Антиген-зв’язувальна молекула, здатна неодноразово зв’язуватися з двома або більше молекулами антигенів

Реферат: Винахід стосується застосування антитіла, що має значення KD(pH 5,8)/KD(pH 7,4), визначене як відношення KD для антигену при рН 5,8 та KD для антигену при рН 7,4, яке становить 2 або більше, причому принаймні одна амінокислота гіперваріабельної ділянки (CDR) або амінокислотний залишок 27 у важкому ланцюзі антитіла (за нумерацією за Kabat) заміщений гістидином або принаймні один гістидин вставлений в CDR антитіла, як фармацевтичного активного начала з покращеною фармакокінетикою у порівнянні з фармакокінетикою, яка була перед заміщенням гістидином або вставленням гістидину. Винахід також стосується способу покращення фармакокінетики антитіла, способу збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антитіла, способу збільшення кількості антигенів, які можуть бути зв'язані антитілом, способу відокремлення усередині клітини антигену від антитіла, яке зв'язалося з ним ззовні клітини та способу підвищення здатності антитіла елімінувати антиген у плазмі, де передбачено заміщення принаймні однієї амінокислоти гіперваріабельної ділянки (CDR) або амінокислотного залишку 27 у важкому ланцюзі антитіла (за нумерацією за Kabat) гістидином або вставляння принаймні одного гістидину в CDR антитіла, при цьому заміщення гістидином або вставлення гістидину підвищує значення KD(pH 5,8)/KD(pН 7,4) порівняно із значенням KD(pH 5,8)/KD(pH 7,4) перед заміщенням гістидином або перед вставленням гістидину, де згадане значення KD(рH 5,8)/KD(pH 7,4) визначається як відношення KD для антигену при рН 5,8 та KD для антигену при рН 7,4. UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Цей винахід стосується способів покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул та способів збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальних молекул, а також антиген-зв'язувальних молекул, що мають покращену фармакокінетику, антиген-зв'язувальних молекул, що мають збільшену кількість разів зв'язування з антигеном, та способів одержання таких молекул. Попередній рівень техніки Антитіла привертають до себе увагу як фармацевтичні препарати, оскільки вони є надзвичайно стійкими у плазмі та мають небагато шкідливих ефектів. На цей час на ринку доступними є ряд фармацевтичних препаратів антитіл типу IgG, та набагато більше фармацевтичних препаратів на основі антитіл зараз розробляється (непатентні документи 1 та 2). Крім того, розроблено різні методи, які можна застосовувати до фармацевтичних препаратів другого покоління на основі антитіл, включаючи такі, як методи, що підсилюють ефекторну функцію, антиген-зв'язувальну здатність, фармакокінетику та стійкість, та такі, що знижують ризик імуногенності (непатентний документ 3). Взагалі, необхідна доза фармацевтичного препарату на основі антитіл є дуже високою. Це, у свою чергу, спричиняє проблеми, такі як висока вартість виробництва, а також складність при виробництві фармацевтичних складів для підшкірного введення. Теоретично дозу фармацевтичного препарату на основі антитіл можна знизити шляхом покращення фармакокінетики антитіл або шляхом покращення афінності між антитілами та антигенами. У літературі повідомляється про способи покращення фармакокінетики антитіл шляхом штучного заміщення амінокислот у константних ділянках (непатентні документи 4 та 5). Подібно до цього, про формування афінності повідомлялося як про спосіб підвищення антигензв'язувальної здатності або антиген-нейтралізуючої активності (непатентний документ 6). Цей метод дозволяє підсилити антиген-зв'язувальну активність шляхом введення амінокислотних мутацій у гіперваріабельну ділянку (CDR) варіабельної ділянки або їй подібної. Підсилення антиген-зв'язувальної здатності дозволяє покращити біологічну активність in vitro або знизити дозу та, крім того, дозволяє покращити ефективність in vivo (непатентний документ 7). Антиген-нейтралізуюча здатність єдиної молекули антитіла залежить від її афінності. За допомогою збільшення афінності антиген можна нейтралізувати меншою кількістю антитіл. Різні способи можна використовувати для підвищення афінності антитіла. Крім того, якщо афінність можна зробити безмежною шляхом ковалентного зв'язування антитіла з антигеном, єдина молекула антитіла може нейтралізувати одну молекулу антигену (двовалентне антитіло може нейтралізувати дві молекули антигену). Проте, стехіометрична нейтралізація одним антитілом одного антигену (одним двовалентним антитілом двох антигенів) є межею попередньо існуючих способів, та, отже, неможливо повністю нейтралізувати антиген меншою кількістю антитіл, ніж кількість антигенів. Інакше кажучи, ефект підвищення афінності має обмеження (непатентний документ 9). Для того, щоб пролонгувати ефект нейтралізації нейтралізуючого антитіла на певний період часу, це антитіло слід вводити у дозі, яка перевищує кількість антигену, що виробляється в організмі під час такого ж самого періоду. При покращенні фармакокінетики антитіла або тільки способу формування афінності, який описано вище, існує, отже, обмеження стосовно зниження необхідної дози антитіла. Відповідно, для того, щоб підтримувати антиген-нейтралізуючий ефект антитіла протягом наміченого періоду часу за допомогою меншої ніж кількість антигену кількості антитіла, єдине антитіло мусить нейтралізувати численні антигени. Способи нейтралізації численних антигенів єдиним антитілом включають інактивацію антигену із використанням каталітичних антитіл, що є антитілами, яким надана каталітична функція. Коли антиген є білком, його можна інактивувати шляхом гідролізу його пептидних зв'язків. Антитіло може неодноразово нейтралізувати антигени шляхом каталізу такого гідролізу (непатентний документ 8). Існує багато попередніх повідомлень, опублікованих стосовно каталітичних антитіл та способів їх отримання. Проте, нема повідомлень стосовно каталітичних антитіл, які мають достатню каталітичну активність як фармацевтичні агенти. Детальніше, при дослідженні антитіла in vivo для певного антигену не виявлено жодної публікації стосовно каталітичних антитіл, які можуть виробляти порівняльний або сильніший ефект навіть при низьких дозах або виробляти більш тривалий ефект навіть при такій самій дозі порівняно зі звичайним некаталітичним нейтралізуючим антитілом. Як сказано вище, не було жодних повідомлень про антитіла, які порівняно зі звичайними нейтралізуючими антитілами можуть виробляти більш суттєвий ефект in vivo за допомогою єдиного антитіла, що нейтралізує численні антигенні молекули. Отже, з точки зору зменшення дози та подовження тривалості, зараз є потреба у нових способах, які б дозволили отримати нові молекули антитіл, які порівняно зі звичайними нейтралізуючими антитілами мають 1 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сильніший ефект in vivo стосовно індивідуальної нейтралізації численних антигенних молекул. Документи попереднього рівня техніки, які стосуються цього винаходу, наведено нижче: Документи попереднього рівня техніки Непатентні документи Непатентний документ 1: Monoclonal antibody successes in the clinic. Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073-1078 (2005). Непатентний документ 2: Pavlou AK, Belsey MJ. The therapeutic antibodies market to 2008. Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96. Непатентний документ 3: Kim SJ, Park Y, Hong HJ. Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies. Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review. Непатентний документ 4: Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N. An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life. J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56. Непатентний документ 5: Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES. Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis. Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40. Непатентний документ 6: Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6. Непатентний документ 7: Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665. Непатентний документ 8: Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S. Catalytic antibodies and their applications. Curr Opin Biotechnol. 2005 Dec;16(6):631-6. Непатентний документ 9: Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Sep 9;334(4):1004-13. Суть винаходу Задачі, які розв'язує винахід Вищевказані обставини зумовили відкриття цього винаходу. Отже, мета цього винаходу – це розробка способів багаторазового зв'язування антиген-зв'язувальних молекул з антигенами та способів покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул, а також розробка антиген-зв'язувальних молекул, які є здатними зв'язуватися з антигенами багато разів, антигензв'язувальних молекул, які мають покращену фармакокінетику, фармацевтичних композицій, що містять такі антиген-зв'язувальні молекули, та розробка способів отримання таких молекул та композицій. Засоби розв'язання задач У цьому описі винаходу описані дослідження стосовно способів багаторазового зв'язування поліпептидів, які мають антиген-зв'язувальну здатність, таких як антиген-зв'язувальні молекули, з антигенами та способів подовження періоду піврозпаду таких молекул у плазмі (крові) (покращення їх фармакокінетики). Внаслідок вказаного визначили, що коли антигензв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при ранньому ендосомному рН є нижчою, ніж її антиген-зв'язувальна активність при рН плазми (крові), то буде можливим зв'язати антигени неодноразово та мати триваліший період піврозпаду у плазмі. Отже, цей винахід стосується способів багаторазового зв'язування антиген-зв'язувальних молекул з антигенами, способів покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул та способів одержання антиген-зв'язувальних молекул з покращеною фармакокінетикою; цей винахід також стосується антиген-зв'язувальних молекул, які є здатними неодноразово зв'язувати антигени, та антиген-зв'язувальних молекул з покращеною фармакокінетикою. Більш специфічно, цим винаходом пропонується: [1] антиген-зв'язувальна молекула, що має значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4), визначене як відношення KD для антигену при рН 5,8 та KD для антигену при рН 7,4, яке становить 2 або більше; [2] антиген-зв'язувальна молекула за [1], де значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) становить 10 або більше; [3] антиген-зв'язувальна молекула за [1], де значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) становить 40 або більше; [4] антиген-зв'язувальна молекула за будь-яким від [1] до [3], де принаймні одна амінокислота антиген-зв'язувальної молекули заміщена гістидином або принаймні один гістидин вставлений в антиген-зв'язувальну молекулу; 2 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [5] антиген-зв'язувальна молекула за будь-яким від [1] до [4], де антиген-зв'язувальна молекула має антагоністичну активність; [6] антиген-зв'язувальна молекула за будь-яким від [1] до [5], де антиген-зв'язувальна молекула зв'язується з мембранним антигеном або розчинним антигеном; [7] антиген-зв'язувальна молекула за будь-яким від [1] до [6], де антиген-зв'язувальна молекула – це антитіло; [8] фармацевтична композиція, яка включає антиген-зв'язувальну молекулу за будь-яким від [1] до [7]; [9] спосіб покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальної молекули шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4; [10] спосіб збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4; [11] спосіб збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою, шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4; [12] спосіб відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антигензв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4; [13] спосіб виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4; [14] спосіб підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антиген у плазмі шляхом зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4; [15] спосіб за будь-яким від [9] до [14], де значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4), визначене як відношення KD для антигену при рН 5,8 та KD для антигену при рН 7,4, становить 2 або більше; [16] спосіб за будь-яким від [9] до [14], де значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) становить 10 або більше; [17] спосіб за будь-яким від [9] до [14], де значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) становить 40 або більше; [18] спосіб покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальної молекули шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу; [19] спосіб збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу; [20] спосіб збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою, шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу; [21] спосіб відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антигензв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антигензв'язувальну молекулу; [22] спосіб виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу; [23] спосіб підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антиген у плазмі шляхом заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставлення принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу; [24] спосіб за будь-яким від [18] до [23], де заміщення гістидином або вставка гістидину підвищує значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4), визначеного як відношення антиген-зв'язувальної активності при рН 5,8 та антиген-зв'язувальної активності при рН 7,4, порівняно зі значенням KD(pH5,8)/KD(pH7,4) до заміщення гістидином або вставки гістидину; [25] спосіб за будь-яким від [9] до [24], де антиген-зв'язувальна молекула має антагоністичну активність; [26] спосіб за будь-яким від [9] до [25], де антиген-зв'язувальна молекула зв'язується з 3 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мембранним антигеном або розчинним антигеном; [27] спосіб за будь-яким від [9] до [26], де антиген-зв'язувальна молекула – це антитіло; [28] спосіб скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, який включає наступні етапи: (a) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 6,7 до 10,0; (b) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 4,0 до 6,5 та (c) вибирання антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при рН від 6,7 до 10,0 є більшою, ніж антиген-зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5; [29] спосіб скринінгу за [28], який включає етап вибору антитіла, антиген-зв'язувальна активність якого при рН від 6,7 до 10,0 удвічі або більше перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН від 4,0 до 6,5; [30] спосіб скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, який включає наступні етапи: (a) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (b) поміщення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном за (а), в умови рН від 4,0 до 6,5 та (c) отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка відокремилася при умові рН від 4,0 до 6,5; [31] спосіб скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, зв'язувальна активність якої при першому значенні рН є вищою, ніж зв'язувальна активність при другому значенні рН, який включає наступні етапи: (a) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові першого значення рН; (b) елюювання антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з колонкою при першому значенні рН, з колонки при умові другого значення рН та (c) збирання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули; [32] спосіб скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, зв'язувальна активність якої при першому значенні рН є більшою, ніж зв'язувальна активність при другому значенні рН, який включає наступні етапи: (a) зв'язування бібліотеки антиген-зв'язувальних молекул з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові першого значення рН; (b) елюювання антиген-зв'язувальної молекули з колонки при умові другого значення рН; (c) ампліфікування гена, що кодує елюйовану антиген-зв'язувальну молекулу; та (d) отримання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули; [33] спосіб скринінгу за [31] або [32], де перше значення рН становить від 6,7 до 10,0, а друге значення рН становить від 4,0 до 6,5; [34] спосіб скринінгу за будь-яким від [28] до [33], де принаймні одна або більше амінокислот антиген-зв'язувальної молекули заміщені гістидином або принаймні один гістидин вставлений в антиген-зв'язувальну молекулу; [35] спосіб скринінгу за будь-яким від [28] до [33] для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка є