Спосіб та композиція для боротьби з бур’янами (варіанти)

Реферат: Винахід стосується способу боротьби з рослинами та композиції для використання у вказаному способі, яка містить полінуклеотид, ідентичний або комплементарний до щонайменше 18 безперервних нуклеотидів послідовності гена 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (EPSPS) або РНК-транскрипту вказаної послідовності гена EPSPS, де вказану послідовність гена EPSPS вибирають із групи, яка складається з SEQ ID NO: 11, 18, 19, 21, 22, 53-55, 61, 72, 74, 75, 84, 88, 99, 101, 110, 115 і 119, і агент перенесення, який кондиціонує поверхню рослини для проникнення вказаного полінуклеотиду, причому ріст, розвиток або репродуктивна здатність вказаної рослини зменшується, або вказана рослина стає сприйнятливішою до гербіциду, що є інгібітором EPSPS, порівняно з необробленою рослиною. UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно до § 119 (e) розділу 35 Кодексу США (35 U.S.C.) у цій заявці заявляється пріоритет за попередньою заявкою на видачу патенту США із серійним номером 61/534,057, поданою 13 вересня 2011 року, розкриття якої включене в цей документ у вигляді посилання в повному обсязі. Перелік послідовностей, що міститься у файлі з ім'ям "40_21(58634)B seq listing.txt", розмір якого складає 1,722,262 байт (виміряний в операційній системі MS-Windows) і який був створений 7 вересня 2012 року, наведений та включений в цей документ у вигляді посилання. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Способи та композиції в цілому належать до галузі боротьби з бур'янами. Зокрема, належать до генів 5-енолпірувіл-шикімат-3-фосфат-синтази у рослин і композицій, що містять полінуклеотидні молекули для модуляції і/або регуляції їх експресії. Нижче наводяться способи та композиції, які використовуються для боротьби з бур'янами. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Бур'яни являють собою рослини, що конкурують з культурними рослинами в агрономічних умовах і коштують фермерам мільярди доларів щорічно у зв'язку із втратами урожаю і витратами на спроби втримати бур'яни під контролем. Бур'яни також є хазяїнами-носіями хвороб сільськогосподарських культур та комах-шкідників. Збитки, завдані бур'янами в умовах сільськогосподарського виробництва, включають зниження врожайності, погіршення якості урожаю, підвищення витрат на зрошування, збільшення витрат на збір урожаю, зниження вартості землі, завдавання шкоди для худоби та ушкодження урожаю шкідниками і хворобами, які несуть бур'яни. Основними засобами, за допомогою яких бур'яни викликають ці наслідки, є: 1) конкуренція із культурними рослинами за воду, поживні речовини, сонячне світло та інші невід'ємні умови для росту та розвитку, 2) виділення токсичних або подразнювальних хімічних речовин, які викликають проблеми зі здоров'ям у людей або тварини, 3) утворення величезної кількості насіння або вегетативних репродуктивних органів або і тих, і інших, які засмічують сільськогосподарську продукцію і назавжди зберігаються в сільськогосподарських землях, та 4) утворення на сільськогосподарських і несільськогосподарських землях величезної кількості рослинності, що підлягає знищенню. Гербіцидостійкі бур'яни є проблемою при використанні майже усіх гербіцидів; існує необхідність ефективної боротьби з цими бур'янами. Нині більше, ніж 365 біотипів бур'янів визначаються як стійкі до одного або декількох гербіцидів згідно з Комітетом з попередження виникнення стійкості до дії гербіцидів (HRAC), Північноамериканським комітетом із попередження виникнення стійкості до дії гербіцидів (NAHRAC) і Американським науковим товариством з дослідження бур'янів (WSSA). Фермент EPSPS (5-енолпірувіл-шикімат-3-фосфат-синтаза) каталізує перетворення шикімат-3-фосфату на 5-енолпірувіл-шикімат-3-фосфат, проміжний продукт в біохімічному каскаді реакцій для створення трьох основних ароматичних амінокислот (тирозин, фенілаланін та триптофан). Фермент EPSPS є мішенню для гербіциду N-фосфонометил гліцин, також відомого як гліфосат. СУТЬ ВИНАХОДУ В одному аспекті цей винахід стосується способу контролю за ростом рослин, що включає зовнішню обробку рослини або частини рослини композицією, яка містить полінуклеотид та агент перенесення, в якій полінуклеотид практично ідентичний або практично комплементарний до послідовності гена EPSPS або її фрагмента, або РНК-транскрипту вказаної послідовності гена EPSPS або її фрагмента, в якій вказану послідовність гена EPSPS обирають із групи, що складається з SEQ ID NO: 1-120 або їх фрагмента полінуклеотиду. Внаслідок такого застосування ріст або розвиток, або репродуктивна здатність знижується, або рослина стає сприйнятливішою до гербіциду, що є інгібітором EPSPS, порівняно з рослиною, яка не оброблена вказаною композицією. Таким чином, рослини, які стали стійкими до застосування гербіцидів, що містять гліфосат, стають сприйнятливішими до гербіцидних дій гербіциду, які містить гліфосат, тим самим посилюючи дію гербіциду. Фрагмент полінуклеотиду, який складається із щонайменше 18 безперервних нуклеотидів, щонайменше 19 безперервних нуклеотидів, щонайменше 20 безперервних нуклеотидів або щонайменше 21 безперервних нуклеотидів у довжину і щонайменше на 85 відсотків ідентичний до послідовності гена EPSPS, обраної із групи, що складається з SEQ ID NO: 1-120 та агента перенесення, являє собою кремнійорганічну композицію або сполуку. Фрагмент полінуклеотиду може бути смисловою або антисмисловою молекулою олДНК або олРНК, длРНК або длДНК, або гібридами длДНК/РНК. Композиція може містити різні компоненти, включаючи більше, ніж один фрагмент полінуклеотиду, гербіцид, що є інгібітором EPSPS, і/або інші гербіциди, які підвищують дію композиції для боротьби з бур'янами. В іншому аспекті розкриваються полінуклеотидні молекули та способи модуляції експресії 1 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гена EPSPS у видів рослин. Спосіб знижує, пригнічує або іншим чином уповільнює експресію гена EPSPS у рослини, що включає зовнішню обробку такої рослини композицією, яка містить полінуклеотид та агент перенесення, в якій полінуклеотид практично ідентичний або практично комплементарний до послідовності гена EPSPS або її фрагмента, або РНК-транскрипту послідовності гена EPSPS або її фрагмента, в якій послідовність гена EPSPS обирають із групи, що складається з SEQ ID NO: 1-120 або їх фрагмента полінуклеотиду. Фрагмент полінуклеотиду складається з щонайменше 18 безперервних нуклеотидів, щонайменше 19 безперервних нуклеотидів, щонайменше 20 безперервних нуклеотидів або щонайменше 21 безперервних нуклеотидів у довжину і щонайменше на 85 відсотків ідентичний до послідовності гена EPSPS, обраної із групи, що складається з SEQ ID NO: 1-120, а агент перенесення являє собою кремнійорганічну композицію. Фрагмент полінуклеотиду може бути смисловою або антисмисловою молекулою олДНК або олРНК, длРНК або длДНК, або гібридами длДНК/РНК. У додатковому аспекті композицію полінуклеотидної молекули можна змішати з іншими гербіцидними сполуками (сумісними гербіцидами), щоб забезпечити додатковий контроль за небажаними рослинами на полі із культурними рослинами. У додатковому аспекті композицію полінуклеотидної молекули можна змішати з будь-яким одним або декількома додатковими агрохімікатами, такими, як, інсектициди, фунгіциди, нематоциди, бактерициди, акарициди, регулятори росту, хемостерилізатори, хімічні сигнальні речовини, репеленти, атрактанти, феромони, стимулятори поїдання, біопестициди, мікробні пестициди або інші біологічно активні сполуки для отримання багатокомпонентного пестициду, що надає ще ширший спектр захисту сільськогосподарської продукції. ПЕРЕЛІК ФІГУР КРЕСЛЕННЯ Наступні креслення утворюють частину цього опису і включені для додаткової демонстрації деяких аспектів принципу дії композицій та способу. Принцип дії можна краще зрозуміти з посиланням на один або декілька з цих креслень у поєднанні з детальним описом конкретних варіантів реалізації винаходу, наведених в цьому документі. Принцип дії можна краще зрозуміти завдяки наступному опису фігур: Фігура 1 ілюструє області кодуючої послідовності EPSPS щириці Палмера (Palmer amaranth), які сприйнятливі до тригерних молекул; Фігура 2 ілюструє трансгенну кукурудзу, стійку до гліфосату, оброблену тригерними полінуклеотидами та гліфосатом; Фігура 3 ілюструє трансгенний бавовник, оброблений тригерними полінуклеотидами та гліфосатом. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Пропонуються способи та композиції, що містять полінуклеотид, який забезпечує регуляцію, репресію або уповільнення експресії гена EPSPS (5-енолпірувіл-шикімат-3-фосфат-синтаза), а також поліпшений контроль за видами бур'янистих рослин і особливо за біотипами бур'янів, стійких до гліфосату. Аспекти способу можуть застосовуватися для контролю за ростом різних бур'янистих рослин в агрономічних та інших культурних середовищах. Наступні визначення та способи пропонуються для того, щоб спрямувати фахівців цієї галузі техніки на практику цього винаходу. Якщо не вказане інше, терміни, використані в цьому винаході, мають ті ж значення, які зазвичай відомі фахівцеві із загальною підготовкою в галузі техніки, до якої належить цей винахід. Якщо термін наведений в однині, автори цього винаходу також мають на увазі множину цього терміну. Під полінуклеотидами, які "не транскрибуються", мають на увазі, що полінуклеотиди не містять повної одиниці транскрипції полімерази II. Використовуваний тут термін "розчин" належить до однорідних сумішей і до неоднорідних сумішей, таких, як суспензії, колоїди, міцели та емульсії. Бур'янистими рослинами є рослини, які конкурують із культурними рослинами, найбільш важливі з яких включають, без обмеження ними, такі важливі інвазивні та шкідливі бур'яни, а також стійкі до дії гербіциду біотипи в рослинництві, як Amaranthus вид -A. albus, A. blitoides, A. hybridus, A. palmeri, A. powellii, A. retroflexus, A. spinosus, A. tuberculatus та A. viridis; Ambrosia вид -A. trifida, A. artemisifolia; Lolium вид -L. multiflorum, L. rigidium, L perenne; Digitaria вид -D. insularis; Euphorbia вид -E. heterophylla; Kochia вид -K. scoparia; Sorghum вид -S. halepense; Conyza вид -C. bonariensis, C. canadensis, C. sumatrensis; Chloris вид -C. truncate; Echinochola вид -E. colona, E. crus-galli; Eleusine вид -E. indica; Poa вид -P. annua; Plantago вид -P. lanceolata; Avena вид -A. fatua; Chenopodium вид -C. album; Setaria вид -S. viridis, Abutilon theophrasti, Ipomoea вид, Sesbania, вид, Cassia вид, Sida вид, Brachiaria, вид та Solanum вид. Додаткові види бур'янистих рослин, знайдені на посівних площах, включають Alopecurus myosuroides, Avena sterilis, Avena sterilis ludoviciana, Brachiaria plantaginea, Bromus diandrus, 2 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Bromus rigidus, Cynosurus echinatus, Digitaria ciliaris, Digitaria ischaemum, Digitaria sanguinalis, Echinochloa oryzicola, Echinochloa phyllopogon, Eriochloa punctata, Hordeum glaucum, Hordeum leporinum, Ischaemum rugosum, Leptochloa chinensis, Lolium persicum, Phalaris minor, Phalaris paradoxa, Rottboellia exalta, Setaria faberi, Setaria viridis var, robusta-alba schreiber, Setaria viridis var, robusta-purpurea, Snowdenia polystachea, Sorghum sudanese, Alisma plantago-aquatica, Amaranthus lividus, Amaranthus quitensis, Ammania auriculata, Ammania coccinea, Anthemis cotula, Apera spica-venti, Bacopa rotundifolia, Bidens pilosa, Bidens subalternans, Brassica tournefortii, Bromus tectorum, Camelina microcarpa, Chrysanthemum coronarium, Cuscuta campestris, Cyperus difformis, Damasonium minus, Descurainia sophia, Diplotaxis tenuifolia, Echium plantagineum, Elatine triandra var, pedicellata, Euphorbia heterophylla, Fallopia convolvulus, Fimbristylis miliacea, Galeopsis tetrahit, Galium spurium, Helianthus annuus, Iva xanthifolia, Ixophorus unisetus, Ipomoea indica, Ipomoea purpurea, Ipomoea sepiaria, Ipomoea aquatic, Ipomoea triloba, Lactuca serriola, Limnocharis flava, Limnophila erecta, Limnophila sessiliflora, Lindernia dubia, Lindernia dubia var, major, Lindernia micrantha, Lindernia procumbens, Mesembryanthemum crystallinum, Monochoria korsakowii, Monochoria vaginalis, Neslia paniculata, Papaver rhoeas, Parthenium hysterophorus, Pentzia suffruticosa, Phalaris minor, Raphanus raphanistrum, Raphanus sativus, Rapistrum rugosum, Rotala indica var, uliginosa, Sagittaria guyanensis, Sagittaria montevidensis, Sagittaria pygmaea, Salsola iberica, Scirpus juncoides var, ohwianus, Scirpus mucronatus, Setaria lutescens, Sida spinosa, Sinapis arvensis, Sisymbrium orientale, Sisymbrium thellungii, Solanum ptycanthum, Sonchus asper, Sonchus oleraceus, Sorghum bicolor, Stellaria media, Thlaspi arvense, Xanthium strumarium, Arctotheca calendula, Conyza sumatrensis, Crassocephalum crepidiodes, Cuphea carthagenenis, Epilobium adenocaulon, Erigeron philadelphicus, Landoltia punctata, Lepidium virginicum, Monochoria korsakowii, Solanum americanum, Solanum nigrum, Vulpia bromoides, Youngia japonica, Hydrilla verticillata, Carduus nutans, Carduus pycnocephalus, Centaurea solstitialis, Cirsium arvense, Commelina diffusa, Convolvulus arvensis, Daucus carota, Digitaria ischaemum, Echinochloa crus-pavonis, Fimbristylis miliacea, Galeopsis tetrahit, Galium spurium, Limnophila erecta, Matricaria perforate, Papaver rhoeas, Ranunculus acris, Soliva sessilis, Sphenoclea zeylanica, Stellaria media, Nassella trichotoma, Stipa neesiana, Agrostis stolonifera, Polygonum aviculare, Alopecurus japonicus, Beckmannia syzigachne, Bromus tectorum, Chloris inflate, Echinochloa erecta, Portulaca oleracea та Senecio vulgaris. Вважається, що усі рослини містять у своєму геномі ген фітоендесатурази, послідовність якого можна виділити та отримати полінуклеотиди відповідно до способів цього винаходу, які застосовуються для регуляції, пригнічення або уповільнення експресії гена-мішені EPSPS в рослинах і росту або розвитку оброблених рослин. Культурна рослина також може бути бур'янистою рослиною, якщо вона зустрічається в небажаному середовищі. Наприклад, кукурудза, яка росте на полі сої. Трансгенні культури, стійкі до одного або декількох гербіцидів, потребують спеціалізованих способів управління для боротьби з бур'янами та самопосівними сільськогосподарськими культурами. Спосіб дозволяє виявляти трансгени стійкості до гербіцидів, щоб дозволити обробленим рослинам стати сприйнятливими до гербіциду. Наприклад, ДНК EPSPS, що міститься в трансгенних об'єктах рослин, може бути мішенню для тригерних молекул, щоб зробити трансгенні культури сприйнятливими до застосування відповідного гербіциду, який містить гліфосат. Такі трансгенні об'єкти відомі в цій галузі техніки і включають, без обмеження ними, DAS-44406-6, MON883302, MON87427, FG72, HCEM485, H7-1, ASR368, J101, J163, DP-098140, GHB614, 356043, MON89788, MON88913, RT200, NK603, GTSB77, GA21, MON1445 та 40-3-2, та публікації патентів США: 20110126310, 20090137395, включені в цей документ у вигляді посилання в повному обсязі. "Тригер" або "тригерний полінуклеотид" являє собою молекулу полінуклеотиду, яка гомологічна або комплементарна до полінуклеотиду гена-мішені. Тригерні молекули полінуклеотиду модулюють експресію гена-мішені при місцевому нанесенні на поверхню рослини за допомогою агента перенесення, завдяки якому ріст або розвиток, або репродуктивна здатність рослини, обробленої вказаною композицією, регулюється, пригнічується або сповільнюється, або вказана рослина стає сприйнятливішою до гербіциду, що є інгібітором EPSPS, в результаті використання вказаної композиції, яка містить полінуклеотид, порівняно з рослиною, яка не оброблена композицією, що містить тригерну молекулу. Тригерні полінуклеотиди, розкриті в цьому винаході, в цілому описані відносно послідовності гена-мішені і можуть використовуватися в смисловій (гомологічній) або антисмисловій (комплементарній) орієнтації як одноланцюгові молекули, або містити обидва ланцюги, як дволанцюгові молекули, або варіанти нуклеотидів і їх модифіковані нуклеотиди залежно від різних областей, в яких виявлятиметься ген. 3 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Передбачається, що композиція може містити декілька полінуклеотидів та гербіцидів, які включають, без обмеження ними, тригерні полінуклеотиди гена EPSPS і гербіцид, що є інгібітором EPSPS, і один або декілька додаткових тригерних полінуклеотидів гена-мішені гербіциду і відповідних гербіцидів, і один або декілька додаткових тригерних полінуклеотидів основного гена. Основні гени являють собою гени в рослині, які кодують ключові ферменти або інші білки, наприклад, фермент біосинтезу, метаболізуючий фермент, рецептор, білокпереносник сигналу, структурний продукт гена, фактор транскрипції або транспортний білок; або регулюючі РНК, такі