Спосіб одержання людської мnо2-дисмутази

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии, в частности к способам получения человеческой MnO2-дисмутазы для. терапевтических целей, например, в качестве антивоспалительного средства. Способ заключается в том, что из плацентарной или печеночной ткани человека выделяют мРНК, получают поли (А)+РНК, синтезируют двунитевую кДНК, конструируют банк кДНК, выделяют последовательность ДНК, кодирующую Мn 2О-дисмутаз у, при помощи зондов и или последовательности кДНК гена MnO2-Дисмутазы человека, последовательность ДНК достраивают до стартового кодона или стоп-кодона, непосредственно за стартовым кодоном гена размещают митохондриальную лидерную или сигнальную последовательность ДНК MnO2-дисмутазы S.cerevisiae или человека, последовательность ДНК, кодирующую МnО2-дисмутазу, используют для конструирования вектора экспрессии, состоящего из промоторов ADHI ADHII, пар олигонуклеотидов EBI 1161/EBI 1164 +EBI 1167/EBI 1160 формулы или CUP1, сигнала инициирования, митохондриальной лидерной или сигнальной последовательности Saccharomyces cerevisiae или человека, стоп-кодона и терминатора ADHII, полученными векторами экспрессии pWS550A, или pWS490A, или pWS491A, или PWS371A, или pWS373A, или рЕ024 - АВ, или рЕ025 АС, или рЕ026 - AD, или рЕ040, или рЕ041, или рЕ042, или рЕ043, или рЕ044, или рЕ045, или рЕ050, или рЕ051 трансформируют штаммы Saccharomyces cerevisiae или плазмиду pSV2 dhf r SOD1 или pSV2 dhfr, которой трансформируют штаммы культивируемых клеток, культивируют трансформированные клетки, выделяют и очищают целевой продукт путем экстракции, осаждения и хроматографии. При осуществлении предлагаемого способа используют промотор ADHI (pES103), регистрационный номер DSN 4013 (фрагмент Bam Hl/Xhol с длиной 1500 п. о. (пар оснований); ускоренный промотор ADHI, регистрационный номер DSM 4016(pWS 323E) (фрагмент Bam Hl/Xho I с длиной 400 п.о.); терминатор AIHII (pGD2), регистрационный номер DSM 4014, (фрагмент Xba l/Hind. Ill с длиной 336 п. о.); буфер Bam HI: 150мМ NaCI, 6мМ трис-НСІ, рН 7,9,6мМ МgСІ2, 100 мкл/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота (АСКРС); буфер Коре: 50мМ трис-HCl, рН 8,0, 10мМ MgCI2, 50мМ NaCI; раствор денатурации: 0,5 Μ NaOH. 1,5 Μ NaСІ; раствор Денхардта (50х):1 г поливинил-пирролидона с мол. массой 360000, 1 г фиколла, 1 г АСКРС, Н2О до 100 мл; Е.соli С 600: F-, sup E44, thil, thrl, leuB6, Lac Y1, ton Α21 l ATCC 33724); Е.соli IМ 101: sup Ε, thi D(Іас-рrо АВ), F-, tra D36, pro AB, Iac 1 Ζ, D15; буфер X: 10 мМ NaCI, 50мМ трис-НСІ, рН 7,5. 10 мМ MgCl 2, 1мМ ди тиотриетола (ДТТ); буфер Y: 10 мМ трис-НСІ, рН 7,5, 60мМ NaCI, 10мМ МgСІ2, 1мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл АСКРС; раствор гибридизации соответствует раствор у предварительной гибридизации, но без ДНК из спермы лосося; содержащий фрагмент Кленова реакционный раствор 22 мкл ДНК/Н 2О, 2,5 мкл 10 буфера НТР (0,5 Μ трис-НСІ, рН 7,2, 0,1 Μ MgSO 4, 1 мМ ДТТ, 500 мкл) (мл АСКРС) по 1 мкл 2мМ dATP, sCTP, dTTP, 2,5 ед. фрагмента Кленова (0,5 мкл); l-буфер: 100мМ трис, рН 7,5, 10мМ МgСІ2, 1мМ этилендинитрилотетрауксусной кислоты ЭДТУК); агар ЛБ: жидкая среда ЛБ, 15 г/л бакто-агара; жидкая среда ЛБ: 10 г/б бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCI, 10 Μ NaOH до рН 7.4; раствор лигирования: 66мМ трис-НСІ, рН 7,6.10мМ MgCl2, 5мМ ДТТ, 1мМ АТР, 1 ед. Т4-ДНК-лигазы; раствор нейтрализации: 0,5 Μ трис-НСІ, рН 7,50, 1,5 Μ NaCI; буфер z: 50мМ KCI, 50мМ NaCl, 50мМ трис-НСІ, рН 8,0,10мМ МgСІ2; раствор предварительной гибридизации: 5 x буфер SSC, 5 x раствор Денхардта, 50мМ натрийфосфа тного буфера, рН 6,8, 1мМ Na2P 4O7 , 100 мкМ АТР, 0,1% додецил-сульфата натрия (ДСП), 30-100 (50) мкг/мл денатурированной обработанной ультразвуком ДНК из спермы лосося; pURA3 регистрационный номер ISM 4015; S. cerevisiae DBY47: a, leu 2, his 3, trpl Ura 3; среда СЦ-УРА: 0,67% BYNB (Dlfco), 2% глюкозы, 2% 50 x смеси аминокислот (г/л): гистидин 1; лейцин 6; триптофан 2,5; лизин 4; аденин 1,2; аргинин 2; метионин 1, фенилаланин 6; треонин 5; изолейцин 6; буфер Sma I: 10мМ трис-НСІ, рН 8,0,20мМ КСІ, 10 мМ МgСІ2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл АСКРС; буфер Sph I: 10мМ трис-НСІ, рН 7,5,100мМ NaCI, 10мМ МgСІ2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл АСКРС; SSC (20х): 3,0 Μ NaCI, 0,3 Μ Na3-цитрата, рН 7,0; SSPE (20х): 3,6 Μ NaCI, 0,2 Μ Na2НРO4 , 20мМ ЭДТУК, NaOH (10 н.) до рН 7,4; буфер ТЕ: 10 мМ трис-НСІ, рН 8,0,1 мМ ЭДТУК; буфер Tha I: 50 мМ трис-НСІ, рН 8,0, 10 мМ МgСІ2 ; τοп-агароза: жидкая среда ЛБ, 0,7% агарозы; раствор предварительной промывки: 1М NaCl, 50мМ трис-НСІ, рН 8,0, 1мМ ЭДТУК, 0.1% ДСН. Пример 1. Конструирование генобанка кДНК. Свежую человеческую плаценту подвергают быстрому замораживанию в жидком азоте, растирают в порошок при температуре ниже -80 С, экстрагируют РНК, из которой получают поли (А)+РНК. Синтезируют ДНК, клонируют ее в EcoRI l gt10, используя Е.