Рослина капусти brassica oleracea, стійка до захворювання килою

1. Рослина B. oleracea, стійка до захворювання килою, де ознаку стійкості одержують зі стійких до кили рослин B. rapa і де ознака стійкості до кили є моногенною та домінантною. 2 (19) 1 3 84548 до захворювання килою, і покоління рослин першої генерації, отримане в результаті схрещування, розщеплюється у співвідношенні 1:0 за ознакою стійкості до захворювання килою, і б) відбувається самозапилення рослин покоління першої генерації, і отримане покоління рослин другої генерації розщеплюється в співвідношенні 1:0 за ознакою стійкості до захворювання килою, де рослина-“тестер” являє собою рослину, що виведена з лінії CFL66, депонованої в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134, і яка несе моногенну та домінантну ознаку стійкості до кили, яка властива лінії CFL667, або нащадка або предка лінії CFL667, що несе моногенну та домінантну ознаку стійкості до кили, яка властива лінії CFL667. 12. Рослина B. oleracea, стійка до захворювання килою, причому, рослина є гетерозиготною за ознакою стійкості і цю рослину, гетерозиготну за ознакою стійкості, схрещують з рослиною“тестером”, гетерозиготною за моногенною та домінантною ознакою стійкості до захворювання килою, і покоління рослин першої генерації, отримане в результаті схре щування, розщеплюється в співвідношенні 3:1 за ознакою стійкості до захворювання килою, де рослина-“тестер” являє собою рослину, виведену з лінії CFL66, що депонована в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134, або нащадка або предка лінії CFL667, що несе моногенну та домінантну ознаку стійкості до кили, що властива лініям CFL667, або рослину, виведену з лінії CFL667, що депонована в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134, та яка несе моногенну та домінантну ознаку стійкості до кили, що власти ва лінії CFL667. 13. Рослина за п.12, причому, рослини з покоління першої генерації додатково схрещують із зазначеною рослиною, гетерозиготною за ознакою стійкості, і отримане покоління рослин другої генерації розщеплюється в співвідношенні 5:1 за ознакою стійкості до захворювання килою. 14. Рослина за одним з пп.1-13, де ця рослина B. oleracea є гомозиготною за зазначеною ознакою стійкості. 15. Рослина за одним з пп.1-13, де ця рослина B. oleracea є гетерозиготною за зазначеною ознакою стійкості. 16. Рослина за одним з пп.1-13, де ця рослина B. oleracea є інбредною або дигаплоїдною. 17. Рослина за одним з пп.1-13, де ця рослина B. oleracea є гібридною. 18. Рослина за п.16 або 17, де ця рослина B. oleracea має цитоплазматичну чоловічу стерильність. 19. Насіння рослини за одним з пп.1-18. 20. Плід або частина рослини за одним з пп.1-18. 21. Частина рослини за одним з пп.1-18, де ця частина являє собою пилок, насінний зачаток або ембріон. 22. Застосування моногенної та домінантної ознаки стійкості до кили для надання рослині B. oleracea стійкості до зазначеного захворювання. 4 23. Застосування за п.22, де зазначену ознаку стійкості одержують з F1-гібрида “Parkin” китайської капусти. 24. Спосіб одержання рослини B. oleracea, що несе моногенну та домінантну ознаку стійкості до кили, який полягає в тому, що: а) одержують рослину B. rapa, стійку до кили; б) схрещують рослину B. rapa з рослиною B. oleracea, в) здійснюють вивільнення ембріона, отриманого в результаті схрещування на стадії б); г) здійснюють регенерацію рослини з ембріона, отриманого на стадії в); д) відбирають рослину, отриману на стадії г), що має стійкість до кили; е) здійснюють зворотне схрещування рослини, отриманої на стадії д) з рослиною B. oleracea. 25. Спосіб за п.24, в якому додатково здійснюють інтрогресію ознаки стійкості в елітну інбредну лінію B. oleracea. 26. Спосіб за п.25, у якому додатково схрещують зазначену інбредну лінію з іншою інбредною лінією B. oleracea з одержанням гібрида. 27. Рослина B. oleracea, яку одержують за допомогою способу за будь-яким з пп.24-26. 28. ДНК-фрагмент, ампліфікований з геному рослин роду Brassica, де ДНК-фрагмент складається з 640 пар основ і представлений SEQ ID NO:2, де ДНК-фрагмент дозволяє виявляти присутність домінантної та моногенної ознаки стійкості до кили в рослині роду Brassica. 29. Застосування ДНК-фрагмента за п.28 для ідентифікації рослини роду Brassica, стійкої до кили. 30. Застосування праймера O20 (SEQ ID NO:1) для ідентифікації стійкості до кили для виявлення в геномі рослини роду Brassica ДНК-фрагмента, що складається з 400 пар основ, де ДНК-фрагмент дозволяє виявляти присутність домінантної та моногенної ознаки стійкості до кили в рослині роду Brassica. 31. Застосування праймера Y13 (SEQ ID NO:2) для виявлення в геномі рослини роду Brassica ДНКфрагмента, що складається з 640 пар основ. 32. Застосування праймера O20 або Y13 для ідентифікації рослини роду Brassica, стійкої до кили. 33. Застосування за одним з пп.29-32, де рослина роду Brassica являє собою B. oleracea. 34. Набір для виявлення моногенної та домінантної ознаки стійкості до кили в рослині B. oleracea, що містить олігонуклеотид, представлений у SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:2. 35. Спосіб перенесення моногенної та домінантної ознаки стійкості до кили в рослину B. oleracea, що має чутливість або недостатній рівень стійкості до захворювання, який полягає в тому, що: а) схрещують рослину B.oleracea за п.1 з рослиною B. oleracea, що має чутливість до кили; б) відбирають рослину, що несе ДНК-фрагмент, який можна одержувати за допомогою ПЛРампліфікації з використанням праймера O20 (SEQ ID NO:1) або праймера Y13 (SEQ ID NO:2) при наступних умовах ампліфікації: 5 ДНК Праймер (10 мкМ) дНТФ (2,5 мМ) 10-кратний буфер Platinium Taq MgCl2 (50 мМ) Platinium Taq (BRL/life) Стерильна вода Програма ПЛР 3 хв. 94°С Рівень 0:00 94°С Рівень 0:00 36°С Рівень 0: 45 72°С 3 хв. 94°С Рівень 0: 00 94°С Рівень 0: 00 36°С Рівень 0: 45 72°С 5 хв. 72°С 84548 6 мкл (розведена ДНК зі стандартного міні-препарату) 1,0 мкл 2,0 мкл 2,5 мкл (200 мМ Трис-HCl рН 8,4, 500 мМ KCl, що не містить MgCl 2) 0,75 мкл 0,2 мкл (5 од./мкл) мкл (залежно від кількості застосовуваної ДНК), кінцевий об‘єм 25 мкл 0,10 0,30 1,05 1 цикл, ПЛР цикл (Perkin Elmer 9600) 0,10 0,30 1,05 40 циклів, ПЛР цикл (Perkin Elmer 9600) де рослина, отримана на стадії б), є стійкою до кили. 36. Спосіб за п.35, в якому додатково шляхом зворотного схрещування вводять ознаку стійкості в рослину B. oleracea, що має чутливість або недостатній рівень стійкості до кили. 37. Спосіб ідентифікації рослини B. oleracea, стійкої до кили, який полягає в тому, що: а) одержують зразок з рослини B. oleracea; б) виявляють у зазначеному зразку ДНК-фрагмент, який одержують за допомогою ПЛР-ампліфікації з використанням праймера O20 (SEQ ID NO:1) або праймера Y13 (SEQ ID NO:2), де розглянута на б) стадії рослина B. oleracea має стійкість до кили. 38. Спосіб відбору стійкої до кили рослини B. oleracea з популяції рослин B. oleracea, який полягає в тому, що: а) одержують популяцію рослин B. oleracea; б) одержують зразок з рослини, що входить у цю популяцію; в) виявляють у цьому зразку ДНК-фрагмент, одержуваний за допомогою ПЛР-ампліфікації з використанням праймера O20 (SEQ ID NO:1) або праймера Y13 (SEQ ID NO:2), де розглянута на стадії б) рослина B. oleracea має стійкість до кили. Даний винахід відноситься до рослин, стійких до захворювань, насамперед, до рослин Brassica oleracea, стійких до захворювання килою. Кила являє собою широко розповсюджене захворювання, що є серйозною проблемою в багатьох зонах вирощування представників роду Brassica [див., наприклад, огляд Dixon, Grower