як, мікроРНК, які важливі для росту або виживання організму або клітини, або беруть участь в нормальному рості і розвитку рослин (Meinke зі співавторами, Trends Plant Sci. 2008:13(9):483-91). Пригнічення основного гена посилює дію гербіциду, що впливає на функцію продукту гена, відмінну від пригніченого основного гена. Композиції можуть містити різні тригерні полінуклеотиди, які модулюють експресію основного гена, відмінного від гена EPSPS. Гербіциди, до яких трансгени рослин проявили стійкість і можна застосувати цей спосіб, включають, без обмеження ними: ауксиноподібні гербіциди, гліфосат, глюфосинат, сульфонілсечовини, імідазолінони, бромоксиніл, делапон, дикамбу, циклогександіон, інгібітори протопорфіриноген оксидази, гербіциди, що є інгібіторами 4-гідроксифеніл-піруват діоксигенази. Наприклад, трансгени та їх полінуклеотидні молекули, які кодують білки, які відповідають за стійкість до гербіцидів, відомі в цій галузі техніки, і включають, без обмеження нею, 5енолпірувіл-шикімат-3-фосфат-синтазу (EPSPS), наприклад, що детальніше описане в патентах США за номерами 7,807,791 (SEQ ID NO: 5); 6,248,876 B1; 5,627,061; 5,804,425; 5,633,435; 5,145,783; 4,971,908; 5,312,910; 5,188,642; 4,940,835; 5,866,775; 6,225,114 B1; 6,130,366; 5,310,667; 4,535,060; 4,769,061; 5,633,448; 5,510,471; патенті США за номером 36,449; патентах США за RE 37,287 E; і 5,491,288; стійкість до сульфонілсечовини і/або імідазолінону, наприклад, що детальніше описана в патентах США за номерами 5,605,011; 5,013,659; 5,141,870; 5,767,361; 5,731,180; 5,304,732; 4,761,373; 5,331,107; 5,928,937; і 5,378,824; і міжнародній заявці WO 96/33270; стійкість до гербіцидів, що є інгібіторами гідроксифенілпіруватдіоксигенази в рослинах, описана в патентах США за номерами 6,245,968 B1; 6,268,549; і 6,069,115; і US7,312,379 SEQ ID NO: 3; US7,935,869; US7,304,209, SEQ ID NO: 1, 3,5 і 15; полінуклеотиди арілоксіалканоат діоксигенази, які надають стійкість до 2,4-D та інших гербіцидів на основі феноксіауксину, а також до гербіцидів на основі арілоксифеноксипропіонату, що описано, наприклад, в WO2005/107437; US7,838,733 (SEQ ID NO: 5), і полінуклеотиди, стійкі до дикамби, що описано, наприклад, в Herman зі співавторами (2005) J. Biol. Chem. 280: 24759-24767. Інші приклади ознак стійкості до гербіциду включають ті, які обумовлені полінуклеотидами, які кодують екзогенну фосфінотріцин ацетилтрансферазу, що описано в патентах США за номерами 5,969,213; 5,489,520; 5,550,318; 5,874,265; 5,919,675; 5,561,236; 5,648,477; 5,646,024; 6,177,616; та 5,879,903. Рослини, що містять екзогенну фосфінотріцин ацетилтрансферазу можуть проявляти підвищену стійкість до гербіцидів на основі глюфосинату, які інгібують фермент глутамінсинтетазу. Крім того, стійкі до гербіцидів полінуклеотиди включають ті, які обумовлені полінуклеотидами, що обумовлюють змінену дію протопорфіриноген оксидази (протокс), як описано в патентах США за номерами 6,288,306 B1; 6,282,837 B1; та 5,767,373; та WO 01/12825. Рослини, які містять такі полінуклеотиди, можуть проявляти покращену стійкість до будь-якого з множини гербіцидів, що націлені на фермент протокс (також позначені як протокс інгібітори). Полінуклеотиди, які кодують гліфосат оксидоредуктазу та гліфосат-N-ацетил трансферазу (GOX описаний в патенті США 5,463,175 та GAT описаний в публікації патенту США 20030083480, дикамба монооксигенази в патенті США 7,022,896 та 7,884,262, усі з яких включені в цей документ у вигляді посилання); молекула полінуклеотиду, яка кодує бромоксиніл нітрилазу (Bxn описана в патенті США за номером 4,810,648 щодо стійкості до бромоксинілу, який включений в цей документ у вигляді посилання); молекула полінуклеотиду, яка кодує фітоендесатуразу (crtI), описана у Misawa зі співавторами, (1993) Plant J. 4:833-840 та у Misawa зі співавторами, (1994) Plant J. 6:481-489 щодо стійкості до норфлуразону; молекула полінуклеотиду, яка кодує синтазу ацетогідроксикислот (AHAS, aka ALS), описана у Sathasiivan зі співавторами (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188-2193 щодо стійкості до гербіцидів групи сульфонілсечовини; та ген bar, описаний у DeBlock зі співавторами (1987) EMBO J. 6:2513-2519, щодо стійкості до глюфосинату та біалафосу. Трансгенні кодуючі області і регуляторні елементи генів стійкості до гербіцидів являють собою мішені, в яких тригерні полінуклеотиди і гербіциди можуть бути включені в композиції, та їх комбінації, щоб забезпечити покращені способи боротьби з бур'янами. Гербіцид "гліфосат" (N-фосфонометил гліцин) інгібує каскад реакцій шикімової кислоти, який призводить до біосинтезу ароматичних сполук, зокрема амінокислот, рослинних гормонів та 4 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вітамінів. Зокрема, гліфосат стримує перетворення фосфоенолпіровиноградної кислоти (РЕР) та 3-фосфошикімової кислоти на 5-енолпірувіл-3-фосфошикімову кислоту шляхом інгібування ферменту 5-енолпірувіл-шикімат-3-фосфат-синтази (надалі згадувана як EPSP-синтаза або EPSPS). Термін "гліфосат" треба розглядати, щоб включити будь-яку гербіцидно-ефективну форму N-фосфонометил гліцину (включаючи будь-які його солі) та інші форми, які призводять до утворення аніону гліфосату в рослині. Гліфосат є прикладом гербіциду, що є інгібітором EPSPS. Гербіциди являють собою молекули, які впливають на ріст або розвиток, або репродуктивну здатність рослини. Гліфосат є комерційно доступним у складі численних композицій. Приклади цих композицій гліфосату включають, без обмеження ними, гербіциди, які випускаються фірмою Monsanto Company (Сент-Луїс, Міссурі) під торговими марками ROUNDUP.RTM., ROUNDUP.RTM. ULTRA, ROUNDUP.RTM. ULTRAMAX, ROUNDUP.RTM. CT, ROUNDUP.RTM. EXTRA, ROUNDUP.RTM. BIACTIVE, ROUNDUP.RTM. BIOFORCE, RODEO.RTM., POLARIS.RTM., SPARK.RTM. та ACCORD.RTM., кожен з яких містить гліфосат у вигляді ізопропіламонієвої солі, ROUNDUP.RTM. WEATHERMAX, який містить гліфосат у вигляді його солі калію; гербіциди ROUNDUP.RTM. DRY та RIVAL.RTM., які містять гліфосат у вигляді солі амонію; ROUNDUP.RTM. GEOFORCE, які містять гліфосат у вигляді його солі натрію; і гербіцид TOUCHDOWN.RTM. (Syngenta, Грінсборо, штат Північна Кароліна), який містить гліфосат у вигляді солі триметилсульфонію. Доступні різні інші солі гліфосату, наприклад, сіль диметиламіну, сіль ізопропіламіну, сіль тримезіум, сіль калію, сіль моноамонію та сіль діамонію. Комерційні композиції та їх норми витрат часто вимірюють у фунтах кислотних еквівалентів на акр (фунт ке/акр). Доступні численні додаткові гербіциди з аналогічними або різними механізмами дії (надалі позначені як сумісні гербіциди), які можна додати до композиції, яка забезпечує багатовидову боротьбу з бур'янами або альтернативні механізми дії для важкоконтрольованих видів бур'янів, наприклад, представники сімейства гербіцидів, що включають, без обмеження ними, амідні гербіциди, гербіциди на основі ароматичних кислот, миш'якові гербіциди, гербіциди на основі бензотіазолу, гербіциди на основі бензоїлциклогександіону, гербіциди на основі бензофураніл алкілсульфонату, гербіциди на основі карбамату, гербіциди на основі циклогексеноксиму, гербіциди на основі циклопропілізоксазолу, гербіциди на основі дикарбоксиміду, гербіциди на основі динітроаніліну, гербіциди на основі динітрофенолу, гербіциди на основі дифенілового ефіру, гербіциди на основі дитіокарбамату, галогеновані аліфатичні гербіциди, гербіциди на основі імідазолінону, неорганічні гербіциди, нітрильні гербіциди, фосфорорганічні гербіциди, гербіциди на основі оксадіазолону, гербіциди на основі оксазолу, феноксигербіциди, гербіциди на основі фенілендіаміну, піразольні гербіциди, гербіциди на основі піридазину, гербіциди на основі піридазинону, піридинові гербіциди, гербіциди на основі піримідиндіаміну, гербіциди на основі піримідинілоксибензиламіну, четвертинні амонієві гербіциди, гербіциди на основі тіокарбамату, гербіциди на основі тіокарбонату, гербіциди на основі тіосечовини, триазинові гербіциди, гербіциди на основі триазинону, гербіциди на основі триазолу, гербіциди на основі триазолону, гербіциди на основі триазолопіримідину, гербіциди на основі урацилу і гербіциди на основі сечовини. Зокрема, норми витрати доданих гербіцидів в композиціях, що містять полінуклеотиди, можна зменшити. Скорочення норм витрат додатково доданих гербіцидів може складати 10-25 відсотків, 26-50 відсотків, 51-75 відсотків або може бути більшим, та очікується підвищення активності полінуклеотидів і композиції гербіциду. Типові гербіциди сімейств включають, без обмеження ними, ацетохлор, ацифлуорфен, ацифлуорфен натрію, аклоніфен, акролеїн, алахлор, алоксидим, аліловий спирт, аметрин, амікарбазон, амідосульфурон, амінопіралід, амітрол, сульфамат амонію, анілофос, асулам, атратон, атразін, азимсульфурон, BCPC, бефлубутамід, беназолін, бенфлуралін, бенфуресат, бенсульфурон, бенсульфуронметил, бенсулід, бентазон, бензфендизон, бензобіциклон, бензофенап, біфенокс, біланафос, біспірібак, біспірібак натрію, буру, бромацил, бромобутид, бромоксиніл, бутахлор, бутафенацил, бутаміфос, бутралін, бутроксидим, бутилат, какодилову кислоту, хлорат кальцію, кафенстрол, карбетамід, карфентразон, карфентразон-етил, CDEA, CEPC, хлорфлуренол, хлорфлуренолметил, хлоридазон, хлоримурон, хлоримурон-етил, хлороцетову кислоту, хлоротолурон, хлорпрофам, хлорсульфурон, хлортал, хлортал-диметил, цинідон-етил, цинметилін, циносульфурон, цисанілід, клетодим, клодинафоп, клодинафоп-пропаргіл, кломазон, кломепроп, клопіралід, клорансулам, клорансулам-метил, CMA, 4-CPB, CPMF, 4CPP, CPPC, крезол, кумілурон, ціанамід, ціаназин, циклоат, циклосульфамурон, циклоксидим, цигалофоп, цигалофоп-бутил, 2,4-D, 3,4-DA, даїмурон, далапон, дазомет, 2,4-DB, 3,4-DB, 2,4DEB, десмедифам, дикамбу, дихлобеніл, орто-дихлорбензол, пара-дихлорбензол, дихлорпроп, дихлорпроп-П, диклофоп, диклофоп-метил, диклосулам, дифензокват, дифензоквату 5 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 метилсульфат, дифлуфенікан, дифлуфензопір, димефурон, димепіперат, диметахлор, диметаметрин, диметенамід, диметенамід-П, диметипін, диметиларсинову кислоту, динітрамін, динотерб, дифенамід, дикват, диквату дибромід, дитіопір, діурон, DNOC, 3,4-DP, DSMA, EBEP, ендотал, ЕРТС, еспрокарб, еталфлуралін, етаметсульфурон, етаметсульфурон-метил, етофумезат, етоксифен, етоксисульфурон, етобензанід, феноксапроп-П, феноксапроп-П-етил, фентразамід, сульфат заліза, флампроп-M, флазасульфурон, флорасулам, флуазіфоп, флуазіфоп-бутил, флуазіфоп-П, флуазіфоп-П-бутил, флукарбазон, флукарбазон натрію, флуцетосульфурон, флухлоралін, флуфенацет, флуфенпір, флуфенпір-етил, флуметсулам, флуміклорак, флуміклорак-пентил, флуміоксазин, флуометурон, флуороглікофен, флуороглікофен-етил, флупропанат, флупірсульфурон, флупірсульфурон-метил натрію, флуренол, флуридон, флуорохлоридон, флуороксипір, флуртамон, флутіацет, флутіацетметил, фомесафен, форамсульфурон, фосамін, глуфозинат, глуфозинат амонію, гліфосат, галосульфурон, галосульфурон-метил, галоксифоп, галоксифоп-П, HC-252, гексазинон, імазаметабенз, імазаметабенз-метил, імазамокс, імазапік, імазапір, імазаквін, імазетапір, імазосульфурон, інданофан, йодометан, йодосульфурон, йодосульфурон-метил натрію, іоксиніл, ізопротурон, ізоурон, ізоксабен, ізоксахлортол, ізоксафлутол, карбутилат, лактофен, ленацил, лінурон, MAA, МАМА, МСРА, МСРА-тіоетил, МСРВ, мекопроп, мекопроп-П, мефенацет, мефлуїдид, мезосульфурон, мезосульфурон-метил, мезотріон, метам, метаміфоп, метамітрон, метазахлор, метабензтіазурон, метиларсонову кислоту, метилдімрон, метилізотіоціанат, метобензурон, метолахлор, С-метолахлор, метосулам, метоксурон, метрибузін, метсульфурон, метсульфурон-метил, МK-66, молінат, монолінурон, MSMA, напроанілід, напропамід, напталам, небурон, нікосульфурон, нонанову кислоту, норфлуразон, олеїнову кислоту (жирні кислоти), орбенкарб, ортосульфамурон, оризалін, оксадіаргіл, оксадіазон, оксасульфурон, оксацикломефон, оксифлуорфен, паракват, дихлоріду паракват, пебулат, пендиметалін, пеноксулам, пентахлорфенол, пентанохлор, пентоксазон, петоксамід, нафтові олії, фенмедифам, фенмедифам-етил, піклорам, піколінафен, піноксаден, піперофос, арсеніт калію, азид калію, претілахлор, примісульфурон, примісульфурон-метил, продіамін, профлуазол, профоксидім, прометон, прометрин, пропахлор, пропаніл, пропаквізафоп, пропазін, профам, пропізохлор, пропоксикарбазон, пропоксикарбазон натрію, пропизамід, просульфокарб, просульфурон, піраклоніл, пірафлуфен, пірафлуфен-етил, піразолінат, піразосульфурон, піразосульфурон-етил, піразоксифен, пірибензоксим, пірибутикарб, піридафол, піридат, пірифталід, піримінобак, піримінобак-метил, піримісульфан, піритіобак, піритіобак натрію, квінклорак, квінмерак, квінокламін, хізалофоп, хізалофоп-П, римсульфурон, сетоксидім, сидурон, симазин, симетрин, SMA, арсеніт натрію, азид натрію, хлорат натрію, сулкотрион, сульфентразон, сульфометурон, сульфометурон-метил, сульфосат, сульфосульфурон, сірчану кислоту, дігтярну олію, 2,3,6-TBA, TCA, TCA-натрію, тебутіурон, тепралоксидим, тербацил, тербуметон, тербутилазін, тербутрин, тенілхлор, тіазопір, тіфенсульфурон, тіфенсульфурон-метил, тіобенкарб, тіокарбазил, топрамезон, тралкоксидим, триалат, триасульфурон, триазифлам, трибенурон, трибенурон-метил, трикамбу, триклопір, триетазин, трифлоксисульфурон, трифлоксисульфурон натрію, трифлуралін, трифлусульфурон, трифлусульфурон-метил, тригідрокситриазин, тритосульфурон, [3-[2-хлор-4флуоро-5-(-метил-6-трифлуорометил-2,4-диоксо-,2,3,4-тетрагідропіримідин-3-іл)фенокси]-2піриділокси] етиловий ефір оцтової кислоти (CAS RN 353292-3-6), 4-[(4,5-дигідро-3-метокси-4метил-5-оксо)-H-,2,4-триазол-ілкарбоніл-сульфамоїл]-5-метилтіофен-3 карбонової кислоти (BAY636), BAY747 (CAS RN 33504-84-2), топрамезон (CAS RN 2063-68-8), 4-гідрокси-3-[[2-[(2метоксиетокси)метил]-6-(трифлуоро-метил)-3-піридиніл]карбоніл]-біцикло[3.2.]окт-3-ен-2-ону (CAS RN 35200-68-5), і 4-гідрокси-3-[[2-(3-метоксипропіл)-6-(дифлуорометил)-3піридиніл]карбон-іл]-біцикло[3.2.]окт-3-ен-2-ону. Крім того, включення гербіцидних сполук із невказаними механізмами дії описано в CN101279950A, CN101279951A, DE10000600A1, DE10116399A1, DE102004054666A1, DE102005014638A1, DE102005014906A1, DE102007012168A1, DE102010042866A1, DE10204951A1, DE10234875A1, DE10234876A1, DE10256353A1, DE10256354A1, DE10256367A1, EP1157991A2, EP1238586A1, EP2147919A1, EP2160098A2, JP03968012B2, JP2001253874A, JP2002080454A, JP2002138075A, JP2002145707A, JP2002220389A, JP2003064059A, JP2003096059A, JP2004051628A, JP2004107228A, JP2005008583A, JP2005239675A, JP2005314407A, JP2006232824A, JP2006282552A, JP2007153847A, JP2007161701A, JP2007182404A, JP2008074840A, JP2008074841A, JP2008133207A, JP2008133218A, JP2008169121A, JP2009067739A, JP2009114128A, JP2009126792A, JP2009137851A, US20060111241A1, US20090036311A1, US20090054240A1, US20090215628A1, US20100099561A1, US20100152443A1, US20110105329A1, US20110201501A1, WO2001055066A2, WO2001056975A1, 6 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 WO2001056979A1, WO2001090071A2, WO2001090080A1, WO2002002540A1, WO2002028182A1, WO2002040473A1, WO2002044173A2, WO2003000679A2, WO2003006422A1, WO2003013247A1, WO2003016308A1, WO2003020704A1, WO2003022051A1, WO2003022831A1, WO2003022843A1, WO2003029243A2, WO2003037085A1, WO2003037878A1, WO2003045878A2, WO2003050087A2, WO2003051823A1, WO2003051824A1, WO2003051846A2, WO2003076409A1, WO2003087067A1, WO2003090539A1, WO2003091217A1, WO2003093269A2, WO2003104206A2, WO2004002947A1, WO2004002981A2, WO2004011429A1, WO2004029060A1, WO2004035545A2, WO2004035563A1, WO2004035564A1, WO2004037787A1, WO2004067518A1, WO2004067527A1, WO2004077950A1, WO2005000824A1, WO2005007627A1, WO2005040152A1, WO2005047233A1, WO2005047281A1, WO2005061443A2, WO2005061464A1, WO2005068434A1, WO2005070889A1, WO2005089551A1, WO2005095335A1, WO2006006569A1, WO2006024820A1, WO2006029828A1, WO2006029829A1, WO2006037945A1, WO2006050803A1, WO2006090792A1, WO2006123088A2, WO2006125687A1, WO2006125688A1, WO2007003294A1, WO2007026834A1, WO2007071900A1, WO2007077201A1, WO2007077247A1, WO2007096576A1, WO2007119434A1, WO2007134984A1, WO2008009908A1, WO2008029084A1, WO2008059948A1, WO2008071918A1, WO2008074991A1, WO2008084073A1, WO2008100426A2, WO2008102908A1, WO2008152072A2, WO2008152073A2, WO2009000757A1, WO2009005297A2, WO2009035150A2, WO2009063180A1, WO2009068170A2, WO2009068171A2, WO2009086041A1, WO2009090401A2, WO2009090402A2, WO2009115788A1, WO2009116558A1, WO2009152995A1, WO2009158258A1, WO2010012649A1, WO2010012649A1, WO2010026989A1, WO2010034153A1, WO2010049270A1, WO2010049369A1, WO2010049405A1, WO2010049414A1, WO2010063422A1, WO2010069802A1, WO2010078906A2, WO2010078912A1, WO2010104217A1, WO2010108611A1, WO2010112826A3, WO2010116122A3, WO2010119906A1, WO2010130970A1, WO2011003776A2, WO2011035874A1, WO2011065451A1, усі