соli С600. Титр кДНК фагов l gt 10 составляет 1,2 x 1010 бляшкообразующи х ед. мл, число независимых клонов 1 x 10. Пример 2. Амплификация генобанка l gt 10. Штамм-реципиент E.coli (например, С 600, Генотип F-, E44, sup E44, thill, thrl, leu B6, Lac YI, ton A21 l выращивают при 37°С в течение ночи в среде ЛБ, содержащей 0,2% мальтозы. Культуру центрифугируют и суспендируют в 10мМ раствора сульфата магния до оптической плотности 4,0 при 600 нм. Полученные Mg-клетки хранят при 4°С. Клетки смешивают с суспензией фагов (по 50000 бляшкообразующи х единиц генобанка ДНК на пластину) и инкубируют в течение 20 мин при 37°С. Затем добавляют расплавленную и доведенную до 42°С топ-агарозу (содержащую 10мМ сульфа та магния), смешивают, выливают на предварительно нагретые ЛБ-агаровые пластинки (диаметром 13,5 см), содержащие 10мМ сульфа та магния, и инкубируют в течение 6-12 ч при 37°С. Пример 3. Первичный скрининг для идентификации рекомбинантных l-фагов. а) Обработка нитроцеллюлозных фильтров. Пластинки по окончании инкубации охлаждают до 4°С. Нитроцеллюлозные фильтры кладут на поверхность пластинок. Через 1 мин после пропитки фильтры осторожно удаляют, кладут в раствор денатуратора и инкубируют в течение одной минуты при комнатной температуре. Нейтрализацию осуществляют в растворе нейтрализатора в течение 5 мин при комнатной температуре, затем инкубируют в течение 30 с в буфере 2 x SSPE при той же температуре. С пластины изготовляют копии. Фильтры высушивают, ДНК фиксируют при 80°С. б) Получение 32р-маркированных зондов ДНК. Синтез олигонуклеотидов проводят на синтезаторе 381 А. Олигонуклеотиды очищают электрофорезом в полиакриламидном геле (20% в 8 Μ мочевине) с последующим обессоливанием на Сефадексе G-50. Синтезированные таким образом ДНК-зонды комплементарны последовательностям оснований РНК, кодирующим аминокислоты 39-46(а) и 200-207(6): Они имеют следующие последовательности оснований: в) Гибридизация In situ. С целью удаления с нитроцеллюлозы остатков агарозы и бактерий фильтры инкубируют в растворе предварительной промывки при 65°С в течение нескольких часов при перемешивании. Фильтры инкубируют в течение 1-12 ч при температуре 37°С в растворе предварительной гибридизации, который подвергают предварительной вакуумной дегазации. Используемые для гибридизации радиоактивно меченные ДНК-зонды (около 1 х 10 9 срм/мкг) добавляют к нагретому до 37°С и дегазированному раствору гибридизации. Для поддержания на высоком уровне концентрации ДНК в растворе гибридизации используют минимальное количество жидкости. Гибридизацию осуществляют в течение 12-18 4 при 37°С. Нитроцеллюлозные фильтры три раза промывают в буфере 6 х SSC и 0,05% ДСН (4°С), два раза в течение 30 мин при 4°С, а также в свежеприготовленном растворе, содержащем 3 Μ хлорида тетраметиламмония, 50мМ трис-HCI, рН 8,22мМ ЭДТУК и 0,05% ДСН следующим образом: три раза при комнатной температуре, два раза в течение 30 мин при комнатной температуре и три раза в течение 30 мин при 49°С, после чего сушат на воздухе. Рентгеновскую пленку экспонируют в течение 2-8 дней при - 70°С. Пример 4. Очистка бляшек. После проявления авторадиограмм из агаровой пластинки выделяют те участки, которые дают положительный сигнал гибридизации на обоих нитроцеллюлозных фильтрах. Для этого желаемое место удаляют из агара и переводят в 0,3-0,6 мл l-буфера. Добавляют по одной капле хлороформа, фагам дают диффундировать из агара в течение ночи при 4°С и каждую отдельную фаговую суспензию в виде нескольких разбавлений наносят на пластинки. Пластинки, имеющие 300-1000 бляшек, снова используют для изготовления копии нитроцеллюлозного фильтра, который подвергают гибридизации с использованием обоих ДНК-зондов. Этот процесс повторяют до тех пор, пока все бляшки одной пластинки не дадут положительный сигнал гибридизации. Пример 5. Анализ полученных фаго вых клонов. а). Титрование l-фагов. Суспензии фагов разбавляют l-буфером в соотношении 1:10, смешивают и наносят на пластинки. После инкубации при 37°С определяют титр в бляшкообразующи х единицах. Для очищенных фаговы х суспензий титр составляют 2,2-8,6 х 1010 ед. мл. б). Получение l-фаговой ДНК. После выделения и титрования гомогенных фаговы х клонов их наносят плотностью 2 х 106 единиц (13,5 см чашки Петри с культуральной средой следующего состава: 1,5% агарозы, 10 г/л триптофана, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCI, 10мМ MgSO 4 и 0,2% глюкозы) вместе с 200 мкл Мg-клеток E.coli С 600 (оптическая плотность 4 при 600 нм), инкубируют в течение 5 ч при 37°С и затем охлаждают до 4°С. Элюцию фагов осуществляют переслаиванием пластинок 8 мл l-буфера и несколькими каплями хлороформа при слабом качании при 4°С в течение ночи. Очищенную центрифугированием надосадочную жидкость удаляют и фаги центрифугируют при 5000 об/мин, в течение 30 мин при комнатной температуре. После добавления 500 мкл l-буфера и инкубации с рибонуклеазой А (10 мкг/мл) и дезоксирибо-нуклеазой (1 мкг/мл) в течение 30 ми» при 37°С и концентрацию соли повышают добавлением 25 мкл 0,5 Μ ЭДТУК, 12 мкл 1 Μ трис-HCl, рН 8,0 и 6,5 мкл 20% ДСН и инкубируют при 70°С в течение 15 мин. После экстракции фенолом и двукратной экстракции смесью хлороформа и изоамилового спирта (24: 1) ДНК осаждают добавлением 0,1 объема ЗМ ацетата натрия с рН 5,2 и 2 объемов спирта, центрифугир уют, промывают. 70%-ным спиртом, сушат и растворяют в 50 мкг буфере ТЕ. в). Рестрикционный анализ. По 2 мкл раствора ДНК инкубируют с 5 ед. EcoRI в буфере X в течение 2 ч при 37°С, полученные фрагменты разделяют в 1 %-ном агарозном геле. Фрагменты длиной 500-1000 п. о. злюируют из геля и подвергают анализу. г). Анализ последовательностей. 100 нг фрагментов встраивают в соответственно приготовленную форму дзДНК (репликативная форма, 50 нг) вектора путем инкубации в течение 2-12ч при 14°Св 10 мкл раствора лигирования. Рекомбинантной конструкцией с обозначениями BS3, BS5, BS8, BS9, BS12, BS13, BSXIII трансформируют компетентные клетки E.coli (штамм IM 101). Выделяют однонитевую ДНК рекомбинантных фагов и проводят анализ последовательностей по Сангеру при использовании вычислительных программ. Выделенный клон 8 (BSS) содержит кодирующую последовательность аминокислоты 22 зрелого энзима. Пример 6, Конструкция экспрессионной кассеты. Для экспрессии человеческой MnO2-дисмутазы чМn-Д) в дрожжах используют промотор ADHI первоначальной длиной около 1500 п. о., укороченный промотор ADHI длиной около 400 п. о. и ADHII терминатор. а). Пополнение гена. Так как у выделенного клона 8 кДНК на