найкращою стосовно утримання у плазмі; [36] спосіб скринінгу за будь-яким від [28] до [33] для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка є здатною зв'язуватися з антигеном два або більше разів; [37] спосіб скринінгу за будь-яким від [28] до [33] для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка є здатною зв'язуватися з більшою кількістю антигенів порівняно з кількістю її антиген-зв'язувальних ділянок; [38] спосіб скринінгу за будь-яким від [28] до [33] для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка усередині клітини відокремлює антиген, з яким вона зв'язалася ззовні клітини. [39] спосіб скринінгу за будь-яким від [28] до [33] для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язується з антигеном, та інтерналізується у клітину, та виділяється за межі клітини у вільній від антигену формі; [40] спосіб скринінгу за будь-яким від [28] до [33] для отримання антиген-зв'язувальної молекули, яка має підвищену здатність елімінувати антиген у плазмі; [41] спосіб скринінгу за будь-яким від [28] до [40], де антиген-зв'язувальна молекула використовується як фармацевтична композиція; [42] спосіб скринінгу за будь-яким від [28] до [41], де антиген-зв'язувальна молекула – це антитіло; [43] спосіб одержання антиген-зв'язувальної молекули, який включає наступні етапи: (a) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 6,7 до 10,0; 4 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (b) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 4,0 до 6,5; (c) вибирання антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при рН від 6,7 до 10,0 є більшою, ніж антиген-зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5; (d) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, вибрану у (с); та (e) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (d); [44] спосіб одержання антиген-зв'язувальної молекули, який включає наступні етапи: (a) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з антигеном при умові рН від 6,7 до 10,0; (b) надання можливості антиген-зв'язувальній молекулі, зв'язаній з антигеном за (а), витримуватися при умові рН від 4,0 до 6,5; (c) збирання антиген-зв'язувальної молекули, яка відокремилася при умові рН від 4,0 до 6,5; (d) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, зібрану у (с); та (e) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (d); [45] спосіб одержання антиген-зв'язувальної молекули, зв'язувальна активність якої при першому значенні рН є вищою, ніж зв'язувальна активність при другому значенні рН, який включає наступні етапи: (a) зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові першого значення рН; (b) елюювання антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з колонкою при першому значенні рН, з колонки при умові другого значення рН; (c) збирання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули; (d) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, отриману у (с); та (e) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (d); [46] спосіб одержання антиген-зв'язувальної молекули, зв'язувальна активність якої при першому значенні рН є вищою, ніж зв'язувальна активність при другому значенні рН, який включає наступні етапи: (a) зв'язування бібліотеки антиген-зв'язувальних молекул з колонкою з іммобілізованим антигеном при умові першого значення рН; (b) елюювання антиген-зв'язувальної молекули з колонки при умові другого значення рН; (с) ампліфікування гена, що кодує елюйовану антиген-зв'язувальну молекулу; (d) збирання елюйованої антиген-зв'язувальної молекули; (e) отримання гена, що кодує антиген-зв'язувальну молекулу, зібрану у (d); та (f) одержання антиген-зв'язувальної молекули із використанням гена, отриманого у (е); [47] спосіб одержання за [45] або [46], де перше значення рН становить від 6,7 до 10,0, а друге значення рН становить від 4,0 до 6,5; [48] спосіб одержання за будь-яким від [43] до [47], який далі включає етап заміщення принаймні однієї амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули гістидином або вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу; [49] спосіб одержання за будь-яким від [43] до [48], де антиген-зв'язувальна молекула – це антитіло; [50] фармацевтична композиція, яка містить антиген-зв'язувальну молекулу, одержану за будь-яким способом одержання від [43] до [49]. Ефекти винаходу Цим винаходом пропонуються способи одержання єдиних антиген-зв'язувальних молекул, які неодноразово зв'язуються з численними антигенними молекулами. Коли антигензв'язувальна молекула зв'язується з численними антигенними молекулами, тоді фармакокінетику антиген-зв'язувальної молекули можна покращити, та така молекула може демонструвати найкращі ефекти in vivo порівняно з ефектами звичайних антиген-зв'язувальних молекул. Стислий опис ілюстративного матеріалу Фіг. 1 – це схема, яка показує шлях антитіл, зв'язаних зі зв'язаним з мембраною антигеном. Фіг. 2 – це схема, яка показує механізм, за допомогою якого молекули IgG реутилізуються за допомогою FcRn. Фіг. 3 – це схема, яка показує повторне зв'язування молекул IgG з новим антигеном після відділення від зв'язаного з мембраною антигеном усередині ендосом. Фіг. 4 - це схема, яка показує повторне зв'язування молекул IgG з новим антигеном після відділення від розчинного антигену усередині ендосом. Фіг. 5 – це схема, яка ілюструє метод пенінгу із використанням колонки з іммобілізованим антигеном. Фіг. 6 представляє графіки фагового ЕЛАЙЗА (ELISA) для клонів, набутих внаслідок пенінгу 5 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з використанням колонки. Верхній графік показує природний тип (WT), а нижній графік показує CL5. Фіг. 7 - це графік, що показує біологічну нейтралізуючу активність антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином. Фіг. 8 представляє графіки, які показують результати Biacore-сенсорграми для зв'язування антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином, з розчинним рецептором IL6 при рН 7,4. Верхній графік показує WT; другий графік зверху показує H3pI/L73; третій графік зверху показує H170/L82 та нижній графік показує CLH5/L73. Фіг. 9 представляє графіки, які показують результати Biacore-сенсорграми для зв'язування антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином, з розчинним рецептором IL6 при рН 5,8. Верхній графік показує WT; другий графік зверху показує H3pI/L73; третій графік зверху показує H170/L82 та нижній графік показує CLH5/L73. Фіг. 10 представляє графіки, які показують результати Biacore-сенсорграми для асоціації (рН 7,4) з рецептором IL6 мембранного типу та відокремлення (рН 5,8) від нього антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином. Верхній графік показує WT; другий графік зверху показує H3pI/L73; третій графік зверху показує H170/L82 та нижній графік показує CLH5/L73. Фіг. 11 – це Biacore-сенсорграма, яка вказує на неодноразове зв'язування антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином, з SR344. Фіг. 12 – це графік, що показує загальну кількість зв'язаного антигену в експерименті багаторазового зв'язування антитіл проти рецептора IL6, що зв'язуються залежним від рН чином, з SR344. Фіг. 13 – це графік, що показує зміну за часом концентрацій антитіла у плазмі антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином, у трансгенних мишей з рецептором IL6 людини. Фіг. 14 – це графік, що показує зміну за часом концентрацій антитіла у плазмі антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином, у мавп cynomolgus. Фіг. 15 – це графік, що показує зміну за часом концентрацій С-реактивного білку у плазмі (CRP) у мавп cynomolgus для антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином. Фіг. 16 – це графік, що показує зміну за часом концентрацій рецептора IL6 незв'язаного типу мавп cynomolgus у мавп cynomolgus для антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином. Фіг. 17 представляє графіки, які показують результати Biacore-сенсорграми для асоціації (рН 7,4) з рецептором IL6 мембранного типу та відокремлення (рН 5,8) від нього антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином. Рухаючись зверху униз, представлено результати для WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1 та Fv4-IgG1. Фіг. 18 – це графік, що показує зміну за часом концентрацій антитіла у плазмі для антитіл проти рецептора IL6 (WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1 та Fv4-IgG1), які зв'язуються залежним від рН чином, у трансгенних мишей з рецептором IL-6 людини. Фіг. 19 представляє графіки, які показують результати Biacore-сенсорграми для асоціації (рН 7,4) з рецептором IL-6 мембранного типу та відокремлення (рН 5,8) від нього антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином. Рухаючись зверху униз, представлено результати для WT, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2 та Fv4-M58. Фіг. 20 – це графік, що показує зміну за часом концентрацій антитіла у плазмі для антитіл проти рецептора IL6 (WT, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2 та Fv4-M58), які зв'язуються залежним від рН чином, у трансгенних мишей з рецептором IL-6 людини. Фіг. 21 представляє графіки, які показують результати Biacore-сенсорграми для асоціації (рН 7,4) з рецептором IL-6 мембранного типу та відокремлення (рН 5,8) від нього антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином. Рухаючись зверху униз, представлено результати для Fv1-M71, Fv1-M73, Fv3-M71 та Fv3-M73. Фіг. 22 – це графік, що показує зміну за часом концентрацій антитіла у плазмі для антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином, у мавп cynomolgus під час введення H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73 та Fv4-M73 у дозі 0,5 мг/кг та під час введення високоафінного антитіла (Ab) у дозі 1,0 мг/кг. Фіг. 23 – це графік, що показує зміну за часом концентрацій CRP у мавп cynomolgus для антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним від рН чином (групи, яким вводилися H3pI/L73-IgG1-, Fv1-M71-, Fv1-M73-, Fv2-IgG1-, Fv3-M73-, Fv4-M73- та високоафінне Ab). Фіг. 24 – це графік, що показує зміну за часом концентрацій рецептора IL-6 незв'язаного типу мавп cynomolgus у мавп cynomolgus для антитіл проти рецептора IL6, які зв'язуються залежним 6 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 від рН чином (групи, яким вводилися H3pI/L73-IgG1-, Fv1-M71-, Fv1-M73-, Fv2-IgG1-, Fv3-M73-, Fv4-M73- та високоафінне Ab). Фіг. 25 – це схема, яка показує FR1, FR2, FR3 та FR4 разом з CDR1, CDR2 та CDR3 важких ланцюгів (VH1, VH2, VH3, VH4) та легких ланцюгів (VL1, VL2, VL3). Зірочки вказують на місця, де існують амінокислотні мутації у вирівняних послідовностях. Фіг. 26 представляє Biacore-сенсорграму, яка показує залежне від рН зв'язування антитіла проти IL-6, клону 2 проти IL-6, з IL-6 при рН 7,4 та рН 5,5. Криві на сенсорграмі при рН 7,4 відповідають 100, 50, 25, 12,5 та 6,25 нг/мл IL-6 у напрямку зверху униз. Фіг. 27 представляє Biacore-сенсорграми, яка показує залежне від рН зв'язування антитіла проти рецептора IL-31, клону 1 проти IL31R, з рецептором IL-31 при рН 7,4 та рН 5,5. Криві на сенсорграмі при рН 5,5 відповідають 100, 50, 25, 12,5 та 6,25 нг/мл рецептора IL-31 у напрямку зверху униз. Фіг. 28 показує зміну концентрації антитіла у плазмі після внутрівенного введення миші розчину суміші, що містить SR344 та антитіло проти людського рецептора IL-6. Фіг. 29 показує зміну концентрації SR344 у плазмі після внутрівенного введення миші розчину суміші, що містить SR344 та антитіло проти людського рецептора IL-6. Варіанти здійснення цього винаходу Цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальних молекул. Більш специфічно, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальних молекул шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальних молекул при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антигензв'язувальних молекул шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти у антигензв'язувальних молекулах або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антигензв'язувальні молекули. Крім того, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальних молекул шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген-зв'язувальних молекул. Цим винаходом також пропонуються способи збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою. Більш специфічно, цим винаходом також пропонуються способи збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антигензв'язувальною молекулою, шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою, шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальних молекулах або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальні молекули. Крім того, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою, шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген-зв'язувальних молекул. Цим винаходом також пропонуються способи відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини. Більш специфічно, цим винаходом також пропонуються способи відокремлення усередині клітини антигену від антигензв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом зниження антигензв'язувальної здатності при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти у антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антигензв'язувальної молекули. Цим винаходом також пропонуються способи виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини. Більш специфічно, цим винаходом також пропонуються способи виділення антигензв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, 7 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цим винаходом також пропонуються способи виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти у антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген-зв'язувальної молекули. Цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі. Більш специфічно, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти в антигензв'язувальних молекулах або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антигензв'язувальні молекули. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антигензв'язувальної молекули. Цим винаходом також пропонуються способи покращення фармакокінетики антигензв'язувальних молекул. Більш специфічно, цим винаходом також пропонуються способи покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул (пролонгація утримання у плазмі) шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рН порівняно з антигензв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальних молекулах або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальні молекули. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген-зв'язувальних молекул. Далі, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антигензв'язувальних молекул елімінувати антигени у плазмі. Більш специфічно, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальних молекул елімінувати антигени у плазмі шляхом зниження антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальних молекул при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антигензв'язувальних молекул елімінувати антигени у плазмі шляхом заміщення гістидином принаймні однієї амінокислоти у антиген-зв'язувальних молекулах або шляхом вставки принаймні одного гістидину в антиген-зв'язувальних молекулах. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальних молекул елімінувати антигени у плазмі шляхом заміщення, делеції, додавання та/або вставки амінокислот у константу ділянку антитіла антиген-зв'язувальних молекул. У цьому описі винаходу словосполучення "покращення фармакокінетики", "поліпшення фармакокінетики", "найкраща фармакокінетика" взаємозамінюються словосполученнями "покращення утримання у плазмі (крові)", "поліпшення утримання у плазмі (крові)" та "найкраще утримання у плазмі (крові)", відповідно, та ці фрази є синонімічними. У цьому описі винаходу вираз "зниження антиген-зв'язувальної активності при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при нейтральному рН" означає, що антигензв'язувальна здатність антиген-зв'язувальної молекули при рН від 4,0 до 6,5 є зниженою порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при рН від 6,7 до 10,0, переважно, що антигензв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рН від 5,5 до 6,5 є зниженою порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН від 7,0 до 8,0, та більш переважно, що антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 є зниженою порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4. Отже, у цьому винаході кислотний рН зазвичай становить рН від 4,0 до 6,5, переважно рН від 5,5 до 6,5, та більш переважно рН 5,8. Альтернативно, у цьому винаході нейтральне рН зазвичай становить рН від 6,7 до 10,0, переважно рН від 7,0 до 8,0, та більш переважно рН 7,4. У цьому описі винаходу фразу "зниження антиген-зв'язувальної здатності антигензв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при 8 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нейтральному рН" можна взаємозамінювати фразою "підвищення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при нейтральному рН порівняно з антигензв'язувальною здатністю при кислотному рН". Інакше кажучи, у цьому винаході різницю в антиген-зв'язувальній здатності антиген-зв'язувальної молекули слід підвищити між значеннями кислотного та нейтрального рН. Наприклад, значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) слід підвищити, як описано нижче. Різницю антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули між значеннями кислотного та нейтрального рН можна підвищити, наприклад, за допомогою одного з наступних способів або їх обох, а саме: за допомогою зниження антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рН та підвищення антиген-зв'язувальної здатності при нейтральному рН. Умови для визначення антиген-зв'язувальної активності, відмінні від рН, можуть бути вибрані відповідним чином фахівцями у цій галузі, та ці умови особливо не обмежуються. Антиген-зв'язувальну активність можна визначити, наприклад, в умовах буферу MES та при 37 °C, як описано у Прикладах цього опису винаходу. Крім того, антиген-зв'язувальну активність антиген-зв'язувальної молекули можна визначити за способами, відомими фахівцям у цій галузі, наприклад, використовуючи Biacore (GE Healthcare) або йому подібний, як описано у Прикладах цього опису винаходу. Коли антиген – це розчинний антиген, тоді активність зв'язування з розчинним антигеном можна визначити шляхом випорскування антигену, як аналітичного зразка, на чип з іммобілізованою антиген-зв'язувальною молекулою. Альтернативно, коли антиген – це мембранний антиген, тоді активність зв'язування з мембранним антигеном можна визначити шляхом випорскування антиген-зв'язувальної молекули, як аналітичного зразка, на чип з іммобілізованим антигеном. У цьому винаході різниця значень антиген-зв'язувальної активності при кислотному та нейтральному рН особливо не обмежується, доки антиген-зв'язувальна активність при кислотному рН є нижчою, ніж антиген-зв'язувальна активність при нейтральному рН. Проте, значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4), яке є відношенням константи дисоціації (KD) при відокремленні від антигену при рН 5,8 та відношенням константи дисоціації при відокремленні від антигену при рН 7,4, переважно становить 2 або більше, більш переважно 10 або більше, а іще більш переважно 40 або більше. Верхня границя значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) особливо не обмежується, та може мати будь-яке значення, наприклад, 400, 1000 або 10000, доки молекулу можна отримувати за способами, відомими фахівцям у цій галузі. Коли антиген – це розчинний антиген, тоді антиген-зв'язувальну активність можна представляти у вигляді константи дисоціації (KD). Альтернативно, коли антиген – це мембранний антиген, тоді антигензв'язувальну активність можна представляти у вигляді позірної константи дисоціації. Константу дисоціації (KD) та позірну константу дисоціації (позірну KD) можна визначити за способами, відомими фахівцям у галузі, наприклад, використовуючи Biacore (GE Healthcare), графік Scatchard або FACS. Альтернативно, можна використовувати, наприклад, k d - константу швидкості дисоціації як індикатор різниці значень антиген-зв'язувальної активності при кислотному та нейтральному рН. Коли константа швидкості дисоціації (k d) використовується як індикатор різниці зв'язувальної активності замість константи дисоціації (KD), тоді значення k d(pH5,8)/kd(pH7,4), яке є відношенням константи швидкості дисоціації (k d) при відокремленні від антигену при рН 5,8 та константи швидкості дисоціації при відокремленні від антигену при рН 7,4, переважно становить 2 або більше, більш переважно 5 або більше, навіть більш переважно 10 або більше та іще більш переважно 30 або більше. Верхня границя значення k d(pH5,8)/kd(pH7,4) особливо не обмежується та може мати будь-яке значення, наприклад, 50, 100 або 200, доки молекулу можна отримувати за способами, загально відомими фахівцям у цій галузі. Коли антиген – це розчинний антиген, тоді антиген-зв'язувальну активність можна представляти у вигляді константи швидкості дисоціації (k d). Альтернативно, коли антиген – це мембранний антиген, тоді антиген-зв'язувальну активність можна представляти у вигляді позірної константи швидкості дисоціації. Константу швидкості дисоціації (kd) та позірну константу швидкості дисоціації (позірну k d) можна визначити за способами, відомими фахівцям у галузі, наприклад, використовуючи Biacore (GE healthcare) або FACS. У цьому винаході, коли антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули визначається при різних значеннях рН, тоді переважно, щоб умови вимірювання, за виключенням рН, були постійними. Способи зниження антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 (способи надання здатності зв'язуватися залежним від рН чином) особливо не обмежуються та можуть бути будь-якими способами. Такі способи включають, наприклад, способи зниження антиген-зв'язувальної 9 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активності при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 шляхом заміщення гістидином амінокислот в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину в антиген-зв'язувальну молекулу. Вже відомо, що антитілу можна надати залежної від рН антиген-зв'язувальної активності шляхом заміщення гістидином амінокислот в антитілі (FEBS Letter, 309(1), 8588 (1992)). Такі гістидинові сайти мутації (заміщення) або сайти вставки гістидину особливо не обмежуються, та прийнятним є будь-який сайт, доки антигензв'язувальна активність при рН 5,8 є нижчою за антиген-зв'язувальну активність при рН 7,4 (значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) стає більшим) порівняно з антиген-зв'язувальною активністю до здійснення мутації або вставки. Коли антиген-зв'язувальна молекула – це антитіло, тоді такі сайти включають, наприклад, сайти усередині варіабельної ділянки антитіла. Відповідну кількість сайтів гістидинової мутації або сайтів вставки гістидину можуть відповідним чином визначити фахівці у галузі. Гістидином можна заміщувати або гістидин можна вставляти на єдиному сайті або на двох сайтах або більше. Можна також одночасно вводити негістидинову мутацію (мутацію амінокислотами, відмінними від гістидину). Крім того, гістидинову мутацію можна вводити одночасно зі вставкою гістидину. Можна заміщувати гістидином або вставляти гістидин наугад, використовуючи спосіб, такий як гістидинове сканування, який використовує гістидин замість аланіну при аланіновому скануванні, який відомий фахівцям у цій галузі. Альтернативно, антиген-зв'язувальні молекули, значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) яких підвищується порівняно зі значенням KD(pH5,8)/KD(pH7,4) до мутації, можна вибирати з бібліотеки антиген-зв'язувальних молекул з випадковою гістидиновою мутацією або вставкою гістидину. Коли гістидин заміщує амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули або вставляється між амінокислотами цієї молекули, тоді переважно, проте необов'язково, щоб антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рН 7,4 після заміщення гістидином або вставки гістидину була порівняльною з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 перед заміщенням гістидином або вставкою гістидину. Фраза "антиген-зв'язувальна активність антигензв'язувальної молекули при рН 7,4 після заміщення гістидином або вставки гістидину є порівняльною з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 перед заміщенням гістидином або вставкою гістидину" означає, що навіть після заміщення гістидином або вставки гістидину антиген-зв'язувальна молекула зберігає 10 % або більше, переважно 50 % або більше, більш переважно 80 % або більше та іще більш переважно 90 % або більше антиген-зв'язувальної активності перед заміщенням гістидином або вставки гістидину. Коли антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули ослаблюється внаслідок заміщення гістидином або вставки гістидину, тоді антиген-зв'язувальну активність можна відрегулювати шляхом введення заміщення, делеції, додавання та/або вставки однієї або більше амінокислот в антигензв'язувальну молекулу, так щоб антиген-зв'язувальна активність стала порівняльною з антигензв'язувальною активністю до заміщення гістидином або вставки гістидину. Цей винахід також включає такі антиген-зв'язувальні молекули, які мають порівняльну зв'язувальну активність, яка є результатом заміщення, делеції, додавання або вставки однієї або більше амінокислот після заміщення гістидином або вставки гістидину. Альтернативні способи ослаблення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 включають методи заміщення неприродними амінокислотами амінокислот в антиген-зв'язувальній молекулі або методи вставки неприродних амінокислот в амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули. Відомо, що рКа можна штучно регулювати, використовуючи неприродні амінокислоти (Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 34; Chem Soc Rev. 2004 Sep 10;33(7):422-30; Amino Acids. 1999;16(34):345-79). Отже, у цьому винаході неприродні амінокислоти можна використовувати замість гістидину, описаного вище. Таке заміщення неприродними амінокислотами та/або вставку неприродних амінокислот можна проводити одночасно із заміщенням гістидином та/або вставкою гістидину, що описано вище. У цьому винаході можна використовувати будь-які неприродні амінокислоти. Можна використовувати неприродні амінокислоти, відомі фахівцям у галузі. Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула – це речовина, що має константну ділянку антитіла, тоді альтернативні способи зниження антиген-зв'язувальної активності антигензв'язувальної молекули при рН 5,8 порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 включають способи модифікації константної ділянки антитіла, що міститься в антигензв'язувальній молекулі. Такі способи модифікації константної ділянки антитіла включають, наприклад, способи заміщення константної ділянки, описані у Прикладах цього опису винаходу. Альтернативні способи модифікації константної ділянки антитіла включають, наприклад, способи визначення різних ізотипів константної ділянки (IgG1, IgG2, IgG3 та IgG4) та вибору 10 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ізотипу, який знижує антиген-зв'язувальну активність при рН 5,8 (підвищує швидкість дисоціації при рН 5,8). Альтернативно, способи включають способи зниження антиген-зв'язувальної активності при рН 5,8 (підвищення швидкості дисоціації при рН 5,8) шляхом заміщення амінокислот в амінокислотній послідовності ізотипу природного типу (амінокислотній послідовності природного типу IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4). Послідовність шарнірної ділянки константної ділянки антитіла є суттєво різною серед ізотипів (IgG1, IgG2, IgG3 та IgG4), та ця різниця в амінокислотній послідовності шарнірної ділянки має сильний вплив на антигензв'язувальну активність. Отже, можна вибрати відповідний ізотип, щоб знизити антигензв'язувальну активність при рН 5,8 (підвищити швидкість дисоціації при рН 5,8), враховуючи тип антигену або епітопу. Крім того, оскільки різниця в амінокислотній послідовності шарнірної ділянки має суттєвий вплив на антиген-зв'язувальну активність, то припускають, що переважні сайти амінокислотних заміщень в амінокислотній послідовності ізотипу природного типу будуть знаходитися усередині шарнірної ділянки. Коли антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної речовини при рН 5,8 ослаблюється порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 (коли збільшується значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) шляхом використання вищеописаних способів та їм подібних, тоді зазвичай переважно, щоб значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) перебільшувало у 2 рази або більше, більш переважно у 5 разів або більше та навіть більш переважно у десять разів або більше значення для оригінального антитіла, проте винахід особливо не обмежується цим. У цьому описі винаходу термін "покращення фармакокінетики" означає пролонгацію часу, необхідного для елімінування антиген-зв'язувальної молекули з плазми (наприклад, досягнення стану, коли антиген-зв'язувальна молекула не може повернутися у плазму внаслідок розпаду у клітинах або за іншими причинами) після введення тварині, такій як людина, миша, щур, мавпа, кроль або собака, а також означає пролонгацію часу утримання у плазмі антиген-зв'язувальної молекули, яка має форму, здатну зв'язуватися з антигенами (наприклад, має вільну від антигену форму) протягом періоду, доки вона не елімінується з плазми після введення. Навіть якщо антиген-зв'язувальна молекула циркулює у плазмі, вона не може зв'язуватися з антигеном, коли вона вже зв'язалася з іншим антигеном. Отже, період, коли антиген-зв'язувальна молекула може знов зв'язатися з іншим антигеном, подовжується (підвищується ймовірність зв'язатися з іншим антигеном) шляхом пролонгації періоду, коли антиген-зв'язувальна молекула знаходиться у вільній від антигену формі. Це дозволяє скоротити період, коли антиген є вільним від антиген-зв'язувальних молекул in vivo (інакше кажучи, пролонгувати період, коли антиген зв'язаний з антиген-зв'язувальною молекулою). Наприклад, відношення антигенів, зв'язаних з антиген-зв'язувальними молекулами, до антигенів у плазмі в організмі (загальної кількості молекул антигенів, зв'язаних з антиген-зв'язувальними молекулами та вільних від них) взагалі зменшується протягом певного періоду часу після введення антиген-зв'язувальних молекул. Проте, таке зменшення можна пригальмувати (наприклад, ступінь зменшення можна зробити меншим) шляхом пролонгації часу утримання антиген-зв'язувальних молекул у формі, здатній зв'язуватися з антигенами. Наслідком цього стає підвищення відношення антигенів, зв'язаних з антиген-зв'язувальними молекулами, до антигенів в організмі протягом певного періоду часу після введення антитіла. Детальніше, у цьому винаході словосполучення "покращення фармакокінетики" необов'язково означає пролонгацію (подовження) часу, необхідного для елімінування антигензв'язувальної молекули після введення. Навіть якщо час, що є необхідним для елімінування антиген-зв'язувальної молекули після введення, залишається незмінним, у цьому винаході фармакокінетику можна вважати "покращеною", якщо: - час утримання у плазмі антиген-зв'язувальної молекули, що має форму, здатну зв'язуватися з антигеном (наприклад, антиген-зв'язувальна молекула має вільну від антигену форму) є пролонгованим; - період, коли антиген є вільним від антиген-зв'язувальної молекули в організмі, є скороченим (інакше кажучи, період, коли антиген-зв'язувальна молекула є зв'язаною з антигеном, є пролонгованим) та - відношення антигенів, зв'язаних з антиген-зв'язувальними молекулами, до антигенів в організмі є збільшеним. Отже, у цьому винаході словосполучення "покращення фармакокінетики" охоплює принаймні наступне: (1) пролонгацію часу, необхідного для елімінування антиген-зв'язувальної молекули з плазми після введення антиген-зв'язувальної молекули; (2) пролонгацію часу утримання у плазмі антиген-зв'язувальної молекули у формі, здатній зв'язуватися з антигеном після введення антиген-зв'язувальної молекули; (3) скорочення періоду, коли антиген є вільним від антиген-зв'язувальної молекули в 11 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 організмі після введення антиген-зв'язувальної молекули (пролонгацію періоду, коли антигензв'язувальна молекула є зв'язаною з антигеном в організмі); та (4) збільшення відношення антигенів, зв'язаних з антиген-зв'язувальними молекулами, до антигенів в організмі. Коли антиген – це розчинний антиген, що є присутнім у плазмі, навіть якщо фармакокінетика антиген-зв'язувальної молекули (швидкість елімінування з плазми) є еквівалентною, трапляються випадки, коли елімінування антигену, зв'язаного з антиген-зв'язувальною молекулою, прискорюється. Зниження фармакокінетики антигену (прискорення елімінування з плазми) зумовлює відносне покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальної молекули та, отже стає причиною пролонгації часу, коли антиген-зв'язувальна молекула є присутньою у плазмі у формі, здатній зв'язуватися з антигенами. Отже, в одному варіанті здійснення словосполучення "покращення фармакокінетики" антиген-зв'язувальних молекул цього винаходу включає підвищення швидкості елімінування розчинних антигенів з плазми після введення антиген-зв'язувальних молекул (здатність антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени з плазми). У цьому винаході, коли антиген – це мембранний антиген, тоді можна визначити за допомогою тесту, чи зв'язується єдина антиген-зв'язувальна молекула з численними антигенами, чи удосконалюється фармакокінетика антиген-зв'язувальної молекули. Визначити, чи "покращилася фармакокінетика", можна наступним способом. Наприклад, визначити, чи подовжився час, необхідний для елімінування антиген-зв'язувальної молекули після введення, можна шляхом визначення будь-якого одного з параметрів для антиген-зв'язувальної молекули, такого як період піврозпаду у плазмі, середній час утримання у плазмі та кліренс у плазмі ("Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nanzando). Наприклад, коли період піврозпаду у плазмі або середній час утримання у плазмі антиген-зв'язувальної молекули, яку ввели мишам, щурам, мавпам, кролям, собакам, людям або іншим тваринам, подовжився, тоді фармакокінетику антиген-зв'язувальної молекули вважають покращеною. Ці параметри можна визначити за допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, параметри можна належним чином визначити за допомогою некомпартментального аналізу, використовуючи програмне забезпечення для аналізу фармакокінетики WinNonlin (Pharsight) згідно з доданою інструкцією виробника. Альтернативно, чи подовжився час утримання у плазмі антиген-зв'язувальної молекули у формі, здатній зв'язуватися з антигенами після введення антиген-зв'язувальної молекули, можна визначити шляхом вимірювання концентрації у плазмі вільної від антигену антигензв'язувальної молекули та шляхом визначення будь-якого одного з параметрів для вільної від антигену антиген-зв'язувальної молекули, таких як період піврозпаду у плазмі, середній час утримання у плазмі та кліренс у плазмі. Концентрацію вільної від антигену антиген-зв'язувальної молекули у плазмі можна визначити за допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, такі вимірювання описано у Clin Pharmacol. 