з яких включені в цей документ у вигляді посилання. Ауксиноподібні гербіциди включають гербіциди на основі бензойної кислоти, гербіциди на основі феноксикарбонової кислоти, гербіциди на основі піридінкарбонової кислоти, гербіциди на основі хінолінкарбонової кислоти, гербіциди на основі піримідинкарбонової кислоти та беназолін-етилові гербіциди. Гербіциди групи бензойної кислоти (дикамба (3,6-дихлор-о-анісова кислота), хлорамбен (3аміно-2,5-дихлорбензойна кислота), а також TBA (2,3,6-трихлорбензойна кислота)) є ефективними гербіцидами як для передсходової, так і для післясходової боротьби з бур'янами. Дикамба є одним з багатьох ауксиноподібних гербіцидів, які належать до недорогих, екологічно безпечних гербіцидів, що використовувався як передсходовий та післясходовий гербіцид для ефективної боротьби з однорічними та багаторічними широколистяними бур'янами та декількома трав'янистими бур'янами в кукурудзі, сорго, зернових культурах, пасовищних культурах, сінокісних культурах, на пасовищних угіддях, в цукровій тростині, спаржі, деренових рослинах та в насінні трав'яних культур (Crop Protection Chemicals Reference, pp. 1803-1821, Chemical & Pharmaceutical Press, Inc., New York, NY, 11th ed., 1995). Дикамба належить до 3,6дихлор-о-анісової кислоти або 3,6-дихлор-2-метокси-бензойної кислоти, а також до її кислот та солей. Її солі включають ізопропіламін, диглікольамін, диметиламін, калій та натрій. Дикамба включає, наприклад, комерційні композиції без обмежень: Banvel™ (у вигляді солі DMA, BASF, Research Triangle Park, Північна Кароліна), Clarity® (сіль DGA, BASF), VEL-58-CS-11™ (BASF) та Vanquish™ (сіль DGA, BASF). Дикамба являє собою гербіцид, який використовується у вигляді бакової суміші одночасно або до, або після обробки композиціями. Ауксиноподібні гербіциди також містять сполуки феноксикарбонової кислоти, сполуки піридінкарбонової кислоти, сполуки хінолінкарбонової кислоти та беназолін-етилові сполуки. Приклади сполук феноксикарбонової кислоти включають, без обмеження ними, 2,4дихлорфеноксиоцетову кислоту, (4-хлор-2-метилфенокси) оцтову кислоту, дихлорпроп (2,4-DP), мекопроп (MCPP) та кломепроп. Приклади піридінових гербіцидів включають, без обмеження ними, клопіралід, піклорам, флуроксипір, аміноциклопірахлор та триклопір. Ці ауксиноподібні гербіциди можуть використовуватися у вигляді бакової суміші одночасно або до, або після обробки композиціями. Ауксиноподібні гербіциди включають комерційно доступні композиції, наприклад, включаючи, але без обмеження ними, 2,4-D, 2,4-DB (Butyrac® 200, Bakker), MCPA (Rhonox®, Rhomene), мекопроп, дихлорпроп, 2,4,5-T, триклопір (Garlon®, Dow AgroSciences, Індіанаполіс, штат Індіана), хлорамбен, дикамбу (Banvel®, Clarity®, Oracle®, Sterling®), 2,3,6TBA, трикамбу, клопіралід (Stinger®, Dow AgroSciences), піклорам (Tordon®, Dow AgroSciences), квінмерак, квінклорак, беназолін, фенак, IAA, NAA, ортоніл та флуроксипір (Vista®, Starane®, Dow AgroSciences), амінопіралід (Milestone®, Dow AgroSciences) та аміноциклопірахлор (Dupont, Вілмінгтон, штат Делавер). Композиції тригерних молекул полінуклеотиду і олігонуклеотиду використовуються в 7 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 композиціях, наприклад, в рідинах, які містять молекули полінуклеотиду при низьких концентраціях, окремо або в комбінації з іншими компонентами, наприклад, однією або декількома молекулами гербіциду або в тій же рідині, або в окремо взятих рідинах, які також забезпечують агент перенесення. Хоча не існує ніякої верхньої межі концентрацій і дозувань молекул полінуклеотиду, які можуть використовуватися в цих способах, для ефективності зазвичай треба буде знайти нижню межу ефективних концентрацій і дозувань. Концентрації можна скорегувати з урахуванням об'єму спрею або обробки, яка застосовується до листя рослини або інших частин поверхні рослини, таких як квіткові пелюстки, стебла, бульби, фрукти, пильовики, пилок або насіння. У одному варіанті реалізації необхідна обробка трав'янистих рослин із використанням 25-мерної олігонуклеотидної молекули вимагає близько 1 наномоль (нмоль) молекул олігонуклеотидів на рослину, наприклад, від близько 0,05 до 1 нмоль на рослину. Інші варіанти реалізації для трав'янистих рослин включають необхідні діапазони концентрації від близько 0,05 до близько 100 нмоль або від близько 0,1 до близько 20 нмоль, або від близько 1 нмоль до близько 10 нмоль полінуклеотидів на рослину. Дуже великі рослини, дерева або лози можуть потребувати відповідно більшої кількості полінуклеотидів. При використанні довгих молекул длРНК, які можна перетворити в декілька олігонуклеотидів, можна використати нижчі концентрації. Щоб продемонструвати деякі варіанти реалізації, відносно олігонуклеотидних молекул для зазначення обробки 0,8 нмоль молекули полінуклеотиду на рослину умовно використовують фактор 1Х; 10Х для 8 нмоль молекули полінуклеотиду на рослину; і 100Х для 80 нмоль молекули полінуклеотиду на рослину. Полінуклеотидні композиції використовуються в композиціях, наприклад, в рідинах, які містять молекули полінуклеотиду, окремо або в комбінації з іншими компонентами, або в тій же рідині, або в окремо взятих рідинах, які також забезпечують агент перенесення. Як використовується в цьому документі, агент перенесення являє собою агент, який у поєднанні з полінуклеотидом в композиції, яка місцево застосовується до поверхні рослини-мішені, дозволяє полінуклеотиду потрапити в клітину рослини. У деяких варіантах реалізації агент перенесення являє собою агент, який кондиціонує поверхню тканини рослини, наприклад, листя, стебла, корені, квіти або фрукти для потрапляння за допомогою молекул полінуклеотиду в клітини рослини. Перенесення полінуклеотидів в клітини рослини може бути полегшене за допомогою попереднього або одночасного застосування агенту перенесення полінуклеотиду до тканини рослини. У деяких варіантах реалізації агент перенесення застосовують після нанесення полінуклеотидної композиції. Агент перенесення полінуклеотиду забезпечує полінуклеотидам шлях через воскові бар'єри серозної оболонки, пори і/або стінки клітини або мембранні бар'єри в клітини рослини. Відповідні агенти перенесення для полегшення перенесення полінуклеотиду в клітину рослини включають агенти, які покращують проникність зовнішньої поверхні рослини або які покращують проникність олігонуклеотидів або полінуклеотидів в клітини рослини. Такі агенти для полегшення перенесення композиції в клітину рослини містять хімічну речовину або фізичну речовину, або їх комбінації. Хімічні речовини для кондиціонування або перенесення містять: (а) поверхнево-активні речовині, (б) органічний розчинник або водний розчин, або водні суміші органічних розчинників, (в) окисники, (г) кислоти, (д) луги, (е) олії, (є) ферменти або їх комбінації. Варіанти реалізації способу можуть необов'язково включати етап інкубації, етап нейтралізації (наприклад, щоб нейтралізувати кислоту, лугу або окисник або інактивувати фермент), етап обполіскування або їх комбінації. Варіанти реалізації агентів або обробки для кондиціонування рослини з метою проникнення полінуклеотидів включають емульсії, зворотні емульсії, ліпосоми та інші міцелоподібні композиції. Варіанти реалізації агентів або обробки для кондиціонування рослини з метою проникнення полінуклеотидів містять протиіони або інші молекули, які, як відомо, пов'язують з молекулами нуклеїнових кислот, наприклад, неорганічні іони амонію, іони алкіламонію, іони алкіллітію, поліаміни, такі як спермін, спермідин або путресцин та інші катіони. Органічні розчинники, які використовуються в кондиціонуванні рослини з метою проникнення полінуклеотидів, містять DMSO, DMF, піридин, N-піролідин, гексаметилфосфорамід, ацетонітрил, диоксан, поліпропіленгліколь, інші розчинники, здатні змішуватися з водою або які розчинятимуть фосфонуклеотиди в неводних системах (наприклад, які використовуються в реакціях синтезу). Можуть використовуватися природні або синтетичні олії з додаванням або без поверхнево-активних речовин або емульгаторів, наприклад, олії рослинного походження, th олії з насіння (наприклад, можна використати ті, які є в переліку 9 Compendium of Herbicide Adjuvants, у відкритому доступі всесвітньої мережі (Інтернет) на сайті herbicide.adjuvants.com, наприклад, парафінові олії, ефіри жирної кислоти і багатоатомного спирту або олії з молекулами з коротким ланцюгом, модифіковані амідами або поліамінами, такі як поліетиленімін або N-піролідин. Агенти перенесення містять, без обмеження ними, 8 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кремнійорганічні препарати. Агрономічні поля, які потребують контролю за ростом рослин, обробляють шляхом нанесенням композиції безпосередньо на поверхню зростаючих рослин, наприклад, за допомогою обприскування. Наприклад, спосіб застосовують для боротьби з бур'янами на полі культурних рослин шляхом розпилення композиції на полі. Композиція може бути надана у вигляді бакової суміші з одною або більше гербіцидними хімічними речовинами і додатковими пестицидними хімічними речовинами для боротьби з шкідниками і захворюваннями культурних рослин, що потребують боротьби з шкідниками і захворюваннями, у вигляді послідовної обробки компонентів (зазвичай композиціями, які містять полінуклеотид, після застосування гербіциду) або одночасної обробки, або змішування одного або більше компонентів композиції з окремих контейнерів. Обробка поля може проводитися в міру необхідності для забезпечення боротьби з бур'янами, а компоненти композиції можна скорегувати для боротьби з конкретними видами бур'янистих рослин або сімействами бур'янів за допомогою використання конкретних полінуклеотидів або полінуклеотидних композицій, здатних вибірково охоплювати конкретні види або сімейства рослин, з якими належить боротися. Композицію можна використовувати з ефективною робочою концентрацією залежно від часу обробки поля, наприклад, передпосівне внесення, при посадці, після посадки, після збору урожаю. Робоча концентрація гліфосату, що може застосуватися на полях, дорівнює від 11-44 унцій/акр до 7,2875 фунтів/акр. Полінуклеотидні композиції можна використовувати, виходячи з норми від 1 до 30 грамів на акр, залежно від кількості тригерних молекул, необхідних для охоплення бур'янів на цьому полі. Культурні рослини, які можуть потребувати боротьби з бур'янами, включають, без обмеження ними, такі рослини, як: кукурудза, соя, бавовна, рапс, цукровий буряк, люцерна, цукрова тростина, рис і пшениця; овочеві рослини, включаючи, без обмеження ними, томат, солодкий перець, гострий перець, диня, кавун, огірок, баклажан, цвітна капуста, броколі, салат, шпинат, лук, горох, морква, солодка кукурудза, пекінська капуста, цибуля-порей, кріп, гарбуз, кабачок або пляшковий гарбуз, редька, брюссельська капуста, фізаліс овочевий, стручкова квасоля, зріла квасоля або бамія; зелень, включаючи, без обмеження ними, базилік, петрушка, кава або чай; або плодові рослини, включаючи, без обмеження ними, яблуко, груша, вишня, персик, слива, абрикос, банан, плантан, столовий виноград, винний виноград, цитрусові, авокадо, манго або ягоди; дерева, які вирощуються для декоративного або комерційного використання, включаючи, без обмеження ними, фруктові або горіхоплідні дерева; або декоративні рослини (наприклад, квітучі декоративні рослини або чагарники, або рулонний газон). Способи та композиції, приведені в цьому документі, також можна застосовувати до рослин, отриманих за допомогою живцювання, клонування або прищепи (тобто до рослин, які виросли не з насіння), зокрема до плодових дерев і рослин, які включають, без обмеження ними, авокадо, помідори, баклажани, огірки, дині, кавуни, виноград, а також різні декоративні рослини. Суміші пестицидів Полінуклеотидні композиції можуть також використовуватися у сумішах із різним агрохімікатами і/або інсектицидами, акарицидами і фунгіцидами, пестицидними і біопестицидними засобами. Приклади включають, без обмеження ними, азинфос-метил, ацефат, ізоксатіон, ізофенфос, етіон, етримфос, оксидеметон-метил, оксидепрофос, хіналфос, хлорпірифос, хлорпірифос-метил, хлорфенвінфос, ціанофос, диоксабензофос, дихлофос, дисульфотон, диметилвінфос, диметоат, сульпрофос, діазинон, тіометон, тетрахлорвінфос, темефос, тебупіримфос, тербуфос, налед, вамідотіон, піраклофос, піридафентіон, піриміфосметил, фенитротіон, фентіон, фентоат, флупиразофос, протіофос, пропафос, профенофос, фоксим, фозалон, фосмет, формотіон, форат, малатіон, мекарбам, месульфенфос, метамідофос, метидатіон, паратіон, паратіон-метил, монокротофос, трихлорфон, EPN, ізазофос, ізамідофос, кадусафос, діамідафос, дихлорфентіон, тіоназин, фенаміфос, фостіазат, фостіетан, фосфокарб, DSP, етопрофос, аланікарб, алдікарб, ізопрокарб, етіофенкарб, карбаріл, карбосульфан, ксилілкарб, тіодикарб, піримікарб, фенобукарб, фуратіокарб, пропоксур, бендиокарб, бенфуракарб, метоміл, метолкарб, XMC, карбофуран, алдоксикарб, оксаміл, акрінатрин, алетрин, есфенвалерат, емпентрин, циклопротрин, цигалотрин, гаммацигалотрин, лямбда-цигалотрин, цифлутрин, бета-цифлутрин, циперметрин, альфациперметрин, зета-циперметрин, силафлуофен, тетраметрин, тефлутрин, дельтаметрин, тралометрин, біфентрин, фенотрин, фенвалерат, фенпропатрин, фураметрин, пралетрин, флуцитринат, флувалінат, флуброцитринат, перметрин, ресметрин, етофенпрокс, картап, тіоциклам, бенсультап, ацетаміприд, імідаклоприд, клотіанидин, динотефуран, тіаклоприд, тіаметоксам, нітенпірам, хлорфлуазурон, дифлубензурон, тефлубензурон, трифлумурон, новалурон, новифлумурон, бистрифлуорон, флуазурон, флуциклоксурон, флуфеноксурон, 9 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гексафлумурон, луфенурон, хромафенозид, тебуфенозид, галофенозид, метоксифенозид, діофенолан, циромазін, пірипроксифен, бупрофезин, метопрен, гідропрен, кінопрен, триазамат, ендосульфан, хлорфенсон, хлорбензилат, дикофол, бромопропілат, ацетопрол, фіпроніл, етіпрол, піретрин, ротенон, сульфат нікотину, агент BT (Bacillus Thuringiensis), спіносад, абамектин, ацеквіноцил, амідофлумет, амітраз, етоксазол, хінометіонат, клофентезин, фенбутатіну оксид, дієнохлор, цигексатин, спіродиклофен, спіромезіфен, тетрадіфон, тебуфенпірад, бінапакрил, біфеназат, піридабен, піримідифен, феназахін, фенотіокарб, фенпіроксимат, флуакрипірим, флуазінам, флуфензин, гекситіазокс, пропаргіт, бензомат, полінактиновий комплекс, мілбемектин, луфенурон, мекарбам, метіокарб, мевінфос, халфенпрокс, азадірахтін, діафентіурон, індоксакарб, бензоат емамектину, олеат калію, олеат натрію, хлорфенапір, толфенпірад, піметрозин, феноксикарб, гідраметилнон, гідроксипропіл крохмаль, піридаліл, флуфенерим, флубендіамід, флонікамід, метафлумізол, лепімектин, TPIC, альбендазол, оксибендазол, оксфендазол, трихламід, фенсульфотіон, фенбендазол, левамізолу гідрохлорид, морантель тартрат, дазомет, метам натрію, триадімефон, гексаконазол, пропіконазол, іпконазол, прохлораз, трифлумізол, тебуконазол, епоксиконазол, дифеноконазол, флусилазол, триадіменол, ципроконазол, метконазол, флухінконазол, бітертанол, тетраконазол, тритіконазол, флутриафол, пенконазол, диніконазол, фенбуконазол, бромуконазол, імібенконазол, сімеконазол, міклобутаніл, хімексазол, імазаліл, фураметпір, тифлузамід, етрідіазол, окспоконазол, окспоконазолу фумарат, пефуразоат, протіоконазол, пірифенокс, фенарімол, нуарімол, бупіримат, мепаніпірим, ципродиніл, піриметаніл, металаксіл, мефеноксам, оксадиксіл, беналаксіл, тіофанат, тіофанат-метил, беноміл, карбендазим, фуберідазол, тіабендазол, манзеб, пропінеб, зінеб, метірам, манеб, зірам, тіурам, хлороталоніл, етабоксама, оксикарбоксин, карбоксин, флутоланіл, силтіофам, мепроніл, диметоморф, фенпропідин, фенпропіморф, спіроксамін, тридеморф, додеморф, флуморф, азоксистробін, крезоксим-метил, метоміностробін, орисастробін, флуоксастробін, трифлоксистробін, димоксистробін, піраклостробін, пікоксистробін, іпродіон, процимідон, вінклозолін, хлозолінат, флусульфамід, дазомет, метил ізотіоціанат, хлорпікрин, метасульфокарб, гідроксиізоксазол, гідроксиізоксазол калію, ехломезол, D-D, карбам, основний хлорид міді, основний сульфат міді, нонілфенолсульфонат міді, оксин міді, DBEDC, безводий сульфат міді, міді сульфат пентагідрат, гідроксид міді, неорганічна сірка, сірка, що змочується, сірчисте вапно, сульфат цинку, фентін, гідрокарбонат натрію, гідрокарбонат калію, гіпохлорит натрію, срібло, едифенфос, толклофос-метил, фосетіл, іпробенфос, дінокап, піразофос, карпропамід, фталід, трициклазол, пірохілон, диклоцимет, феноксаніл, касугаміцин, валідаміцин, поліоксини, бластицидін С, окситетрациклін, мілдіоміцин, стрептоміцин, рапсова олія, машинне мастило, бентіавалікарбізопропіл, іпровалікарб, пропамокарб, диетофенкарб, флуороімід, флудиоксаніл, фенпіклоніл, хіноксифен, оксолінова