N-конце отсутствует участок, соответствующий 21 аминокислоте, для пополнения гена конструируют и синтезируют с учетом выбора дрожжевого кодона 2 пары олигонуклеотидов (фрагмент Xhol/Xbal) согласно формуле (ОП1): ОП1 вставляют через Xho I/Xba І в плазмиду V17 (полученную из pUC18 после рестрикции Hinс II и введения линкеров Xho I (dCCTCGAGG) и рестрикции Smal полученной плазмиды pES102 с последующим выделением линкеров Nco I (dCCCATGGG), а ОП2 через Xba I/Nco I следующим образом. По 4 мкг ДНК V17 переваривают 10 ед. Xba I и Nco I или Xho I и Xba l в течение 2 ч при 37°С и очищают путем гельэлектрофореза (0,7% агарозы). По 5 мкл синтезированных нитей ОП1 и ОП2 (каждый раз 10 рМ/мкл) перемешивают, инкубируют в течении 10 мин при температуре 65°С и медленно охлаждают до комнатной температуры. По 1/10 полученного объема подвергают лигированию с 50 нг разрезанного ХНо I вектора (в случае ОП1) или разрезанного Xba I и Nco I вектора (в случае ОП2). После двойного переваривания Sсa I и Xba I в буфере Коре в течение 2 ч при 37°С, очистки и выделения разрезанных векторов путем гельэлектрофореза HSOD2 и HSOD3 подвергают лигированию (клонирование олигонуклеотидных пар ОП1 и ОП2) с получением плазмиды ΗSODY, которую гидролизуют рестриктазой Nco I, инкубируют с фрагментом Кленова и гидролизуют рестриктазой Eco RI. При этом 5 мкг ДНК инкубируют с 18 ед. Nco І в течение нескольких часов в 50 мкл буфера X при 37°С, разрезанную ДНК очищают гельэлектрофорезом и половину инкубируют с фрагментом Кленова. ДНК очищают гельэлектрофорезом, выделяют и гидролизуют 7,5 ед. Eco RI в 20 мкл буфера X, е ще раз очищают и выделяют. Плазмидой BS8, содержащей выделенный клон 8 кДНК, трансформируют компетентные клетки Е.соli (штам 1М101) и получают плазмиду. 10 мкг плазмиды переваривают с 25 единицами Tha І в 40 мкл буфера Thal в течение 8 ч при 60°С, фрагмент длиной 759 п. о. гидролизуют с помощью Eco RI с последующей очисткой гельэлектрофорезом. Фрагмент Tha I/Eco RI объединяют с плазмидой HSOD4, получая HSOO6. Плазмида HSOD6 содержит полную кДНЕ для чМn = Д, включая Met. При этом сохраняется рамка считывания. б). Конструкция экспрессионной кассеты. Плазмиду HSOD6 переваривают с Xho Ι и Eco RI в буфере Коре, выделяют фрагмент Xho I и вводят в плазмиду PKHI, соответственно РКН2 через Xho I/Eco RI. В плазмиду PES 103, содержащую промотор ADHI в качестве фрагмента Bam I/Xho I длиной 1500 п. о. в PES 102 (PES 102 представляет собой производное pUC18, которое в месте разреза Hinc II содержит линкер Xho I), вводят линкер Bg1 II после рестрикции Sma I (1 мкг плазмиды подвергают перевариванию 5 С ед. Sma I в буфере Sma І в течение 2 ч при 37°С), очистки и выделения. Полученную таким образом плазмиду превращают в плазмиду Р154/2 рестрикцией инкубацией с фрагментом Кленова и повторным лигированием. После переваривания Xho I и Hind III в буфере Коре в плазмиду pES103 вставляют синтезированный линкер - Xho I, Eco RI. Xba I, Hind III. Э тот линкер имеет следующую последовательность: TCGAGGATTCTCTAGAA CCTTAAGAGATCTTTCGA. В плазмиду р150/1 (после переваривания Xba I/Hind III в буфере Коре) вставляют терминатор ADHII, получая плазмиду 150/2. Ε Терминатор ADHII получают следующим образом. Плазмиду pMWS ADHII переваривают сначала Hind III, затем Spn I и фрагмент длиной 605 п. о. клонируют вектор V18 и в место разреза HincII вставляют линкер Xba E I (CTCTAGAG). Фрагмент Xba I/Sph I длиной 335 п. о. вводят в pUC18 (pGD2). Вектор V18 получают за счет того, что в PUC18 вводят линкер Hind III по сайту Sma I. Место мультиклокирования в V18 содержит Eco RI, Sst I, Kpn I. Hind III, Bam HI. Xba I, Salll, Pst, Sphl. После переваривания Xba I и Hind III терминатор ADHII выделяют. Таким образом, за исключением вводимого через Xho I Eco RI гена плазмида р150/2 содержит необходимые для экспрессии гена промотор длиной около 1500 п. о., линкер Xho I длиной 7 п. о. линкер Eco RI длиной 6 п. о., линкер Xba I длиной 7 п. о., терминатор длиной 329 п. о. Эти единицы вставляют через Bam Hi/Hind III в вектор р154/2. В получаемой плазмиде рКН1 заменяют промотор ADHI на укороченный промотор ADHIk из фрагмента Bam Hl/Xho I (длиной 412 п. о.) плазмиды рКН2. В обе плазмиды вставляют по сайтам Xho I/Eco RI полный ген кДНК, вырезанный из HSOD6. Получаемые плазмиды HSOD7/1 и HSOD7/2 отличаются друг от друга только различными промоторами ADHI и ADHIk. После двойного переваривания Bg lll/Hind III и выделения экспрессионных фрагментов изготовленные экспрессионные кассеты вставляют в соответственно подготовленные дрожжевые трансформационные векторы УЕр13 (АТСС37 115), plDB207(DSM3181) pEAS102 YIpS (ATCC 37062) через места разреза Bam III и Hind III. Пример 7. Получение пригодного для экспрессии дрожжевого мутанта Μn=Д. Ген дрожжевого мутанта Μn=Д содержится в качестве фрагмента Ваm НІ в векторе PL41. После рестрикции Bam HI фрагмент длиной 2045 п. о. очищают гельэлектрофорезом, выделяют и субклонируют по сайту Ваm НІ в вектор VO. Вектор VO получают за счет того, что 1 мкг pVC18 гидролизуют рестриктазой Hind III. Фрагмент выделяют из геля, выступающие концы пополняют полимеразой Кленова и лигируют Т4-ДНК лигазой. Полученную плазмиду SODY1 превращают в SOD Y3 путем гидролиза рестриктазой Nrv1 и встраиванием линкера Hind III (CAAGCTTG). В место разреза вставляют ген URA3, полученный из pURA3, SODY3 переваривают с Hind III и дефосфорилируют в следующих условия х. К 40 мкл реакционной смеси добавляют 40 мкл Н2О, 10 мкл 1мМ ЭДТУК, 5 мкл трис-НСІ, рН 9,5, 1 мкл 100мМ спермидина и 1 мкл (1 мг/мл Н2О) щелочной фосфатазы кишечника теленка (ФТК) и инкубируют при 36°С. По истечении 15 мин еще раз добавляют 1 мкл ФТК и инкубируют в течение 15 мин. Дефосфорилированный вектор очищают электрофорезом в агаровом геле. 2 мкг плазмиды pURA3 режут Hind III и фрагмент длиной 1,2 т. п. о., содержащий дрожжевой ген URA3, выделяют и вставляют в подготовленный вектор. Получаемые таким образом плазмиды SODY7 и SODY8 содержат ген URA3 в дрожжевом гене Mn-Д и различаются ориентацией гена URA относительно гена Мn-Д. Ориентацию гена URA3 относительно, гена Mn-Д можно устанавливать, так как ген URA3 содержит асимметричное место Pst I. Плазмидой SODY7 и SODY8 трансформируют штамм DBY 747 (генотип a, leu 2, his 3, trpi, ura3) следующим образом. 