2008 Apr;48(4):406-17. Крім того, чи скоротився період, коли антиген є вільним від антиген-зв'язувальних молекул в організмі після введення антиген-зв'язувальних молекул (чи подовжився період, коли антигензв'язувальна молекула є зв'язаною з антигеном в організмі), можна визначити шляхом визначення концентрації у плазмі незв'язаного антигену, що є вільним від антиген-зв'язувальних молекул, та враховуючи період, коли концентрація вільного антигену у плазмі або відношення кількості вільного антигену до загальної кількості антигенів залишається низькою. Концентрацію у плазмі вільного антигену або відношення кількості вільного антигену до загальної кількості антигену можна визначити за допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, такі вимірювання описано у Pharm Res. 2006 Jan;23(1):95-103. Альтернативно, коли антиген впливає на деяку функцію in vivo, тоді визначити, чи зв'язався антиген антиген-зв'язувальною молекулою, яка нейтралізує функцію антигену (антагоністичною молекулою), можна шляхом випробовування того, чи нейтралізувалася функція антигену. Чи нейтралізувалася функція антигену, можна визначити, проаналізувавши in vivo маркер, який відбиває функцію антигену. Чи зв'язався антиген антиген-зв'язувальною молекулою, яка активує функцію антигену (агоністичною молекулою), можна визначити, проаналізувавши in vivo маркер, який відбиває функцію антигену. Нема жодного особливого обмеження стосовно визначення концентрації у плазмі вільного антигену та відношення кількості вільного антигену до загальної кількості антигену та стосовно аналізу маркера in vivo, проте визначення переважно виконується після певного періоду після введення антиген-зв'язувальної речовини. У цьому винаході такий період після введення антиген-зв'язувальної речовини особливо не обмежується, та належний період можуть визначити фахівці у цій галузі, залежно від властивостей антиген-зв'язувальної речовини, що 12 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вводиться, та їм подібного. Приклади періоду є наступними: один день після введення антигензв'язувальної речовини; три дні після введення антиген-зв'язувальної речовини; сім днів після введення антиген-зв'язувальної речовини, 14 днів після введення антиген-зв'язувальної речовини та 28 днів після введення антиген-зв'язувальної речовини. У цьому винаході переважно покращувати фармакокінетику у людини. Навіть коли важко визначити утримання у плазмі у людини, це можна передбачити на підставі утримання у плазмі у мишей (наприклад, звичайних мишей, трансгенних мишей, що експресують антиген людини, та трансгенних мишей, що експресують FcRn людини) або у мавп (наприклад, мавп cynomolgus). Способи визначення утримання у плазмі особливо не обмежуються. Визначення можна виконувати, наприклад, згідно зі способами, описаними у Прикладах цього опису винаходу. Чи є антиген-зв'язувальна молекула здатною зв'язуватися з антигенами багато разів, можна визначити, здійснивши тестування того, чи відокремлюється антиген, зв'язаний з антигензв'язувальною молекулою за такої ж самої нейтральної умови, що і у плазмі, за такої ж самої кислотної умови, що і в ендосомі, та зі скількома антигенами антиген-зв'язувальна молекула може повторно зв'язатися за нейтральної умови. Специфічно, визначення можна виконувати, дозволивши антиген-зв'язувальній молекулі та антигену утворити комплекс за нейтральної умови, піддавши цей комплекс дії кислотної умови протягом заздалегідь визначеного періоду часу, а потім зробити випробовування, чи може антиген-зв'язувальна молекула повторно зв'язуватися з антигеном за нейтральної умови, використовуючи при цьому пристрій для аналізу реакцій між антигеном та антиген-зв'язувальною молекулою, такий як Biacore. Коли антигензв'язувальна здатність антиген-зв'язувальної молекули, якій надано залежну від рН зв'язувальну здатність, зросла удвічі порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю антигензв'язувальної молекули перед модифікацією, тоді можна вважати, що кількість разів зв'язування антиген-зв'язувальної молекули, якій надано залежну від рН зв'язувальну здатність, зросла удвічі порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю антиген-зв'язувальної молекули перед модифікацією. Альтернативно, коли антиген – це мембранний антиген, та, отже, антигензв'язувальна молекула елімінується з плазми внаслідок опосередкованого антигеном захоплення та руйнування у лізосомі, тоді можна визначити, чи зросла кількість разів зв'язування антиген-зв'язувальної молекули, якій надано залежну від рН зв'язувальну здатність, порівняно з кількістю разів зв'язування до модифікації, шляхом порівняння фармакокінетики або тривалості зв'язування антигену між антиген-зв'язувальною молекулою, якій надано залежну від рН зв'язувальну здатність, та антиген-зв'язувальною молекулою до модифікації. Наприклад, коли тривалість зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули, якій надано залежну від рН зв'язувальну здатність, подовжується удвічі порівняно з антиген-зв'язувальною молекулою до модифікації, тоді вважають, що кількість разів зв'язування антиген-зв'язувальної молекули, якій надано залежну від рН зв'язувальну здатність, збільшується удвічі порівняно з антиген-зв'язувальною молекулою до модифікації. Альтернативно, коли визначається концентрація у плазмі незв'язаного антигену, що є вільним від антиген-зв'язувальної молекули, та період, коли концентрація у плазмі вільного антигену або відношення кількості вільного антигену до загальної кількості антигену залишається низькою, подовжується удвічі, тоді вважають, що кількість разів зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з наданою рНзалежною зв'язувальною здатністю збільшується удвічі порівняно з антиген-зв'язувальною молекулою до модифікації. Коли антиген – це розчинний антиген, якщо антиген, зв'язаний з антиген-зв'язувальною молекулою за нейтральної умови у плазмі, відокремлюється в ендосомі, а антиген-зв'язувальна молекула повертається до плазми, тоді антиген-зв'язувальна молекула може знов зв'язатися з антигеном за нейтральної умови у плазмі. Отже, антиген-зв'язувальна молекула, що має властивість відокремлюватися від антигену у кислотній умові ендосоми, є здатною зв'язуватися з антигенами багато разів. Порівняно з тим, коли антиген, зв'язаний з антиген-зв'язувальною молекулою, не відокремлюється в ендосомі (антиген залишається зв'язаним з антигензв'язувальною молекулою, коли повертається до плазми), у випадку, коли антиген, зв'язаний з антиген-зв'язувальною молекулою, відокремлюється в ендосомах, антиген доставляється в лізосому, а потім руйнується, та, отже, швидкість елімінування антигену з плазми зростає. Тобто, використовуючи швидкість елімінування антигену з плазми як показник, також можна визначити, чи є антиген-зв'язувальна молекула здатною зв'язуватися з антигенами багато разів. Швидкість елімінування антигену з плазми можна визначити, наприклад, шляхом введення антигенів (наприклад, мембранного антигену) та антиген-зв'язувальних молекул in vivo, а потім шляхом вимірювання концентрації антигенів у плазмі. Коли антиген (наприклад, мембранний антиген) виробляється або виділяється in vivo, тоді концентрація антигену у плазмі 13 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зменшується, якщо швидкість елімінування антигену з плазми зростає. Отже, можна також визначити, чи є антиген-зв'язувальна молекула здатною зв'язуватися з антигенами багато разів, використовуючи при цьому концентрацію антигену у плазмі як показник. У цьому описі винаходу словосполучення "збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули" означає, що кількість циклів зростає, коли за один цикл враховується процес, де антиген-зв'язувальна молекула, що вводиться людині, миші, мавпі або їм подібним, зв'язується з антигеном та інтерналізується у клітину. Специфічно, у цьому описі винаходу фраза "антиген-зв'язувальна молекула зв'язується двічі з антигеном" означає, що антиген-зв'язувальна молекула, зв'язана з антигеном, інтерналізується у клітину та виділяється у вільній від антигену формі за межі клітини, та виділена антиген-зв'язувальна молекула знов зв'язується з іншим антигеном та знов інтерналізується у клітину. Коли антиген-зв'язувальна молекула інтерналізується у клітину, тоді вона може бути у формі, зв'язаній з єдиним антигеном, або двома, або більше антигенами. У цьому описі винаходу фраза "кількість разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули зростає" необов'язково означає, що кількість разів зв'язування з антигеном зростає у кожної антиген-зв'язувальної молекули. Наприклад, серед антиген-зв'язувальних молекул у сукупності антиген-зв'язувальних молекул може зростати пропорція антиген-зв'язувальних молекул, які зв'язуються з антигенами двічі або більше разів, або може зростати середня кількість зв'язувальних подій антиген-зв'язувальних молекул у сукупності антиген-зв'язувальних молекул. У цьому винаході переважно, щоб кількість разів зв'язування з антигеном антигензв'язувальної молекули зростала, коли молекула вводиться людині. Проте, коли важко визначити кількість разів зв'язування антигену у людини, тоді кількість разів зв'язування у людини можна передбачити на підставі результатів, отриманих внаслідок вимірювання або аналізу in vitro із використанням мишей (наприклад, трансгенних мишей, що експресують антиген, та трансгенних мишей, що експресують FcRn людини) або мавп (наприклад, мавп cynomolgus). У цьому винаході переважно, щоб антиген-зв'язувальна молекула зв'язувалася з антигенами двічі або більше разів. Наприклад, переважно, щоб антиген-зв'язувальні молекули у сукупності антиген-зв'язувальних молекул принаймні у 10 % випадків або більше, переважно у 30 % випадків або більше, більш переважно у 50 % випадків або більше та іще більш переважно у 80 % випадків або більше (наприклад, у 90 % випадків або більше, у 95 % випадків або більше тощо) зв'язувалися з антигенами двічі або більше разів. У цьому описі винаходу фраза "збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою" означає збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою протягом періоду, доки антиген-зв'язувальна молекула не зруйнується у лізосомі клітини після введення антиген-зв'язувальної молекули тварині, такій як людина, миша або мавпа. Взагалі, антитіла, такі як IgG, мають два зв'язувальні домени, та, отже, єдине антитіло зв'язується максимум з двома антигенами. Антитіло, зв'язане з антигеном (антигенами), інтерналізується у клітину, та антитіло та антиген (антигени) руйнуються у лізосомі. Звичайно, антитіла, такі як IgG, можуть зв'язуватися максимум з двома антигенами. Коли антигензв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули, такої як антитіло, при ендосомному рН ослаблюється порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН плазми шляхом використання способів цього винаходу, тоді антиген-зв'язувальна молекула, така як антитіло, інтерналізована у клітину, відокремлюється від антигену, та виділяється за межі клітини, та, отже, може знов зв'язуватися з іншим антигеном. Інакше кажучи, способи цього винаходу дозволяють антиген-зв'язувальній молекулі зв'язуватися з більшою кількістю антигенів, ніж кількість її антиген-зв'язувальних ділянок. Специфічно, внаслідок використання способів цього винаходу, наприклад, IgG, що має дві антиген-зв'язувальні ділянки, може зв'язуватися з трьома або більше антигенами, переважно чотирма або більше антигенами, протягом періоду, доки антитіло не руйнується після введення. Наприклад, коли антитіло – це нейтралізуюче антитіло, тоді словосполучення "збільшення кількості антигенів, які можуть зв'язуватися антигензв'язувальною молекулою" можна взаємозамінювати словосполученням "збільшення кількості антигенів, які антиген-зв'язувальна молекула може нейтралізувати". Отже, слово "зв'язувати" можна замінити словом "нейтралізувати", коли антитіло – це нейтралізуюче антитіло. У цьому винаході словосполучення "збільшення кількості антигенів, що можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою" необов'язково означає збільшення кількості антигенів, що можуть зв'язуватися кожною антиген-зв'язувальною молекулою. Наприклад, середня кількість антигенів, що можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою у сукупності антиген 14 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язувальних молекул, може збільшуватися, або може збільшуватися пропорція антигензв'язувальних молекул, які можуть зв'язуватися з більшою кількістю антигенів, ніж кількість їхніх антиген-зв'язувальних ділянок. У цьому винаході переважно, щоб кількість антигенів, що можуть зв'язуватися антигензв'язувальною молекулою, збільшувалася, коли молекула вводиться людині. Проте, коли важко визначити таку кількість у людини, тоді кількість у людини можна передбачити на підставі результатів, отриманих внаслідок вимірювання або аналізу in vitro із використанням мишей (наприклад, трансгенних мишей, що експресують антиген, та трансгенних мишей, що експресують FcRn людини) або мавп (наприклад, мавп cynomolgus). Коли антитіло – це нейтралізуюче антитіло, тоді зазвичай припускають, що вищеописана кількість разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули корелює з кількістю антигенів, які можуть бути нейтралізовані антиген-зв'язувальною молекулою. Отже, кількість антигенів, які можуть бути нейтралізовані антиген-зв'язувальною молекулою, можна визначити за такими ж самими способами, які описано вище для визначення кількості разів зв'язування антиген-зв'язувальної молекули. Крім того, цим винаходом пропонуються способи зв'язування антиген-зв'язувальної молекули з антигенами двічі або більше разів в організмі шляхом введення антигензв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при кислотному рН є нижчою, ніж при нейтральному рН. Цей винахід також стосується способів нейтралізації антигенів, кількість яких є більшою, ніж кількість антиген-зв'язувальних ділянок антиген-зв'язувальної молекули, яка має нейтралізуючу активність, шляхом введення антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при кислотному рН є нижчою, ніж при нейтральному рН. Переважно, цей винахід стосується способів нейтралізації трьох або більше антигенів, переважно чотирьох або більше антигенів шляхом введення