April 29, 1999, стор.28-29]. Збудником хвороби є одноклітинний організм Plasrnodiophora brassicae. Симптоми хвороби включають неправильне формування листя з вираженим розбуханням (килою), що, зрештою, приводить до гниття. Хвороба приводить також до карликовості через уповільнений ріст та до в'янення листя при стресі, викликаному нестачею води. Застосування хімічних засобів захисту рослин для боротьби з хворобою є неефективним. Таким чином, для захисту культури від захворювання важливою є високоефективна генетична стійкість. Рід капустяних (Brassica) включає декілька видів, що представляють комерційний інтерес, таких як В. rара (капуста китайська, пак-хой, турнепс (або ріпа городня)), В. nарus (призначена для одержання олії капуста, бруква), B.juncea (гірчиця), В. nigra (гірчиця чорна) та В. oleracea (цвітна капуста, броколі, капуста городня, брюссельська капуста, савойська капуста, капуста кормова (городня, бра унколь, кольрабі, та інші). Хоча підвиди видів, що відносяться до роду Brassica, як правило, мають статеву сумісність, статева сумісність не завжди має місце у випадку різних видів роду Brassica. Наприклад, В. rара та В. oleracea мають різне число хромосом (10 хромосом і 9 хромосом, відповідно) і тому не мають статевої сумісності. Це дуже в значній мірі утруднює перенос ознаки від одного виду роду Brassica до іншого. Для представників роду Brassica описано кілька видів, які можна використовувати для переносу ознаки стійкості до кили [див., наприклад, Bradshaw та ін., Ann. Appl. Віоі. 130, 1997, стор.337-348; Gowers, Euphytica 31, 1982, стор.971-976]. У деяких випадках стійкість є моногенною, у деяких випадках полігенною, у деяких випадках домінантною, а у деяких випадках рецесивною. Моногенна домінантна стійкість виявлена у В. rара та В. nарus, наприклад, моногенна домінантна стійкість виявлена у китайської капусти В. rара [Yoshikawa, Japan Agricultural Research Quarterly, т.17, №1, 1983, стор.6-11]. Встановлено, що F1-гібриди китайської капусти, які мають таку стійкість, добре захищені від кили, хоча невелике число штамів ("рас") збудника кили можуть пригнічувати цю стійкість. Імовірно, що такі раси превалюють в Азії, а не в Європі. 7 84548 На противагу цьому, у тих представників роду Brassica, наприклад, В. oleracea, якіможна розглядати як джерела ознаки стійкості, відомі тільки випадки полігенної рецесивної стійкості [див., наприклад, Voorrips, Euphytica 83, 1995, стор.139146]. Доведено, що такі представники В. oleracea, які можна розглядати як джерела ознаки стійкості, не тільки не мають достатнього рівня стійкості до кили, але цю ознаку також дуже важко переносити від одних ліній В. oleracea, що мають комерційне значення, до інших. Це дуже сильно утруднює та подовжує селекцію за ознакою стійкості. Таким чином, існує нагальна потреба в одержанні рослин В. oleracea, що мають підвищену стійкість до кили, які легко відбирати та переносити в лінії В. oleracea, що мають комерційне значення. Таким чином, проблемою, на вирішення якої спрямований даний винахід, є незадовільна стійкість до захворювання килою у представників В. oleracea. Для підвищення стійкості до хвороби у В. oleracea у даному винаході запропонований перенос моногенної домінантної ознаки стійкості до кили від капусти китайської (B rара) до броколі В. oleracea, а потім до інших підвидів В. oleracea, таких, як капуста городня білокачанна, цвітна капуста та брюссельська капуста. Для подолання статевої несумісності між Я гора та B oleracea ознаку стійкості до кили переносили за допомогою міжвидової гібридизації з використанням методу "порятунку" ембріона, з наступними повторними зворотними схрещуваннями та оцінками ураження захворюванням усіх поколінь беккросів. Отримані рослини B. oleracea характеризувалися високим рівнем стійкості до кили. Ця стійкість була стабільною, піддавалася переносу в інші покоління та переносу в чутливі рослини B oleracea або такі, що мають недостатній рівень стійкості. Таким чином, у даному винаході описані стійкі до кили рослини B oleracea, включаючи насіння та матеріал, одержаний від зазначених рослин, та їх потомство, де стійкість до кили є моногенною та домінантною. У даному винаході описані також способи одержання стійких до кили рослин B. oleracea, способи переносу стійкості до кили в чутливі рослини B. oleracea або такі, що мають недостатній рівень стійкості. У даному винаході описані також молекулярні маркери, пов'язані з генетичним фактором, що обумовлює стійкість до кили. Важлива перевага даного винаходу в порівнянні з існуючими методами надання стійкості до кили у B. oleracea полягає в тому, що стійкість, запропоновану в даному винаході, легко переносити від одних рослин B. oleracea в інші та у сорти, що мають комерційний інтерес. Стійкі рослини через те, що вони не уражуються захворюванням, дають більш високі врожаї. Крім того, при вирощуванні рослин B oleracea, запропонованих у даному винаході, необхідне застосування істотно менших кількостей хімічних засобів захисту рослин від кили або хімічних засобів захисту рослин не вимагається взагалі. Таким чином, у даному винаході запропоновано: 8 Рослина B oleracea, стійка до захворювання килою, більш конкретно до захворювання килою, що викликається патогеном Plasmodiophora brassicae. У конкретному варіанті здійснення винаходу стійкість до захворювання килою є моногенною та домінантною. Бажане ураження рослини B. oleracea відповідає балу 2 або менше при оцінці ураження, що викликається захворюванням, за 19-бальною шкалою, переважно відповідно до методу, описаного у прикладі 2. Бажане ураження рослини B oleracea відповідає балу 1 при оцінці ураження, що викликається захворюванням, за 19-бальною шкалою, переважно відповідно до методу, описаного у прикладі 2. Бажано, коли ураження рослини B. oleracea відповідає балу 1 або менше при оцінці ураження, що викликається захворюванням, за 0-5-бальною шкалою, переважно відповідно до методу, описаного у прикладі 2. Бажано, коли ураження рослини B oleracea відповідає балу 0 при оцінці ураження, що викликається захворюванням, за 1-5-бальною шкалою, переважно відповідно до методу, описаного у прикладі 2. Відповідно до іншого кращого варіанта здійснення винаходу рослина B oleracea має стійкість до зараження через кореневі волоски. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу рослина B. oleracea являє собою броколі, білокачанну капусту, цвітну капусту, брюссельську капусту, капусту кормову (браунколь), капусту савойську або капусту червонокачанну. У наступному кращому варіанті здійснення винаходу рослина B. oleracea є гомозиготною або гетерозиготною за ознакою стійкості до кили. Ще в одному кращому варіанті здійснення винаходу стійкість до кили генетично зчеплюють з молекулярним маркером. Переважно молекулярний маркер можна одержувати за допомогою ПЛРампліфікації. Бажано, коли генетичний фактор, що обумовлює стійкість, знаходиться на відстані 10сМ (сантиморганід) від молекулярного маркера, бажано на відстані менше 6сМ, більш бажано менше 5сМ, ще більш бажано менше 3с, найбільш бажано менше 1,5сМ. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу генетичний фактор стійкості до кили зчеплений з молекулярним маркером, який можна одержувати за допомогою ПЛР-ампліфікації з використанням праймера О20 (SEQ ID NO:1) або праймера Y13 (SEQ ID NO:2). У наступному кращому варіанті здійснення винаходу стійкість можна одержувати зі стійкої до кили рослини В. rара, переважно з F1-гібрида капусти китайської "Parkin". B іншому кращому варіанті здійснення винаходу стійкість до кили, запропоновану в даному винаході, можна одержувати з лінії CFL667, депонованої в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134. У наступному кращому варіанті здійснення винаходу стійкість виводять або одержують з лінії CFL667 або з нащадка або предка лінії CFL667, що несе зазначену ознаку стійкості. Ще в одному кращому варіанті здійснення винаходу рослина є інбредною або гібридною. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу рослина є дигаплоїдною. Ще в одному кращому варіанті здійснення винаходу рослина має цитоплазматичну чоловічу стерильність (ЦЧС). У наступному кращому варіанті здійснення даного винаходу рослина В. oleracea 9 84548 має локус, що обумовлює стійкість до кили. Бажано, коли локус знаходиться на відстані 10 сантиморганід (сМ) від молекулярного маркера, який можна одержувати за допомогою ПЛР-ампліфікації з використанням праймера O20 (SEQ ID NO:1) або праймера Y13 (SEQ ID NO:2), бажано 6сМ, більш бажано 5сМ, ще більш бажано 3сМ, найбільш бажано на відстані 1,5сМ від зазначеного молекулярного маркера. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу локус, що з умовлює стійкість, відповідає локусу, який є присутнім у лінії CFL667, депонованій в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134, та переважно косегрегується з локусом, що обумовлює стійкість, який є присутнім у лінії CFL667. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу локус, що обумовлює стійкість до кили, можна одержувати з лінії CFL667, депонованої в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134, або з нащадка або предка лінії CFL667, що несе цю ознаку стійкості. У наступному кращому варіанті здійснення винаходу локус, що зумовлює стійкість, виводять або одержують з лінії CFL667 або з нащадка або предка лінії CFL667, що несе ознаку стійкості. Крім того, у даному винаході запропоновані: - насінний матеріал описаної вище рослини, включаючи його потомство, де насінний матеріал або потомство має стійкість, запропоновану в даному винаході; - плід описаної вище рослини; частина описаної вище рослини, включаючи пилок, насінний зачаток та ембріон зазначеної рослини. У даному винаході запропоновано також: Рослину В. oleracea, що має стійкість до захворювання килою, причому, коли рослина є гомозиготною за ознакою стійкості і цю рослину, гомозиготну за ознакою стійкості, схрещують з рослиною-"тестером", що є гомозиготною за моногенною та домінантною ознакою стійкості до захворювання килою, то покоління рослин першої генерації, отримане в результаті цього схрещування, розщеплюється в співвідношенні 1:0 за ознакою стійкості до захворювання килою. У кращому варіанті здійснення винаходу, коли це покоління рослин першої генерації є таким, що самозапилюється, то покоління рослин, яке утворилося, другої генерації розщеплюється в співвідношенні 1:0 за ознакою стійкості до захворювання килою. У кращому варіанті здійснення винаходу рослина"тестер" являє собою рослину, що виведена з лінії CFL667, депонованої в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134, і яка несе моногенну та домінантну ознаку стійкості до кили, притаманну зазначеній лінії CFL667 або нащадку або предку лінії CFL667, які несуть моногенну та домінантну ознаку стійкості до кили, властиву лінії CFL667. У кращому варіанті здійснення винаходу рослину"тестер" виводять з рослини лінії CFL667 або рослини-нащадка лінії CFL667 шляхом клітинного злиття. У наступному кращому варіанті здійснення винаходу рослина-"тестер" має чоловічу фертильність. Рослину В. oleracea, що має стійкість до захворювання килою, причому, коли вказана рослина є гетерозиготною за фактором стійкості і цю 10 рослину, гетерозиготну за ознакою стійкості, схрещують з рослиною-"тестером", яка є гетерозиготною за моногенною та домінантною ознакою стійкості до захворювання килою, то покоління першої генерації, отримане в результаті цього схрещування, розщеплюється в співвідношенні 3:1 за ознакою стійкості до захворювання килою. У кращому варіанті здійснення винаходу, коли ці рослини з покоління першої генерації додатково схрещують із зазначеною рослиною, гетерозиготною за ознакою стійкості, то покоління, що утворилося, другої генерації розщеплюється в співвідношенні 5:1 за ознакою стійкості до захворювання килою. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу рослина-"тестер" являє собою рослину лінії CFL667, депонованої в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134, або нащадка або предка лінії CFL667, що володіють моногенною та домінантною ознакою стійкості до кили, яка властива лінії CFL667, або рослину, що виведена з лінії CFL667, депонованої в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134, і яка володіє моногенною та домінантною ознакою стійкості до кили, що властива лінії CFL667. У наступному кращому варіанті здійснення винаходу оцінка потомства індивідуальних рослин дозволяє встановити, що отримане покоління другої генерації розщеплюється в співвідношенні 3:1, 1:0 або 1:1 за ознакою стійкості в залежності від генетичного статусу індивідуальних рослин з покоління першої генерації (гетерозиготні, гомозиготні за ознакою стійкості або гомозиготні за ознакою чутливості, відповідно). В іншому кращому варіанті здійснення винаходу ознака стійкості до кили є моногенною, переважно моногенною та домінантною. У кращому варіанті здійснення винаходу рослина В. oleracea є гомозиготною за ознакою стійкості. У наступному кращому варіанті здійснення винаходу рослина В. oleracea є гетерозиготною за ознакою стійкості. У даному винаході запропоновані також: - насінний матеріал описаної вище рослини, включаючи її потомство, де насінний матеріал або потомство має стійкість, запропоновану в даному винаході; - плід описаної вище рослини; частина описаної вище рослини, включаючи пилок, насінний зачаток та ембріон зазначеної рослини. У даному винаході запропоновано також: Застосування моногенної та домінантної ознаки стійкості до кили, запропонованої в даному винаході, для надання стійкості до цього захворювання рослині В. oleracea. Переважно ознаку стійкості можна одержувати з рослини В. rара, переважно з F1-гібрида капусти китайської "Parkin". У даному винаході запропонований також: Спосіб одержання рослини В. oleracea, яка несе моногенну та домінантну ознаку стійкості до кили, який полягає в тому, що а) одержують рослину В. rора, стійку до кили; б) схрещують зазначену рослину В. тара з рослиною В. oleracea, в) "рятують" ембріони, отримані в результаті схрещування, зазначеного на стадії б); г) регенерують рослину з ембріона, отриманого на стадії в); д) відбирають рослину, отриману на стадії г), що має 11 84548 стійкість до кили; e) здійснюють зворотне схрещування рослини, отриманої на стадії д), з рослиною В. oleracea. У кращому варіанті здійснення винаходу спосіб додатково передбачає інтрогресію ознаки стійкості в елітні інбредні рослини В. oleracea. B іншому кращому варіанті здійснення винаходу спосіб передбачає також схрещування зазначеної інбредної рослини з іншою інбредною рослиною В. oleracea для одержання гібрида. У даному винаході запропоновано також: Рослину В. oleracea, у тому числі гібридну рослину, яку можна одержувати за допомогою описаного вище способу. У даному винаході запропонований також: Спосіб переносу моногенної та домінантної ознаки стійкості до кили в рослину В. oleracea, чутливу або таку, що має недостатній рівень стійкості до захворювання, який полягає в тому, що: а) одержують рослину В. oleracea, яка несе моногенну та домінантну ознаку стійкості до кили; б) схрещують отриману на стадії а) рослину В. oleracea з рослиною В. oleracea, що має чутли вість або