2 мкг SODY7 и SODY8 режут 50 ед. Ваm НI в 200 мкл буфера Ваm НІ (150мМ NaCI, 6мМ трис-НСl, рН 7,9, 6мМ МgСІ 2, 1мМ ДТT) и всю смесь (без отделения части pUC) экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. ДНК растворяют в воде и используют для трансформации дрожжей. Трансформанты выращивают в среде SC-URA в течение ночи при 28°С. Клетки отделяют центрифугированием, разрушают и исследует на содержание в них Mn-Д. При этом для определения Мn-Д, с одной стороны, и Cu/Zn = Д, с другой стороны, работают по известным методикам с использованием гельэлектрофореза путем разделения протеинов с последующим окрашиванием нитросиним тетразолием. Повысить чувстви тельность можно путем окрашивания дианизидином. Для обеспечения дальнейшего анализа применяют спектрометрический метод с использованием щелочного диметил-сульфоксида в качестве выделяющей кислород системы и цитохрома С в качестве восстановителя. Mn-Д и Cu/Zn-Д можно различать путем добавления KCN. Штаммы SODY/72, SOD Y7/6, SOD Y7/8 и SOD Y7/10 не проявляют активности Мn-Д. Пример 8. Получение экспрессионных векторов. Из плазмид HSOD7/1 и HSOD7/2 вырезают фрагменты Bg III, Hind III. Плазмиды YEp13, pIDB и pEAS 102 также гидролизуют Hind III и Bam III. По 50 мкг векторной ДНК и 200 мкг вставки лигируют и трансформируют в штамм E.coli HB 101. В табл. 1 приведено обозначение соответствующи х плазмид. Пример 9. Получение пригодного для трансформации дрожжевого штамма (WS30-5g). Получают дрожжевой штамм, который, кроме описанных для штамма SODY/2 генетических маркеров, дополнительно содержит мутацию в одной из лизосомальных основных протеаз и, таким образом, при разрушении дрожжевых клеток выделяет меньше протеаз. Для этого дефицитный Мn-Д штамм SODY7/2 скрещивают с дефицитным по протеазам штаммом VVS20=25 (a, Ieu2, his3, trpi, uraЗ, рер4). Штамм VVS30-5g, можно трансформировать, он отвечает соответствующим требованиям. Такие скрещивания можно с успехом осуществлять с другими известными дрожжевыми штаммами, например, с 20 В-12. Пример 10. Трансформация дрожжей и экспрессия в дрожжах. Штамм SODY/2 трансформируют плазмидами pWS371A, pWS372A и pWS373A. Трансформанты исследуют на экспрессию. Трансформанты выращивают в жидкой среде SC-1leu при встряхивании. 100 мкл культуры инокулируют в 4 мл YP5%D (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 5% глюкозы) и выращивают в течение ночи, клетки отделяют и расщепляют согласно примеру 7. Hа активирующий гель наносят такое количество сырой жидкости клеток, которое соответствует 1 мл культуры. Опыт по определению активности проводят по примеру 7. Дрожжевой штамм VVS30-5g (Ieu2, his3, trp1, pep4, sod1) также трансформируют плазмидами pWS550A, pWS490A, pVV491A. Измеренное в дрожжах в эти х условиях количество Mn-Д соотве тствуе т примерно 0,5 мг/л культуры. Пример 11. Синтез линкера. Изготавливают шесть различных олиго-нуклеотидов ЕВ1656, ЕВ1636, ЕВ1643, ЕВ1643, ЕВ1646, ЕВ1660 и ЕВ1638 со следующем последовательностью и длиной Олигонуклеотиды EBI636, EBI643, ЕВІ646 и ЕВІ660 фосфорилируют с 5'-концов в следующи х условия х. Исходная реакционная смесь №1 содержит 2 мкл EBI 636 (100 пмоль), 1 амкл 10х линкерного буфера киназы, 3 мкл 10мМ АТР, 1 мкл Т4, полинуклеотидкиназы (10 ед./мкл), 3 мкл воды. Исходная реакционная смесь №2 аналогична смеси №1, но с 2 мкл (100 пмоль) EBI660. Исходная реакционная смесь № 3 содержит 2 мкл олигонуклеотида EBI 643 (100 пмоль), 1 мкл 10х линкерного буфера киназы, 3 мкл 10мМ АТР, 1 мкл Т4-полинуклеотидкиназы (10 ед,)(мкл, 1 мкл воды). 10х линкерный буфер киназы состоит из 0,7 Μ трис-НСl, рН 7,6, 0,1 Μ MgCl 2, 0,05 Μ ДТТ. Реакцию осуществляют в течение 30 мин при 37°С. Затем Т4-полинуклеотидкиназу инактивируют путем нагрева до 100°С. Олигонуклеотиды EBI 656 и EBI 638, которые образуют 5'-концы готовой вставки ДНК длиной 128 п. о. не фосфорилируют, чтобы избежать образования мультимерных вставок ДНК на последующей стадии реакции лигирования. Линкер конструируют из отдельных олигонуклеотидов по схеме: К реакционной смеси №1 добавляют 2 мкл (100 пмоль) ЕВ 1656, а к реакционной смеси №2 - 2 мкл ΕΒΙ 638 (100 пмоль) и проводят реакцию гибридизации олигонуклеотидов друг с др угом. В исходной реакционной смеси №3 содержатся уже 2 комплементарных олигонуклеотида (ЕВI 643. ΕΒΙ 646). 3 смеси нагревают в течение 2 мин при 100°С и медленно охлаждают. Получаемые в реакциях №1-3 короткие двухнитевые фрагменты ДНК лигируют друг с другом следующим образом; 10 мкл смеси №1 (ΕΒΙ 636 + ЕВI 656): 10 мкл смеси №2 (ΕΒΙ 660 + ΕΒΙ 638); 10 мкл смеси №3 (ЕВІ 643 + EBI 646); 3 мкл 10мМ АТР; 1 мкл лигазы ДНК (7 ед./мкл). Реакцию осуществляют в течение 15 ч при 4°С. ДНК разделяют в 1 %-ном агарозном геле и фрагмент ДНК длиной 128 п. о. выделяют из геля путем элюции. Пример 12. Конструкция экспрессионных векторов. Плазмиду HSOD6 переваривают рестриктазами Хhо I и Хbа I и вставляют в нее линкер длиной 128 п. о. (Xho I - митохондриальный лидер - Хbа I) известным методом (рЕ022-А). Ген чМn-Д, снабженный митохондриальной дрожжевой лидерной последовательностью ДНК, подвергают двойному перевариванию Xho I и Eco RI и через Xho I - Eco Rl вставляют в рКН1 (рЕ023-А). Изготовленную таким образом зкспрессионную