IgG, антиген-зв'язувальна активність якого при кислотному рН є нижчою, ніж при нейтральному рН. Цей винахід також стосується способів відокремлення усередині клітини антигену від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. У цьому винаході антиген може відокремлюватися від антиген-зв'язувальної молекули будь-де усередині клітини; проте, переважно, щоб антиген відокремлювався усередині ранньої ендосоми. У цьому винаході фраза "антиген відокремлюється усередині клітини від зв'язаної з ним ззовні антигензв'язувальної молекули" необов'язково означає, що кожен антиген, інтерналізований у клітину внаслідок зв'язування з антиген-зв'язувальною молекулою, відокремлюється від антигензв'язувальної молекули усередині клітини. Можна прийняти, що пропорція антигену, який відокремлюється від антиген-зв'язувальної молекули усередині клітини, збільшується порівняно з пропорцією до ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Крім того, цей винахід стосується способів підсилення внутрішньоклітинного зв'язування антиген-зв'язувальної молекули, вільної від антигену, з FcRn шляхом ослаблення антигензв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антигензв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Звичайно, FcRn зв'язується з антигензв'язувальною молекулою усередині ендосоми. Проте, припускається, що антиген-зв'язувальна молекула, зв'язана з мембранним антигеном, не зв'язується з FcRn. Отже, у переважному варіанті здійснення, коли антиген - це зв'язаний з мембраною антиген, тоді цей винахід включає способи підсилення ендосомного відокремлення антигенів від антиген-зв'язувальних молекул та, внаслідок цього, підсилення зв'язування з FcRn антиген-зв'язувальних молекул шляхом ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при ендосомному рН (кислотному рН) порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при рН плазми (нейтральному рН). Коли антиген – це розчинний антиген, тоді антиген-зв'язувальна молекула може зв'язуватися з FcRn у присутності або відсутності антигену. Якщо відокремлення антигену від антиген-зв'язувальної молекули усередині ендосом можна стимулювати шляхом ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при внутрішньоендосомному (кислотному) рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при рН плазми (нейтральному рН), тоді зв'язування з FcRn антиген-зв'язувальної молекули, що є "вільною від антигену", можна підсилити за допомогою способів цього винаходу. Незалежно від того, чи є антиген розчинним або зв'язаним з мембраною, якщо антигензв'язувальна молекула, вільна від антигену, може повертатися до плазми з FcRn, то антигензв'язувальна молекула може знов зв'язуватися з антигеном. Повторюючи цей процес, антиген 15 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язувальна молекула може зв'язуватися з антигеном багато разів. У цьому винаході словосполучення "підсилення зв'язування з FcRn антиген-зв'язувальної молекули усередині клітини" необов'язково означає, що кожна антиген-зв'язувальна молекула зв'язується з FcRn. Можна прийняти, що пропорція антиген-зв'язувальних молекул, вільних від антигену, які зв'язуються з FcRn усередині клітини, збільшується порівняно з пропорцією до ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при ендосомному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при рН плазми. Переважні антиген-зв'язувальні молекули у способах цього винаходу підсилення внутрішньоклітинного зв'язування між антигензв'язувальною молекулою та FcRn включають, наприклад, антиген-зв'язувальні молекули, які зв'язуються зі зв'язаними з мембраною антигенами (мембранними антигенами), такими як мембранні білки. Інші переважні антиген-зв'язувальні молекули включають антиген-зв'язувальні молекули, які зв'язуються з розчинними антигенами, такими як розчинні білки. Способи підсилення зв'язування антиген-зв'язувальної молекули та FcRn усередині клітини альтернативно називаються способами стимулювання зв'язування з FcRn антиген-зв'язувальної молекули усередині клітини, наприклад, усередині ендосом. Крім того, цей винахід стосується способів виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. У цьому винаході вираз "виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини" необов'язково означає, що кожна антиген-зв'язувальна молекула, що зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, виділяється у вільній від антигену формі за межі клітини. Можна прийняти, що пропорція антиген-зв'язувальних молекул, що виділяються за межі клітини, збільшується порівняно з пропорцією до ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антигензв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Переважно, щоб антиген-зв'язувальна молекула, що виділяється за межі клітини, зберігала антиген-зв'язувальну здатність. Крім того, спосіб виділення антигензв'язувальної молекули, що зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини можна також назвати способом надання антиген-зв'язувальній молекулі такої властивості, що антиген-зв'язувальна молекула стає такою, яку легше виділити за межі клітини у вільній від антигену формі, коли антиген-зв'язувальна молекула зв'язана з антигеном та інтерналізована у клітину. Крім того, цей винахід стосується способів підвищення здатності антиген-зв'язувальних молекул елімінувати антигени у плазмі шляхом ослаблення антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальних молекул при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН. У цьому винаході термін "здатність елімінувати антигени у плазмі" означає здатність елімінувати з плазми антигени, які є присутніми у плазмі, коли антигензв'язувальні молекули вводяться in vivo або виділяються in vivo. Отже, у цьому винаході словосполучення "підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антиген у плазмі" означає, що швидкість елімінування антигенів з плазми, коли антиген-зв'язувальні молекули вводяться in vivo, прискорюється порівняно зі швидкістю до зниження антигензв'язувальної здатності антиген-зв'язувальних молекул при кислотному рН порівняно з антигензв'язувальною здатністю при нейтральному рН. Чи зростає здатність антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі, можна визначити, наприклад, шляхом введення розчинних антигенів та антиген-зв'язувальних молекул in vivo, а потім вимірювання концентрації розчинних антигенів у плазмі. Коли концентрація розчинних антигенів у плазмі після введення розчинних антигенів та антиген-зв'язувальних молекул зменшується внаслідок зниження антиген-зв'язувальної здатності антиген-зв'язувальної молекули при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН, тоді можна визначити, що здатність антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі підвищилася. Цей винахід також стосується способів покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальної молекули шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу. Крім того, цим винаходом пропонуються способи збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антиген-зв'язувальної молекули шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу. Крім того, цей винахід стосується способів збільшення кількості антигенів, які можуть 16 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою, шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу. Цим винаходом також пропонуються способи відокремлення антигену усередині клітини від антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антигензв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу. Цим винаходом також пропонуються способи виділення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу. Цим винаходом також пропонуються способи підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі шляхом заміщення гістидином або неприродною амінокислотою принаймні однієї амінокислоти в антиген-зв'язувальній молекулі або шляхом вставки гістидину або неприродної амінокислоти у молекулу. Сайт гістидинової мутації або мутації неприродною амінокислотою (заміщення, вставка тощо) особливо не обмежується. Заміну гістидином або неприродною амінокислотою можна зробити на будь-якому сайті, або гістидин або неприродну амінокислоту можна вставити на будь-якому сайті. Переважні сайти заміщення або вставки гістидину або неприродної амінокислоти включають, наприклад, сайти усередині ділянки, що має вплив на антигензв'язувальну здатність антиген-зв'язувальної молекули. Наприклад, коли антиген-зв'язувальна молекула – це антитіло, тоді такі ділянки включають варіабельну ділянку або гіперваріабельну ділянку (CDR) антитіла. Кількість гістидинових мутацій або мутацій неприродною амінокислотою особливо не обмежується. Гістидином або неприродною амінокислотою можна замістити або їх можна вставити на єдиному сайті або на двох або більше сайтах. Крім того, делецію, додавання, вставку та/або заміщення інших амінокислот можна зробити одночасно із заміщенням або вставкою гістидину або неприродної амінокислоти. У цьому винаході, коли антиген-зв'язувальна молекула – це антитіло, тоді можливі сайти заміщення гістидином або неприродною амінокислотою включають, наприклад, сайти у послідовності CDR або послідовності, що є відповідальною за структуру CDR антитіла. Такі сайти включають, наприклад, сайти, перелічені нижче. Амінокислотні позиції пронумеровано на підставі нумерації за Kabat (Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH). Важкий ланцюг: H27, H31, H32, H33, H35, H50, H58, H59, H61, H62, H63, H64, H65, H99, H100b та H102. Легкий ланцюг: L24, L27, L28, L32, L53, L54, L56, L90, L92 та L94. Серед вищевказаних сайтів H32, H61, L53, L90 та L94 можуть бути універсальними сайтами модифікації. Коли антиген – це рецептор IL-6 (наприклад, рецептор IL-6 людини), переважні сайти модифікації включають наступні. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ними. Важкий ланцюг: H27, H31, H32, H35, H50, H58, H61, H62, H63, H64, H65, H100b та H102. Легкий ланцюг: L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L92 та L94. Коли гістидином або неприродною амінокислотою роблять заміщення на численних сайтах, тоді переважні комбінації сайтів заміщення включають, наприклад, комбінацію H27, H31 та H35; комбінацію H27, H31, H32, H35, H58, H62 та H102; комбінацію L32 та L53 та комбінацію L28, L32 та L53. Коли антиген – це IL-6 (наприклад, IL-6 людини), тоді переважні сайти модифікації включають наступні. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ними. Важкий ланцюг: H32, H59, H61 та H99. Легкий ланцюг: L53, L54, L90 та L94. Коли антиген – це рецептор IL-31 (наприклад, рецептор IL-31 людини), тоді переважні сайти модифікації включають Н33. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ним. Стосовно вищевказаних сайтів, тільки один сайт може заміщуватися гістидином або неприродною амінокислотою. Альтернативно, численні сайти можуть заміщуватися гістидином або неприродною амінокислотою. Способи цього винаходу можна використовувати для будь-яких антиген-зв'язувальних молекул, незалежно від типу антигену-мішені. Антиген-зв'язувальні молекули цього винаходу особливо не обмежуються, доки вони мають 17 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 специфічну зв'язувальну активність з антигеном, що представляє інтерес. Переважні антигензв'язувальні молекули цього винаходу включають, наприклад, речовини, що мають антигензв'язувальний домен антитіла. Антиген-зв'язувальний домен антитіла включає, наприклад, CDR та варіабельну ділянку. Коли антиген-зв'язувальний домен антитіла – це CDR, тоді антигензв'язувальна молекула може включати усі шість CDR цілого антитіла, або одну, або дві, або більше з них. Альтернативно, коли антиген-зв'язувальна молекула включає CDR як зв'язувальний домен антитіла, тоді CDR може включати амінокислотну делецію, заміщення, додавання та/або вставку або може бути частковою CDR. Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів покращення фармакокінетики антиген-зв'язувальних молекул шляхом модифікації (наприклад, шляхом амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі. Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів збільшення кількості разів зв'язування з антигеном антигензв'язувальної молекули шляхом модифікації (наприклад, амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі. Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів збільшення кількості антигенів, що можуть зв'язуватися антиген-зв'язувальною молекулою шляхом модифікації (наприклад, амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі. Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів відокремлення усередині клітини антигену від антигензв'язувальної молекули, яка зв'язалася з ним ззовні клітини, шляхом модифікації (наприклад, амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі. Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів вивільнення антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину, у вільній від антигену формі за межі клітини шляхом модифікації (наприклад, амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі. Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула включає константну ділянку антитіла, тоді цей винахід стосується способів підвищення здатності антиген-зв'язувальної молекули елімінувати антигени у плазмі шляхом модифікації (наприклад, амінокислотного заміщення, делеції, додавання та/або вставки) константної ділянки антитіла в антиген-зв'язувальній молекулі. У переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальна речовина цього винаходу включає антиген-зв'язувальні речовини, які включають FcRn-зв'язувальну ділянку. Після інтерналізації у клітини антиген-зв'язувальні речовини, які включають FcRn-зв'язувальну ділянку, можуть повертатися до плазми FcRn-реутилізаційним шляхом. FcRn-зв'язувальна ділянка – це переважно домен, який безпосередньо зв'язується з FcRn. Переважна FcRn-зв'язувальна ділянка включає, наприклад, ділянки Fc антитіла. Проте, FcRn-зв'язувальна ділянка цього винаходу може бути ділянкою, яка може зв'язуватися з поліпептидом, що має здатність зв'язуватися з FcRn, таким як альбумін або IgG, оскільки така ділянка, яка може зв'язуватися з поліпептидом, що має FcRn-зв'язувальну здатність, може зв'язуватися опосередковано з FcRn за допомогою альбуміну, IgG тощо. Антигени, що розпізнаються антиген-зв'язувальними молекулами, такими як антитіла, що представляють інтерес у способах цього винаходу, особливо не обмежуються. Такі антитіла, що представляють інтерес, можуть розпізнавати будь-який антиген. Антитіла, фармакокінетику яких слід покращити за способами цього винаходу, включають, наприклад, антитіла, які розпізнають мембранні антигени, такі як рецепторні білки (зв'язані з мембраною рецептори та розчинні рецептори), та клітинні поверхневі маркери, та антитіла, які розпізнають розчинні антигени, такі як цитокіни. Переважні приклади мембранних антигенів цього винаходу включають мембранні білки. Приклади розчинних антигенів цього винаходу включають розчинні білки. Антигени, що розпізнаються антитілами, фармакокінетику яких слід покращити способами цього винаходу, включають, наприклад, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL31, IL-23, рецептор IL-2, рецептор IL-6, рецептор OSM, gp130, рецептор IL-5, CD40, CD4, Fas, остеопонтин, CRTH2, CD26, PDGF-D, CD20, моноцитний хемотактичний фактор, CD23, TNF-α, HMGB-1, інтегрин α4, ICAM-1, CCR2, CD11a, CD3, IFNγ, BLyS, HLA-DR, TGF-β, CD52 та рецептор IL-31. Особливо переважні антигени включають рецептор IL-6. 