недостатній рівень стійкості до кили; в) відбирають рослину, отриману на стадії б), яка має стійкість до кили. У кращому варіанті здійснення винаходу спосіб додатково передбачає зворотне схрещування стійкої рослини з рослиною В. oleracea, яка має чутливість або недостатній рівень стійкості до кили. У кращому варіанті здійснення винаходу ураження рослини В. oleracea, яка має чутливість або недостатній рівень стійкості до захворювання, відповідає балу 4 або більше, переважно балу 3 або більше, при оцінці ураження, що викликається захворюванням, за 1-9-бальною шкалою, або балу 3 або більше, переважно балу 2 або більше, при оцінці ураження, що викликається захворюванням, за 0-5-бальною шкалою. У даному винаході запропоновані також: ДНК-фрагмент, ампліфікований з генома рослин роду Brassica, де цей ДНК-фрагмент складається приблизно з 400 пар основ і представлений у SEQ ID NO:1. ДНК-фрагмент, ампліфікований з генома рослин роду Brassica, де цей ДНК-фрагмент складається приблизно з 640 пар основ і представлений у SEQ ID NO:2. У кращому варіанті здійснення винаходу описаний вище ДНК-фрагмент є індикатором присутності домінантної та моногенної ознаки стійкості до кили у рослини роду Brassica. Застосування описаного вище ДНК-фрагмента для ідентифікації рослини роду Brassica, стійкої до кили. Застосування праймера О20 (SEQ ID NO:1) для виявлення ДНК-фрагмента довжиною приблизно 400 пар основ в геномі рослини роду Brassica. Застосування праймера Y13 (SEQ ID NO:) для виявлення ДНК-фрагмента довжиною приблизно 640 пар основ в геномі рослини роду Brassica. Застосування праймера О20 або Y13 для виявлення рослини роду Brassica, стійкої до кили. У кращому варіанті здійснення винаходу рослина роду Brassica являє собою В. oleracea. Набір для виявлення моногенної та домінантної ознаки стійкості до кили у рослини В. oleracea, 12 який містить олігонуклеотид, представлений у SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:2. У даному винаході запропонований також: Спосіб переносу моногенної та домінантної ознаки стійкості до кили у рослину В. oleracea, що має чутливість або недостатній рівень стійкості до захворювання, який полягає в тому, що а) одержують рослину В. oleracea, яка несе моногенну та домінантну ознаку стійкості до кили; б) схрещують рослину В. oleracea, отриману на стадії а), з рослиною В. oleracea, яка має чутливість або недостатній рівень стійкості до кили; в) відбирають рослину, що несе ДНК-фрагмент, який можна одержувати за допомогою ПЛР-ампліфікації та який косегрегується з ознакою стійкості. Переважно ДНК-фрагмент можна одержувати за допомогою ПЛР-ампліфікації з використанням праймера О20 (SEQ ID NO:1) або праймера Y13 (SEQ ID NO:2). Краща рослина, отримана на стадії в), має стійкість до кили. У кращому варіанті здійснення винаходу спосіб додатково передбачає зворотне схрещування стійкої рослини з рослиною В. oleracea, яка має чутливість або недостатній рівень стійкості до кили. У даному винаході запропонований також: Спосіб виявлення рослини В. oleracea, стійкої до кили, який полягає в тому, що а) одержують зразок з рослини В. oleracea; б) виявляють у зазначеному зразку ДНК-фрагмент, який можна одержувати за допомогою ПЛР-ампліфікації з використанням праймера О20 (SEQ ID NO:1) або праймера Y13 (SEQ ID NO:2), де розглянута на стадії б) рослина В. oleracea має стійкість до кили. У даному винаході запропонований також: Спосіб відбору стійкої до кили рослини В. oleracea з популяції рослин В. oleracea, який полягає в тому, що: а) одержують популяцію рослин В. oleracea; б) одержують зразок з рослини, яка входить у цю популяцію; в) виявляють у цьому зразку ДНК-фрагмент, який можна одержувати за допомогою ПЛР-амшііфікації з використанням праймера 020 (SEQ ID NO:1) або праймера Y13 (SEQ ID NO:2), де розглянута на б) стадії рослина В. oleracea має стійкість до кили. Визначення Ознака: характеристика або фенотип, наприклад, стійкість до захворювання. Ознака може успадковуватися як домінантна або рецессивна або може бути моногенною або полігенною. Наприклад, ознака може являти собою стійкість до захворювання, такого як кила. Стійкість: характеристика або фенотип рослини, при яких відсутні симптоми захворювання або присутні незначні симптоми захворювання. Таким чином, стійкість переважно являє собою здатність рослини знижувати розвиток патогена [див., наприклад, Robinson R.A., Review Applied Mycology, 48, 1969, cтop.593-606]. Моногенний: визначається одним локусом. Полігенний: визначається більше, ніж одним локусом. Домінантний: визначає фенотип, коли є присутнім у гетерозиготному чи гомозиготному стані. Рецесивний: виявляється тільки тоді, коли є присутнім у гомозиготному стані. 13 84548 Локус: область хромосоми, яка несе один або кілька генетичних факторів, наприклад, один або кілька генів, що визначають ознаку, таку, як стійкість до захворювань. Генетичне зчеплення: тенденція хромосомних областей успадковуватися спільно в результаті їх локалізації на одній і тій самій хромосомі. Оцінюється за відсотком рекомбінацій між локусами (сантиморганіда, сМ). Ізогенні: рослини, які є генетично ідентичними за винятком того, що вони можуть відрізнятися присутністю або відсутністю гетерологічної послідовності ДНК. Здійснюваний за допомогою маркера відбір: відноситься до процесу відбору необхідної ознаки або необхідних ознак у рослині або рослинах шляхом виявлення однієї або декількох нуклеїнових кислот з рослини, де нуклеїнова кислота зв'язана з необхідною ознакою. Дигаплоїдний: дублікація гаплоїдного (одна хромосома) статусу генома (наприклад, з використанням культури або пиляка або культури мікроспор) з утворенням цілком гомозиготної рослини. Рослина-"тестер": рослина, яку застосовують для генетичного вивчення ознаки у рослині, яку піддають тестуванню. Як правило, рослину, яку піддають тестуванню, схрещують з рослиною"тестером" та оцінюють співвідношення розщеплення ознаки в потомстві, отриманому в результаті схрещування. У даному винаході описані рослини В. oleracea, стійкі до захворювання килою, більш конкретно до захворювання килою, збудником якого є патоген Plasmodiophora brassicae. Зокрема, у даному винаході описані рослини В. oleracea, які несуть моногенну домінантну ознаку стійкості до захворювання. Генетичний фактор стійкості забезпечує підвищений рівень стійкості до захворювання в порівнянні з відомими рівнями стійкості рослин В. oleracea, та його легко переносити з однієї рослини В. oleracea в іншу. Види та підвиди роду Brassica описані, наприклад, у Р.