кассету вставляют аналогично примеру 8 через Bgl Il/Hind III в дрожжевые трансформационные векторы YEp13, plDB207 и pEAS102 no сайтам Bam III и Hind III. Пример 13. Трансформация дрожжей и экспрессия в дрожжах. Дрожжевой штамм WS30-5g (пример 9) трансформируют полученными плазмидами и трансформанты исследуют на и х экспрессию (пример 10). Штамм WS30-5g выращивают в культуре следующего состава, г/л: дрожжевой экстракт 6,7; глюкоза 10; аргинин 0,16; лизин 0,25; триптофан 0,06; метионин 0,08; цистеин 0,03; гистидин 0,10; тирозин 0,16: фенилаланин 0,17; треонин 0,16; изолейцина 0,18; валин 0,21; глутаминовая кислота 0,40; глицин 0,21; цистеин 0,02; аланин 0,15; аспарагиновая кислота 0,20; пролин 0,20; серии 0,15; аспарагин 0,10; глутамин 0,20; аденин 0,025; урацил 0,050. Процесс выращивания осуществляют при аэрации до достижения оптической плотности 0,01 при 546 нм с использованием магнитной мешалки. Основную культур у состава: 8,0 г/л (NH4)2SO 4; 2,56 г/л (ΝΗ4)2ΗΡΟ4; 1,16 г/л KCl; 0,60 г/л MgSO4×7H2O; 0,56 г/л СаСl2×Н2О; 0,04 мг/л биотина; 80 мг/л м-инозита; 40 мг/л Сапантотената; 8 мг/л тиамина; 2 мг/л пиридоксина; 3,1 мг/л CuSO4×5H2О; 19 мг/л: FeCl 3×6H2O; 12 мг/л ZnSO4×7H2O; 14 мг/л MgSO4×H2О; 5 мг/л Н3ВО3; 1 мг/л Кl; 2 мг/л Na2 MgSO4×2H2O; 1 г/л дрожжевого экстракта; 0,2 г/л урацила; 0,1 г/л аденина: 0,5 г/л лимонной кислоты; 15 г/л глутаминовой кислоты; 0,2 г/л гистидина; 0,5 г/л триптофана; 100 г/л глюкозы, получают в ферментере емкостью 20 л. В качестве инокулята используют 5% количества предварительной культуры, выращивание осуществляют аэрацией при размешивании (100 об/мин) и постоянном значении рН 5,0 при 28°С. После снижения содержания глюкозы до 50 г/л еще раз добавляют 50 г/л глюкозы и продолжают ферментацию до тех пор, пока содержание глюкозы не составит 10 г/л (примерно через 45 ч) охлаждают, центрифугир уют и биомассу замораживают. Выход биомассы 18 г/л влажных клеток. Пример 14. Получение дрожжевых митохондрий. Для того, чтобы установить приводит ли введение дрожжевой митохондриальной лидерной последовательности перед геном чМn-Д к импорту протеина в митохондрии, изготовляют дрожжевые митохондрии и определяют активность Мn-Д в митохондриях и цитоплазме. Культуру выращивают п утем встряхи вания (300 об/мин) при 28°С в течение ночи, инокулируют 225 мл среды YPD и выращивают в указанных условиях · течение ночи. После достижения оптической плотности 5-7 при 6000 нм клетки центрифугируют при 6500 οб/мин в течение 5 мин. Клетки промывают водой, суспендируют в 1 Μ маннита, 20мМ КР; (КН2РО4 /К2НРО 4), рН 7,4, добавляют 1 мг/мл цимолазы с мол. массой 500 и 2 ч встряхивают (50 об/мин) при 28°С, получая сферопласты. Их центрифугир уют при 3000 об/мин в течение 5 мин, промывают раствором 1 Μ маннита, 20мМ КР; рН 7,4, 1мМ фторида фенилметилсульфонила (ФФМС). Надосадочную жидкость удаляют и добавляют стеклянные шарики диаметром 0,1мМ в количестве, соответствующем 1-2 объема промытых клеток. Клетки разрушают, суспендируют в 2,5 мл 0,65 Μ маннита, 1мМ ЭДТУК, 1мМ ФФМС, центрифугируют при 2000об/мин в течение 5 мин. Митохондрии выделяют из надосадочной жидкости путем центрифугирования при 12000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочная жидкость содержит цитоплазму и поэтому ее хранят с тем, чтобы потом исследовать активность Мn-Д. Красно-коричневый, центрифугат промывают буфером (белые цитоплазматические компоненты выливают) и затем митохондрии суспендируют в 2-5 мл того же буфера. Загрязнения еще раз удаляют путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 5 мин. Митохондрии удаляют из надосадочной жидкости путем повторного центрифугирования (при 122000 об/мин в течение 10 мин). Митохондрии разрушают при помощи стеклянных шариков и, используя активирующий гель, их исследуют на содержание Мn-Д. Пример 15. Очистка чМn-Д. Стадия 1: разрушение клеток. Клетки (пример 13} промывают в 10 мл дистиллированной воды на 1 г влажной массы и центрифугируют при 16000 об/мин в течение 15 мин. Осадок повторно суспендируют в натриево-калиевом фосфатном буфере (50 мМ, рН 7,0) при соотношении 1:3. Затем клетки разрушают в мельнице при помощи стеклянных шариков диаметром 0,1мМ при расходе 6 л/ч. Экстракт клеток центрифугируют в течение 15 мин (16000 об/мин 4°С) и осадок удаляют. Стадия 2: осаждение полиэтиленимином. К надосадочной жидкости первой стадии добавляют 5%-ный водный раствор полиэтиленимина (рН 8,0) конечной концентрации 0,5%. Затем продолжают размешивать еще в течение 30 мин и осадок удаляют центрифугированием при 16000 об/мин в течение 30 мин. Стадия 3: осаждение путем термообработки. Надосадочную жидкость второй стадии при перемешивании нагревают до 60°С в водяной бане с температурой 80°С, находящейся в стальных стаканах. Затем в ледяной бане охлаждают до комнатной температуры. Выпавший протеин удаляют центрифугированием (10000 об/мин в течение 10 мин при 4°С). Стадия 4: осаждение сульфатом аммония. Надосадочную жидкость стадии 3 насыщают сульфатом аммония до 20% и осадок отделяют центрифугированием (10000 об/мин в течение 15 мин при 4°С). Затем концентрацию сульфата аммония повышают до 90% и осадок отделяют центрифугированием (10000 об/мин в течение 15 мин при 4°С). Осадок поглощают в незначительном количестве (50 мМ, рН 6,0) буфера морфолиноэтансульфоната - 2морфолиноэтансульфоновой кислоты (буфер МЭС) и диализуют в течение ночи с использованием того же буфера. Стадия 5: хроматография на катионите. Колонку, содержащую катионит моно-S-HR 5/5 уравновешивают 5 объемами буфера МЭС. После подачи экстракта на колонку не связанные протеины промывают 5 объемами буфера МЭС. Затем чМn-Д элюируют 20 объемами буфера МЭС с линейным градиентом от 0 до 50мМ NaCI. Фракции, содержащие активность