кислота, хлороталоніл, каптан, фолпет, пробеназол, ацибензолар-С-метил, тіадиніл, цифлуфенамід, фенгексамід, дифлуметорим, метрафенон, пікобензамід, прохіназид, фамоксадон, ціазофамід, фенамідон, зоксамид, боскалід, цимоксаніл, дитіанон, флуазінам, дихлофлуанід, трифорін, ізопротіолан, ферімзон, дикломезин, теклофталам, пенцикурон, хіномеіионат, іміноктадину ацетат, іміноктадину албесілат, амбам, полікарбамат, тіадіазін, хлоронеб, диметилдитіокарбамат нікелю, гуазатин, додецилгуанідинацетат, квінтозен, толілфлуанід, анілазін, нітроталізопропіл, фенітропан, діметірімол, бентіазол, білок гарпін, флуметовер, мандіпропамід та пентіопірад. Полінуклеотиди Як використовується в цьому документі, термін "ДНК", "молекула ДНК", "полінуклеотидна молекула ДНК" належить до одноланцюгової ДНК (олДНК) або дволанцюгової ДНК (длДНК) молекули геномного або синтетичного походження, наприклад, полімеру з дезоксирибонуклеотидних основ або полінуклеотидна молекула ДНК. Як використовується в цьому документі, термін "послідовність ДНК", "нуклеотидна послідовність ДНК" або "полінуклеотидна послідовність ДНК" належить до нуклеотидної послідовності молекули ДНК. Як використовується в цьому документі, термін "РНК", "молекула РНК", "полінуклеотидна молекула РНК" належить до одноланцюгової РНК (олРНК) або дволанцюгової РНК (длРНК) молекули геномного або синтетичного походження, наприклад, полімер із рибонуклеотидних основ, які складають одно- або дволанцюгові ділянки. Якщо не вказане інше, то нуклеотидні послідовності в тексті цього опису читаються зліва направо в напрямку від 5' до 3'. Номенклатура, яка використовується в цьому документі, приведена згідно з вимогами Розділу 37 Зводу нормативних актів федеральних органів виконавчої влади США § 1,822 і представлена в таблицях згідно стандарту ВОІВ (Всесвітня організація інтелектуальної власності) ST.25 (1998), Додаток 2, Таблиці 1 та 3. Як використовується в цьому документі, "полінуклеотид" належить до молекули ДНК або 10 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 РНК, що містить декілька нуклеотидів і зазвичай належить як до "олігонуклеотидів" (молекула полінуклеотиду зазвичай із 50 або менше нуклеотидів у довжину), так і до полінуклеотидів із 51 або більше нуклеотидів. Варіанти реалізації включають композиції, які складаються з олігонуклеотидів довжиною 18-25 нуклеотидів (18-мер, 19-мер, 20-мер, 21-мер, 22-мер, 23-мер, 24-мер або 25-мер), наприклад, олігонуклеотиди SEQ ID NO: 3223-3542 або їх фрагменти, або полінуклеотиди середньої довжини, довжина яких складає 26 або більше нуклеотидів (полінуклеотиди з 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, близько 65, близько 70, близько 75, близько 80, близько 85, близько 90, близько 95, близько 100, близько 110, близько 120, близько 130, близько 140, близько 150, близько 160, близько 170, близько 180, близько 190, близько 200, близько 210, близько 220, близько 230, близько 240, близько 250, близько 260, близько 270, близько 280, близько 290 або близько 300 нуклеотидів), наприклад, SEQ ID NO: 121-3222 або їх фрагменти, або довгі полінуклеотиди, більше ніж близько 300 нуклеотидів (наприклад, полінуклеотиди від близько 300 до близько 400 нуклеотидів, від близько 400 до близько 500 нуклеотидів, від близько 500 до близько 600 нуклеотидів, від близько 600 до близько 700 нуклеотидів, від близько 700 до близько 800 нуклеотидів, від близько 800 до близько 900 нуклеотидів, від близько 900 до близько 1000 нуклеотидів, від близько 300 до близько 500 нуклеотидів, від близько 300 до близько 600 нуклеотидів, від близько 300 до близько 700 нуклеотидів, від близько 300 до близько 800 нуклеотидів, від близько 300 до близько 900 нуклеотидів або близько 1000 нуклеотидів у довжину, або навіть більше ніж близько 1000 нуклеотидів у довжину, наприклад, досягають загальної довжини гена-мішені, зокрема з кодуючими або некодуючими, або як кодуючими, так і некодуючими ділянками гена-мішені), наприклад, полінуклеотиди Таблиці 1 (SEQ ID NO: 1-120), в якій обрані полінуклеотиди або їх фрагменти, які гомологічні або комплементарні SEQ ID NO: 1-120, пригнічують, стримують або іншим чином уповільнюють експресію гена-мішені EPSPS. Якщо полінуклеотид є дволанцюговим, його довжина може бути аналогічним чином описана відповідно до пар основ. Ген-мішень містить будь-яку молекулу полінуклеотиду в клітині рослини або її фрагменті, для якої модуляція експресії гена-мішені забезпечується способами та композиціями. Ген містить некодуючі генетичні елементи (компоненти), які забезпечують функціонування гена; цими елементами є полінуклеотиди, які забезпечують регуляцію експресії гена, наприклад, промотор, енхансер, 5'-нетрансльована область, області інтрону та 3'-нетрансльована область. Олігонуклеотиди і полінуклеотиди можна зробити практично ідентичними або практично комплементарними будь-якому з генетичних елементів гена і полінуклеотидам, що охоплюють області з'єднання генетичного елементу, наприклад, інтрону і екзону, області з'єднання промотору та області, що транскрибується, області з'єднання 5'-лідерної і кодуючої послідовності, з'єднання 3'-нетрансльованої області і кодуючої послідовності. Композиції полінуклеотидів, використовувані в різних варіантах реалізації, включають композиції, які містять олігонуклеотиди або полінуклеотиди, або суміші їх обох, зокрема РНК або ДНК, або гібриди РНК/ДНК, або хімічно модифіковані олігонуклеотиди або полінуклеотиди, або їх суміші. У деяких варіантах реалізації полінуклеотид може являти собою сполучення рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів, наприклад, синтетичні полінуклеотиди, що складаються переважно з рибонуклеотидів, але з одним або декількома кінцевими дезоксирибонуклеотидами або синтетичні полінуклеотиди, що складаються переважно з дезоксирибонуклеотидів, але з одним або більше кінцевими дидезоксирибонуклеотидами. У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить неканонічні нуклеотиди, такі як інозин, тіоуридин або псевдоуридин. У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить хімічно модифіковані нуклеотиди. Приклади хімічно модифікованих олігонуклеотидів або полінуклеотидів добре відомі в цій галузі техніки; дивися, наприклад, публікацію патенту США 20110171287, публікацію патенту США 20110171176 та публікацію патенту США 20110152353, публікацію патенту США 20110152346, публікацію патенту США 20110160082, які включені в цей документ у вигляді посилання. Наприклад, ті, які включають, без обмеження ним, фосфодиефірний остов олігонуклеотиду або полінуклеотиду, який зустрічається в природі, можуть бути частково або повністю модифіковані за допомогою міжнуклеотидних зв'язків, модифікованих фосфоротіоатом, фосфородитіоатом або метилфосфонатом, модифіковані нуклеозидні основи або модифіковані цукри можуть використовуватися у синтезі олігонуклеотидів або полінуклеотидів, та олігонуклеотиди або полінуклеотиди можуть бути помічені флуоресцентним фрагментом (наприклад, флуоресцеїн або родамін) або іншою міткою (наприклад, біотин). Полінуклеотиди можуть бути одно- або дволанцюговою РНК або одно- або дволанцюговою ДНК, або дволанцюговими ДНК/РНК гібридами або їх модифікованими аналогами та можуть 11 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мати довжини, як у олігонуклеотида або більше. У більш конкретних варіантах реалізації полінуклеотиди, які забезпечують одноланцюгову РНК в клітині рослини, обирають із групи, що складається з (а) одноланцюгової молекули РНК (олРНК), (б) одноланцюгової молекули РНК, яка самостійно гибридизується з утворенням дволанцюгової молекули РНК, (в) дволанцюгової молекули РНК (длРНК), (г) одноланцюгової молекули ДНК (олДНК), (д) одноланцюгової молекули ДНК, яка самостійно гибридизується з утворенням дволанцюгової молекули ДНК, і (е) одноланцюгової молекули ДНК, яка містить модифікований ген Pol III, який транскрибується в молекулу РНК, (є) дволанцюгової молекули ДНК (длДНК), (ж) дволанцюгової молекули ДНК, яка містить модифікований ген Pol III, який транскрибується в молекулу РНК, (з) дволанцюгової, гибридизированої молекули РНК/ДНК або їх комбінацій. У деяких варіантах реалізації ці полінуклеотиди містять хімічно модифіковані нуклеотиди або неканонічні нуклеотиди. У деяких варіантах реалізації винаходу олігонуклеотиди можуть бути з тупими кінцями або можуть мати 3'-виступ з 1-5 нуклеотидів, щонайменше одного або обох ланцюгів. Інші конфігурації олігонуклеотиду відомі в цій галузі техніки та розглядаються в цьому документі. У варіантах реалізації способу полінуклеотиди містять дволанцюгову ДНК, утворену внутрішньомолекулярною гібридизацією, дволанцюгову ДНК, утворену міжмолекулярною гібридизацією, дволанцюгову РНК, утворену внутрішньомолекулярною гібридизацією або дволанцюгову РНК, утворену міжмолекулярною гібридизацією. У одному варіанті реалізації полінуклеотиди містять одноланцюгову ДНК або одноланцюгову РНК, яка самостійно гібридизується і утворює шпилькову структуру із щонайменше частково дволанцюговою структурою, що містить щонайменше один сегмент, який буде гібридизуватися з РНК, яка транскрибується з гена, який підлягає пригніченню. У разі, якщо не передбачається зв'язування якимось механізмом, вважають, що такі полінуклеотиди є або утворюватимуть одноланцюгову РНК з щонайменше одним сегментом, який буде гібридизуватися з РНК, яка транскрибується з гена, який підлягає пригніченню. У деяких інших варіантах реалізації полінуклеотиди додатково містять промотор, зазвичай промотор, що функціонує в рослині, наприклад, промотор pol II, промотор pol III, промотор pol IV або промотор pol V. Термін "ген" належить до компонентів, які включають хромосомну ДНК, плазмідну ДНК, кДНК, інтрон та екзон ДНК, штучну полінуклеотидну ДНК або іншу ДНК, яка кодує пептид, поліпептид, білок або молекулу РНК-транскрипту, а також генетичні елементи, які фланкують кодуючу послідовність, які беруть участь в регуляції експресії, наприклад, промоторні області, 5'-лідерні області, 3'-нетрансльована область, які можуть існувати як природні гени або трансгени в геномі рослини. Ген або його фрагмент ізолюють і піддають дії способів секвенування полінуклеотидів, що визначає порядок нуклеотидів, які містять ген. Будь-який з компонентів гена являє собою потенційну мішень для тригерного олігонуклеотиду і полінуклеотидів. Тригерні молекули полінуклеотиду призначені для модуляції експресії за допомогою індукції регуляції або пригнічення ендогенного гена EPSPS в рослині і призначені, щоб їх нуклеотидна послідовність була практично ідентичною або практично комплементарною нуклеотидній послідовності ендогенного гена EPSPS рослини або послідовності РНК, яка транскрибується з ендогенного гена EPSPS рослини, його послідовності, що визначається шляхом виділення гена або фрагмента гена з рослини, який може бути кодуючою або некодуючою послідовністю. Ефективні молекули, які модулюють експресію, називають "тригерною молекулою або тригерними полінуклеотидами". Під "практично ідентичними" або "практично комплементарними" мають на увазі, що тригерні полінуклеотиди (або щонайменше один ланцюг дволанцюгового полінуклеотиду або його ділянки, або ділянки одноланцюгового полінуклеотиду) призначені для гібридизаціі з ендогенним геном некодуючої послідовності або з РНК, що транскрибується (відома як інформаційна РНК або РНК-транскрипт) з ендогенного гена для здійснення регуляції або пригнічення експресії ендогенного гена. Тригерні молекули визначають за допомогою "перекриття" генів-мішеней зондами, які частково перекриваються, або зондами, які не перекриваються, антисмислових або смислових полінуклеотидів, які практично ідентичні або практично комплементарні нуклеотидній послідовності ендогенного гена. Декілька послідовностей-мішеней можуть збігатися та області послідовності з однаковою гомологією, відповідно до способів, визначають як потенційні тригерні молекули для декількох мішеней. Декілька тригерних молекул різної довжини, наприклад, з 18-25 нуклеотидів, 26-50 нуклеотидів, 51-100 нуклеотидів, 101-200 нуклеотидів, 201-300 нуклеотидів або більше можна об'єднати в пул із декількох обробок для дослідження полінуклеотидних молекул, які охоплюють ділянку генної послідовності (наприклад, ділянка кодуючої області в порівнянні з ділянкою некодуючої області, або 5'-ділянка гена в порівнянні з 3'-ділянкою гена) або усю генну послідовність, включаючи кодуючу і некодуючу область гена-мішені. Полінуклеотидні молекули 12 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тригерних молекул, об'єднаних в пул, можна розділити на дрібніші пули або одиночні молекули, щоб визначити тригерні молекули, які забезпечують бажаний ефект. Полінуклеотидні молекули РНК та ДНК гена-мішені (Таблиця 1, SEQ ID NO: 1-120) секвенують будь-якою кількістю доступних способів і устаткування. Деякі з технологій секвенування є у продажу, наприклад, платформа для секвенування за допомогою гібридизації від компанії Affymetrix Inc. (Саннівейл, штат Каліфорнія) і платформи для секвенування за допомогою синтезу від компаній 454 Life Sciences (Бредфорд, штат Коннектікут), Illumina/Solexa (Хейуорд, штат Каліфорнія), і Helicos Biosciences (Кембрідж, штат Массачусетс), а також платформа секвенування за допомогою лігування від компанії Applied Biosystems (Фостер Сіті, штат Каліфорнія), як описано нижче. На додаток до секвенування одиночної молекули, виконаного з використанням секвенування за допомогою синтезу від компанії Helicos Biosciences, інші технології секвенування одиночної молекули здійснюються і включають технологію SMRT™ компанії Pacific Biosciences, технологію Ion Torrent™ і нанопорове секвенування, розроблені, наприклад, компанією Oxford Nanopore Technologies. Ген-мішень EPSPS, що містить ДНК або РНК, може бути виділений із використанням праймерів або зондів практично комплементарних або практично гомологічних SEQ ID NO: 1-120 або їх фрагмента. Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) фрагмента гена можна отримати за допомогою використання праймерів практично комплементарних або практично гомологічних SEQ ID NO: 1120 або їх фрагмента, що доцільно для виділення гена EPSPS із геному рослини. SEQ ID NO: 1120 або їх фрагменти можуть використовуватися в різних технологіях захоплення послідовності для виділення додаткових послідовностей гена-мішені, наприклад, включаючи, без обмеження ними, Roche NimbleGen® (Медісон, штат Вісконсін) та стрептавідин-зв'язані Dynabeads® (Life Technologies, Гранд Айленд, штат Нью-Йорк), та US20110015084, які включені в цей документ у вигляді посилання в повному обсязі. В деяких варіантах реалізації комплементарність послідовностей функціональних одноланцюгових полінуклеотидів має бути не 100 відсотковою, а щонайменше достатньою, щоб дозволити гібридизацію з РНК, яка транскрибується з гена-мішені або ДНК гена-мішені з утворенням дуплексу, щоб дозволити механізм пригнічення експресії генів. Таким чином, у варіантах реалізації фрагмент полінуклеотиду призначений бути практично ідентичним або практично комплементарним послідовності з 18 або більше безперервних нуклеотидів як у послідовності гена-мішені EPSPS, так і в інформаційній РНК, що транскрибується з гена-мішені. Під "практично ідентичними" мають на увазі 100 відсоткову ідентичність послідовності або щонайменше близько 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 відсоткову ідентичність послідовності в порівнянні з послідовністю з 18 або більше безперервних нуклеотидів як у гені-мішені, так і в РНК, що транскрибується з гена-мішені; під "практично комплементарними" мають на увазі 100 відсоткову комплементарність послідовності або щонайменше близько 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 відсоткову комплементарність послідовності в порівнянні з послідовністю з 18 або більше безперервних нуклеотидів як у гені-мішені, так і в РНК, що транскрибується з гена-мішені. У деяких варіантах реалізації молекули полінуклеотиду мають 100 відсоткову ідентичність послідовності з компліментарністю до однієї алелі або до одного представника сімейства цього гена-мішені (кодуюча або некодуюча послідовність гена); у інших варіантах реалізації молекули полінуклеотиду мають 100 відсоткову ідентичність послідовності з комплементарністю до декількох алелей або представників сімейства цього гена-мішені. "Ідентичність" належить до міри схожості двох послідовностей полінуклеїнових кислот або білків. Вирівнювання двох послідовностей виконується за допомогою відповідної комп'ютерної програми. Комп'ютерною програмою для виконання вирівнювання послідовностей, яка широко використовується і прийнята до використання являється CLUSTALW v1.6 (Thompson, зі співавторами Nucl. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). Кількість схожих основ або амінокислот ділять на загальну кількість основ або амінокислот та множать на 100, щоб отримати відсоток ідентичності. Наприклад, якщо у двох послідовностей із 580 пар основ було б 145 схожих основ, вони були б ідентичними на 25 відсотків. Якщо дві порівнювані послідовності мають різну довжину, кількість збігів ділять на найменшу з двох довжин. Наприклад, якщо з 200 і 400 амінокислот білку є 100 схожих амінокислот, вони ідентичні на 50 відсотків по відношенню до коротшої послідовності. Якщо коротша послідовність складається з менше ніж 150 основ або 50 амінокислот у довжину, кількість збігів ділять на 150 (для основ нуклеїнових кислот) або на 50 (для амінокислот) і множать на 100, щоб отримати відсоток ідентичності. Тригерні молекули для конкретних представників сімейства генів можна визначити з кодуючих і/або некодуючих послідовностей сімейств генів рослини або декількох рослин шляхом вирівнювання і вибору 200-300 фрагментів полінуклеотиду з найменш гомологічних 13 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 областей серед вирівняних послідовностей і оцінити за допомогою місцево застосованих полінуклеотидів (таких, як смислова або антисмислова олДНК або олРНК, длРНК або длДНК), щоб визначити їх відносну ефективність в забезпеченні фенотипу стійкості до гербіцидів. Ефективні сегменти додатково ділять на 50-60 фрагментів полінуклеотиду з відданням переваги найменш гомологічним і повторно оцінюють за допомогою місцево застосованих полінуклеотидів. 50-60 ефективних фрагментів полінуклеотиду ділять на 19-30 фрагментів полінуклеотиду з відданням переваги найменш гомологічним і знову оцінюють для стимулювання фенотипу стійкості до гербіцидів. Після оцінки відносної ефективності фрагменти використовують окремо або знову оцінюють у комбінації з одним або декількома іншими фрагментами для визначення складу тригеру або суміші тригерних полінуклеотидів для забезпечення фенотипу стійкості до гербіцидів. Тригерні молекули для широкого спектру дій можна визначити з кодуючих і/або некодуючих послідовностей сімейств генів рослини або декількох рослин шляхом вирівнювання і вибору 200-300 фрагментів полінуклеотиду з найбільш гомологічних областей серед вирівняних послідовностей і оцінити за допомогою місцево застосованих полінуклеотидів (таких, як смислова або антисмислова олДНК або олРНК, длРНК або длДНК), щоб визначити їх відносну ефективність в стимулюванні фенотипу стійкості до гербіцидів. Ефективні сегменти ділять на 50-60 фрагментів полінуклеотиду з відданням переваги більш гомологічним і повторно оцінюють за допомогою місцево застосованих полінуклеотидів. 50-60 ефективних фрагментів полінуклеотиду ділять на 19-30 фрагментів полінуклеотиду з відданням переваги більш гомологічним і знову оцінюють для стимулювання фенотипу стійкості до гербіцидів. Після оцінки відносної ефективності фрагменти використовують окремо або в комбінації з одним або декількома іншими фрагментами для визначення складу тригеру або суміші тригерних полінуклеотидів для забезпечення фенотипу стійкості до гербіцидів. Способи отримання полінуклеотидів добре відомі в цій галузі техніки. Способи і композиції хімічного синтезу, синтезу in vivo та синтезу in vitro відомі в цій галузі техніки і включають різні вірусні елементи, мікробні клітини, модифіковані полімерази і модифіковані нуклеотиди. Комерційний синтез олігонуклеотидів часто забезпечує два дезоксирибонуклеотиди на 3'-кінці смислового ланцюга. Довгі молекули полінуклеотиду можна синтезувати за допомогою комерційно доступних наборів, наприклад, у наборах Applied Biosystems/Ambion (Остін, штат Техас) ДНК лігується на 5'-кінці в мікробній касеті експресії, яка містить бактерійний промотор полімерази Т7, що робить ланцюги РНК, які можна зібрати в длРНК, і наборів, що постачаються різними виробниками, які включають T7 RiboMax Express (Promega, Медісон, штат Вайомінг), AmpliScribe T7-Flash (Epicentre, Медісон, штат Вайомінг) та TranscriptAid T7 High Yield (Fermentas, Глен Берні, штат Меріленд). Молекули длРНК можна отримати з мікробних касет експресії в бактерійних клітинах (Ongvarrasopone зі співавторами ScienceAsia 33:35-39; Yin, Appl. Microbiol. Biotechnol 84:323-333, 2009; Liu зі співавторами, BMC Biotechnology 10:85, 2010), у яких регульована або недостатня активність ферменту РНКази III або із використанням різних вірусних векторів для отримання достатньої кількості длРНК. Фрагменти гена EPSPS поміщають в мікробні касети експресії в такому положенні, в якому фрагменти швидко формують олРНК або длРНК, які використовуються в способах, описаних у цьому документі, для регуляції експресії гена-мішені EPSPS. Довгі молекули полінуклеотиду можна також зібрати з декількох фрагментів РНК або ДНК. У деяких варіантах реалізації розрахункові параметри, такі як індекс Рейнольдса (Reynolds зі співавторами Nature Biotechnology 22, 326-330 (2004), правила Тушля (Pei та Tuschl, Nature Methods 3(9): 670-676, 2006), алгоритм i-score (Nucleic Acids Res 35: e123‚ 2007), програма i-Score Designer tool і пов'язані алгоритми (Nucleic Acids Res 32: 936-948‚ 2004. Biochem Biophys Res Commun 316: 1050-1058‚ 2004, Nucleic Acids Res 32: 893-901‚ 2004, Cell Cycle 3: 790-5‚ 2004, Nat Biotechnol 23: 995-1001‚ 2005, Nucleic Acids Res 35: e27‚ 2007, BMC Bioinformatics 7: 520‚ 2006, Nucleic Acids Res 35: e123‚ 2007, Nat Biotechnol 22: 326-330‚ 2004) відомі в цій галузі техніки і можуть використовуватися при виборі полінуклеотидних послідовностей, ефективних для пригнічення експресії генів. У деяких варіантах реалізації проводять скринінг послідовності полінуклеотиду проти геномної ДНК рослини-мішені, щоб мінімізувати неумисне пригнічення експресії інших генів. Ліганди можуть бути прив'язані до полінуклеотиду, наприклад, длРНК, олРНК, длДНК або олДНК. Ліганди в цілому можуть містити модифікатори, наприклад, для поліпшення поглинання; діагностичні сполуки або репортерні групи, наприклад, для моніторингу розподілу; зшиваючі агенти; фрагменти, які надають стійкість до нуклеази; і природні або нестандартні нуклеїнові основи. Звичайні приклади включають ліпофіли, ліпіди (наприклад, холестерин, жовчна кислота або жирні кислоти (наприклад, літохолевий олеїл, лауроїл, докозеніл, стеароїл, пальмитоїл, міристоїлу олеоїл, лінолеоїл)), стероїди (наприклад, уваол, гецигенін, диосгенін), терпени 14 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, тритерпени, наприклад, сарсасапогенін, фриеделін, літохолева кислота, дериватизирована епифріделанолом), вітаміни (наприклад, фолієва кислота, вітамін А, біотин, піридоксаль), вуглеводи, білки, агенти, що зв'язують білок, молекули, спрямовані на інтегрин, полікатіони, пептид, поліаміни і пептидоміметики. Ліганд може також бути рекомбінантною або синтетичною молекулою, такою як синтетичний полімер, наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ), ПЕГ-40K, ПЕГ-20K та ПЕГ-5K. Інші приклади лігандів включають ліпофільні молекули, такі як, холестерин, холева кислота, адамантан оцтової кислоти, 1-пірен масляна кислота, дигідротестостерон, гліцерин (наприклад, складні ефіри та їх прості ефіри, наприклад, С 10, С11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 або С20 алкіл; наприклад, лауроїл, докозеніл, стеароїл, олеоїл, лінолеоїл, 1,3-біс-O(гексадецил)гліцерину, 1,3-біс-O(октадецил)гліцерину, геранілоксигексильна група, гексадецилгліцерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандіол, гептадецильна група, пальмітинова кислота, міристинова кислота, O3-(олеоїл)литохолевої кислоти, O3(олеоїл)холенової кислоти, додеканоїл, літохоліл, 5β-холаніл, N, N-дистеарїл-літохоламід, 1,2ди-О-стеароїлгліцерид, диметокситритіл або феноксазин) та ПЕГ (наприклад, ПЕГ-5K, ПЕГ-20K, ПЕГ-40K). Переважні ліпофільні фрагменти містять ліпід, холестерини, олеїл, ретиніл або холестерильні залишки. З'єднання ліганду з длРНК може поліпшити її клітинну абсорбцію, ліпофільні сполуки, які були з'єднані з олігонуклеотидами, містять 1-пірен масляну кислоту, 1,3-біс-O(гексадецил)гліцерин та ментол. Одним із прикладів ліганду для рецепторно-опосередкованого ендоцитозу є фолієва кислота. З'єднання длРНК, які містять фолієву кислоту, можна було б ефективно транспортувати в клітину за допомогою фолат-рецепторно-опосередкованого ендоцитозу. Інші ліганди, які були з'єднані з олігонуклеотидами, включають поліетиленгліколі, вуглеводні кластери, зшиваючі агенти, кон'югати порфірину, транспортні пептиди та ліпіди, такі як холестерин. В деяких випадках з'єднання катіонного ліганду з олігонуклеотидом призводить до поліпшення стійкості до дії нуклеази. Типовими прикладами катіонних лігандів є пропіламонію та диметилпропіламонію. Цікаво, що повідомлялося, що антисмислові олігонуклеотиди зберігають свою високу афинність зв'язування з іРНК після того, як катіонний ліганд розподілили по усьому олігонуклеотиду. Дивися M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103 та посилання в ньому. Біологічна доставка може бути здійснена різними способами, включаючи, без обмеження ними, (1) завантаження ліпосом молекулою длРНК, описаною в цьому винаході і (2) утворення комплексу молекули длРНК із ліпідами або ліпосомами з отриманням комплексів "нуклеїнова кислота-ліпід" або "нуклеїнова кислота-ліпосома". Ліпосома може складатися з катіонних та нейтральних ліпідів, зазвичай використовуваних для трансфекції клітин in vitro. Катіонні ліпіди можуть вступати в реакції комплексоутворення (наприклад, з перенесенням заряду) з негативно зарядженими нуклеїновими кислотами з утворенням ліпосом. Прикладами катіонних ліпосом є, без обмеження ними, ліпофектин, ліпофектамін, ліпофектак та DOTAP. Способи отримання ліпосом добре відомі фахівцям в цій галузі техніки. Ліпосомні композиції можна отримати, наприклад, з фосфатидилхоліну, диміристоїлфосфатидилхоліну, дипальмітоїлфосфатидилхоліну, диміристоїлфосфатиділгліцерину, диолеїлфосфатиділетаноламіну або ліпосом, що містять дигідросфінгоміелін (DHSM). Багато ліпофільних агентів є комерційно доступними, включаючи Lipofectin® (Invitrogen/Life Technologies, Карлсбад, штат Каліфорнія) та Effectene™ (Qiagen, Валенсія, штат Каліфорнія). Крім того, способи системної доставки можуть бути оптимізовані з використанням комерційно доступних катіонних ліпідів, таких як DDAB або DOTAP, кожен з яких може бути змішаний із нейтральним ліпідом, таким як DOPE або холестерин. В деяких випадках можуть використовуватися ліпосоми, наприклад, описані в публікації Templeton зі співавторами Nature Biotechnology, 15:647-652 (1997). В інших варіантах реалізації для доставки in vivo та ex vivo можуть використовуватися полікатіони, такі як поліетиленімін (Boletta зі співавторами, J. Am Soc. Nephrol. 7:1728, 1996). Додаткову інформацію, що належить до використання ліпосом для доставки нуклеїнових кислот, можна знайти в патенті США за номером 6,271,359, у публікації заявки PCT WO 96/40964 та в публікації Morrissey, D. зі співавторами, 2005, Nat Biotechnol. 23(8):1002-7. У деяких варіантах реалізації кремнійорганічний препарат, який є комерційно доступним, як поверхнево-активна речовина Silwet® L-77 під номером CAS 27306-78-1 та номером EPA: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA і нині поставляється компанією Momentive Performance Materials, Олбані, штат Нью-Йорк, можна використовувати для виготовлення полінуклеотидної композиції. У деяких варіантах реалізації, в яких кремнійорганічний препарат Silwet L-77 використовується для попередньої обробки (перед розпиленням) листя рослини або інших поверхонь рослини, свіжоприготовані концентрації в діапазоні від близько 0,015 до близько 2 відсотків по вазі 15 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 (мас. %) (наприклад, близько 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас. %) є ефективними в підготовці листа або іншої поверхні рослини до перенесення молекул полінуклеотиду в клітини рослини при місцевому застосуванні на поверхні. У деяких варіантах реалізації способів та композицій, приведених у цьому винаході, використовується або надається композиція, яка містить полінуклеотидну молекулу і кремнійорганічний препарат, який містить Silwet L-77 в діапазоні від близько 0,015 до близько 2 відсотків по вазі (мас. %) (наприклад, близько 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас. %). У деяких варіантах реалізації будь-який із комерційно доступних кремнійорганічних препаратів, що надаються під наступними товарними знаками: Breakthru S 321, Breakthru S 200 Cat# 67674-67-3, Breakthru OE 441 Cat#68937-55-3, Breakthru S 278 Cat #27306-78-1, Breakthru S 243, Breakthru S 233 Cat#134180-76-0, виробництва компанії Evonik Goldschmidt (Німеччина), Silwet® HS 429, Silwet® HS 312, Silwet® HS 508, Silwet® HS 604 (виробництва компанії Momentive Performance Materials, Олбані, штат Нью-Йорк), може використовуватися як агент перенесення в полінуклеотидній композиції. У деяких варіантах реалізації, в яких кремнійорганічний препарат використовується для попередньої обробки (перед розпиленням) листя рослини або інших поверхонь рослини, свіжоприготовані концентрації в діапазоні від близько 0,015 до близько 2 відсотків по вазі (мас. %) (наприклад, близько 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас. %) є ефективними в підготовці листа або іншої поверхні рослини до перенесення молекул полінуклеотиду в клітини рослини при місцевому застосуванні на поверхні. У деяких варіантах реалізації способів та композицій, приведених у цьому винаході, використовується або надається композиція, яка містить полінуклеотидну молекулу і кремнійорганічний препарат в діапазоні від близько 0,015 до близько 2 відсотків по вазі (мас. %) (наприклад, близько 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас. %). Кремнійорганічні препарати, використовувані в способах та композиціях, приведених у цьому винаході, можуть містити одну або більше ефективних кремнійорганічних сполук. Як використовується в цьому документі, вираз "ефективна кремнійорганічна сполука" використовується для опису будь-якої кремнійорганічної сполуки, яка міститься в кремнійорганічному препараті, який дозволяє полінуклеотиду потрапити в клітину рослини. У деяких варіантах реалізації ефективні кремнійорганічні сполуки можуть дозволити полінуклеотиду потрапити в клітину рослини таким чином, щоб дозволити полінуклеотидоопосередковане пригнічення експресії гена-мішені в клітині рослини. В цілому, ефективні кремнійорганічні сполуки включають, без обмеження ними, сполуки, які можуть містити: i) трисилоксанову головну групу, сполучену ковалентним зв'язком з, ii) алкільним лінкером, який включає, без обмеження ним, н-пропіловий лінкер, сполучений ковалентним зв'язком з, iii) полігліколевим ланцюгом, сполученим ковалентним зв'язком з, iv) кінцевою групою. Трисилоксанові головні групи таких ефективних кремнійорганічних сполук включають, без обмеження ним, гептаметилтрисилоксан. Алкільні лінкери можуть включати, без обмеження ним, н-пропіловий лінкер. Полігліколеві ланцюги включають, без обмеження ними, поліетиленгліколь або поліпропіленгліколь. Полігліколеві ланцюги можуть містити суміш, яка забезпечує середню довжину ланцюга "n" близько "7,5". У деяких варіантах реалізації середня довжина ланцюга "n" може варіюватися від близько 5 до близько 14. Кінцеві групи можуть включати, без обмеження ними, алкільні групи, такі як метильна група. Вважається, що ефективні кремнійорганічні сполуки включають, без обмеження ними, трисилоксанетоксиліровані поверхнево-активні речовини або поліалкіленоксид, модифікований гептаметилтрисилоксаном. 