18 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, антиген-зв'язувальна молекула, що представляє інтерес у способах цього винаходу, включає антиген-зв'язувальні молекули, які мають антагоністичну активність (антагоністичні антиген-зв'язувальні молекули) та антиген-зв'язувальні молекули, що мають агоністичну активність (агоністичні антиген-зв'язувальні молекули). У переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальна молекула включає антагоністичні антиген-зв'язувальні молекули, зокрема, антагоністичні антиген-зв'язувальні молекули, що розпізнають мембранні антигени, такі як рецептори, або розчинні антигени, такі як цитокіни. Наприклад, антагоністична антиген-зв'язувальна молекула, яка розпізнає рецептор, інгібує зв'язування ліганду з рецептором шляхом зв'язування з рецептором та, отже, інгібує передачу сигналу, опосередковану рецептором. У цьому винаході антиген-зв'язувальна молекула, яка представляє інтерес, особливо не обмежується, та вона може бути будь-якою антиген-зв'язувальною молекулою. Антигензв'язувальна молекула цього винаходу переважно має як антиген-зв'язувальну активність (антиген-зв'язувальну ділянку), так і FcRn-зв'язувальну ділянку. Зокрема, переважна антигензв'язувальна молекула цього винаходу включає ділянку, яка зв'язується з FcRn людини. Антиген-зв'язувальна молекула, яка має як антиген-зв'язувальну активність, так і FcRnзв'язувальну ділянку, включає, наприклад, антитіла. Антитіла, переважні у контексті цього винаходу, включають, наприклад, антитіла IgG. Коли антитіло, яке слід використовувати, - це антитіло IgG, тоді тип IgG не обмежується; можна використовувати IgG, що належить до будьякого ізотипу (підкласу), такий як IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Крім того, амінокислотні мутації (наприклад, М73) можна вводити у константну ділянку будь-якого з цих ізотипів IgG. Амінокислотні мутації, які слід вводити, включають, наприклад, ті мутації, які підсилюють або ослаблюють зв'язування з рецептором Fcγ (Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):400510), або ті, що підсилюють або ослаблюють зв'язування з FcRn (J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604), проте вони не обмежуються цими прикладами. Альтернативно, можна змінювати залежне від рН зв'язування шляхом вибирання відповідної константної ділянки, такої як IgG2. Коли антиген-зв'язувальна молекула, яка представляє інтерес цього винаходу, - це антитіло, тоді вона може бути антитілом, що походить від будь-якої тварини, таким як мишаче антитіло, антитіло людини, антитіло щура, антитіло кроля, антитіло козла або антитіло верблюда. Крім того, антитіло може бути модифікованим антитілом, наприклад, химерним антитілом, та зокрема, модифікованим антитілом, яке включає амінокислотне заміщення у послідовності гуманізованого антитіла, тощо. Антитіла також включають біспецифічні антитіла, продукти модифікації антитіл, з'єднані з різними молекулами, та поліпептиди, які включають фрагменти антитіл. "Химерні антитіла" - це антитіла, отримані внаслідок комбінації послідовностей, що походять від різних тварин. Специфічно, химерне антитіло включає, наприклад, антитіла, що мають варіабельні (V) ділянки важкого та легкого ланцюгів від мишачого антитіла та константні (С) ділянки важкого та легкого ланцюгів від антитіла людини. "Гуманізовані антитіла", які також називаються антитілами людини зі зміненою формою, - це антитіла, у яких гіперваріабельні ділянки (CDR) антитіла, що походять від ссавця, що не є людино, наприклад, миші, трансплантуються у CDR антитіла людини. Способи ідентифікації CDR є відомими (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342:877). Загальні способи генетичної рекомбінації, що є придатними для цього, є також відомими (дивись Європейську патентну заявку EP 125023 та WO 96/02576). Термін "біспецифічне антитіло" означає антитіло, яке має у молекулі одного й того ж самого антитіла варіабельні ділянки, які розпізнають різні епітопи. Біспецифічне антитіло може бути антитілом, яке розпізнає два або більше різних антигенів, або антитілом, яке розпізнає два або більше різних епітопів на одному й тому ж антигені. Крім того, поліпептиди, що включають фрагменти антитіла, включають, наприклад, фрагменти Fab, фрагменти F(ab")2, scFv (Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36), доменні антитіла (dAb) (WO 2004/058821, WO 2003/002609), scFv-Fc (WO 2005/037989), dAb-Fc та злиті білки Fc. З них, молекули, що включають домен Fc, мають активність зв'язування з FcRn, та внаслідок цього є придатними для використання у способах, розкритих у цьому винаході. Крім того, антиген-зв'язувальні молекули, які можна використовувати у цьому винаході, можуть бути подібними до антитіла молекулами. Антитіло-подібна молекула – це молекула, яка може демонструвати функції шляхом зв'язування з молекулою-мішенню (Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658; Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10; Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469; Protein Science 2006, 15:14-27), та включає, наприклад, 19 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 DARPins (WO 2002/020565), Affibody (WO 1995/001937), Avimer (WO 2004/044011; WO 2005/040229) та Adnectin (WO 2002/032925). Якщо ці антитіло-подібні молекули можуть зв'язуватися з молекулами-мішенями залежним від рН чином, тоді єдина молекула може зв'язуватися з багатьма молекулами-мішенями. Крім того, антиген-зв'язувальна молекула може бути рецепторним білком або злитим з рецептором білком Fc, який зв'язується з мішенню, включаючи, наприклад, злитий білок TNFRFc, злитий білок IL1R-Fc, злитий білок VEGFR-Fc та злитий білок CTLA4-Fc (Nat Med. 2003 Jan;9(1):47-52; BioDrugs. 2006;20(3):151-60). Якщо такі рецепторні білки та злиті з рецептором білки Fc можуть зв'язуватися з молекулами-мішенями залежним від рН чином, тоді єдина молекула може зв'язуватися з багатьма молекулами-мішенями. Крім того, антиген-зв'язувальна молекула може бути штучним лігандним білком або штучним злитим лігандним білком, який зв'язується з мішенню та має нейтралізуючий ефект, та включає, наприклад, мутантний IL-6 (EMBO J. 1994 Dec 15;13(24):5863-70). Якщо такі штучні лігандні білки або штучні злиті лігандні білки можуть зв'язуватися з молекулами-мішенями залежним від рН чином, тоді єдина молекула може зв'язуватися з багатьма молекуламимішенями. Крім того, антитіла цього винаходу можуть включати модифіковані цукрові ланцюги. Антитіла з модифікованими цукровими ланцюгами включають, наприклад, антитіла з модифікованою глікозиляцією (WO 99/54342), антитіла з дефіцитом у фукозі, що додається до цукрового ланцюга (WO 00/61739; WO 02/31140; WO 2006/067847; WO 2006/067913) та антитіла, що мають цукрові ланцюги з бісекторним GlcNAc (WO 02/79255). Хоча способи цього винаходу не обмежуються будь-якою специфічною теорією, взаємозв'язок між послабленням антиген-зв'язувальної здатності при кислотному рН порівняно з антиген-зв'язувальною здатністю при нейтральному рН, покращення фармакокінетики та багаторазове зв'язування з антигеном можна пояснити, наприклад, наступним чином. Наприклад, коли антитіло – це антитіло, що зв'язується з мембранним антигеном, тоді антитіло, яке введене в організм, зв'язується з антигеном, а потім захоплюється шляхом інтерналізації в ендосоми у клітинах разом з антигеном та при цьому антитіло зберігає зв'язок з антигеном. Потім, антитіло переміщується до лізосом, зберігаючи зв'язок з антигеном, та антитіло руйнується лізосомою разом з антигеном. Опосередковане інтерналізацією елімінування з плазми називається антиген-залежним елімінуванням, та повідомлялося про таке елімінування багатьма молекулами-антитілами (Drug Discov Today. 2006 Jan;11(1-2):81-8). Коли єдина молекула антитіла IgG зв'язується з антигенами двовалентним чином, тоді єдина молекула антитіла інтерналізується, зберігаючи зв'язок з двома молекулами антигену, та руйнується у лізосомі. Отже, у випадку звичайних антитіл одна молекула антитіла IgG не може зв'язуватися з трьома або більше молекулами антигену. Наприклад, єдина молекула антитіла IgG, що має нейтралізуючу активність, не може нейтралізувати три або більше молекул антигену. Відносно подовжене утримання (повільне елімінування) молекул IgG у плазмі є наслідком функції FcRn, що є відомим як рецептор реутилізації молекул IgG. Коли молекули IgG захоплюються в ендосоми внаслідок піноцитозу, тоді вони зв'язуються з FcRn, що експресується в ендосомах за кислотних умов, що існують в ендосомах. У той час, коли молекули IgG, які не зв'язалися з FcRn, переносяться до лізосом, де вони руйнуються, молекули IgG, що зв'язалися з FcRn, переміщуються до клітинної поверхні та знов повертаються у плазму, при цьому відокремлюючись від FcRn за нейтральних умов у плазмі. Альтернативно, коли антиген – це антиген, який зв'язується з розчинним антигеном, тоді антитіло, яке введене в організм, зв'язується з антигеном, а потім захоплюється у клітини, при цьому антитіло зберігає зв'язок з антигеном. Багато антитіл, захоплених у клітини, виділяються за межі клітин завдяки FcRn. Проте, оскільки антитіла виділяються за межі клітин та при цьому зберігають зв'язок з антигенами, то антитіла не можуть зв'язуватися з антигенами знов. Отже, подібно до антитіл, що зв'язуються з мембранними антигенами, у випадку звичайних антитіл, одна молекула антитіла IgG не може зв'язуватися з трьома або більше молекулами антигенів. Автори цього винаходу зробили висновок, що, коли антитіла, які зв'язуються з антигенами, такими як мембранні антигени, захоплюються в ендосоми шляхом інтерналізації, то антитіла, які зберігають зв'язок з антигенами, переміщуються до лізосом та руйнуються, а антитіла IgG, від яких антигени відокремлюються в ендосомах, можуть зв'язуватися з FcRn, які експресуються в ендосомах. Специфічно, автори цього винаходу визначили, що антитіло, яке сильно зв'язується з антигеном у плазмі, проте слабо зв'язується з антигеном усередині ендосоми, може зв'язуватися з антигеном у плазмі та, продовжуючи утворювати комплекс з антигеном, захоплюватися в ендосоми у клітинах внаслідок інтерналізації; потім відокремлюватися від 20 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антигену в ендосомі; потім зв'язуватися з FcRn та переміщуватися до клітинної поверхні та повертатися знов у плазму у стані, не зв'язаному з антигенами, внаслідок чого воно нейтралізує численні антигени, зв'язані з мембраною. Крім того, автори цього винаходу визначили, що антитіло, яке має властивість сильно зв'язуватися з антигенами у плазмі, проте слабо зв'язуватися з антигенами в ендосомі, може відокремлюватися від антигенів в ендосомі, навіть коли антитіло зв'язалося з антигенами, такими як розчинні антигени; отже, вони знов виділяються у плазму у незв'язаному з антигенами стані та можуть нейтралізувати численні розчинні антигени. Зокрема, автори цього винаходу відмітили, що рН у плазмі відрізнялося від рН в ендосомах, та, отже, вони визначили, що антитіла, які сильно зв'язуються з антигенами в умовах рН плазми, проте слабо зв'язуються з антигенами в умовах ендосомного рН, мали перевагу стосовно утримання у плазмі, оскільки одна молекула антитіла могла зв'язуватися з численними антигенами. Ендосоми, які є мембранними везикулами, утворюють мережі у цитоплазмі еукаріотних клітин, та вони відповідають за метаболізм макромолекул у процесі від клітинної мембрани до лізосом. Повідомлялося, що рН в ендосомах є зазвичай кислотним рН, яке становить від 5,5 до 6,0 (Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32). Проте, відомо, що рН у плазмі є майже нейтральним (звичайно 7,4). Отже, антиген-зв'язувальна молекула, антиген-зв'язувальна активність якої при кислотному рН є більш слабкою порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при нейтральному рН, зв'язується з антигеном у плазмі, яка має нейтральний рН, захоплюється у клітини, а потім відокремлюється від антигену в ендосомах, які мають кислотний рН. Антиген-зв'язувальна молекула, яка відокремилася від антигену, зв'язується з FcRn, переміщується до клітинної поверхні та повертається знов у плазму у незв'язаному з антигенами стані. Внаслідок цього антиген-зв'язувальна молекула може зв'язуватися з антигенами багато разів, що зумовлює покращення фармакокінетики. Речовини антиген-зв'язувальних молекул Крім того, цим винаходом пропонуються антиген-зв'язувальні молекули, антигензв'язувальна активність яких при рН від 4,0 до 6,5 є нижчою, ніж при рН від 6,7 до 10,0, переважно антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН від 5,0 до 6,0 є нижчою, ніж при рН від 7,0 до 8,0. Специфічно, антиген-зв'язувальні молекули, антигензв'язувальна активність яких при рН від 4,0 до 6,5 є нижчою, ніж при рН від 6,7 до 10,0, включають, наприклад, антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4. Антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, можуть також визначатися як антигензв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 7,4 є вищою, ніж при рН 5,8. Що стосується антиген-зв'язувальних молекул цього винаходу, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, доки антиген-зв'язувальна активність при рН 5,8 є нижчою, ніж зв'язування при рН 7,4, то нема обмежень стосовно різниці у зв'язувальній активності, та антиген-зв'язувальна активність при рН 5,8 мусить тільки бути нижчою, навіть незначно. Переважний варіант здійснення антиген-зв'язувальної молекули цього винаходу, антигензв'язувальна активність якої при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, включає антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 7,4 удвічі або більше перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН 5,8. Більш переважний варіант здійснення антигензв'язувальної молекули включає антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 7,4 у десять разів або більше перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН 5,8. Іще більш переважний варіант здійснення антиген-зв'язувальної молекули включає антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 7,4 у 40 разів або більше перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН 5,8. Специфічно, у переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальна молекула цього винаходу має антиген-зв'язувальну активність при рН 5,8, яка є нижчою, ніж при рН 7,4, де значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4), яке є відношенням KD для антигену при рН 5,8 та KD для антигену при рН 7,4, переважно становить 2 або більше, більш переважно 10 або більше, та іще більш переважно 40 або більше. Верхня границя значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) особливо не обмежується та може мати будь-яке значення, наприклад, 400, 1000 або 10000, доки молекулу можна одержувати за способами, звичайними для фахівців у цій галузі. В іншому переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальна молекула цього винаходу, антиген-зв'язувальна активність якої при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, має значення kd(pH5,8)/kd(pH7,4), яке є відношенням k d для антигену при рН 5,8 та k d для антигену при рН 7,4, 21 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 яке становить 2 або більше, більш переважно 5 або більше, навіть більш переважно 10 або більше та іще більш переважно 30 або більше. Верхня границя значення k d(pH5,8)/kd(pH7,4) особливо не обмежується та може мати будь-яке значення, наприклад, 50, 100 або 200, доки молекулу можна одержувати за способами, звичайними для фахівців у цій галузі. Умови, відмінні від рН, при яких вимірюється антиген-зв'язувальна активність, можуть відповідним чином бути вибрані фахівцями у цій галузі, та ці умови особливо не обмежуються; проте, вимірювання можна виконувати, наприклад, в умовах буфера MES та при 37 °C, як описано у Прикладах. Крім того, антиген-зв'язувальну активність антиген-зв'язувальної молекули можна визначити за способами, відомими фахівцям у цій галузі, наприклад, використовуючи Biacore Т100 (GE Healthcare) або йому подібний, як описано у Прикладах. Передбачається, що така антиген-зв'язувальна молекула, яка слабо зв'язується з антигеном при кислотному рН, легко відокремлюється від антигену в ендосомних кислотних умовах, та що після інтерналізації у клітини вона зв'язується з FcRn та легко виділяється за межі клітин. Антиген-зв'язувальна молекула, що виділяється за межі клітин, не руйнуючись усередині клітин, може знов зв'язуватися з іншими антигенами. Отже, коли антиген-зв'язувальна молекула – це, наприклад, антиген-зв'язувальна нейтралізуюча молекула, при цьому - це антиген-зв'язувальна молекула, що може легко відокремитися від антигену при ендосомних кислотних умовах, тоді вона може зв'язуватися з антигенами багато разів та нейтралізувати їх. Внаслідок цього антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН від 4,0 до 6,5 є нижчою, ніж при рН від 6,7 до 10,0, є найкращими стосовно утримання у плазмі. У переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальна молекула, антиген-зв'язувальна активність якої при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, включає антиген-зв'язувальні молекули, у яких принаймні одна амінокислота в антиген-зв'язувальній молекулі заміщена гістидином або неприродною амінокислотою або у які вставлений принаймні один гістидин або неприродна амінокислота. Ділянка, у яку вводиться мутація гістидином або неприродною амінокислотою, особливо не обмежується, та вона може бути будь-якою ділянкою, доки антиген-зв'язувальна активність при рН 5,8 є слабшою, ніж при рН 7,4 (значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) є більшим або значення kd(pH5,8)/kd(pH7,4) є більшим) порівняно з антиген-зв'язувальною активністю до