MnД, объединяют и диализуют с использованием натриево-калиевого фосфатного буфера (5 мМ, рН 7,0). Стадия 6: хроматография на гидроксилапатите. На уравновешенную фосфатным буфером (5 мМ, рН 7,0) колонку гидроксилапатита подают диализат стадии 5 и чМn-Д элюируют 20 объемами натриево-калиевого фосфатного буфера с рН 7,0 с линейным градиентом от 5 до 300мМ указанных солей. За степенью очистки чМn-Д наблюдают при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с использованием ДСН. В результате очистки получают 21 мг (1,16 мг/клетки) чMnO2-дисмутазы. Пример 16. Характеристика чМn-Д. Очищенную чМn-Д анализируют при помощи жидкостной гельхроматографии под давлением, жидкостной хроматографии с обратной фазой под давлением, гельэлектрофореза с использованием ДСН, нативного гельэлектрофореза и изоэлектрического фокусирования и сравнивают с естественной чМn-Д. а). Жидкостная гельхроматография под давлением. Колонка; Уотерс Протеин Пак I 125,2 х (7,8 x 300 мМ), диаметр частиц геля 10 мкм; элюент: 0,5 Μ Na2SO4, 0,02 Μ Na2SO 4, рН 7,0, 0,04% Твин 20, 25% пропиленгликоля; скорость подачи 0,5 мл/мин; детекция: поглощение УФ, 214 нм. Естественная и получаемая предлагаемым способом чМn-Д показывает главный пик тетрамера энзима при мол. массе 70000 и 76000соответственно, причем градуирование осуществляют с использованием четырех стандартных протеинов. б). Жидкостная хроматография с обратной фазой под давлением. Колонка; Бакербонд ВП С 18, 4,6 x 250 мМ, 5 мкм диаметра частиц, диаметр пор: 30 нм; элюент A: 0,1 %ная трифторуксусная кислота в воде; элюент Б: 0,1 %-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле; градиент; 20% Б в течение 2 мин, 20-68% Б в течение 24 мин, 68% Б в течение 10 мин. 68 - 20% Б в течение 1 мин; скорость подачи 1,0 мл/мин; детекция: поглощение УФ, 214 нм и 280 нм. Естественная и получаемая предлагаемым способом чМn-ДП проявляют время удерживания около 21 мин (20,7 и 20,9 мин, соответственно). в). Гельэлектрофорез с использованием ДСН. Разделительный гель - 15% акриламида; стекинг-гель - 4% акриламида; окраска серебром; величина геля 0,75мм (8x10 см); режим: 60 мин, 150 В. При подготовке проб для чМn-Д пробы смешивают с ДТТ в качестве восстановителя и кипятят. В геле ДСН обнаруживается мономер чМn-Д с мол. массой около 25000. В зависимости от степени полноты реакции восстановления можно доказать также наличие тетрамера с мол. массой около 90000. г). Нативный гельэлектрофорез. Разделительный гель - 7,5% полиакриламидный гель; стекинг-гель - 2% акриламида + сахароза; величина геля 0,75мм (8x10 см); режим: 75 мин, 150 В; окрашивание кумасси голубым. Получаемая после хроматографии на гидроксилапатите чМn-Д проявляет после электрофореза как после окрашивания кумассисиним (нанесенное количество чМn-Д 0,3 мкг), так и после активирующего окрашивания о-дианизидином единую и находящуюся в том же положении полосу. д). Изоэлектрическое фокусирование, Пределы значения рН 3,5-9,5; гелевые пластинки LKB (1мм x (9 x 10 см); электродные растворы; 1 Μ фосфорная кислота анод), 1 Μ натриевый щелок (катод); температура охлаждения 7°С; объем проб 4,0 и 6,5 мкг соответственно; режим: предварительное фокусирование 500 Вч: фокусирование 3000 Вч в целом; окраска: кумасси-голубой, о-дианизидин. В качестве изоэлектрической точки определяют рl = 8,15. Пример 17. Конструкция кДНК-гено-банка из печеночной ткани человека. Аналогично примеру 1 из свежей печеночной ткани (приблизительно 1 кг) выделяют РНК, получают поли(А)+ РНК и синтезируют кДНК. Получение lgt10-гено-банка осуществляют аналогично примеру 1. Пример 18. Использование гена MnO2-дисмутазы в качестве ДНК-зонда. Полная кДНК гена МnО2-дисмутазы (пример 6) используется в качестве радиоактивно маркированного ДНК-зонда. 5 мг плазмидной ДНК HSOD6 гидролизуют рестриктазами EcoRI и Xho I. После разделяют в 1%ном агарозном геле из геля выделяют ДНК-фрагмент с длиной 600 п. о., содержащий ген MnO2-дисмутазы, его радиоактивно метят и используют в качестве ДНК-зонда. Реакционная смесь: 5 мкл 10 х НИК трансляционного буфера; 10 мкл ДНК-фрагмента; 15 мкл a=p32 dCTP/3000 С (мМоль, водный раствор); 1 мкл 1мМ dATP; 1 мкл ТТР; 1 мкл 1 мM dCTP; 5 ед ДНК полимеразы 1: вода до 50 мкл. 10 х НИК трансляционный буфер содержит 0,5 Μ трис-НСІ, рН 7,2; 0,1 м MgSO4; 1мМ дитиотреитола; 500 мкг/мл альбумина из сыворотки крупного рогатого скота. Реакцию ведут в течение 1 ч при 14°С и прекращают добавлением 5 мкл 250мМ ЭДТУК. Несвязанную радиоактивность удаляют на колонке с биогелем P6-DG. В качестве элюента используют буфер ТЕ. Гибридизацию осуществляют согласно примеру 3. Пример 19. Включение митохондриальной человеческой лидерной ДНК-последовательности MnO2дисмутазы перед геном MnO2-дисмутазы. Совместной гибридизацией двух синтезированных олигонуклеотидов (ЕВІ 917, EBI 919) получают ДНКфрагмент длиной 122 п. о. с Xho I/Xba I выступающими концами. Этот фрагмент соответствует приведенной в примере 6 формуле ОП1, с той разницей, что между стартовым кодоном ATG и кодоном для лизина AAG включают человеческую лидерную ДНК-последовательность. ДНК-последовательность, содержащая вставку с человеческим геном MnO2-дисмутазы, имеет следующую стр уктур у. Плазмиду HSOD6 гидролизуют рестриктазами Xho I и Хbа I и вставляют линкер с длимой 122 п. о. (Xho I человеческий митохондриальный лидер - Хbа I). Получают плазмиду рКН22-А, переваривают ее рестриктазами Xho I и Eco RI (по 5 ед. мкг ДНК) и вставляют в рКН 1. Получают плазмиду рКН23-А. Полученную таким образом экспрессионную кассету аналогично примеру 12 по сайтам Bglll/Hind III (после двойного переваривания плазмид и выделения экспрессионной кассеты) вставляют векторы ΥΕp13, рIDВ207 и pEAS102 по сайтам Bam HI и Hind III. В табл. 2 указаны соответствующие