16 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 (Сполука I: поліалкіленоксид гептаметилтрисилоксан, середня довжина n=7.5). У деяких варіантах реалізації кремнійорганічний препарат, що містить кремнійорганічну сполуку, включаючу трисилоксанову головну групу, використовується в способах та композиціях, приведених у цьому винаході. У деяких варіантах реалізації кремнійорганічний препарат, що містить кремнійорганічну сполуку, включаючу гептаметилтрисилоксанову головну групу, використовується в способах та композиціях, приведених у цьому винаході. У деяких варіантах реалізації кремнійорганічна композиція, яка містить Сполуку I, використовується в способах та композиціях, приведених у цьому винаході. У деяких варіантах реалізації способів та композицій, приведених у цьому винаході, використовується або надається композиція, яка містить полінуклеотидну молекулу та одну або більше ефективну кремнійорганічну сполуку в діапазоні від близько 0,015 до близько 2 відсотків по вазі (мас. %) (наприклад, близько 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас. %. Композиції містять, без обмеження ними, компоненти, в яких один або більше полінуклеотидів практично ідентичні або практично комплементарні послідовності гена EPSPS (промотор, інтрон, екзон, 5'-нетрансльована область, 3'-нетрансльована область), агент перенесення, який забезпечує полінуклеотиду потрапляння в клітину рослини, гербіцид, який доповнює дію полінуклеотиду, один або декілька додаткових гербіцидів, які додатково посилюють гербіцидну дію композиції або забезпечують додатковий механізм дії, відмінний від механізму дії доповнюючого гербіциду, різні солі та стабілізуючи агенти, які збільшують корисність композиції у вигляді домішки компонентів композиції. Способи включають одну або декілька обробок полінуклеотидною композицією та одну або декілька обробок агентом перенесення для кондиціонування рослини з метою проникнення полінуклеотидів. Якщо агент для кондиціонування з метою проникнення являє собою кремнійорганічну сполуку або сполуку, що міститься в нім, варіанти реалізації полінуклеотидних молекул являють собою дволанцюгові РНК олігонуклеотиди, одноланцюгові РНК олігонуклеотиди, дволанцюгові РНК полінуклеотиди, одноланцюгові РНК полінуклеотиди, дволанцюгові ДНК олігонуклеотиди, одноланцюгові ДНК олігонуклеотиди, дволанцюгові ДНК полінуклеотиди, одноланцюгові ДНК полінуклеотиди, хімічно модифіковані РНК або ДНК олігонуклеотиди або полінуклеотиди або їх суміші. Композиції та способи можуть використовуватися для модуляції експресії ендогенного гена EPSPS або трансгенного гена EPSPS (наприклад, CP4 EPSPS, патент США за номером RE39,247 та 2mEPSPS, патент США за номером 6,040,497) у клітині рослини. У різних варіантах реалізації ген EPSPS містить кодуючу (білок-кодуючу або трансльовану) послідовність, некодуючу (нетрансльовану) послідовність або як кодуючу, так і некодуючу послідовність. Композиції можуть містити полінуклеотиди та олігонуклеотиди, призначені для виявлення декількох генів або декількох сегментів одного або більше генів. Ген-мішень може містити декілька послідовних сегментів гена-мішені, декілька непослідовних сегментів гена-мішені, декілька алелей гена-мішені або декілька генів-мішені з одного або більше видів. Розкривається спосіб для модуляції експресії гена EPSPS у рослині, який включає: (а) кондиціонування рослини для проникнення полінуклеотидів та (б) обробку рослини полінуклеотидними молекулами, в якій полінуклеотидні молекули містять щонайменше один сегмент із 18 або більше безперервних нуклеотидів, клонованих або іншим чином отриманих із гена-мішені EPSPS в антисмисловій або смисловій орієнтації, при якій полінуклеотидні молекули потрапляють всередину рослини та стимулюють модуляцію гена-мішені. Кондиціонування тазастосування полінуклеотиду можна виконати окремо або за один етап. Коли кондиціонування та застосування полінуклеотиду виконують на окремих етапах, кондиціонування може передувати або може виконуватися після застосування полінуклеотиду впродовж декількох хвилин, годин або днів. У деяких варіантах реалізації на одній і тій же рослині може здійснювати більше ніж один етап кондиціонування або застосовувати більше ніж 17 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одну молекулу полінуклеотиду. У варіантах реалізації способу сегмент можна клонувати або отримати з (а) кодуючої (білок-кодуючої), (б) некодуючої (промотор та інші молекули, які стосуються гена) або (в) і кодуючих, і некодуючих частин гена-мішені. Некодуючі частини включають ДНК, наприклад, промоторні області або РНК, що транскрибується за допомогою ДНК, яка забезпечує регуляторні молекули РНК, включаючи, без обмеження ними: інтрони, 5'або 3'-нетрансльовані області та мікроРНК, транс-діючі міРНК, природні антисмислові міРНК та інші малі РНК із регуляторною функцією або РНК, виконуючі структурну або ферментативну функцію, включаючи, без обмеження ними: рібозими, рібосомні РНК, тРНК, аптамери та рібосвітчі. Усі публікації, патенти та патентні заявки включені в цей документ у вигляді посилання так, як якби кожна окрема публікація або патентна заявка була б конкретно і окремо включена за допомогою окремого посилання. Наступні приклади включені для демонстрації прикладів деяких переважних варіантів реалізації. Фахівцями в цій галузі техніки повинне оцінитися те, що технології, розкриті в прикладах, відповідають підходам, які винахідники успішно застосували на практиці, і, отже, можуть розглядатися як зразки переважних варіантів реалізації для його практичного застосування. Проте, фахівці в цій галузі техніки, відповідно до цього опису, повинні оцінити можливість виконання багатьох змін в конкретних варіантах реалізації, які були розкриті і все ж таки отримати схожий або аналогічний результат без відхилення від суті і обсягу. ПРИКЛАДИ Приклад 1. Полінуклеотиди, що належать до послідовностей гена EPSPS. Полінуклеотидні молекули гена-мішені EPSPS в природі зустрічаються в геномі Amaranthus palmeri, Amaranthus rudis, Amaranthus graecizans, Amaranthus hybridus, Amaranthus lividus, Amaranthus spinosus, Amaranthus thunbergii, Amaranthus viridis, Lolium multiflorum, Lolium rigidium, Ambrosia artemisiifolia, Ambrosia trifida, Euphorbia heterophylla, Kochia scoparia, Abutilon theophrasti, Sorghum halepense, Chenopodium album, Commelina diffusa, Conyza candensis, Digitaria sanguinalis та включають молекули, пов'язані з експресією поліпептиду, який визначається як EPSPS, що містить регуляторні молекули, кДНК, які містять кодуючі і некодуючі області гена EPSPS і його фрагментів, як показано в Таблиці 1. Крім того, кодуюча послідовність гена EPSPS, виділена з Agrobacterium tumefaciens, яка кодує стійкий до гліфосату фермент EPSPS і яка зазвичай використовується для отримання культурних рослин, стійких до гліфосату, показана в SEQ ID NO: 1 в Таблиці 1. Полінуклеотидні молекули екстрагують із цих видів рослин за допомогою стандартних для цієї галузі техніки способів, наприклад, тотальну РНК екстрагують із використанням реагенту Trizol (Invitrogen Corp, Карлсбад, штат Каліфорнія, Cat. No. 15596-018) з дотриманням фахівцями в галузі екстракції полінуклеотиду протоколу виробника або його модифікацій, що може поліпшити відновлення або чистоту екстрагованої РНК. Коротко, розпочинають із 1 граму подрібнених тканин рослини для екстракцїї. Розподіляють на аліквоти 10 мілілітрів (мл) реагенту Trizol у 15 мл конічні пробірки. Додають подрібнений порошок у пробірки і струшують, щоб гомогенізувати. Інкубують гомогенізовані зразки впродовж 5 хвилин (хв) при кімнатній температурі (КТ) та потім додають 3 мл хлороформу. Енергійно трясуть пробірку вручну впродовж 15-30 секунд (сек) і інкубують при КТ впродовж 3 хв. Центрифугують пробірку при 7000 оборотах за хвилину (об/хв) впродовж 10 хв при 4 °C. Переливають водну фазу в нову 1,5 мл пробірку і додають 1 об'єм холодного ізопропанолу. Інкубують зразки впродовж 20-30 хв при КТ і центрифугують при 10000 об/хв впродовж 10 хв при 4 °C. Промивають гранули 80 відсотковим етанолом Sigma-класу. Видаляють супернатант і швидко висушують гранули на повітрі. Розчиняють РНК гранулу приблизно у 200 мікролітрах води, очищеної діетилпірокарбонатом. Недовго нагрівають при 65 °C, щоб розчинити гранулу і перемішують на вортексі або відміряють піпеткою, щоб ресуспендувати РНК гранулу. Корегують концентрацію РНК до 1-2 мікрограмів/мікролітр. ДНК екстрагують за допомогою набору EZNA SP Plant DNA Mini kit (Omega Biotek, Норкросс, штат Джорджія, Cat#D5511) і пробірки Lysing Matrix E (Q-Biogen, Cat#6914) з дотриманням фахівцями в галузі екстракції полінуклеотиду протоколу виробника або його модифікацій, що може поліпшити відновлення або чистоту екстрагованої ДНК. Коротко, до аліквоти подрібненої тканини в пробірці Lysing Matrix E на сухому льоді додають 800 мкл Buffer SP1 в кожен зразок, гомогенізують за допомогою руйнуючого клітини міні-гомогенізатора типу beadbeater впродовж 35-45 сек, інкубують на льоду впродовж 45-60 сек, центрифугують при ≥ 14000 об/хв впродовж 1 хв при КТ, додають 10 мікролітрів РНКази А в лізат, інкубують при 65 °C впродовж 10 хв, центрифугують впродовж 1 хв при КТ, додають 280 мкл Buffer SP2 і вортекс у суміш, інкубують зразки на льоду впродовж 5 хв, центрифугують при ≥ 10000 об/хв впродовж 10 хв при КТ, 18 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переносять супернатант у колонку-гомогенізатор у 2 мл пробірці для збору зразків, центрифугують при 10000 об/хв впродовж 2 хв при КТ, переносять очищений лізат у 1,5 мл мікроцентрифужну пробірку, додають 1,5 об'єму Buffer SP3 до очищеного лізату, негайно перемішують на вортексі для отримання гомогенної суміші, переносять до 650 мкл супернатанту до колонки Hi-Bind, центрифугують при 10000 об/хв впродовж 1 хв, повторюють, застосовують 100 мкл 65 °C Elution Buffer до колонки, центрифугують при 10000 об/хв впродовж 5 хв при КТ. Секвенсори ДНК нового покоління, такі як 454-FLX (Roche, Бренфорд, штат Коннектікут), SOLiD (Applied Biosystems), а також Genome Analyzer (HiSeq2000, Illumina, Сан-Дієго, штат Каліфорнія) використовують, щоб забезпечити екстракцію з тканин рослини полінуклеотидної послідовності ДНК та РНК. Первинні дані збирають у контиги, як проілюстровано в Таблиці 1 та SEQ ID NO: 2-120. Послідовність контигів використовують для визначення тригерних молекул, які можуть застосовуватися до рослин, щоб дозволити регуляцію експресії генів. Приклад 2. Полінуклеотиди, що належать до тригерних молекул Послідовності генів та фрагментів із Таблиці 1 розділяють на довжини по 200 полінуклеотидів (200-мер) з 25 полінуклеотидними областями, що перекриваються (SEQ ID NO: 121-3222). Ці полінуклеотиди випробують, щоб вибрати найбільш ефективні тригерні області по усій довжині будь-якої послідовності-мішені. Тригерні полінуклеотиди виконують у вигляді смислової або антисмислової олДНК або олРНК, длРНК або длДНК, або длДНК/РНК гібридів і об'єднують з агентом перенесення на кремнійорганічній основі, щоб забезпечити створення полінуклеотидного препарату. Полінуклеотиди об'єднують у набори з від двох до трьох полінуклеотидів у наборі, використовуючи по 4-8 нмоль кожного полінуклеотиду. Кожен набір полінуклеотидів готують з агентом перенесення і застосовують до рослини або поля рослин у комбінації з гербіцидом, що містить гліфосат, або з подальшою обробкою гліфосатом на перший-третій день після застосування полінуклеотиду, щоб визначити вплив на сприйнятливість рослини до гліфосату. Вплив визначають як затримку росту і/або загибель рослини та визначають на 8-14 день після обробки набором полінуклеотиду і гліфосатом. Виявляють найбільш ефективні набори і випробовують окремі полінуклеотиди тими ж способами, як і набори та виявляють окремий 200-мерний найбільш ефективний полінуклеотид. 200-мерну послідовність розділяють на дрібніші послідовності з 50-70-мерних областей із 10-15 полінуклеотидними областями, що перекриваються, і випробовують полінуклеотиди в індивідуальному порядку. Найбільш ефективний 50-70-мерний полінуклеотид додатково розділяють на дрібніші послідовності з 25-мерних областей із 12-13 полінуклеотидними областями, що перекриваються, і випробовують на ефективність у комбінації з обробкою гліфосатом. За допомогою цього способу можна визначити олігонуклеотид або декілька олігонуклеотидів, які є найбільш ефективними тригерними молекулами для впливу на сприйнятливість рослини до гліфосату або на модуляцію експресії гена EPSPS. Модуляцію експресії гена EPSPS визначають за допомогою виявлення міРНК молекул EPSPS, характерних для гена EPSPS, або за допомогою вивчення зменшення кількості РНК-транскрипту EPSPS, що виробляється, порівняно з необробленою рослиною, або за допомогою простого вивчення очікуваного фенотипу застосування тригеру з гербіцидом, що містить гліфосат. Виявити міРНК можна, наприклад, з використанням наборів, таких як mirVana (Ambion, Остін, штат Техас) і mirPremier (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, штат Міссурі). Послідовності генів та фрагментів із Таблиці 1 порівнюють та виявляють 21-мерні безперервні полінуклеотиди з гомологією по усіх різних послідовностях гена EPSPS (SEQ ID NO: 1-120). Мета полягає в тому, щоб визначити тригерні молекули, які застосовуються в якості гербіцидних молекул або в комбінації з гербіцидом гліфосат підвищують ефективність боротьби з бур'янами в широкому діапазоні бур'янистих видів, включаючи біотипи бур'янів, стійкі до гліфосату. SEQ ID NO: 3223-3542 показує 21-мери, які присутні в гені EPSPS щонайменше восьми видів бур'янів із Таблиці 1. Передбачається, що додаткові 21-мер можна обрати з послідовностей Таблиці 1, які є характерними для одного виду бур'янів або декількох видів бур'янів у межах роду, або тригерних молекул, які складаються із щонайменше 18 безперервних нуклеотидів, щонайменше 19 безперервних нуклеотидів, щонайменше 20 безперервних нуклеотидів або щонайменше 21 безперервних нуклеотидів у довжину і щонайменше на 85 відсотків ідентичні послідовності гена EPSPS, обраної із групи, яка складається з SEQ ID NO: 1120 або їх фрагмента. 21-мерні олігонуклеотиди об'єднують в набір з 6-12 олігонуклеотидів та випробовують на ефективність проти широкого спектру видів бур'янів, в яких олігонуклеотид практично ідентичний або практично комплементарний до послідовності гена EPSPS в геномі видів бур'янів. Ефективні набори розділяють на менші набори з 2-3 олігонуклеотидів та випробовують на ефективність. Кожен набір полінуклеотидів готують разом з агентом 19 UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перенесення та застосовують до рослини або поля рослин в комбінації з гербіцидом, що містить гліфосат, або з подальшою обробкою гліфосатом на перший-третій день після застосування олігонуклеотиду, щоб визначити вплив на сприйнятливість рослини до гліфосату. Вплив визначають як затримку росту і/або знищення рослини та визначають на 8-14 день після обробки набором полінуклеотиду і гліфосатом. За допомогою цього способу можна визначити олігонуклеотид або декілька олігонуклеотидів, які є найбільш ефективними тригерними молекулами для впливу на сприйнятливість рослини до гліфосату або на модуляцію експресії гена EPSPS. Модуляцію експресії гена EPSPS визначають шляхом виявлення міРНК молекул EPSPS, характерних для гена EPSPS, або шляхом вивчення зменшення кількості РНК-транскрипту EPSPS, що виробляється, порівняно з необробленою рослиною. Виявити міРНК можна, наприклад, з використанням наборів, таких як mirVana (Ambion, Остін, штат Техас) і mirPremier (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, штат Міссурі). Приклад 3. Способи, пов'язані з обробкою рослин або частин рослин сумішшю з модифікованих тригерних молекул олігонуклеотиду для зовнішньої обробки. Одноланцюгові або дволанцюгові фрагменти ДНК або РНК у смисловій або антисмисловій орієнтації, або і ті, і інші визначають та змішують з агентом перенесення та іншими компонентами в композиції. Цю композицію місцево наносять на рослини для здійснення експресії генів-мішеней EPSPS у вказаної рослині, щоб отримати бажаний ефект відносно росту або розвитку рослини. У цьому прикладі вирощувані рослини Amaranthus palmeri обробляють місцево нанесеною композицією для стимулювання модуляції гена-мішені в рослині, яка містить: (а) агент для кондиціонування рослини з метою проникнення полінуклеотидів та (б) полінуклеотиди, які містять щонайменше один полінуклеотидний ланцюг, що складається щонайменше з одного сегменту з 17-25 безперервних нуклеотидів гена-мішені в антисмисловій (AS), або в смисловій (S) орієнтації. Рослини Amaranthus palmeri обробляють шляхом місцевого нанесення растворуад'юванту, що містить длРНК, олДНК та ДНК/РНК гібридні полінуклеотиди, показані у Таблиці 2 (SEQ ID NO: 3544-3587, відповідно), практично гомологічні або практично комплементарні кодуючій послідовності EPSPS Amaranthus palmeri. Полінуклеотидні послідовності тригерних молекул, які використовують при кожній обробці, показані в стовпці 2. В тригерні молекули 5.2РНК-M1 - 5.2-РНК-M6 вводять заміни нуклеотидів (n) відносно 5.2.