нм, довжина хвилі порівняння 655 нм). Результати конкурентного аналізу ELISA приведені на Фіг. 2. Вважається, що епітопи антитіла, яке конкурентно інгібує зв'язування біотинільованого антитіла на 50% або більше, в трьохвимірній конформації розташовані близько один до одного. Внаслідок класифікації відповідно до характеру розвитку забарвлення при конкурентному інгібуванні зв'язування 8 типів біотинільованих антитіл, 11 клонів, отриманих від мишей, імунізованих розчинною формою GPC3, поділяють на 5 груп (а, b, с, d i e) (Фіг. 16). Приклад 11 Класифікація по епітопах методом Вестернблотингу Розчинну форму корового білка GPC3 наносять на мініпластину 10% SDS-PAGE (TEFCO) і піддають електрофорезу у відновлювальних умовах. Потім переносять на Immobilon-P (Millipore), використовуючи осередок для електрофоретичного напівсухого перенесення Trans-Blot SD (BIORAD). Після короткого промивання мембрани TBST (0,05% Tween 20, TBS), її струшують в TBS-T, що містить 5% знежиреного молока, протягом 1 години. Мембрану струшують в TBS-T протягом приблизно 10 хвилин, потім додають кожне антитіло проти GPC3, розбавлене TBS-T, що містить 1% знежиреного молока, і мембрану струшують протягом 1 години. Мембрану промивають TBS-T, струшують в розчині HRP-антитіла проти мишачих IgG (Amersham), розбавленого TBS-T, що містить 1% знежиреного молока, протягом 1 години, і потім промивають TBS-T. Для розвитку забарвлення, яке детектують за допомогою Hyperfilm ECL (Amersham), додають ECL-Plus (Amersham). Як показано на Фіг. 3, L9G11 визначають як антитіло, що зв'язується з Текінцем, оскільки воно зв'язується з смугою, відповідною приблизно 40 кДа. М3С11 визначають, як антитіло, що зв'язується з С-кінцем, оскільки воно зв'язується з смугою, відповідною приблизно 30 кДа. Всі антитіла, які відносять до групи с, d або e за результатами конкурентного аналізу ELISA, зв'язуються з N-кінцем, а всі антитіла, що відносяться до групи а або b, зв'язуються з С-кінцем (Фіг. 16). По даним вестерн 59 блотингу L9G11 має більш високу чутливість виявлення, ніж інші антитіла, які зв'язуються з Nкінцем, дозволяючи передбачити, що дане антитіло можна використати для детекції N-кінцевого фрагмента методом вестерн-блотингу. Приклад 12 Детекция секретованої форми GPC3 Після того як було виявлено, що GPC3 розщеплюється по 358-ому або по 374-ому амінокислотному залишку, автори даного винаходу висунули гіпотезу, що секретована форма GPC3 надходить в кров пацієнта з раком печінки. У зв'язку з цим, щоб детектувати секретовану форму GPC3, була розроблена сендвіч-система ELISA для детекції GPC3. Імунопланшет покривають антитілом проти GPC3 в концентрації 10 мкг/мл і блокують субстратним буфером. Імунопланшет тримають декілька годин при кімнатній температурі або протягом ночі при 4°С, потім додають культуральний супернатант HepG2 і інкубують 1 годину при кімнатній температурі. Імунопланшет промивають 3 рази буфером для промивання по 300 мкл/ямка, додають мічене біотином антитіло проти GPC3, розбавлене до 10 мкг/мл, і інкубируют 1 годину при кімнатній температурі. Імунопланшет промивають 3 рази буфером для промивання по 300 мкл/ямка, додають АР-стрептавідин і інкубують 1 годину при кімнатній температурі. Імунопланшет промивають 5 разів буфером для промивання по 300 мкл/ямка. Забезпечують розвиток забарвлення за допомогою АМРАК (DAKO) відповідно до прикладеної інструкції і вимірюють поглинання за допомогою спектрофотометра для зчитування мікропланшетів. Антитіла, що зв'язуються з N-кінцем (М6В1, М19В11 і M18D4), і антитіла, що зв'язуються з Скінцем (М3С11, М13В3 і М3В8), об'єднують для створення п'яти сендвіч-систем ELISA. Всі вказані поєднання володіють однаковою чутливістю по стандартній кривій, отриманій з використанням