плазмиды. Дрожжевой штамм WS30-5g аналогично примеру 10 трансформируют экспрессионной плазмидой рКН 24АВ. Экспрессию плазмиды рКН24-АВ в штамме WS30-5g подтверждают, используя методику примера 13. Для подтверждения того, приводит ли введение дрожжевой митохондриальной лидерной последовательности перед геном MnO2-дисмутазы к тому, что протеин вводится в митохондрии, получают дрожжевые митохондрии согласно примеру 14 и анализируют активность MnO2-дисмутазы в митохондриях, а также в цитоплазме. Пример 20. Конструкция экспрессионной кассеты с промотором ADHII (спиртовой дегидрогеназы II). В экспрессионной кассете рКН1 (пример 66) промотор ADHI заменяют промотором ADHI по сайтам Xho I/Bam HI. Промотор ADHII выделяют из плазмиды pMW 5 - ADH II/B/X. Плазмида pMW 5-ADHII В/Х содержит фрагмент Bam HI/Hind III, содержащий промотор ADHII и имеющий участок гена ADHII 760 п. о. EcoRI-сайт рестрикции в начале кодирующего участка с помощью линкера превращают в Xho І-сайт рестрикции, причем получают два Ват Hl-сайта, расположенные с обеих сторон Xho I-сайта, Sph I - Xho 1-фрагмент, содержащий стыковое место между промотором и геном заменяют олигонуклеотидными парами для того, чтобы удалить кодирующий участок гена ADHII и вставить правильный переход к гену MnO2-дисмутазы. Конструируют 3 различные олигонуклеотидные пары OL1, OL2 и OL3 аналогично примеру 11 или 36, которые незначительно отличаются длиной нуклеотидной последовательности промо горной части. Согласно примеру 11 осуществляют реакции гибридизации комплементарных олигонуклеотидов: №1 EBI 1161/EBI 1164 №2 ЕВI 1167/ЕBI 1160 №3 ЕВI 1159/ЕВI 1168 №4 ΕΒΙ 1165/EBI 1166 Синтезы EBI 1164, EBI 1167, EBI 1159, EBI 1165 и лигирование олигонуклеотидов №1 + №2 = OL1 №1 + №3 = OL2 №1 + №4 = OL3 с тем, чтобы получить три олигонуклеотидные пары OL1, OL2 и OL3 со следующими ДΗКпоследовательностями: Олигонуклеотидная пара №1(OL1) из EBI 1161/EBI 1164 + EBI 1167/EBI 1160 ADHII - промоторную часть выделяют путем последовательного гидролиза рестриктазами переваривания Xho I и Bam HI и вместо ADHI-промотора вводят в экспрессионную кассету рКН1. В результате использования трех различных олигонуклеотидных лар получают три различные экспрессионные кассеты: pKH1-ADHII-OL1 PKH1-ADHII-OL2 рКН2 - ADHII-OL3 Ген MnO2-дисмутазы выделяют из плазмиды рЕ022-А (пример 12) в виде Xho I - Есо Rl-фрагмента и лигируют во все три ADHII-экспрессионные кассеты. Снабженные геном MnO2-дисмутазы экспрессионные кассеты вырезают с помощью ВgIII и Hind III и через сайты рестрикции Bam HI и Hind III лигированием вводят в дрожжевые векторы рID207 и YEp13 аналогично примеру 8. Дрожжевые экспрессионные плазмиды с промотором ADHII приведены в табл. 3. Дрожжевой штамм WS30-5g трансформируют экспрессионными плазмидами, указанными в табл. 3, и продукты трансформации аналогично примеру 13 исследует на экспрессию. Пример 21. Конструкция экспрессной ной кассеты с промотором тионеина/меди (CUP1). Промотор CUP1 аналогично примеру 20 путем замены ADHII-промотора встраивают в рКН1 по сайтам рестрикции Bam HI и Xho I. Дрожжевой промотор CUP1 лигируют с 8 олигонуклеотидами, синтезированными аналогично примеру 36 или 11. Для достижения желаемого сочетания CUP1-промотора с отдельными 1691/1692/1696/1704/1711/ /1710/1716 по схеме: олигонуклеотидами EBI осуществляют: 1} синтез олигонуклеотидов EBI 1692, ЕВI 1704, ЕВI 1710, EBI 1716 2} реакции гибридизации олигонуклеотидов №1 EBI 1691/EBI 1692 №2 EBI 1696/EBI 1704 №3 EBI 1711/EBI 1710 №4 EBI 1716/EBt 1717 3) лигирование олигонуклеотидов с олигонуклеотидами №1 и 2, согласно примеру 11; ДНК-фрагмент элюируют из 2 %-ного агарозного геля и по сайтам Bam HI - Xba I вводят в pES 102 (пример 6а). Подучают плазмиду рЕ046. Олигонуклеотиды №3 и 4 лигируют др уг с др угом, ДНК-фрагмент элюируют из 2%-ного агарозного геля и вводят по сайтам Xba I - Xho і в рЕ046. Получают плазмиду рЕ047. Теперь весь CUP1-промотор можно лигировать в pKH1 no сайтам Bam H1 и Xho I. Получаемую экспрессионную касету называют рЕ048. Ген MnO2-Дисмутазы выделяют из плазмиды рЕ022-А (пример 12) с помощью рестрикции энзимами Xho I и Eco RI и лигируют в экспрессионную кассету в Ε 048. Снабженную геном MnO2-дисмутазы экспрессионную кассету гидролизуют рестриктазой ВgIII и аналогично примеру 8 по сайтам Bam HI и Hind III вводят в дрожжевые векторы рIDВ207 и уЕр13. Дрожжевые экспрессионные плазмиды с CUΡ1-промотором приведены в табл. 4. Дрожжевой штамм WS30-5g трансформируют аналогично примеру 13 экспрессионными плазмидами, указанными в табл. 4, и продукты трансформации исследуют на экспрессию. Пример 22. Экспрессия MnO2-дисмутазы в эукариотических клетках животного происхождения. а). Конструкция экспрессионных плазмид. Ген MnO2-дисмутазы с помощью синтетических олигонуклеотидов снабжают на конце 5' соответствующими контрольными и лидерными последовательностями. Необходимыми контрольными последовательностями являются сайт САР и стартовый сигнал ATG. Для секреции в среде используют лидерную последовательность омега-интерферона (ω-ИФ). Для внутриклеточной продукции используют человеческую митохондриальную лидерную последовательность MnO2-дисмутазы. Путем сочетания четырех синтетических олигонуклеотидов OL39, OL40, OL41, OL42, получаемых согласно примеру 36 или 11: получают фрагмент ДНК длиной 192 п. о. с выступающими концами Hind III/Xba I. Этот фрагмент ДНК представляет собой 5'-нетранслируемый участок ω -ИФ с сайтом САР, стартовым сигналом ATG, ω-ИФ-лидерной последовательностью (21 аминокислота) и кодирующий участок первых тринадцати аминокислот MnO2-дисмутазы (от лизина до аланина). Путем сочетания синтетических олигонуклеотидов OL39, OL40 указанных формул и синтетических олигонуклеотидов OL43 и OL44 получают ДНК-фрагмент длиной 