РНК-wt (дикий тип). Тип полінуклеотиду для кожного тригера показаний в стовпці 3, його довжина - в стовпці 4, а спостережувані результати - в стовпці 5. Результати виражені у вигляді відносного виміру активності; під час біопроби олігонуклеотид, який вивчали, був або активним, менш активним, або неактивним. Тригерну послідовність визначають, щоб виявити промотор EPSPS у стійкої до гліфосату Amaranthus palmeri та проводять випробування з метою визначення деяких напрямів діяльності тригеру, визначеного як AS83 (SEQ ID NO: 3670). Послідовність тригеру виконують як олДНК, длДНК або длРНК та випробовують різні 3' та 5' делеції AS83 разом з внутрішніми замінами нуклеотидів. Наступну процедуру використовують для усіх аналізів, описаних в цьому прикладі. У цьому аналізі використовують приблизно чотиритижневі рослини Amaranthus palmeri (щириця Палмера, стійка до гліфосату, "R-22"). Рослини обробляють свіжоприготованим розчином 0,1 % Silwet L-77 з ddH2O. Два листа рослини, що повністю розкрилися (один на стадії сім'ядолі, один справжній лист) обробляють розчином полінуклеотид/Silwet L-77. Кінцева концентрація для кожного олігонуклеотиду або полінуклеотиду складає 25 мкм (у 0,01 % Silwet L-77, 5 мкм фосфатного буферу, рН 6,8), якщо не вказане інше. Двадцять мікролітрів розчину наносять на верхню поверхню кожного з двох заздалегідь оброблених листів, щоб забезпечити в цілому 40 мкл (1 нмоль олігонуклеотиду або полінуклеотиду) для кожної рослини. Розчин для розпилення готують в день розпилення. Поодинокі молекули олігонуклеотиду, показані в Таблиці 2 та Таблиці 4, при нормі від 0,04 до 0,18 мг/мл в 20 мкм калій-фосфатного буферу (рН 6,8) додають до розчину для розпилення за 15-50 хвилин перед розпиленням. Розчин для розпилення в концентрації один до двох мл наносять за допомогою призначеного для користувача розпилювача з малим мертвим об'ємом (мілі-аппликатор) при витратах 8-30 галон/акр на рослини заввишки 1-4 дюйми. Оброблені рослини поміщають в теплицю при 26.7/21.1C або при 29.4/21.1C 14/10 годинній температурі і додатковому графіку світлового дня. Кількість реакцій в порівнянні з необробленими шляхом розпилення рослинами збирають з різним часовим інтервалом аж до 21 дня після обробки. За умовчанням під час усіх обробок до самохідного обприскувача кріплять розпорошувальний наконечник, а саме Turbo Teejet з плоскоструминним наконечником (015) з 2 технологією всмоктування повітря при мінімальному тиску 20 фунтів/дюйм (160 кПа). 20 UA 115534 C2 5 10 15 20 Розпорошувальний наконечник розміщують на висоті 16-18 дюймів над верхньою частиною рослинного матеріалу. Обробку проводять, коли рослини досягають бажаного розміру, висоти або стадії листя. Норму внесення обирають так, щоб рівень контролю за рослинами досягав 50 % при мінімальному і до 90 % при максимальному рівні контролю. Норми при такому рівні контролю забезпечують найкращі можливі порівняльні характеристики по ефективності серед композицій, дозволяючи розділяти відносні показники зразків. Норма гліфосату, який використовують під час цих випробувань, як правило, залишається незмінною - 1680 грамів кислотного еквіваленту на гектар (г ке/га). В окремих випадках залежно від цілей випробування можуть знадобитися нижчі або вищі норми. Структура норм внесення, яка використовується для цього випробування, залежатиме від умов довкілля під час нанесення спрею (пора року), виду рослини, яка підлягає обробці (дуже сприйнятлива або стійка) та вік (чи розмір) рослин, які підлягають обробці. Ці результати, проілюстровані в Таблиці 2, показують, що длРНК, длДНК та олДНК були ефективними олігонуклеотидними тригерними молекулами щодо активності проти кодуючої і некодуючої (промотор) послідовності екзону гена EPSPS. Як правило, в 21-мерній або біля 85 відсоткової гомології послідовностей допускають невідповідність трьох основ; виявилось, що активність олігонуклеотидів коротших за 21 була найменшою в цьому аналізі. Інші модифікації, такі як додавання деяких 3' синтетичних нуклеотидів (ddC та IdT), не допускають в цьому біоаналізі. Таблиця 2 Різні типи полінуклеотидів і модифіковані гомології послідовностей 5.2-РНК-wt 5.2-ДНК-wt 2. Послідовність (АС ланцюг, якщо не вказане інше) GTC ATA GCA ACA TCT GGC ATT GTC ATA GCA ACA TCT GGC ATT длРНК длДНК 5.2-олДНК-S AAT GCC AGA TGT TGC TAT GAC олДНК 5.2-олДНК-AS GTC ATA GCA ACA TCT GGC ATT олДНК 5.2-сДНК/asРНК GTC ATA GCA ACA TCT GGC ATT 5.2-asДНК/сРНК GTC ATA GCA ACA TCT GGC ATT 5.2-РНК-5'-20 TC ATA GCA ACA TCT GGC ATT 5.2-РНК-5'-19 C ATA GCA ACA TCT GGC ATT длРНК 19 5.2-РНК-5'-18 5.2-РНК-M1 5.2-РНК-M2 5.2-РНК-M3 ATA GCA ACA TCT GGC ATT GTC ATA GCA ACA TCT GGC ATa GTC ATA GCA ACA TCT GGC Aaa GTC ATA GCA AgA TCT GGC ATT длРНК длРНК длРНК длРНК 18 21 21 21 5.2-РНК-M4 GTC ATA GCA tgt TCT GGC ATT длРНК 21 5.2-РНК-M5 5.2-РНК-M6 5.2-РНК-3'ddC 5.2-РНК-3'IdT 3' Аналіз делецій AS83-ДНК-25-wt AS83-ДНК-24-3'D AS83-ДНК-23-3'D AS83-ДНК-22-3'D AS83-ДНК-21-3'D AS83-ДНК-20-3'D AS83-ДНК-19-3'D AS83-ДНК-18-3'D GTC Aat GCA ACA TCT GGC ATT GTC ATA GCA ACA TCT ccC ATT GTC ATA GCA ACA TCT GGC ATT-3'ddC GTC ATA GCA ACA TCT GGC ATT-3'IdT длРНК длРНК длРНК длРНК CTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA ATT T CTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA ATT CTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA AT CTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA A CTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA CTC TTT GTT TTT CTT CTG CC CTC TTT GTT TTT CTT CTG C CTC TTT GTT TTT CTT CTG олДНК олДНК олДНК олДНК олДНК олДНК олДНК олДНК 1. Ім'я Оліго 21 3. Тип ДНК/РНК гібрид ДНК/РНК гібрид длРНК 4. Дов5. Активність жина 21 активний 21 активний менш 21 активний менш 21 активний 21 неактивний 21 неактивний 20 21 21 22 22 активний менш активний неактивний активний активний неактивний менш активний активний активний неактивний неактивний 25 24 23 22 21 20 19 18 активний активний активний активний активний активний неактивний неактивний UA 115534 C2 Таблиця 2 Різні типи полінуклеотидів і модифіковані гомології послідовностей 2. Послідовність (АС ланцюг, якщо не вказане інше) CTC TTT GTT TTT CTT CT олДНК TCT TTG TTT TTC TTC TGC CAA TTT CTT TGT TTT TCT TCTGCC AAT TT TTT GTT TTT CTT CTG CCA ATT T TTG TTT TTC TTC TGC CAA TTT TTG TTT TTC TTC TGC CAA TT олДНК олДНК олДНК олДНК олДНК 24 23 22 21 20 AS83-ДНК-19-5'D TTG TTT TTC TTC TGC CAA T олДНК 19 AS83-ДНК-18-5'D AS83-ДНК-17-5'D Аналіз замін TTG TTT TTC TTC TGC CAA TTG TTT TTC TTC TGC CA олДНК олДНК 18 17 AS83-ДНК-5'M1 gTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA ATT T олДНК 25 AS83-ДНК-5'M2 gaC TTT GTT TTT CTT CTG CCA ATT T олДНК 25 AS83-ДНК-M3 CTC TTT GTT TTT gTT CTG CCA ATT T олДНК 25 AS83-ДНК-M4 CTC TTT GTT TTa gaT CTG CCA ATT T олДНК 25 AS83-ДНК-M5 CTC TTT caa TTT CTT CTG CCA ATT T олДНК 25 AS83-ДНК-M6 CTC TTT GTT TTT CTT Cac gCA ATT T олДНК 25 AS83-ДНК-3'M1 CTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA ATT a олДНК 25 олДНК 25 менш активний менш активний менш активний менш активний менш активний менш активний менш активний неактивний олДНК 26 неактивний олДНК 26 неактивний 1. Ім'я Оліго AS83-ДНК-17-3'D 5' Аналіз делецій AS83-ДНК-24-5'D AS83-ДНК-23-5'D AS83-ДНК-22-5'D AS83-ДНК-21-5'D AS83-ДНК-20-5'D AS83-ДНК-3'M2 CTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA ATa a CTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA ATT TAS83-ДНК-3'ddC 3'ddC CTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA ATT TAS83-ДНК-3'InvdT 3'InvdT 5 10 15 20 3. Тип 4. Дов5. Активність жина 17 неактивний активний активний активний активний активний менш активний неактивний неактивний Приклад 4. Визначення ефективних тригерних полінуклеотидів Один необмежуючий приклад способу вибору полінуклеотиду для використання в композиції для місцевого нанесення на поверхню вихідної рослини включає картування ефективних олігонуклеотидних або полінуклеотидних послідовностей (чи сегментів послідовностей) за допомогою аналізу на мікрочіпах із зондами, що покривають цілий ген (чи повнорозмірну стандартну послідовність). Доступні повнорозмірні стандартні послідовності ділять на "послідовності, що перекриваються" або сегменти з 25 послідовних нуклеотидів уздовж усієї довжини доступної послідовності. Для зручності розробляють шаблон Excel з метою забезпечення зручної генерації смислових та антисмислових послідовностей, що перекриваються для будь-якої заданої повнорозмірної стандартної послідовності, який забезпечує отримання списку смислових та антисмислових послідовностей, та який надають компаніям, які займаються синтезом олігонуклеотидів, таким як IDT (Integrated DNA Technologies, Коралвіль, штат Айова). Олігонуклеотиди, які відповідають кожній 25-мерній послідовності, яка перекриваються (у смисловій, антисмисловій або і смисловій, і антисмисловій орієнтації), синтезують для ефективного скринінгу. Скринінг олігонуклеотидів проводиться в наборах. Фахівцям в цій області техніки очевидно, що розмір послідовностей, що перекриваються може бути відмінним від 25 нуклеотидів (наприклад, бути близько 18, 19, 20, 21, 22, 23 або 24 нуклеотидів, або більше 25 нуклеотидів), що ці послідовності, що перекриваються можуть бути безперервними сегментами без перекриття або перекривати суміжні сегменти і що такі послідовності, що перекриваються можуть бути згруповані в набори будь-якого розміру. Наприклад, набори з п'яти окремих олігонуклеотидів об'єднують в єдину 22 UA 115534 C2 5 10 15 композицію полінуклеотидів з використанням 20 мкм фосфатного буферу і 2 % маса/об'єм сульфату амонію, і 1 % Silwet L-77, і місцево наносять на рослини при нормі, яка ефективна для виду-мішені рослини (наприклад, 4 нмоль на рослину). Потім повторно проводять скринінг цих олігонуклеотидних наборів, які демонструють кращу ефективність, за допомогою випробування окремих компонентів олігонуклеотидів на ефективність. Конкретний приклад вибору полінуклеотиду для використання в композиції для місцевого нанесення на поверхню вихідної рослини виглядає таким чином. EPSPS промотор 1302 нуклеотидної послідовності визначають з геномної послідовності щириці Палмера (Amaranthus palmeri) так, як якби послідовність була SEQ ID NO: 3543. В цьому прикладі використовують 1152 сегмент нуклеотиду з 1302 промоторної нуклеотидної послідовності EPSPS. 1152-нт промоторну послідовність EPSPS "перекривають" (тобто повнорозмірну послідовність перекривають коротшими послідовностями) 25-мерними антисмисловими (AS) і смисловими (S) олДНК. В цілому 96 25-мерних олігонуклеотидів олДНК розробляють та групують в 16 набори з 6 олДНК олігонуклеотидів кожен (кожен набір покриває 150 безперервних нуклеотидів промоторної послідовності). Олігонуклеотиди синтезують за допомогою IDT в 96-лунковій плашці. Олігонуклеотидні послідовності надані в Таблиці (SEQ ID NO: 3588-3779). Олігонуклеотиди в цьому наборі складаються з шести безперервних послідовностей (відповідно до їх положення у рамках 1152-нт повнорозмірної послідовності), в яких кожен нуклеотид не перекриває суміжний олігонуклеотид(и). 20 Таблиця 3 Полінуклеотиди для виявлення промотору EPSPS щириці Палмера Ім'я AS1 AS2 AS3 AS4 AS5 AS6 AS7 AS8 AS9 AS10 AS11 AS12 AS13 AS14 AS15 AS16 AS17 AS18 AS19 AS20 AS21 AS22 AS23 AS24 AS25 AS26 AS27 AS28 AS29 AS30 AS31 AS32 AS33 Антисмислова послідовність cgaatcaaaggaaaaagttatccaa aataatccgattcgaatcaaaggaa tactgtattaaaaataatccgattc atcagttcataatactgtattaaaa cactttcattaaatcagttcataat tgaaacttcctccactttcattaaa aactttaaaaattgaaacttcctcc cattacacctacaactttaaaaatt aaaatgagaaaacattacacctaca actttcatatccaaaatgagaaaac gaaacttcctccactttcatatcca tgattcgaaattgaaacttcctcca aactggcaaacatgattcgaaattg attcattgaatcaactggcaaacat atttccaagagcattcattgaatca gaactcttggtcatttccaagagca acaagaagccttgaactcttggtca aaatgttttataacaagaagccttg agatcaaaattgaaatgttttataa tagttcattcttagatcaaaattga ttaagttctaaatagttcattctta aatttaattactttaagttctaaat gttataactaataatttaattactt atttttttataagttataactaata ggttaaaattgaatttttttataag ttataaatttaaggttaaaattgaa taaggtcataatttataaatttaag acttgatctttttaaggtcataatt tatgcgttcaatacttgatcttttt aatttttctaaatatgcgttcaata aagccgaattataatttttctaaat tatgagactgataagccgaattata agaccgtctcaatatgagactgata SEQ ID NO: 3588 3589 3590 3591 3592 3593 3594 3595 3596 3597 3598 3599 3600 3601 3602 3603 3604 3605 3606 3607 3608 3609 3610 3611 3612 3613 3614 3615 3616 3617 3618 3619 3620 23 Ім'я S_1 S_3 S_5 S_7 S_9 S_11 S_2 S_4 S_6 S_8 S_10 S_12 S_13 S_15 S_17 S_19 S_21 S_23 S_14 S_16 S_18 S_20 S_22 S_24 S_25 S_27 S_29 S_31 S_33 S_35 S_26 S_28 S_30 Смислова послідовність ttggataactttttcctttgattcg gaatcggattatttttaatacagta attatgaactgatttaatgaaagtg ggaggaagtttcaatttttaaagtt tgtaggtgtaatgttttctcatttt tggatatgaaagtggaggaagtttc ttcctttgattcgaatcggattatt ttttaatacagtattatgaactgat tttaatgaaagtggaggaagtttca aatttttaaagttgtaggtgtaatg gttttctcattttggatatgaaagt tggaggaagtttcaatttcgaatca caatttcgaatcatgtttgccagtt tgattcaatgaatgctcttggaaat tgaccaagagttcaaggcttcttgt ttataaaacatttcaattttgatct taagaatgaactatttagaacttaa aagtaattaaattattagttataac atgtttgccagttgattcaatgaat tgctcttggaaatgaccaagagttc caaggcttcttgttataaaacattt tcaattttgatctaagaatgaacta atttagaacttaaagtaattaaatt tattagttataacttataaaaaaat cttataaaaaaattcaattttaacc cttaaatttataaattatgacctta aaaaagatcaagtattgaacgcata atttagaaaaattataattcggctt tatcagtctcatattgagacggtct Tcgtccaagacaagttgtatcattt ttcaattttaaccttaaatttataa aattatgaccttaaaaagatcaagt tattgaacgcatatttagaaaaatt SEQ ID NO: 3684 3686 3688 3690 3692 3694 3685 3687 3689 3691 3693 3695 3696 3698 3700 3702 3704 3706 3697 3699 3701 3703 3705 3707 3708 3710 3712 3714 3716 3718 3709 3711 3713 UA 115534 C2 Таблиця 3 Полінуклеотиди для виявлення промотору EPSPS щириці Палмера Ім'я AS34 AS35 AS36 AS37 AS38 AS39 AS40 AS41 AS42 AS43 AS44 AS45 AS46 AS47 AS48 AS49 AS50 AS51 AS52 AS53 AS54 AS55 AS56 AS57 AS58 AS59 AS60 AS61 AS62 AS63 AS64 AS65 AS66 AS67 AS68 AS69 AS70 AS71 AS72 AS73 AS74 AS75 AS76 AS77 AS78 AS79 AS80 AS81 AS82 AS83 AS84 AS85 Антисмислова послідовність Ttgtcttggacgagaccgtctcaat aaatgatacaacttgtcttggacga atttgattatataaatgatacaact actcataattatatttgattatata ctacatgaatacactcataattata taaagttgaaacctacatgaataca tcacctaggctttaaagttgaaacc acaacatatctttcacctaggcttt cacaaagatgctacaacatatcttt taggctgactttcacaaagatgcta agaaccaagttataggctgactttc cttcaaaattttagaaccaagttat tatatggttatgcttcaaaatttta aattcgagggactatatggttatgc acaacttgaatgaattcgagggact aaagtaaattggacaacttgaatga ggcaagtataaaaaagtaaattgga aaatgttgtctcggcaagtataaaa attaagggtttaaaatgttgtctcg ttaattagaaatattaagggtttaa ttttaattaagattaattagaaata aattttcataatttttaattaagat ttattaatatcaaattttcataatt tcaatacaaagattattaatatcaa gttaaattcgtttcaatacaaagat atgtgagatcttgttaaattcgttt taaaacatagtcatgtgagatcttg taatctataagttaaaacatagtca ttgtattttttttaatctataagtt atcactcttaatttgtatttttttt cactattcacttatcactcttaatt tttgttttggggcactattcactta taagttgtcccatttgttttggggc ctccaattcatctaagttgtcccat acctaatattacctccaattcatct agatcacttgctacctaatattacc tgatcacttgctagatcacttgcta ttgatgttaaagtgatcacttgcta aagtgatcaattttgatgttaaagt atttgaacctataagtgatcaattt gtaaaagtttcaatttgaacctata atatcaattaaagtaaaagtttcaa tagtatttaaacatatcaattaaag ttcaatttaaagtagtatttaaaca aaaaatatcaatttcaatttaaagt aattttgaccttaaaaatatcaatt cttaaaggtttcaattttgacctta ttcaattataatcttaaaggtttca cttctgccaattttcaattataatc ctctttgtttttcttctgccaattt cttatattctttctctttgtttttc caatttgcgtgtcttatattctttc SEQ ID NO: 3621 3622 3623 3624 3625 3626 3627 3628 3629 3630 3631 3632 3633 3634 3635 3636 3637 3638 3639 3640 3641 3642 3643 3644 3645 3646 3647 3648 3649 3650 3651 3652 3653 3654 3655 3656 3657 3658 3659 3660 3661 3662 3663 3664 3665 3666 3667 3668 3669 3670 3671 3672 24 Ім'я S_32 S_34 S_36 S_37 S_39 S_41 S_43 S_45 S_47 S_38 S_40 S_42 S_44 S_46 S_48 S_49 S_51 S_53 S_55 S_57 S_59 S_50 S_52 S_54 S_56 S_58 S_60 S_61 S_63 S_65 S_67 S_69 S_71 S_62 S_64 S_66 S_68 S_70 S_72 S_73 S_75 S_77 S_79 S_81 S_83 S_74 S_76 S_78 S_80 S_82 S_84 S_85 Смислова послідовність tataattcggcttatcagtctcata attgagacggtctcgtccaagacaA Agttgtatcatttatataatcaaat Tatataatcaaatataattatgagt Tgtattcatgtaggtttcaacttta Aaagcctaggtgaaagatatgttgt Tagcatctttgtgaaagtcagccta Ataacttggttctaaaattttgaag Gcataaccatatagtccctcgaatt Tataattatgagtgtattcatgtag Ggtttcaactttaaagcctaggtga Aaagatatgttgtagcatctttgtg Gaaagtcagcctataacttggttct Taaaattttgaagcataaccatata Agtccctcgaattcattcaagttgt Tcattcaagttgtccaatttacttt Ttttatacttgccgagacaacattt Ttaaacccttaatatttctaattaa Atcttaattaaaaattatgaaaatt Ttgatattaataatctttgtattga Aaacgaatttaacaagatctcacat Tccaatttacttttttatacttgcc Cgagacaacattttaaacccttaat Tatttctaattaatcttaattaaaa Aattatgaaaatttgatattaataa Atctttgtattgaaacgaatttaac Caagatctcacatgactatgtttta Tgactatgttttaacttatagatta Aaaaaaaatacaaattaagagtgat Taagtgaatagtgccccaaaacaaa Atgggacaacttagatgaattggag Ggtaatattaggtagcaagtgatct Tagcaagtgatcactttaacatcaa Aacttatagattaaaaaaaatacaa Aattaagagtgataagtgaatagtg Gccccaaaacaaatgggacaactta Agatgaattggaggtaatattaggt Tagcaagtgatctagcaagtgatca Actttaacatcaaaattgatcactt Aaattgatcacttataggttcaaat Ttgaaacttttactttaattgatat Tgtttaaatactactttaaattgaa Aattgatatttttaaggtcaaaatt Tgaaacctttaagattataattgaa Aaattggcagaagaaaaacaaagag Tataggttcaaattgaaacttttac Ctttaattgatatgtttaaatacta Actttaaattgaaattgatattttt Taaggtcaaaattgaaacctttaag Gattataattgaaaattggcagaag Gaaaaacaaagagaaagaatataag Gaaagaatataagacacgcaaattg SEQ ID NO: 3715 3717 3719 3720 3722 3724 3726 3728 3730 3721 3723 3725 3727 3729 3731 3732 3734 3736 3738 3740 3742 3733 3735 3737 3739 3741 3743 3744 3746 3748 3750 3752 3754 3745 3747 3749 3751 3753 3755 3756 3758 3760 3762 3764 3766 3757 3759 3761 3763 3765 3767 3768 UA 115534 C2 Таблиця 3 Полінуклеотиди для виявлення промотору EPSPS щириці Палмера Ім'я AS86 AS87 AS88 AS89 AS90 AS91 AS92 AS93 AS94 AS95 AS96 5 10 15 20 25 30 Антисмислова послідовність agtagatcggtacaatttgcgtgtc aattgaaataagagtagatcggtac agaccgtctcaaaattgaaataaga tagtcttgggcgagaccgtctcaaa tgaccgaacatctagtcttgggcga