Н. Williams [Screening Crucifers for multiple disease resistance, Workshop 1981, Un. Wisconsin-Madison], a їх генетичний аналіз додатково проведений та описаний у [Song KM та ін., TAG 75, 1988, cтop.784-794; TAG 76, 1988, стор.593-600 та TAG 79, 1990, стор.497-506 (серія з трьох статей)]. У кращому варіанті здійснення винаходу рослини В. oleracea, що застосовують відповідно до даного винаходу, являють собою, наприклад: Brassica oleracea L. (капустяні культури) - сорт acephala DC. (капуста кормова, капуста листова, браунколь) - сорт albiflora Sun [В. alboglabra] (капуста китайська) - сорт alboglabra [B. alboglabra] (капуста китайська) - сорт botrytis L. (капуста цвітна) - сорт capitata L. (капуста городня качанна) - сорт chinensis Prain (сорт "Рrаіn" капусти китайської) - сорт fimbriata Mill, (капуста городня) - сорт fruticosa Metz. (капуста кормова тисяча 14 голова) - сорт gemmifera DC. (брюссельська капуста) - сорт gongylodes L. (кольрабі) - сорт italica Plenck. (броколі, спаржева капуста) - сорт sabauda L. (савойська капуста) - сорт sabellica (капуста кормова) - сорт tronchuda L.H. Bailey (капуста тронхуда, описаний L.H. Bailey) - сорт costata (португальська капуста) - сорт medullosa (капуста коров'яча) - сорт pamifolia (капуста джерсейна) - сорт ramosa (капуста тисячаголова) - сорт selensia (капуста кормова) Кращими рослинами В. oleracea згідно з даним винаходом є білокачанна капуста, цвітна капуста, брюссельська капуста та броколі. Згідно із даним винаходом моногенну домінантну ознаку стійкості до кили переносили з китайської капусти (В. rора) у броколі (В. oleracea). Для міжвидової гібридизації використовували броколі (В. oleracea сорт italica) як материнську рослину та В. rара як батьківську рослину. Інбредні лінії броколі вибирали як материнську рослину для запобігання присутності клітинних органел різного походження в кінцевих продуктах схрещування. Застосовувана для міжвидового схрещування батьківська рослина являла собою стійкий до кили F1-гібрид китайської капусти, отриманий з Японії, що надходить у продаж під назвою "Parkin" (фірма Таkіi Seeds, Японія). Після кожного схрещування або зворотного схрещування підраховували число хромосом отриманих рослин для оцінки рівня поліплоїдії рослин та успіху з погляду одержання хромосомного набору, характерного для В. oleracea. Підрахунок хромосом здійснювали з використанням методу, описаного в Chiang та ін., [Euphytica 28, 1979, стор.41-45]. Для проточної цитометрії використовували пристрій типу Partec CA II (фірма Partech, Великобританія). F1-гібриди, які представляють собою результат схре щування, одержували методом "порятунку" ембріона. Метод "порятунку" ембріона потрібно застосовувати через те, що В. rара та В. oleracea мають різне число хромосом і тому не мають статевої сумісності. Метод "порятунку" ембріона дозволяє вирішити проблеми, пов'язані з руйнуванням ендосперму. Використовували метод "порятунку" ембріона, описаний у Harbert та ін. [Euphytica 18, 1969, стор.425-429]. Стерилізовані 10-12-денні насінні зачатки після запилення розрізали навпіл та переносили у культуральне середовище при постійному перемішуванні. Культуральне середовище являло собою середовище Уайта, доповнене 8% сахарози та 400част./млн казеїнового гідролізату. Ембріони відмивали від насінних зачатків та вирощували у рідкому середовищі. Стійкі до кили F1-рослини схрещували з рослинами броколі (тобто здійснювали зворотне схрещування). Описаний вище метод "порятунку" ембріона також був потрібний для одержання рослин після першого зворотного схрещування (тобто ВС1-рослин). Знову здійснювали зворотне схрещування 15 84548 стійких до кили ВС1-рослин з рослинами броколі, при цьому за допомогою звичайного набору насіння було одержано три ВС2-рослини, що мали стійкість до кили. Ці рослини знову піддавали зворотному схрещуванню з рослинами броколі та рослини, отримані після четвертого зворотного схрещування (тобто ВС4-рослини), застосовували як джерело ознаки стійкості для інших культурних сортів В. oleracea. Докладний експериментальний протокол, що дозволяє переносити ознаку стійкості у В. oleracea, описаний у прикладі 1. Оцінка ураження захворюванням, яку застосовували для виявлення наявності стійкості, описана в прикладі 2. Результати польових дослідів, що демонструють стійкість до кили, представлені в прикладі 3. Репрезентативна лінія В. oleracea, яка несе моногенну домінантну ознаку стійкості до кили, запропонована в даному винаході, тобто лінія CFL667, була депонована в [NCIMB, Абердин, АВ2 1RY, Шотландія, Великобританія, під реєстраційним номером NCIMB 41134 28 червня 2002р.]. Рослини лінії CFL667 мають цитоплазматичну чоловічу стерильність та є гетерозиготними за ознакою стійкості. Таким чином, згідно з даним винаходом стійкість до кили можна одержувати з використанням лінії CFL667, депонованої в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134. У кращому варіанті здійснення даного винаходу рослину В. oleracea, стійку до кили, визначають як рослину, ураження якої відповідає балу 0 або 1 при використанні 0-5-бальної шкали, що описана в прикладі 2, або рослину, ураження якої відповідає балу 1 або 2 при використанні 1-9-бальної шкали, що описана в прикладі 2. Ознаку стійкості до кили переносили в інші сорти В. oleracea, насамперед, у білокачанну капусту, цвітн у капусту та брюссельську капусту, з використанням стандартних методів відбору, добре відомих в області селекції представників роду Brassica. Ознаку стійкості також інтрогресували в елітні лінії В. oleracea. Інтрогресію ознаки стійкості в елітну лінію здійснювали, наприклад, шляхом рекурентної селекції (повторюваний відбір), наприклад, шляхом зворотного схрещування. У цьому випадку елітну лінію (рекурентний батько) спочатку схрещували з інбредним донором (нерекурентний батько), який несе ознаку стійкості. Потомство цього схрещування потім знову схрещували з рекурентним батьком та відбирали отримане потомство за ознакою стійкості до кили. Після одержання трьох, бажано чотирьох, більш бажано п'яти або більше поколінь, отриманих в результаті зворотного схрещування з рекурентним батьком, та відбору за ознакою стійкості до кили, потомство було гетерозиготним за локусом, який обумовлює стійкість, але нагадувало рекурентного батька за більшістю або майже за всіма іншими генами [див., наприклад, Poehlman і Sleper, Breeding Field Crops, 4-е вид., 1995, стор.172-175; Fehr, Principles of Cultivar Development, том 1: Theory and Technique, стор.360-376], публікації включені в даний опис як посилання). Після кожного схрещу 16 вання здійснювали відбір за ознакою стійкості до кили. Таким чином, кращим варіантом здійснення даного винаходу є спосіб переносу домінантної та моногенної ознаки стійкості до кили в рослину В. oleracea, яка має чутливість або недостатній рівень стійкості до захворювання, що полягає в тому, що: схрещують першу рослину В. oleracea із другою рослиною В. oleracea, де перша рослина несе домінантну та моногенну ознаку стійкості до кили, відбирають отриману в результаті схрещування рослину, яка має стійкість до кили. Ураження захворюванням рослини В. oleracea, що є чутливою або має недостатній рівень стійкості до захворювання, наприклад, відповідає балу 4 або вище, переважно 3 або вище, при оцінці хвороби за 1-9-бальною шкалою, або балу 3 або вище, переважно 2 та вище, при оцінці хвороби за 0-5бальною шкалою. Спосіб передбачає також зворотне схрещування відібраної за допомогою вищевикладеного способу рослини з другою рослиною В. oleracea, доти, поки ознака стійкості не буде перенесена у др угу рослину В. oleracea. Ознаку стійкості до кили переважно переносять у лінії В. oleracea, які мають комерційне значення. Такі лінії являють собою, наприклад, інбредні лінії. В іншому варіанті лінії, що мають комерційне значення, являють собою гібриди, які одержують схрещуванням двох інбредних ліній. У цьому випадку генетичний фактор, що обумовлює стійкість до кили, може бути присутнім в одному з інбредних батьків або в обох батьках. Таким чином, кращим варіантом здійснення даного винаходу є інбредна або гібридна лінія В. oleracea, що несе моногенну домінантну ознаку стійкості до кили, включаючи насіння та матеріал зазначеної інбредної або гібридної лінії та її потомство. Переважно генетичний фактор стійкості може мати походження від В. rара, переважно з F1-гібрида китайської капусти "Parkin". B іншому кращому варіанті здійснення винаходу ознака стійкості до кили, запропонована в даному винаході, є притаманною лінії CFL667, депонованій в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134. Згідно з ще одним кращим варіантом здійснення винаходу стійка до кили рослина