заміщення. Приклади включають варіабельні ділянки та гіперваріабельні ділянки (CDR) антитіла у випадку, коли антиген-зв'язувальна молекула – це антитіло. Кількість амінокислот, які слід замістити гістидином або неприродною амінокислотою, та кількість амінокислот, які слід вставити, можуть відповідним чином визначити фахівці у цій галузі. Одна амінокислота може заміщуватися гістидином або неприродною амінокислотою, або одну амінокислоту можна вставити, або дві або більше амінокислот можуть заміщуватися гістидином або неприродними амінокислотами, або дві або більше амінокислот можна вставити. Крім того, окрім заміщень гістидином або неприродною амінокислотою або окрім вставки гістидину або неприродної амінокислоти, можна також одночасно здійснювати делецію, додавання, вставку та/або заміщення, та їм подібне, інших амінокислот. Заміщення на гістидин або неприродну амінокислоту або вставку гістидину або неприродної амінокислоти можна виконувати наугад, використовуючи спосіб, такий як гістидинове сканування, при якому використовується гістидин замість аланіну при аланіновому скануванні, який є добре відомим фахівцям у цій галузі. Антиген-зв'язувальні молекули, значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) або k d(pH5,8)/kd(pH7,4) яких збільшуються порівняно зі значеннями до мутації, можна вибрати з антиген-зв'язувальних молекул, у яких було наугад проведено мутацію гістидином або неприродною амінокислотою. Переважні антиген-зв'язувальні молекули з мутацією гістидином або неприродною амінокислотою, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, включають, наприклад, антиген-зв'язувальні молекули, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 7,4 після мутації гістидином або неприродною амінокислотою є еквівалентною антигензв'язувальній активності при рН 7,4 до мутації гістидином або неприродною амінокислотою. У цьому винаході фраза "антиген-зв'язувальна молекула після мутації гістидином або неприродною амінокислотою має антиген-зв'язувальну активність, яка є еквівалентною антигензв'язувальній активності до мутації гістидином або неприродною амінокислотою" означає, що, коли антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули до мутації гістидином або неприродною амінокислотою становить 100 %, тоді антиген-зв'язувальна активність антигензв'язувальної молекули після мутації гістидином або неприродною амінокислотою становить принаймні 10 % або більше, переважно 50 % або більше, більш переважно 80 % або більше та іще більш переважно 90 % або більше. Антиген-зв'язувальна активність при рН 7,4 після мутації гістидином або неприродною амінокислотою може бути більшою, ніж антиген-зв'язувальна активність при 7,4 до мутації гістидином або неприродною амінокислотою. Коли антигензв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули знижується внаслідок заміщення або 22 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вставки гістидину або неприродної амінокислоти, тоді антиген-зв'язувальну активність можна відрегулювати шляхом введення заміщення, делеції, додавання та/або вставки, та їм подібного, однієї або більше амінокислот в антиген-зв'язувальну молекулу, так що антиген-зв'язувальна активність стає еквівалентною антиген-зв'язувальній активності до заміщення або вставки гістидину. Цей винахід також включає такі антиген-зв'язувальні молекули, зв'язувальну активність яких зробили еквівалентною за допомогою заміщення, делеції, додавання та/або вставки однієї або більше амінокислот після заміщення або вставки гістидину. Крім того, коли антиген-зв'язувальна молекула – це речовина, яка включає константну ділянку антитіла, тоді в іншому переважному варіанті здійснення антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, цей винахід включає способи модифікації константних ділянок антитіл, які містяться в антиген-зв'язувальних молекулах. Специфічні приклади константних ділянок антитіл після модифікації включають константні ділянки, описані у Прикладах. Коли антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної речовини при рН 5,8 ослаблюється порівняно з антиген-зв'язувальною активністю при рН 7,4 (коли значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) збільшується) внаслідок вищеописаних способів та їм подібних, тоді звичайно переважно, щоб значення KD(pH5,8)/KD(pH7,4) перебільшувало у 2 рази або більше, більш переважно у 5 разів або більше та навіть більш переважно у десять разів або більше значення щодо оригінального антитіла, проте, цими значеннями особливо не обмежуються. Антиген-зв'язувальні молекули цього винаходу можуть, крім того, мати будь-яку іншу властивість, доки їхня антиген-зв'язувальна активність при рН від 4,0 до 6,5 є нижчою, ніж при рН від 6,7 до 10,0. Наприклад, антиген-зв'язувальні молекули можуть бути антагоністичними або агоністичними антиген-зв'язувальними молекулами. Переважні антиген-зв'язувальні молекули цього винаходу включають, наприклад, антагоністичні антиген-зв'язувальні молекули. Зазвичай, антагоністична антиген-зв'язувальна молекула інгібує опосередковану рецептором внутрішньоклітинну передачу сигналу шляхом інгібування зв'язування між лігандом (агоністом) та рецептором. Крім того, цим винаходом пропонуються антитіла, у яких амінокислота принаймні на одному з сайтів, вказаних нижче, заміщена гістидином або неприродною амінокислотою. Амінокислотні позиції пронумеровано на підставі нумерації за Kabat (Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH). Важкий ланцюг: H27, H31, H32, H33, H35, H50, H58, H59, H61, H62, H63, H64, H65, H99, H100b та H102. Легкий ланцюг: L24, L27, L28, L32, L53, L54, L56, L90, L92 та L94. Серед вищевказаних сайтів H32, H61, L53, L90 та L94 можуть бути універсальними сайтами модифікації. Коли антиген – це рецептор IL-6 (наприклад, рецептор IL-6 людини), тоді переважні сайти модифікації включають наступні. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ними. Важкий ланцюг: H27, H31, H32, H35, H50, H58, H61, H62, H63, H64, H65, H100b та H102. Легкий ланцюг: L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L92 та L94. Коли гістидин або неприродна амінокислота заміщує на численних сайтах, тоді переважні комбінації сайтів заміщення включають, наприклад, комбінацію H27, H31 та H35; комбінацію H27, H31, H32, H35, H58, H62 та H102; комбінацію L32 та L53 та комбінацію L28, L32 та L53. Крім того переважні комбінації сайтів заміщення важкого та легкого ланцюгів включають комбінацію H27, H31, L32 та L53. Коли антиген – це IL-6 (наприклад, IL-6 людини), тоді переважні сайти модифікації включають наступні. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ними. Важкий ланцюг: H32, H59, H61 та H99. Легкий ланцюг: L53, L54, L90 та L94. Коли антиген – це рецептор IL-31 (наприклад, рецептор IL-31 людини), тоді переважні сайти модифікації включають Н33. Проте, сайти модифікації особливо не обмежуються ним. Антиген-зв'язувальні молекули цього винаходу можуть розпізнавати будь-який антиген. Антигени, що розпізнаються антитілами цього винаходу, специфічно включають вищезгадані рецепторні білки (зв'язані з мембраною рецептори або розчинні рецептори), мембранні антигени, такі як клітинні поверхневі маркери, та розчинні антигени, такі як цитокіни, наприклад, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-31, IL-23, рецептор IL-2, рецептор IL-6, рецептор OSM, gp130, рецептор IL-5, CD40, CD4, Fas, остеопонтин, CRTH2, CD26, PDGF-D, CD20, фактор моноциту хемоатрактанту, CD23, TNF-α, HMGB-1, інтегрин α4, ICAM-1, CCR2, CD11a, CD3, IFNγ, BLyS, HLA-DR, TGF-β, CD52 та рецептор IL-31. Особливо переважні антигени включають рецептор IL-6. 23 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антиген-зв'язувальні молекули цього винаходу описані вище. У переважному варіанті здійснення цього винаходу антиген-зв'язувальні молекули включають антитіла. Антитіла, що мають антиген-зв'язувальну активність та FcRn-зв'язувальну ділянку, включають, наприклад, антитіла IgG. Коли антитіло, що використовується, - це антитіло IgG, тоді нема жодного обмеження стосовно його типу. Можна використовувати IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 та їм подібне. Походження антитіла цього винаходу особливо не обмежується, та воно може мати будьяке походження. Можна використовувати, наприклад, антитіла миші, антитіла людини, антитіла щурів, антитіла кролів, антитіла козлів, антитіла верблюдів та їм подібні. Крім того, антитіла можуть бути, наприклад, вищеописаними химерними антитілами, та, зокрема, модифікованими антитілами із заміщеннями в амінокислотних послідовностях, такими як гуманізовані антитіла. Антитіла можуть також бути вищеописаними біспецифічними антитілами, продуктами модифікації антитіл, до яких приєднали різні молекули, поліпептидами, що включають фрагменти антитіл, та антитілами з модифікованими цукровими ланцюгами. Покоління химерних антитіл є відомим. У випадку химерного антитіла людини-миші, наприклад, ДНК, що кодує V-ділянку антитіла, може бути зв'язаною з ДНК, що кодує С-ділянку антитіла людини; це можна вставити у вектор експресії та увести хазяїну для отримання химерного антитіла. "Гуманізовані антитіла", також називаються антитілами людини зі зміненою формою, - це антитіла, у яких гіперваріабельна ділянка (CDR), що походить від ссавця, що не є людиною, наприклад, миші, трансплантуються у CDR антитіла людини. Способи ідентифікації CDR є відомими (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342:877). Загальні способи генетичної рекомбінації, що є придатними для цього, є також відомими (дивись європейську патентну заявку EP 125023 та WO 96/02576). Гуманізовані антитіла можна отримати за відомими способами, наприклад, можна визначити CDR мишачого антитіла та отримати ДНК, що кодує антитіло, у якому CDR приєднана до каркасної ділянки (FR) антитіла людини. Гуманізовані антитіла можна потім отримувати із використанням системи, яка використовує традиційні вектори експресії. Такі ДНК можна синтезувати шляхом ПЛР, використовуючи як праймери декілька олігонуклеотидів, які вироблено так, щоб вони мали частини, які перекривають кінцеві ділянки як CDR, так і FR (дивись спосіб, описаний у WO 98/13388). Каркасні ділянки антитіла людини, з'єднані за допомогою CDR, вибираються так, що CDR утворюють придатну антигензв'язувальну ділянку. Якщо необхідно, амінокислоти у каркасних ділянках варіабельної ділянки антитіла можна заміщувати так, щоб CDR антитіла людини зі зміненою формою могли утворювати придатну антиген-зв'язувальну ділянку (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53:10.016). Амінокислотні залишки у каркасних ділянках, які можна модифікувати, включають частини, які безпосередньо зв'язуються з антигеном за допомогою нековалентних зв'язків (Amit et al., Science (1986) 233: 747-53), частини, що впливають або мають вплив на структуру CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17), та частини, що залучаються у взаємодії VH-VL (EP 239400). Коли антитіла цього винаходу – це химерні антитіла або гуманізовані антитіла, тоді Сділянки цих антитіл переважно походять від антитіл людини. Наприклад, Cγ1, Cγ2, Cγ3 та Cγ4 можна використовувати для Н-ланцюга, проте Cκ та Cλ можна використовувати для L-ланцюга. Крім того, якщо необхідно, амінокислотні мутації можна вводити у С-ділянку антитіла людини для підсилення або ослаблення зв'язування з рецептором Fcγ або FcRn або для покращення стійкості або продуктивності антитіла. Химерне антитіло цього винаходу переважно включає варіабельну ділянку антитіла, що походить від ссавця, який не є людиною, та константну ділянку, що походить від антитіла людини. Проте, гуманізоване антитіло переважно включає гіперваріабельні ділянки (CDR) антитіла, що походить від ссавця, який не є людиною, та каркасні ділянки та С-ділянки, що походять від антитіла людини. Константні ділянки, що походять від антитіл людини, переважно включають FcRn-зв'язувальну ділянку. Такі антитіла включають, наприклад, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 та IgG4). Константні ділянки, що використовуються для гуманізованих антитіл цього винаходу, можуть бути константними ділянками антитіл будьякого ізотипу. Переважно використовується константна ділянка IgG людини, проте нею не обмежуються. Каркасні ділянки, які походять від антитіла людини та які використовуються для гуманізованих антитіл, особливо не обмежуються, та вони можуть походити від антитіла будьякого ізотипу. Варіабельні та константні ділянки химерних та гуманізованих антитіл цього винаходу можна модифікувати шляхом делеції, заміщення, вставки та/або додавання та їм подібного, доки демонструється зв'язувальна специфічність оригінальних антитіл. 24 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Оскільки імуногенність в організмі людини знижується, то вважають, що химерні та гуманізовані антитіла, які використовують похідні від людини послідовності, є корисними, коли їх вводять людям для терапевтичних цілей тощо. Антитіла цього винаходу можна отримати за будь-яким способом. Наприклад, антитіла, антиген-зв'язувальна активність яких при рН 5,8 є первинно більшою, ніж антиген-зв'язувальна активність при рН 7,4, або порівняльною з нею, можна штучно модифікувати шляхом заміщення гістидином, описаним вище, або йому подібним способом, так щоб їх антиген-зв'язувальна активність при рН 5,8 стала нижчою, ніж при рН 7,4. Альтернативно, антитіла, антигензв'язувальна активність яких при рН 5,8 є нижчою, ніж при рН 7,4, можна вибрати шляхом скринінгу ряду антитіл, отриманих з бібліотеки антитіл або гібридом, як описано нижче. Коли гістидин заміщує амінокислоти в антитілі, тоді можна використовувати відомі послідовності для амінокислотної послідовності важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла до введення мутацій гістидином або можна використовувати амінокислотні послідовності антитіл, щойно отриманих за способами, відомими фахівцям в цій галузі. Наприклад, антитіла можна отримати з бібліотеки антитіл, або їх можна отримати шляхом клонування генів, що кодують антитіла, з гібридом, що утворюють моноклональні антитіла. Що стосується бібліотек антитіл, то вже відомо багато бібліотек антитіл, та способи виробництва бібліотек антитіл є також відомими; отже, фахівці у цій галузі можуть належним способом отримати бібліотеки антитіл. Наприклад, стосовно фагових бібліотек антитіл можна звернутися до такої літератури, як Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8; Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97; Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6; Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 324.0-60; Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14; та Japanese Patent Kohyo Publication No. (JP-A) H20-504970 (публікація щодо японської національної фази заявки, що не пройшла експертизу, яка відповідає міжнародній публікації, яка не є японською). Крім того, можна використовувати відомі способи, такі як способи, що використовують як бібліотеки еукаріотні клітини (WO 95/15393) та способи рибосомного виявлення. Крім того, також відомі способи отримання антитіл людини шляхом пенінгу із використовуванням бібліотек антитіл людини. Наприклад, варіабельні ділянки антитіл людини можна експересувати на поверхні фагів як одноланцюгові антитіла (scFv), використовуючи способи фагового виявлення, та можна вибрати фаги, що зв'язуються з антигенами. Генетичний аналіз вибраних фагів може визначити послідовності ДНК, що кодують варіабельні ділянки антитіл людини, які зв'язуються з антигенами. Якщо послідовності ДНК scFv, які зв'язуються з антигенами, виявлено, можна отримати придатні вектори експресії на основі цих послідовностей, щоб отримати антитіла людини. Ці способи є вже добре відомими, та стосовно них можна звернутися до WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 та WO 95/15388. Що стосується способів отримання генів, які кодують антитіла, з гібридом, взагалі можна використовувати відомі способи, під час яких використовуються бажані антигени або клітини, що експресують бажані антигени, у якості сенсибілізуючих антигенів, використовуючи їх для здійснення імунізації згідно з традиційними способами імунізації, зливаючи отримані імунні клітини з відомими батьківськими клітинами за допомогою традиційних способів злиття клітин, здійснюючи скринінг клітин (гібридом), що виробляють моноклональні антитіла, за допомогою традиційних способів скринінгу, синтезуючи кДНК варіабельних ділянок (V-ділянок) антитіла з мРНК отриманих гібридом із використанням ревертази та зшиваючи їх з ДНК, що кодують бажані константні ділянки (С-ділянки) антитіла. Більш специфічно, сенсибілізуючі антигени для отримання вищеописаних генів антитіл, що кодують Н-ланцюги та L-ланцюги, включають як повні антигени з імуногенністю, так і неповні антигени, які включають гаптени та їм подібне без антигенності; проте, вони не обмежуються цими прикладами. Наприклад, можна використовувати суцільні білки та часткові пептиди білків, що представляють інтерес. Крім того, відомо, що речовини, які включають полісахариди, нуклеїнові кислоти, ліпіди та їм подібне, можуть бути антигенами. Отже, антигени антитіл цього винаходу особливо не обмежуються. Антигени можна приготувати згідно зі способами, відомими фахівцям у цій галузі, наприклад, способами на основі бакуловірусу (наприклад, WO 98/46777) та їм подібними. Гібридоми можна отримати, наприклад, за способом Milstein та інших (G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46) та йому подібним. Коли імуногенність антигену є низькою, тоді імунізацію можна виконувати після з'єднання антигену з макромолекулою, яка має імуногенність, такою як альбумін. Альтернативно, якщо необхідно, то антигени можна перетворювати у розчинні антигени шляхом з'єднання їх з іншими молекулами. Коли трансмембранні молекули, такі як мембранні антигени (наприклад, рецептори) використовуються як антигени, тоді частини зовнішньоклітинних ділянок мембранних антигенів можна використовувати як фрагмент, або клітини, що експресують трансмембранні молекули на 25 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 їхній клітинній поверхні, можна використовувати як імуногени. Клітини, що виробляють антитіла, можна отримати шляхом імунізації тварин, використовуючи при цьому відповідні сенсибілізуючі антигени, як описано вище. Альтернативно, клітини, що виробляють антитіла, можна приготувати шляхом імунізації in vitro лімфоцитів, які можуть виробляти антитіла. Різних ссавців можна використовувати для імунізації; такі тварини, що зазвичай використовуються, включають гризунів, зайцеподібних (lagomorphas) та приматів. Такі тварини включають, наприклад, гризунів, таких як миші, щури та хом'ячки; зайцеподібних (lagomorphas), таких як кролі; та приматів, які включають мавп, таких як мавпи cynomolgus, макаки-резус, бабуїни та шимпанзе. Крім того, також відомими є трансгенні тварини, які є носіями репертуарів генів антитіл людини, та антитіла людини можна отримати, використовуючи цих тварин (дивись WO 96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56). Замість використання таких трансгенних тварин, наприклад, бажані антитіла людини, що мають зв'язувальну активність проти антигенів, можна отримати шляхом сенсибілізації in vitro лімфоцитів людини бажаними антигенами або клітинами, що експресують бажані антигени, з наступним злиттям сенсибілізованих лімфоцитів з клітинами мієломи людини, такими як U266 (дивись японську патентну заявку Kokoku Publication No. (JP-B) H01-59878 (пройшла експертизу, ухвалена японська патентна заявка, яку опубліковано для опонентів)). Крім того, бажані антитіла людини можна отримати шляхом імунізації трансгенних тварин, що є носіями повного репертуару генів антитіла людини, бажаними антигенами (дивись WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 96/34096 та WO 96/33735). Імунізацію тварин можна здійснювати шляхом відповідного розведення та суспендування сенсибілізуючого антигену у сольовому розчині з фосфатним буфером (PBS), фізіологічному сольовому розчині або їм подібному та шляхом змішування цього з ад'ювантом з метою емульгування, якщо це необхідно. Цю суміш потім вводять тваринам шляхом інтраперитонеальної або підшкірної ін'єкції. Потім сенсибілізуючий антиген, змішаний з неповними ад'ювантом Фрейнда, переважно вводиться декілька разів кожні 4 – 21 день. Виробництво антитіла можна підтвердити шляхом вимірювання титру антитіла, яке представляє інтерес, у сироватці тварини, використовуючи при цьому традиційні способи. Клітини, що виробляють антитіла, які отримано з лімфоцитів або тварин, імунізованих бажаним антигеном, можна злити з клітинами мієломи, щоб генерувати гібридоми, використовуючи при цьому традиційні для злиття агенти (наприклад, поліетиленгліколь) (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103). Коли це необхідно, клітини гібридом можна культивувати та вирощувати, а зв'язувальну специфічність антитіла, виробленого з цих гібридом, можна вимірювати, використовуючи відомі аналітичні способи, такі як імунопреципітація, радіоімуноаналіз (RIA) та твердофазний імуноферментний аналіз (ЕЛАЙЗА). Після цього гібридоми, що виробляють антитіла, які представляють інтерес, у яких визначили специфічність, афінність або активність, можна субклонувати за способами, такими як обмежувальне розведення. Після цього, гени, що кодують вибрані антитіла, можна клонувати з гібридом або клітин, що виробляють антитіла (сенсибілізованих лімфоцитів та їм подібних), використовуючи зонди, які можуть специфічно зв'язуватися з цими антитілами (наприклад, олігонуклеотиди, які є комплементарними до послідовностей, що кодують константні ділянки антитіла). Можна також клонувати гени з мРНК, використовуючи RT-PCR (полімеразно-ланцюгову реакцію зі зворотною транскриптазою). Імуноглобуліни поділяються на п'ять різних класів, IgA, IgD, IgE, IgG та IgM. Ці класи далі поділяються на декілька підкласів (ізотипів) (наприклад, IgG-1, IgG-2, IgG-3 та IgG-4; IgA-1 та IgA-2; та їм подібні). Н-ланцюги та L-ланцюги, що використовуються у цьому винаході для виробництва антитіл, особливо не обмежуються, та вони можуть походити від антитіл, які належать до будь-якого з цих класів або підкласів; проте, особливо переважним є IgG. У цьому описі винаходу можна модифікувати гени, що кодують Н-ланцюги, та гени, що кодують L-ланцюги, використовуючи при цьому способи генної інженерії. Генетично модифіковані антитіла, такі як химерні антитіла та гуманізовані антитіла, які штучно модифікували з метою зниження гетерологічної імуногенності та їй подібного проти людини, можна відповідним чином виробляти для антитіл, таких як мишачі антитіла, щурячі антитіла, кролячі антитіла, антитіла хом'ячків, антитіла овець та антитіла верблюдів. Химерні антитіла – це антитіла, які включають варіабельні ділянки Н-ланцюга та L-ланцюга антитіла ссавця, який не є людиною, такого як мишаче антитіло, та константні ділянки Н-ланцюга та L-ланцюга антитіла людини. Химерні антитіла можна отримати шляхом зшивання ДНК, що кодує варіабельну ділянку мишачого антитіла, з ДНК, що кодує константну ділянку антитіла людини, шляхом вставки цього у вектор експресії та введення вектора хазяїну для виробництва антитіла. Гуманізоване антитіло, яке також називають антитілом людини зі зміненою формою, 26 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна синтезувати шляхом ПЛР, використовуючи декілька олігонуклеотидів, отриманих так, що вони мають перекриваючі частини на кінцях послідовностей ДНК, побудованих для з'єднання гіперваріабельних ділянок (CDR) антитіла ссавця, що не є людиною, такого як миша. Отриману ДНК можна зшити з ДНК, що кодує константну ділянку антитіла людини. Зшиту ДНК можна вставити у вектор експресії, а вектор можна увести хазяїну з метою отримання антитіла (дивись EP 239400 та WO 96/02576). Каркасні ділянки антитіла людини, зшиті за допомогою CDR, вибираються, коли CDR утворює сприятливу антиген-зв'язувальну ділянку. Якщо необхідно, амінокислоти у каркасній ділянці варіабельної ділянки антитіла можна заміщувати так, щоб CDR антитіла людини зі зміненою формою утворювала відповідну антиген-зв'язувальну ділянку (K. Sato et al., Cancer Res. 1993, 53: 10.01-10.06). Окрім описаної вище гуманізації, антитіла можна модифікувати з метою покращення їх біологічних властивостей, наприклад, шляхом зв'язування з антигеном. У цьому винаході таких модифікацій можна досягнути за допомогою способів, таких як сайт-спрямований мутагенез (дивись, наприклад, Kunkel (1910.0) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488), ПЛР-мутагенез та касетний мутагенез. Взагалі, мутантні антитіла, біологічні властивості яких були покращені, демонструють гомологію та/або подібність амінокислотних послідовностей у 70 % або більше, більш переважно у 80 % або більше та навіть більш переважно у 90 % або більше (наприклад, 95 % або більше, 97 %, 98 % або 99 %) при порівнянні з амінокислотною послідовністю варіабельної ділянки оригінального антитіла. У цьому описі винаходу гомологія та/або подібність послідовності визначається, як відношення амінокислотних залишків, що є гомологічними (такий самий залишок) або подібними (амінокислотні залишки, які класифікуються до такої ж самої групи на основі загальних властивостей амінокислотних бічних ланцюгів) до залишків оригінального антитіла, після того, як значення гомології послідовності досягло максимального значення внаслідок вирівнювання послідовності та введення проміжків, якщо необхідно. Взагалі, природні амінокислотні залишки поділяються на групи на основі характеристик їхніх бічних ланцюгів, а саме: - гідрофобні: аланін, ізолейцин, валін, метіонін та лейцин; - нейтральні гідрофільні: аспарагін, глютамін, цистеїн, треонін та серин; - кислотні: аспарагінова кислота та глютамінова кислота; - лужні: аргінін, гістидин та лізин; - залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: гліцин та пролін; та - ароматичні: тирозин, триптофан та фенілаланін. Взагалі, усього шість гіперваріабельних ділянок (CDR), що є присутніми у варіабельних ділянках Н-ланцюга та L-ланцюга, взаємодіють одна з одною, утворюючи антиген-зв'язувальну ділянку антитіла. Також відомо, що сама варіабельна ділянка є здатною розпізнавати та зв'язуватися з антигеном, хоча її афінність є нижчою, ніж афінність усієї зв'язувальної ділянки. Отже, гени антитіла, що кодують Н-ланцюг або L-ланцюг цього винаходу, можуть кодувати фрагменти, кожен з яких включає антиген-зв'язувальну ділянку Н-ланцюга або L-ланцюга, доки поліпептид, який кодується генами, зберігає активність зв'язування з бажаним антигеном. Як описано вище, варіабельна ділянка важкого ланцюга взагалі складається з трьох CDR та чотирьох каркасних ділянок. У переважному варіанті здійснення цього винаходу амінокислотні залишки, які слід "модифікувати", можна відповідним чином вибрати з амінокислотних залишків, наприклад, у CDR або у каркасній ділянці. Взагалі, модифікації амінокислотних залишків у CDR можуть знижувати антиген-зв'язувальну здатність. Отже, відповідні амінокислотні залишки, які слід "модифікувати" у цьому винаході, переважно вибираються з амінокислотних залишків у каркасних ділянках, проте не обмежуються ними. Можна вибирати амінокислоти у CDR, доки підтверджується, що модифікація не знижує зв'язувальну здатність. Альтернативно, використовуючи доступні бази даних та їм подібне, фахівці у цій галузі можуть отримати відповідні послідовності, які можна використовувати як каркасну ділянку варіабельної ділянки антитіла організму, такого як людина або миша. Крім того, цим винаходом пропонуються гени, що кодують антитіла цього винаходу. Гени, що кодують антитіла цього винаходу, можуть бути будь-якими генами, та вони можуть бути ДНК, РНК, аналогами нуклеїнових кислот та їм подібним. Крім того, цим винаходом також пропонуються клітини-хазяїни, які є носіями генів, описаних вище. Клітини-хазяїни особливо не обмежуються та включають, наприклад, E. coli та різні тваринні клітини. Клітини-хазяїни можна використовувати, наприклад, як системи виробництва для одержання та експресування антитіл цього винаходу. Системи виробництва іn vitro та in vivo є доступнимидля систем виробництва поліпептидів. Такі системи виробництва in vitro включають, наприклад, системи виробництва, що використовують еукаріотні клітини або прокаріотні клітини. 27 UA 108060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Еукаріотні клітини, які можна використовувати як клітини-хазяїни, включають, наприклад, тваринні клітини, рослинні клітини та клітини грибів. Тваринні клітини включають: клітини ссавців, наприклад, CHO (J. Exp. Med. (1995) 108: 94.0), COS, HEK293, 3T3, мієлому, ВНК (нирку дитинча хом'ячка), HeLa та Vero; клітини амфібій, такі як овоцити Xenopus laevis (Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340); клітини комах, такі як Sf9, Sf21 та Tn5. Клітини CHO-DG44, CHODX11B, COS7, клітини HEK293 та клітини ВНК переважно використовуються для експресування антитіл цього винаходу. Серед тваринних клітин клітини СНО є особливо переважними для великомасштабної експресії. Вектори можна вводити у клітини-хазяїни, наприклад, за допомогою способів з використанням фосфату кальцію, способів з використанням DEAEдекстрану, способів, що використовують DOTAP катіонних ліпосом (Boehringer-Mannheim), способів електропорації та способів ліпофекції. Стосовно рослинних клітин, наприклад, клітини, що походять від Nicotiana tabacum та ряски (Lemna minor), є відомими як система для виробництва білків. Калюси можна культивувати з цих клітин для виробництва антитіл цього винаходу. Стосовно клітин грибів, відомі системи експресії білків – це ті системи, що використовують клітини дріжджів, наприклад, клітини роду Saccharomyces (такі як Saccharomyces cerevisiae та Saccharomyces pombe); та клітини ниткоподібних грибів, наприклад, роду Aspergillus (такі як Aspergillus niger).Ці клітини можна використовувати як хазяїв для виробництва антитіл цього винаходу. Бактеріальні клітини можна використовувати у прокаріотних системах виробництва. Стосовно бактеріальних клітин, окрім вищеописаних систем виробництва, що використовують E. coli, відомими є системи виробництва, що використовують Bacillus subtilis. Такі системи можна використовувати для виробництва антитіл цього винаходу. Способи скринінгу Цим винаходом пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, антигензв'язувальна активність яких при кислотному рН є нижчою, ніж при нейтральному рН. Цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, які можуть окремо зв'язуватися з багатьма антигенами. Цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, які є найкращими стосовно утримання у плазмі. Цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, яка відокремлюється усередині клітини від антигену, який був зв'язаний нею ззовні клітини. Цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальної молекули, яка зв'язалася з антигеном та інтерналізувалася у клітину та яка виділяється за межі клітини у вільній від антигену формі. Цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антигензв'язувальної молекули, яка має підвищену здатність елімінувати антигени у плазмі. Крім того, цим винаходом також пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, які є особливо корисними, коли їх використовують як фармацевтичні композиції. Специфічно, цим винаходом пропонуються способи скринінгу антиген-зв'язувальних молекул, які включають наступні етапи: (a) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 6,7 до 10,0; (b) визначення антиген-зв'язувальної активності антиген-зв'язувальної молекули при рН від 4,0 до 6,5 та (c) вибирання антиген-зв'язувальної молекули, антиген-зв'язувальна активність якої при рН від 6,7 до 10,0 перебільшує антиген-зв'язувальну активність при рН від 4,0 до 6,5. У способах скринінгу цього винаходу антиген-зв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рН від 6,7 до 10,0 особливо не обмежується, доки вона є антиген-зв'язувальною активністю при рН від 6,7 до 10,0. Проте, наприклад, переважна антиген-зв'язувальна активність – це антиген-зв'язувальна активність при рН від 7,0 до 8,0, а більш переважна антигензв'язувальна активність – це антиген-зв'язувальна активність при рН 7,4. Далі, антигензв'язувальна активність антиген-зв'язувальної молекули при рН від 4,0 до 6,5 особливо не обмежується, доки вона є антиген-зв'язувальною активністю при рН від 4,0 до 6,5. Проте, наприклад, переважна антиген-зв'язувальна активність – це антиген-зв'язувальна активність при рН від 5,5 до 6,5, а більш переважна антиген-зв'язувальна активність – це антигензв'язувальна активність при рН 5,8 або 5,5. Антиген-зв'язувальну активність антиген-зв'язувальної молекули можна визначити за способами, відомими фахівцям у цій галузі. Фахівці у цій галузі можуть відповідним чином визначити умови, відмінні від рН. Антиген-зв'язувальну активність антиген-зв'язувальної молекули можна визначити як константу дисоціації (KD), позірну константу дисоціації (позірну KD), константу швидкості дисоціації (k d), позірну константу швидкості дисоціації (позірна k d) та їм подібними. Ці константи можна визначити за способами, відомими фахівцям у цій галузі, 28