gttggtgtaggatgaccgaacatct gaattttttggggttggtgtaggat gactttgttgttgaattttttgggg gaatcattataagactttgttgttg gtagattagagggaatcattataag gtgtagactgtagtagattagaggg SEQ ID NO: 3673 3674 3675 3676 3677 3678 3679 3680 3681 3682 3683 Ім'я S_87 S_89 S_91 S_93 S_95 S_86 S_88 S_90 S_92 S_94 S_96 Смислова послідовність Gtaccgatctactcttatttcaatt Tttgagacggtctcgcccaagacta Agatgttcggtcatcctacaccaac Ccccaaaaaattcaacaacaaagtc Cttataatgattccctctaatctac Gacacgcaaattgtaccgatctact Tcttatttcaattttgagacggtct Tcgcccaagactagatgttcggtca Atcctacaccaaccccaaaaaattc Caacaacaaagtcttataatgattc Ccctctaatctactacagtctacac SEQ ID NO: 3770 3772 3774 3776 3778 3769 3771 3773 3775 3777 3779 Набори олігонуклеотидів з парним номером n містять олігонуклеотиди з послідовністю, яка зсунута на 12 або 13 нуклеотидів (нт) відносно 3'-кінця олігонуклеотидів в наборі з номером (n 1). Наприклад, олігонуклеотидна послідовність в наборі 2 зсунута на 12 або 13 нт відносно 3'кінця олігонуклеотидів в наборі 1. З олігонуклеотидів олДНК складають 100 мкмоль (на олігонуклеотид) суміші (кожна з яких містить набір з 6 олігонуклеотидів) в 20 ммоль фосфатного буферу (рН 7,0), 2 % сульфату амонію, 1 % Silwet® L-77 та вручну наносять шляхом піпетки на поверхню чотирьох вихідних листів, що повністю розкрилися, щириці Палмера (Amaranthus palmeri R-22), стійкої до гліфосату. Кожен лист отримав 10 мкл 100 мікромолярного розчину олДНК (по 1 нмоль олігонуклеотиду на лист, в цілому 4 нмоль олігонуклеотиду на одно рослину). Буфер, що містить Silwet, без олігонуклеотидів застосовують як негативну регуляцію. Композицію з чотирьох EPSPS коротких длРНК1, 3, 4 та 5 (дивися Приклад 6) застосовують при 4 нм кожного олігонуклеотиду на рослину як позитивну регуляцію. Потім рослини Палмера обприскують 2X WeatherMAX (1,5 фунт ке/акр) на 2-3 день після обробки олігонуклеотидами. Перший етап випробувань ефективності показав, що набори 8 та 13 здійснюють кращий гербіцидний контроль за щирицею Палмера (як при смислових, так і при антисмислових ланцюгах). Другий етап випробувань ефективності, на якому використовують 12 індивідуальних олігонуклеотидів в наборах 8 та 13, показав, що п'ять індивідуальних олДНК олігонуклеотидів, пронумеровані як 44, 48, 79, 81 та 83, здійснюють кращий гербіцидний контроль за щирицею Палмера, ніж інші сім олДНК олігонуклеотидів. Ці п'ять олДНК олігонуклеотидів індивідуально випробовують на 16 нмоль/рослина з подальшою обробкою 2X WMax на рослинах Палмера R22. Оброблену щирицю Палмера спостерігають десять днів після обробки і показують, що олДНК олігонуклеотиди під номерами 79 (SEQ ID NO: 3666), 81 (SEQ ID NO: 3668) та 83 (SEQ ID NO: 3670) здійснюють 95, 98 та 99 відсотковий контроль відповідно при використанні в комбінації з длРНК5 (EPSPS) і длРНКTIF1 (SEQ ID NO: 3780). Проводять додаткове експериментальне випробування AS83 тригеру, який виявляє промотор EPSPS в рослині Палмера R-22, де AS83 тригер використовують для створення олДНК, длРНК (SEQ ID NO: 3789) та длДНК. Ці AS83 молекули випробовують, як описано в Прикладі 3, а результати, показані в Таблиці 4, визначають, що усі молекулярні форми AS83 були активними під час надання рослині Палмера R-22 сприйнятливості до гліфосату. Таблиця 4 EPSPS промотор AS83 тригерних молекул Ім'я Оліго AS83-ДНК-wtAS83-РНК-wtAS83-ДНК-blunt Послідовність (AS/нижній ланцюг) CTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA ATT T CUC UUU GUU UUU CUU CUG CCA AUU U CTC TTT GTT TTT CTT CTG CCA ATT T Приклад 5 25 Тип олДНК длРНК длДНК Розмір Активність 25 активний 25 активний 25 активний UA 115534 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перекриття тригерних олігонуклеотидів здійснюють на EPSPS кодуючої області щириці Палмера, використовуючи аналогічний протокол випробувань, як описано в Прикладі 3. У цьому випробуванні приблизно 700 пар основ кодуючої області використовують, щоб вибрати 46 індивідуальних антисмислових олДНК олігонуклеотидів, кожен завдовжки у 25 нуклеотидів. Їх застосовують до щириці Палмера (R-22) при 12 нмоль олігонуклеотиду на рослину, а потім, через 2 дні після обробки олігонуклеотидами, обробляють за допомогою 2X WeatherMax. Оцінюють вплив гліфосату на зростання рослини. Як проілюстровано на Фіг. 1, в кодуючій послідовності визначають дві області, в яких багато тригерних молекул змогли забезпечити фенотип сприйнятливості до гліфосату обробленим рослинам, вони показані на Фіг. 1 блоками. 5'-область (Область 1, SEQ ID NO: 3787) містить приблизно 150 нуклеотидів та знаходиться між антисмисловою оліго 34 (SEQ ID NO: 3781) і оліго 57 (SEQ ID NO: 3782), а 3'-область (Область 2, SEQ ID NO: 3788) містить приблизно 100 нуклеотидів та знаходиться між антисмисловою оліго 32 (SEQ ID NO: 3783) і оліго 36 (SEQ ID NO: 3784). Тригери разом з гліфосатом забезпечили 30-70 відсотковий і 25-45 відсотковий контроль в 5'-області та в 3'-області, відповідно. Додаткові тригерні полінуклеотиди в цих областях включають оліго 81 (SEQ ID NO: 3785) і оліго 95 (SEQ ID NO: 3786). Передбачається, що в цих областях можна визначити додаткові тригерні молекули, а комбінації тригерів були б корисні для забезпечення високого рівня сприйнятливості до гліфосату. Приклад 6. Вплив на трансгенні рослини, стійкі до гербіцидів Цей приклад демонструє, що місцеву обробку із застосуванням тригерної молекули полінуклеотиду можна використати, щоб зробити трансгенні культури, стійкі до гербіцидів, сприйнятливими до гербіциду, до якого у них була вироблена стійкість. В цьому прикладі дві тригерні молекули длРНК, позначені як CP4-12 (82-462 з SEQ ID NO: 1) з 381 полінуклеотиду і CP4-34 (594-1043 з SEQ ID NO: 1) з 450 полінуклеотидів, були спрямовані на кодуючу послідовність гена для Agrobacterium tumefaciens CP4 EPSPS (SEQ ID NO: 1). Кукурудзу і бавовник, які були трансформовані геном CP4 EPSPS і є стійкими до гліфосату, саджають в горщики в теплиці паралельно з рослинами ізоліній, негативних за цією ознакою, і вирощують до стадії появи першого справжнього листа, потім обробляють тригерним розчином, який містить 0,5 % Silwet L77, 2 % сульфату амонію, 20 мМнатрій-фосфатного буферу (рН 6,8) при різній нормі змісту тригеру - 0 пікомоль (пмоль), 210 пмоль, 630 пмоль і 1890 пмоль. Для кожної повторної обробки (8-10 рослин) дві сім'ядолі, що повністю розкрилися, обробляють шляхом капання піпеткою 50 мікролітрів тригерного розчину на кожну з них, потім через 2-3 дні обприскують 1,5 фунт ке/акр RoundUp™ Ultra (гліфосат, Monsanto, Сент-Луїс, Міссурі). Бавовник і кукурудзу оцінюють на затримку зростання і ушкодження на 7-16 день після обприскування. На Фіг. 2 і 3 проілюстровані результати по кукурудзі і бавовнику, відповідно. На Фіг. 2 проілюстрована кількість оброблених рослин кукурудзи, у яких після обробки тригерними полінуклеотидами і гліфосатом на фоні гліфосату з'явилися ушкодження, які проявилися у вигляді усохлого або пошкодженого верхівкового листя на 2-4 день після обробки RoundUp і затримки в зростанні, яка стала очевидною на 7-14 день після обробки RoundUp. Нетрансгенний контроль маркують як "Minus CP4"; ця рослина загинула через обробку RoundUp. Фіг. 3 ілюструє результати по бавовнику, стійкому до гліфосату, який обробляють тригерними полінуклеотидами та гліфосатом, що призвело до сильного уповільнення росту та загибелі апікальної меристеми бавовника. Ці результати показують, що місцева обробка тригерним полінуклеотидом може використовуватися для впливу на ознаку стійкості до гербіциду у трансгенних рослин, стійких до гербіцидів. Приклад 7. Поліпшення шляхом додавання гербіцидів, що не містять EPSPS Цей приклад демонструє, що додавання гербіцидів з механізмом дії, відмінним від гліфосату, посилює ефект обробки, яка включає гліфосат, тригерні полінуклеотиди EPSPS і тригерний полінуклеотид основного гена (фактор ініціації транскрипції, TIF). Гліфосат застосовують у вигляді композиції Roundup WeatherMAX® (RU Wmax, Monsanto, Сент-Луїс, штат Міссурі) при концентрації 2X (1,5 фунт ке/акр), 4X і 8X на польовій дослідній ділянці, зарослій стійкою до гліфосату щирицею Палмера. Clarity® (сіль дигліколамину, BASF), що являє собою композицію дикамби, застосовують при нормі 0,25 фунт ке/акр, що дорівнює половині рекомендованої норми використання для боротьби з широколистяними бур'янами. Усі полінуклеотиди являють собою длРНК, 4001 являє собою суміш наступних чотирьох тригерних полінуклеотидів длРНК EPSPS щириці Палмера: длРНК1: послідовність смислового ланцюга CUACCAUCAACAAUGGUGUCC (1479-1499 з SEQ ID NO: 10) і комплементарний до антисмисловий ланцюг, і длРНК3: смисловий ланцюг GUCGACAACUUGCUGUAUAGU (42414261 з SEQ ID NO: 10) і комплементарний до антисмисловий ланцюг, і длРНК4: смисловий ланцюг GGUCACCUGGACAGAGAAUAG (9919-9939 з SEQ ID NO: 10) і комплементарний до 26 UA 115534 C2 5 10 15 20 антисмисловий ланцюг, і длРНК5: смисловий ланцюг AAUGCCAGAUGUUGCUAUGAC (1001510035 з SEQ ID NO: 10) і комплементарний до антисмисловий ланцюг, і один тригерний полінуклеотид TIF длРНК щириці Палмера (длРНКTIF1: смисловий ланцюг GCACAAAUGUAAAUAAACCGUCUCC (SEQ ID NO: 3780) і комплементарний до антисмисловий ланцюг, 4002 являє собою суміш з одного тригерного полінуклеотиду EPSPS длРНК (длРНК5) і одного тригерного полінуклеотиду TIF длРНК щириці Палмера (длРНКTIF1). Композиція гербіцидів і полінуклеотидів також містить один відсоток Silwet L77. Здійснюють обробку польових ділянок, на яких росте стійка до гліфосату щириця Палмера (переважно 4-6 см заввишки), композиціями, які показані в Таблиці 6, з 4 повторними обробками при нормі об'єму розпилення 10 галонів на акр, загальна концентрація полінуклеотиду склала приблизно 160 нмоль. Оброблену щирицю Палмера, стійку до гліфосату, оцінили на відсоток ушкоджень на 10-14 день після обробки. Результати показують, що гліфосат (RU Wmax) виявився неефективним у боротьбі з цією популяцією стійкої щириці Палмера навіть при 8Х збільшенні рекомендованої норми для поля - 52,5 відсотків. Додавання 4001 і 4002 полінуклеотидів істотно збільшило спостережуваний відсоток ушкоджень, викликаних гліфосатом, а саме він склав 83,75 і 72,5 відсотка, відповідно. Обробка, яка також включала 0,25 фунт ке/акр Clarity (дикамба), збільшила рівень ушкоджень до 95.75 відсотків при включенні до складу 4001 тригерних полінуклеотидів і до 93,25 відсотків при включенні до складу 4002 тригерних полінуклеотидів. При використання лише RU Wmax і Clarity рівень ушкоджень досяг 83.75 відсотків проти стійкої до гліфосату щириці Палмера. Таблиця 5 Додавання дикамби до гліфосату і EPSPS, і тригерних полінуклеотидів основного гена підвищує коефіцієнт ушкоджень у стійкої до гліфосату щириці Палмера Обробка RU Wmax 2X RU Wmax 4X RU Wmax 8X 2X RU Wmax+4001 2X RU Wmax+4001+0,25 фунтів Clarity 2X RU Wmax+4002 2X RU Wmax+4002+0,25 фунтів Clarity 2X RU Wmax+0,25 фунтів Clarity 25 30 35 Показник відсотка ушкоджень 28,75 30 52,5 83,75 95,75 72,5 93,25 83,75 Стандартна погрішність 12,045 4,291 11,219 3,1 4,095 3,067 3,513 6,221 Тепличне випробування проводять, щоб визначити вплив композиції, що містить гербіцид 2,4-D, EPSPS длРНК, основний ген длРНК і гербіцид гліфосат. Під час випробування використовують полінуклеотиди 4002, які є сумішшю 1 тригерного полінуклеотиду EPSPS длРНК (длРНК5) і 1 тригерного полінуклеотиду TIF длРНК щириці Палмера (длРНКTIF1), і наносять при концентрації 80 нм за допомогою розпорошувального наконечнику 9501E при витраті 93 л/га (літр/гектар). Roundup WeatherMax®, який являє собою гербіцид гліфосат, використовують при нормі 2Х. Гербіцид 2,4-D, який являє собою 2,4-D амін (сіль диметиламіну), використовують в концентрації 3,8 фунтів/галон і випробовують при нормі 2Х, 0,0625 фунт ке/акр і 0,125 фунт ке/акр. Композиція гербіцидів і полінуклеотидів також містить один відсоток Silwet L77. Щирицю Палмера (R-22) обробляють композиціями, які представлені в Таблиці 6, коли вона досягає 4-8 сантиметрів заввишки і на них з'являється 6-12 листків; експеримент повторюють 6 разів. Дію композиції вимірюють як відсотковий контроль в порівнянні з контролем необроблених рослин на 14 день після обробки. Таблиця 6 демонструє, що композиція, яка містить полінуклеотиди і гліфосат, має підвищену гербіцидну активність при додаванні 2,4-D до її складу, про що свідчить зниження норм, необхідних для забезпечення такого ж рівня відсоткового контролю, як і при подвійному об'ємі. 40 27 UA 115534 C2 Таблиця 6 Додавання 2,4-D до гліфосату та тригерних полінуклеотидів Опис обробки Roundup WeatherMAX (1,5 фунтів/акр) 2,4-D (0,0625 фунтів/акр) 2,4-D (0,125 фунтів/акр) RU Wmax (1,5 фунтів/акр) + 2,4-D (0,0625 фунтів/акр) RU Wmax (1,5 фунтів/акр) + 2,4-D (0,125 фунтів/акр) 4002+RU Wmax (1,5 фунтів/акр) + 2,4-D (0,0625 фунтів/акр) 4002+RU Wmax (1,5 фунтів/акр) + 2,4-D (0,125 фунтів/акр) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 % Контроль (показник) 51,7 60 80,8 57,5 77,5 80,8 88,3 Приклад 8. Спосіб боротьби з бур'янами на полі. Спосіб для боротьби з бур'янами на полі включає використання тригерних полінуклеотидів, які можуть модулювати експресію гена EPSPS в одному або декількох видах бур'янистих рослин-мішеней. Приклад 5 демонструє, що композиція для боротьби з бур'янами, що містить декілька гербіцидів і декілька полінуклеотидів, може використовуватися в польових умовах для боротьби із ростом щириці Палмера. Аналіз послідовностей гена EPSPS з 20 видів рослин забезпечив відбір 21-мерних полінуклеотидів (SEQ ID NO: 3223-3542), які можна використати в композиціях для впливу на ріст або розвиток, або для покращення сприйнятливості до гербіциду гліфосат, щоб контролювати декілька видів бур'янів на полі. Композиція, що містить 1 або 2, або 3, або 4, або більше за полінуклеотидів з SEQ ID NO: 3223-3542 забезпечить широку активність композиції проти декількох видів бур'янів або варіантів популяцій, які зустрічаються в середовищі поля. Спосіб включає створення агрохімічної композиції, яка містить компоненти, які включають щонайменше один полінуклеотид з SEQ ID NO: 3223-3542 або будь-який інший полінуклеотид, що ефективно модулює експресію гена, практично ідентичний або практично комплементарний до SEQ ID NO: 1-120 або їх фрагмента, агент перенесення, яке мобілізує полінуклеотид в клітину рослини, і гербіцид, який містить гліфосат, і необов'язково полінуклеотид, який модулює експресію основного гена, і необов'язково гербіцид з відмінним механізмом дії порівняно з гліфосатом. Полінуклеотид композиції містить длРНК, олДНК або длДНК, або їх комбінацію. Робоча концентрація композиції, що містить полінуклеотид, може бути від близько 1 до 30 грамів або більше на акр залежно від розміру полінуклеотиду і кількості полінуклеотидів в композиції. Композиція може містити один або більше додаткових гербіцидів, кількість яких потрібна для забезпечення ефективної боротьби з бур'янами декількох видів. Наприклад, композиція, що містить тригерний олігонуклеотид гена EPSPS, додатково містить сумісний гербіцид, який може включати, без обмеження ними, ацетохлор, ацифлуорфен, ацифлуорфен натрію, аклоніфен, акролеїн, алахлор, алоксидим, аліловий спирт, аметрин, амікарбазон, амідосульфурон, амінопіралід, амітрол, сульфамат амонію, анілофос, асулам, атратон, атразін, азимсульфурон, BCPC, бефлубутамід, беназолін, бенфлуралін, бенфуресат, бенсульфурон, бенсульфурон-метил, бенсулід, бентазон, бензфендізон, бензобіциклон, бензофенап, біфенокс, біланафос, біспірібак, біспірібак натрію, бура, бромацил, бромобутид, бромоксиніл, бутахлор, бутафенацил, бутаміфос, бутралін, бутроксидим, бутилат, какодилову кислоту, хлорат кальцію, кафенстрол, карбетамід, карфентразон, карфентразон-етил, CDEA, CEPC, хлорфлуренол, хлорфлуренол-метил, хлоридазон, хлорімурон, хлорімурон-етил, хлороцетову кислоту, хлоротолурон, хлорпрофам,хлорсульфурон, хлортал, хлортал-диметил, цинідон-етил, цинметилін, циносульфурон, цисанілід, клетодим, клодинафоп, клодинафоп-пропаргіл, кломазон, кломепроп, клопіралід, клорансулам, клорансулам-метил, CMA, 4-CPB, CPMF, 4CPP, CPPC, крезол, кумілурон, ціанамід, ціаназин, циклоат, циклосульфамурон, циклоксидим, цигалофоп, цигалофоп-бутил, 2,4-D, 3,4-DA, даімурон, далапон, дазомет, 2,4-DB, 3,4-DB, 2,4DEB, десмедіфам, дикамбу, дихлобеніл, орто-дихлорбензол, пара-дихлорбензол, дихлорпроп, дихлорпроп-П, диклофоп, диклофоп-метил, диклосулам, дифензокват, дифензоквату метилсульфат, дифлуфенікан, дифлуфензопір, димефурон, димепіперат, диметахлор, диметаметрин, диметенамід, диметенамід-П, диметипін, диметиларсинову кислоту, динітрамін, динотерб, дифенамід, дикват, диквату дибромід, дитіопір, діурон, DNOC, 3,4-DP, DSMA, EBEP, ендотал, ЕРТС, еспрокарб, еталфлуралін, етаметсульфурон, етаметсульфурон-метил, етофумезат, етоксифен, етоксисульфурон, етобензанід, феноксапроп-П, феноксапроп-П-етил, фентразамід, сульфат заліза, флампроп-M, флазасульфурон, флорасулам, флуазіфоп, 28