В. oleracea, запропонована в даному винаході, має чоловічу стерильність. Чоловіча стерильність є важливої для гібрида В. oleracea,, що дає насіння, оскільки звичайні квітки є самозапильними. Лінії з чоловічою стерильністю не продукують життєздатний пилок та не здатні до самозапилення. Шляхом елімінації пилка одногоз батьківських сортів, застосовуваних для схрещування, агрономселекціонер гарантовано повинен одержати гібридний насінний матеріал однорідної якості. Найбільш кращою системою чоловічої стерильності є цитоплазматична чоловіча стерильність (ЦЧС). Прикладом такою ЦЧС у представників роду Brassica є описана Ogura ЦЧС, яка спочатку була виявлена в рослинах редьки [див., наприклад, Ogura, Mem. Fac. Agric. Kagoshima Univ. 6, 1968, стор.39-78; Makaroff, Journal of Biol. Chem. 264, 1989, стор.11706-11713; US 5254802]. Таким чином, у даному винаході описана рослина В. oleracea, яка має чоловічу стерильність, насампе 17 84548 ред, ЦЧС, та яка несе моногенну домінантну ознаку стійкості до кили, включаючи насіння та матеріал таких рослин та їх потомство. Переважно генетичний фактор стійкості може мати походження від В. rара, переважно з F1-гібрида китайської капусти "Parkin". Переважно ЦЧС одержують з описаного в Ogura генома. Чоловічу фертильність рослин з чоловічою стерильністю можна відновлювати за допомогою добре відомих у даній області техніки методів. Чоловічу фертильність рослин із ЦЧС, зокрема, рослин В. oleracea із ЦЧС, переважно відновлюють шляхом злиття клітин. З цією метою ЦЧСрослину зливають із клітинами рослини з чоловічою фертильністю, замінюючи ядро фертильної рослини ядром стерильної рослини у фертильному цитоплазматичному оточенні, та відновлюють фертильність. Методи злиття клітин є добре відомими в даній області, наприклад, описані в [Sigareva та Еагіе, Theor. Appl. Genet. 94, 1997, стор.213-320]. За допомогою таких методів регенерують рослини, які володіють чоловічою фертильністю, та дають їм можливість самозапилюватися або схрещуватися з іншою рослиною. Ознаки, зокрема, ознаки, які мають фенотипічний прояв, такі, як стійкість до хвороби, можна потім оцінювати генетично шляхом схрещувань та визначення розщеплення ознаки в потомстві, отриманому в результаті схрещування. Цей підхід дозволяє, наприклад, визначати, чи є ознака домінантною або рецесивною. Це дозволяє також оцінювати, чи знаходяться генетичні фактори, які обумовлюють ці ознаки, у тому самому локусі (наприклад, в одному(их) і тому(ти х) же гені(ах) або в різних генах, в одному(их) і тому(тих) же алелі(ях) або в різних алелях) або в різних зчеплених або незчеплених локусах. Наприклад, коли гомозиготну за ознакою рослину схрещують з рослиною-"тестером", гомозиготним за домінантною ознакою, що має такий самий фенотип, то потомство, отримане в результаті схрещування, не повинно розщеплюватися за фенотипом ознаки (співвідношення 1:0). Це співвідношення 1:0 одержують, коли генетичні фактори, які обумовлюють ознаку, знаходяться в тому самому локусі або в різних локусах. Коли відбувається самозапилення рослин з покоління першої генерації, отриманого в результаті описаного вище схрещування, то співвідношення 1:0 є характерним для домінантних ознак, обумовлених генетичними факторами, які знаходяться в тому самому локусі у рослини, яку піддають тестуванню, та у рослини-"тестера". На противагу до цього, співвідношення 15:1 є характерним для домінантних ознак, обумовлених генетичними факторами, які знаходяться в різних незчеплених локусах у рослини, яку піддають тестуванню, та у рослини"тестера". Якщо генетичні фактори знаходяться в різних, але генетично зчеплених локусах, то співвідношення знаходиться між зазначеними співвідношеннями 1:0 та 15:1. В іншому прикладі, коли досліджувану рослину, яка є гетерозиготною за домінантною ознакою, схрещують з рослиною-"тестером", яка також є гетерозиготною за домінантною ознакою, що має 18 такий самий фенотип, то отримане в результаті схрещування потомство розщеплюється в співвідношенні 3:1 за фенотипом стійкості. Це співвідношення 3:1 є характерним для випадку, коли генетичні фактори, які обумовлюють ознаку, знаходяться в тому самому локусі або в різних локусах. Коли отримані в результаті описаного вище схрещування рослини з покоління першої генерації схрещують з рослинами "тестерної" лінії або з рослиною, яку піддають повторному тестуванню, гетерозиготною за ознакою, то співвідношення 3:1 є характерним для домінантних ознак, основою яких є генетичні фактори, розташовані в тому самому локусі, а співвідношення 23:9 є характерним для домінантних ознак, основою яких є генетичні фактори, розташовані в різних незчеплених локусах. Якщо два генетичні фактори знаходяться в дво х різних, але генетично зчеплених локусах, то співвідношення звичайно знаходиться між зазначеними двома співвідношеннями. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу покоління другої генерації окремих рослин аналізують індивідуально. У цьому випадку для генетичних факторів, розташованих у тому самому локусі, 50% рослин з покоління другої генерації знову розщеплюється в співвідношенні 3:1, 25% у співвідношенні 1:0, а 25% у співвідношенні 1:1 при схрещуванні з гетерозиготною рослиною. При наявності незчепленого генетичного фактора в досліджуваній рослині в поколінні другої генерації 50% рослин розщеплюється в співвідношенні 3:1, 25% у співвідношенні 7:1, а 25% у співвідношенні 1:1 (у поколінні другої генерації немає рослин із зафіксованою стійкістю). Якщо ознака являє собою стійкість до хвороби та досліджуване захворювання викликає загибель чутливи х рослин або перешкоджає цвітінню чутливих рослин, то в поколінні другої генерації можуть бути різні співвідношення розщеплення через загибель або відсутність потомства в чутливи х рослин з покоління першої генерації. Наприклад, у цьому випадку замість зазначених вище співвідношень 3:1 та 23:9, одержують співвідношення 5:1 та 19:5, відповідно. При оцінці ураження захворюванням окремих рослин 2/3 покоління другої генерації розщеплюється в співвідношенні 3:1, а 1/3 у співвідношенні 1:0 за генетичними факторами, що розташовані в тому самому локусі, а 2/3 розщеплюється в співвідношенні 3:1 та 1/3 у співвідношенні 7:1 за генетичними факторами, що розташовані в різних локусах. Застосовують також інші стратегії схрещування, наприклад, з використанням інших комбінацій гомозиготних або гетерозиготних рослин або рослин, які не несуть ознаки. Потім оцінюють розщеплення ознаки в потомстві. Ці стратегії схрещування та відповідні їм співвідношення розщеплення добре відомі фахівцю в даній області, для якого очевидні також шляхи одержання та застосування відповідних рослин"тестерів" та інтерпретація отриманих у результаті таких схрещувань співвідношень розщеплення. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу проілюстровані вище схеми схрещування застосовують для створення стійкості до захворювання килою в контексті даного опису. Таким чином, іншим 19 84548 кращим варіантом здійснення даного винаходу є рослина В. oleracea, гомозиготна або гетерозиготна за ознакою стійкості до кили, причому, коли ознака стійкості до кили є гомозиготною у досліджуваній рослині та цю рослину схрещують з рослиною-"тестером", гомозиготною за ознакою стійкості до кили, то в отриманому в результаті цього схрещування поколінні рослин першої генерації розщеплення ознаки стійкості до кили відбувається в співвідношенні 1:0. Застосовувана для такого схрещування рослина-"тестер" являє собою, наприклад, рослину, яка отримана з лінії CFL667, депонованої в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134, та яка несе ознаку стійкості, запропоновану в даному винаході. У кращому варіанті здійснення винаходу рослину-"тестер" одержують з рослини лінії CFL667 або з потомства рослини лінії CFL667 шляхом злиття клітин. Інші рослини з чоловічою фертильністю, які несуть ознаку стійкості, запропоновану в даному винаході, можна використовувати також як рослину-"тестер". У кращому варіанті здійснення винаходу, коли рослинам з покоління першої генерації дають самозапилюватися, то отримане покоління другої генерації розщеплюється в співвідношенні 1:0 за ознакою стійкості. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу, коли рослинам з покоління першої генерації дають самозапилюватися, то отримане покоління другої генерації розщеплюється в співвідношенні 15:1 за ознакою стійкості. Ще в одному кращому варіанті здійснення винаходу покоління другої генерації, отримане в результаті самозапилення, розщеплюється в співвідношенні від 1:0 до 15:1. Таким чином, на основі співвідношення розщеплення можна або визначати локалізовані генетичні фактори стійкості досліджуваної рослини та рослин-"тестерів" у тому самому локусі або в різних зчеплених або незчеплених локусах. Іншим кращим варіантом здійснення даного винаходу є рослина В. oleracea, гомозиготна або гетерозиготна за ознакою стійкості до кили, причому, коли ознака стійкості до кили є гетерозиготною у досліджуваної рослини і цю досліджувану рослину схрещують з рослиною-"тестером", гетерозиготною за ознакою стійкості до кили, то отримане в результаті цього схрещування покоління першої генерації розщеплюється в співвідношенні 3:1 за ознакою стійкості до кили. Рослина-"тестер" для такого схрещування являє собою, наприклад, рослину лінії CFL667, депонованої в NCIMB під реєстраційним номером NCIMB 41134, або рослину-нащадок лінії CFL667, що несе ознаку стійкості, запропоновану в даному винаході. Як рослину"тестер" можна застосовувати також будь-яку іншу рослину, яка несе ознаку стійкості, запропоновану в даному винаході. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу, коли рослину з покоління першої генерації додатково схрещують з досліджуваними рослинами, гетерозиготними за ознакою стійкості, то очікується, що розщеплення за ознакою стійкості покоління другої генерації повинно відбуватися в співвідношенні 3:1. Проте у зв'язку з тим, що чутливі рослини, як правило, не виживають у дослідах з оцінки стійкості до захворювання килою або в таких дослідах у них не 20 відбувається цвітіння, то покоління другої генерації розщеплюється в співвідношенні 5:1. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу, коли рослини з покоління першої генерації додатково схрещують з рослинами "тестерної" лінії, то очікується, що розщеплення отриманого покоління другої генерації за ознакою стійкості повинно відбуватися в співвідношенні 23:9, але звичайно розщеплення відбувається в співвідношенні 19:5. Ще в одному кращому варіанті здійснення винаходу розщеплення покоління другої генерації відбувається в співвідношенні від 5:1 до 19:5. При індивідуальній оцінці ураження захворюванням потомства окремих рослин були виявлені зазначені вище співвідношення. Таким чином, на основі співвідношення розщеплення можна або визначати локалізовані генетичні фактори стійкості досліджуваної рослини та рослин-"тестерів" у тому самому локусі або в різних зчеплених або незчеплених локусах. Ще одним кращим варіантом здійснення даного винаходу є молекулярні маркери, зчеплені з генетичним фактором, що обумовлює моногенну домінантну ознаку стійкості до кили. Такі молекулярні маркери дозволяють диференціювати на молекулярному рівні стійкі та чутливі рослини і в такий спосіб виявляють моногенну та домінантну ознаку стійкості в рослинах роду Brassica, переважно в рослинах В. oleracea. Основою для створення молекулярних маркерів є генетичний поліморфізм між стійкими та чутливими рослинами, при цьому вони локалізовані в локусі, який зумовлює стійкість, або в безпосередній близькості від нього. Молекулярні маркери застосовують, наприклад, для відбору та одержання стійких рослин, для виявлення наявності ознаки стійкості при відборі або для контролю присутності ознаки стійкості в партії насіння, що надходить у продаж. Таким чином, кращим варіантом здійснення даного винаходу є способи картування генетичного фактора стійкості до кили в рослинах роду Brassica, переважно в рослинах В. oleracea, способи виявлення присутності ознаки стійкості в рослині роду Brassica, переважно рослині В. oleracea, та способи переносу ознаки стійкості у рослину роду Brassica, що має чутливість або недостатній рівень стійкості, переважно рослину В. oleracea. Наприклад, зазначені способи застосовують для відбору нових стійких рослин або ліній або для контролю якості партії насіння. Представлені в описі молекулярні маркери дозволяють прискорювати впровадження стійких ліній на ринок та поліпшува ти якість контролю партій насіння, що надходять у продаж. Внаслідок цього можна не здійснювати оцінку ураження захворюванням та заміняти її застосуванням молекулярного маркера. Молекулярні маркери та способи, запропоновані в даному винаході, є особливо корисними на різних стадіях одержання комерційного сорту, таких як програми відбору та процес одержання насіння. Наприклад, даний винахід застосовують для інтрогресії ознаки стійкості в рослину В. oleracea, наприклад, в елітну інбредну лінію. Відбір за ознакою стійкості до кили здійснюють шляхом оцінки насіння або рослин, отриманих після кожного 21 84548 схрещування з молекулярними маркерами. Таким чином, кращим варіантом здійснення даного винаходу є способи переносу домінантної та моногенної ознаки стійкості до кили в рослину В. oleracea, яка має чутливість або недостатній рівень стійкості до захворювання, що полягають у тому, що: схрещують першу рослину, стійку до захворювання, із другою рослиною, яка має чутливість або недостатній рівень стійкості, збирають насіння, отримане в результаті схрещування, одержують зразок насінного матеріалу або вирощеної з нього рослини, визначають у цьому зразку наявність молекулярного маркера, запропонованого в даному винаході, присутність зазначеного молекулярного маркера свідчить про стійкість до захворювання в цьому насінному матеріалі або рослині, відбирають рослину, позитивну у відношенні присутності зазначеного маркера, причому, ця рослина переважно має стійкість до захворювання. Переважно потім здійснюють зворотне схрещування стійкої рослини з рослиною, яка має чутливість або недостатній рівень стійкості. Молекулярні маркери, запропоновані в даному винаході, зручно застосовувати також для одержання стабільних гомогенних інбредних ліній або культиварів (які також іноді називають сортами), при цьому конкретна лінія самозапилюється до досягнення задовільної чистоти та гомогенності лінії. Даний винахід можна застосовувати також для промислового виробництва насіння конкретної лінії або культивара. І в цьому випадку після кожного схрещування запропонований у винаході спосіб застосовують для оцінки насіння, отриманого в результаті схрещування, і відбирають тільки стійкі рослини. Таким чином, кращим варіантом здійснення даного винаходу є способи одержання стійкого до кили насіння або стійких до кили рослин, які полягають у тому, що: схре щують стійку рослину із собою, збирають насіння, що утворилося в результаті схрещування, одержують зразок насінного матеріалу або вирощеної з нього рослини, визначають у цьому зразку наявність молекулярного маркера, запропонованого в даному винаході, присутність зазначеного молекулярного маркера свідчить про стійкість до захворювання в цьому