декретованої форми GPC3. Дані системи оцінюють з використанням культурального супернатанту HepG2. При використанні поєднання антитіл, що зв'язуються з N-кінцем, детектують високу концентрацію секретованої форми GPC3, приблизно 1 мкг/мл (Фіг. 4). При використанні поєднання антитіл, що зв'язуються з С-кінцем, детектують низьку концентрацію, це дозволяє передбачити, що в секретованій формі GPC3 присутній переважно Nкінцевий фрагмент. Потім культуральний супернатант HepG2 піддають імунопреципітації, використовуючи антитіло проти GPC3 для детекції секретованої форми GPC3. При використанні M10D2, який зв'язується з N-кінцевим фрагментом, детектують секретовану форму GPC3 розміром 40 кДа (Фіг. 5). З іншого боку, при використанні М1Е7, який зв'язується з Скінцевим фрагментом, секретовану форму GPC3 не виявляють. Імунопреципітацію проводять для всіх отриманих антитіл проти GPC3. Секретована форма GPC3 добре виявляється за допомогою всіх антитіл, що зв'язуються з N-кінцевим фрагментом, тоді як при застосуванні антитіл, що зв'язуються з С-кінцевим фрагментом, секретована форма GPC3 не виявляється або виявляється погано 94019 60 (Фіг. 16). Приблизно, антитіло, яке дозволяє детектувати секретовану форму GPC3 методом імунопреципітації, можна використати для діагностики гепатоми. Крім того, передбачають, що антитіло, за допомогою якого секретована форма GPC3 детектується погано, можна використати для розробки терапевтичного антитіла, що володіє ADCCактивністю і CDC-активністю, оскільки таке антитіло може мігрувати до ділянки, ураженої гепатомою, не вловлюючись секретованою формою GPC3, присутньою в крові. Приклад 13 Клонування варіабельної ділянки антитіла проти GPC3 Варіабельну ділянку антитіла проти GPC3 ампліфікують методом ПЛР із зворотною транскриптазою з використанням загальної РНК, екстрагованої з гібридоми, що продукує антитіло проти GPC3. Загальну РНК екстрагують з 1x107 клітин гібридоми з використанням наборів RNeasy Plant Mini (QIAGEN). 5'-Кінцевий фрагмент гена ампліфікують, використовуючи 1 мкг загальної РНК, набір для ампліфікації кДНК SMART RACE (CLONTECH) і будь-який з нижченаведених синтетичних олігонуклеотидів: синтетичний олігонуклеотид MHC-lgG1, комплементарний послідовності константної ділянки мишачого lgG1: GGG CCA GTG GAT AGACAG ATG (SEQ ID NO: 7); синтетичний олігонуклеотид MHC-IgG2a, комплементарний послідовності константної ділянки мишачого IgG2a: CAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG (SEQ ID NO: 8); синтетичний олігонуклеотид MHC-IgG2b, комплементарний послідовності константної ділянки мишачого IgG2b: CAG GGG CCA GTG GAT AGA CTG ATG (SEQ ID NO: 9); і синтетичний олігонуклеотид каппа, комплементарний послідовності константної ділянки мишачого каппа-ланцюга: GCT САС TGG ATG GTG GGA AGA TG (SEQ ID NO: 10). Реакцію зворотної транскрипції проводять при 42°С протягом 1 години і 30 хвилин. Суміш для ПЛР (50 мкл) містить 5 мкл буферу для ПЛР 10х Advantage 2, 5 мкл суміші універсальних праймерів А 10x, 0,2 мМ dNTPs (dATP, dGTP, dCTP і dTTP), 1 мкл полімеразної суміші Advantage 2 (всі реагенти від CLONTECH), 2,5 мкл продукту реакції зворотної транскрипції і 10 пмоль синтетичного олігонуклеотиду MHC-lgG1, MHC-IgG2a, MHCIgG2b або каппа. ПЛР проводять, використовуючи 5 циклів, що включають в себе 94°С протягом 30 секунд, 94°С протягом 5 секунд і 72°С протягом 3 хвилин, 5 циклів, що включає в себе 94°С протягом 5 секунд, 70°С протягом 10 секунд і 72°С протягом 3 хвилин, і 25 циклів, що включає в себе 94°С протягом 5 секунд, 68°С протягом 10 секунд і 72°С протягом 3 хвилин. І нарешті, продукт реакції нагрівають при 72°С протягом 7 хвилин. Кожний продукт ПЛР виділяють з агарозного гелю, використовуючи набір для гель-екстракції QIAquick