196 п. о. С выступающими концами Hind Ill/Xba I. Этот ДНК-фрагмент представляет собой часть нетранслированного 5'-участка ω-ИФ с сайтом САР и стартовым сигналом ATG, а также с митохондриальной лидерной последовательностью MnO2-дисмутазы человека (24 аминокислоты) для внутриклеточной продукции MnO2-дисмутазы и кодирующего участка первых тринадцати аминокислот MnO2-дисмутазы. Олигонуклеотиды OL39, OL42 и OL44 фосфорилируют на 5'-конце при помощи Т4-полинуклеотидной киназы с тем, чтобы обеспечить осуществление последующей реакции лигирования. Реакционная смесь: 2 мкл олигонуклеотида (100 пмоль); 1 мкл 10 х буфер линкерной киназы; 3 мкл 10мМ АТР; 1 мкл Т4-полинуклеотидной киназы, 10 ед/мкл. 10 х буфера линкерной каназы содержит 0,7 Μ трис-НСІ, рН 7,6; 0,1 Μ MgCl2; 0,05 Μ дитиотреитола. Реакцию ведут 30 мин при 37°С, энзим инактивируют путем нагревания до 100°С. Олигонуклеотиды OL40, OL41 и OL43, образующие 5'-концы готовых ДНК-фрагментов, не фосфорилируют во избежание образования мультимерных ДНК-вставок при последующей реакции лигирования. Гибридизацию комплементарных олиго-нуклеотидов друг с другом осуществляют следующим образом: Олигонуклеотиды А и Б представляют собой комплементарные олигонуклеотиды. Реагенты: №1: А = OL39 Б = OL40 №2: A = OL41 Б = OL42 №3: А = OL43 Б = OL44 Реакционная смесь: 1 мкл олигонуклеотида A (100 пмоль); 1 мкл олигонуклеотида Б (100 пмоль); 8 мкл воды. Реакционные смеси №1-3 нагревают при 100°С в течение 2 мин и медленно охлаждают в водяной бане до комнатной температуры. Получаемые результаты реакций 1-3-κοроткие двунитевые фрагменты ДНК лигируют друг с другом следующим образом: Лидер ω-ИФ: 5 мкл реакционной смеси №1; 5 мкл реакционной смеси №2; 1,5 мкл/мл 10мМ АТР; 0,5 мкл/мл ДНК-лигазы (7 ед/мкл). Мито хондриальная лидерная последовательность MnO2-дисмутазы: 5 мкл реакционной смеси №1; 5 мкл реакционной смеси №3; 1,5 мкл 10мМ АТР; 0,5 мкл ДНК-лигазы (7ед.). Реакции протекают в. течение 15 ч при температуре 4°С. ДНК разделяют по размерам на 2%-ном агарозном геле и желаемые ДНК-фрагменты длиной 192 и 196 п. о. элюируют из геля. Готовый ДНК-фрагмент длиной 192 п. о. с лидером ω-ИФ для секреции MnO2-дисмутазы в среду лигируют в HSOD6 по сайтам Hind III и Хbа I. Получают плазмиду HSOD11. Плазмиду гидролизуют по сайтам Eco RI и обрабатывают фрагментом Кленова с образованием тупых концов. Затем переваривают Hind III и большой ДНК-фрагмент длиной приблизительно 700 п. о. выделяют из 1.5%-ного агарозного геля. ДНК-фрагмент лигируют в эукариотический вектор pSV2 gptdhfr, который получают из pBR 322 dhfr разрезанием Esp I и Hind III, заполнением фрагментом Кленова и лигированием в вектор pSV2gpt по сайтам Eco RI - Bam HI, заполненным фрагментом Кленова и обработанным щелочной фосфатазой. Лигирование выделившегося большого ДНК-фрагмента, имеющего приблизительно 700 п. о. в вектор pSV2gptdhfr осуществляют после предварительного гидролиза вектора с помощью Ара I, заполнения сайта рестрикции фрагментом Кленова и дополнительного гидролиза с помощью Hind III. Таким образом, ген gpt заменяют в векторе на ген MnO2-дисмутазы. Смесь лигирования используют для трансформации E.coli HB101. После рестрикционного анализа плазмидной ДНК положительных клонов получают экспрессионную плазмиду, которую обозначают как pSV2dhfrSODf. Аналогично ДНК-фрагмент с митохондриальным лидером MnO2-дисмутазы длиной 196 п. о. по сайтам Hind III - Xbal лигируют в HSO16. Получают плазмиду HSOD12. Ген с регулярными последовательностями клонируют в эукариотический вектор pSV2gptdhfr по сайтам рестрикции Hind lll - Eco RI после предварительного заполнения выступающих концов Eco RI энзимом Кленова. Получаемую экспрессионную плазмиду обозначают как pSV2dhfrSOD2. Экспрессию pSV2dhfrS0D1 и pSV2dhfrSOD2 осуществляют в клетках СНО с де фицитом дегидрофолатредуктазы, которые культивируют в a-МЕМ-среде (10% эмбриональной телячьей сыворотки, гипоксантин, тимидин). Трансфекцию клеток СНО экспрессионными плазмидами pSV2dhfrS0D1 /D2 осуществляют известным образом. За день до трансфекции 7 х 10 клеток подают на питательные пластинки. Клетки обрабатывают продуктом осаждения фосфатом кальция, содержащим до 10 мкг плазмидной ДНК, при 37°С в течение 4 ч. Затем среду отсасывают и заменяют селекционной средой a-MEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, которую каждые два дня заменяют. Колонии трансформированных клеток появляются по истечении 12-16 дней. Надосадочную жидкость (среду) исследуют на наличие активности MnO2-дисмутазы. Пример 23. Очистка MnO 2-дисмутазы. а) Разрешение клеток. Аналогично примеру 15 клеточную массу промывают дистиллированной водой и в концентрации 30% суспендируют в 50мМ трис-уксусной, кислоты, рН 8,5. Клетки разрушают в мельнице, содержащей стеклянные шарики диаметром 0,45-0,5 мМ. Экстракт клеток центрифугируют (16000 об/мин, 15 мин, 4°С и осадок удаляют). б) Осаждение нагреванием и кислотой. Надосадочную жидкость со стадии "а" нагревают до 60°С, в ледяной бане охлаждают до 20°С, добавлением 1 Μ уксусной кислоты рН среды устанавливают до 5,5, Центрифугир уют при 16000 об /мин и подвергают диализу с помощью трис-уксусной кислоты (60 мМ, рН 5,5). в) Катмонообменная хроматография. Содержащий MnO2-дисмутазу диализат со стадии "б" подают на колонку с СМ-сефарозой, уравновешенную 60мМ трис-уксусной кислотой, рН 5,5, элюируют линейным градиентом (15 объемов колонки) от 60мМ трис-уксусной кислоты до 0,12 Μ ацетата натрия. г) Гельпроникающая хроматография. Фракции с активностью MnO2-дисмутазы со стадии "в" собирают и подают на колонку, содержащую сефакрил S 300 HR или суперозу 12, уравновешенную 0,1 Μ фосфатным буфером, рН = 7, 8. Элюцию проводят тем же буфером. Получают 20 мг (1,1 мг/г клетки) чMnO 2-дисмутазы.