насінному матеріалі або рослині. Даний винахід застосовують також для одержання гібридного насінного матеріалу. У цьому випадку даний винахід застосовують для гарантії того, що усе гібридне насіння, яке проросло та виросло в польових умовах, має стійкість до захворювання. Переважно молекулярні маркери, запропоновані в даному винаході, застосовують також для гарантії якості та для гарантії того, що стійкість до захворювання присутня в гібридному насінні. Таким чином, кращим варіантом здійснення даного винаходу є способи одержання насіння, які полягають у тому, що: схрещують першу рослину та др угу рослину, де одна з рослин має стійкість до кили, збирають насіння, що утворилося в результаті схрещування, одержують зразок насінного матеріалу або вирощеної з нього рослини, визначають у цьому зразку наявність молекулярного маркера, запропонованого в даному винаході, присутність зазначеного молекулярного маркера 22 свідчить про наявність ознаки стійкості до захворювання в цьому насінному матеріалі або рослині. Таким чином, даний винахід дозволяє істотно удосконалювати промислові процеси селекції та одержання насіння. У кращому варіанті здійснення винаходу молекулярний маркер, запропонований у даному винаході, розташований на відстані 10 сантиморганід (сМ) від локусу, який обумовлює стійкість до кили, бажано 6сМ, більш бажано 5сМ, ще більш бажано 3сМ, найбільш бажано на відстані 1,5сМ від локусу, що обумовлює стійкість до кили, і в результаті цього має високу здатність до косегрегації з ознакою стійкості. У контексті даного опису кращі поліморфізми включають, наприклад, повтори однієї послідовності [SSR, див, наприклад, Неаrnе та ін., Trends Genet 8, 1992, стор.288-294], поліморфізми одного нуклеотиду [SNP, Botstein B та ін., Am J Hum Genet 32, 1980, стор.314-331] та будь-які інші типи перегруп увань ДНК, такі як делеції, ампліфікації, кросовери. У контексті даного опису для одержання молекулярних маркерів, зчеплених з генетичним фактором, який обумовлює стійкість, можна застосовувати методи виявлення поліморфізмів, що добре відомі в даній області. Кращими є методи, які базуються на ПЛР-ампліфікації, наприклад, на SSR-технології та R APD-те хнології [Williams та ін., Nucl Acids Res 18, 1990, стор.6531-6535]. У цілому, кращі олігонуклеотиди, які застосовуються для ПЛР, складаються з 8-50 нуклеотидів, більш бажано з 10-30 нуклеотидів. Отримані за допомогою ПЛР-ампліфікації ДНК-фрагменти, що містять сайт, який включає поліморфізм, запропонований у даному винаході, бажано складаються приблизно з 100-3000, більш бажано приблизно з 2002000, ще більш бажано приблизно з 300-1000 нуклеотидів. Інші методи скринінга або виявлення поліморфізмів, які можна застосовувати відповідно до даного винаходу, включають пряме секвенування нуклеїнових кислот, аналіз одноланцюгових поліморфізмів, лігазну ланцюгову реакцію, ферментативне розщеплення та Саузерн-гібридизацію. Альтернативні методи являють собою кілька методів, призначених для виявлення розщеплених ампліфікованих поліморфних послідовностей [Cleaved Amplified Polymorphic Sequences; CAPSметоди; Konieczny та ін., The Plant Journal 4(2), 1993, стор.403-410] та для виявлення поліморфізмів одного нуклеотиду (SMP) за допомогою методу, призначеного для виявлення розщеплених амплифікованих модифікованих поліморфних послідовностей (Cleaved Amplified Modified Polymorphic Sequences, позначений як CAMPSметод), також відомого як dCAPS-метод [Neff та ін., Plant J. 14, 1998, стор.387-392; Michaels та Amasino, Plant J. 14, 1998, стор.381-385]. Відповідно до CAPS-методу н уклеїнову кислоту, що містить поліморфний сайт рестрикції, ампліфікують з використанням праймерів, які фланкують сайт рестрикції. ПЛР-продукт, який утворився, розщеплюють рестриктазою, що відповідає поліморфному сайту рестрикції, і розщеплені продукти аналізують за допомогою гель-електрофорезу. 23 84548 Саузерн-гібридизація також являє собою ефективний метод виявлення відмінностей у послідовностях, зокрема, на основі поліморфізмів довжин рестрикційних фрагментів (RFLP; restriction fragment length polymorphisms) [Botstein В та ін., Am J Hum Genet 32, 1980, стор.314-331]. Кращим варіантом здійснення даного винаходу є молекулярні маркери, міцно зчеплені з генетичним фактором, що обумовлює стійкість до кили, які одержують за допомогою RAPD-методу (див. приклад 4 даного опису). Нижче винахід проілюстрований на прикладах, що не обмежують його об'єм. Усі процитовані в даному описі публікації цілком включені в нього як посилання. Приклади Приклад 1: Перенос ознаки стійкості в В. Oleracea E1 Здійснювали кілька сотень схрещувань стійкого до кили F1-гібрида сорту "Parkin" китайської капусти з броколі (В. oleracea). "Рятували" ембріони, отримані в результаті цих схре щувань [Harbert та ін., Euphytica 18, 1969, стор.425-429]. З чотирьох ембріонів розвивалися рослини, дві з який виявилися стійкими до захворювання. Геном цих двох стійких рослин включав 19 хромосом. За фенотипом рослини виявилися гібридом китайської капуста та броколі. BP1 Для одержання ВС1-рослин також здійснювали "порятунок" ембріонів. Інбредну лінію броколі використовували як батька при зворотному схрещуванні. Для одержання наступних генерацій як батька при зворотному схре щуванні також використовували лінії броколі. Тільки одна із зазначених вище двох рослин покоління F1 виявилася респондером та з 5 ембріонів розвивалися рослини. Чотири з них виявилися стійкими до кили. За фенотипом ВС1-рослини виявилися ближче до рослин броколі, які застосовували як батька при зворотному схрещуванні. Оскільки розподіл хромосом генома В. rара у ВС1-рослинах є довільним, то рослини містили 18 хромосом В. oleracea та 0-10 хромосом В. rара. В результаті були отримані рослини з 18-28 хромосомами. ВС2 ВС2-рослини одержували шляхом закладання насіння ВС1-рослин. Встановлено, що дев'ять рослин, які були отримані в результаті закладання насіння однієї рослини, позначеної як рослина В, із зазначених вище ВС1-рослин, мали стійкість до кили. У них визначали кількість хромосом та за допомогою проточного цитометра оцінювали відхилення вмісту ДНК від основного рівня. У подальшій програмі досліджень використовували три рослини, а саме В23, В27 та В28. ВС3 та ВС4 ВС3- та ВС4-рослини також одержували шляхом закладання насіння. У рослину В27, що вже в ВС2-поколінні була диплоюїдною, виявився включеним домінантний ген, який обумовлює стійкість до кили. В отриманих шля хом зворотного схрещування поколіннях ВС3 та ВС4 виявлене очікуване 24 розщеплення 1:1. Як було встановлено при аналізі наступних поколінь, ген, що обумовлює стійкість, був також інтрогресований у рослини В23 та В28. Польовий дослід Попередній польовий дослід здійснювали з використанням стійких рослин, відібраних після оцінки проростків, які були отримані від однієї з ВС3-рослин, позначеної як В27. Рослини висаджували в поле з високим рівнем зараження на дослідній базі фірми-заявника в Клюванні, Німеччина. Усі рослини виявилися здоровими та в них не виявлено ніяких симптомів при викопуванні після дозрівання. Перенос ознаки стійкості в інших представників В. oleraceas Стійку рослину В27 використовували як джерело ознаки стійкості до кили для здійсненню програми по зворотному схрещуванню з броколі, цвітною капустою, капустою городньою та брюссельською капустою, одержуючи стійкі сорти, що представлені, зокрема, у прикладі 3. Приклад 2: Оцінка симптомів захворювання Проростки пересаджували через один тиждень після посіву в блок паперових або пластмасових горщиків, що містять суміш піску та торф'яного ґрунту в співвідношенні 2:1, значення рН