Антитіло до cd40

Реферат: Винахід належить до гуманізованого антагоністичного антитіла до CD40 та терапевтичного і діагностичного способів і композицій, призначених для їх застосування для індукції функції людського CD40. UA 107827 C2 (12) UA 107827 C2 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід належить в цілому до гуманізованих антитіл до CD40, призначеним для діагностичного і терапевтичного застосування. Більш конкретно, у винаході запропоновані гуманізовані антитіла до CD40 і способи їх застосування для лікування різних захворювань або порушень, які відрізняються наявністю клітин, що експресують CD40. Описані також фармацевтичні композиції і набори, які містять гуманізоване антитіло до CD40. Передумови створення винаходу CD40 являє собою має молекулярну масу 48 кДа інтегральний мембранний глікопротеїн типу I і він є представником суперсімейства рецепторів фактора некрозу пухлин (TNF). CD40 експресується на широкому розмаїтті клітинних типів, включаючи здорові і неопластичні Bклітини, інтердігітатні (переплетені) клітини, клітини карциноми, епітеліальні клітини (наприклад, кератиноцити), фібробласти (наприклад, синовіоцити) і тромбоцити. Він присутній також на моноцитах, макрофагах, деяких типах ендотеліальних клітин і фолікулярних дендритних клітинах. Для CD40 характерна експресія на ранній стадії онтогенезу В-клітин, він з'являється на попередниках B-клітин після появи CD10 і CD19, але перед експресією CD21, CD23, CD24 і появою поверхневого імуноглобуліну M (sIgM) (Uckun та ін, Blood 15, 1990, з. 2449). CD40 виявлений також на мигдалинах і продукуються кістковим мозком плазматичних клітинах (PellatDecounynck та ін, Blood 84, 1994, с. 2597). Лігандом CD40 є CD40L (який позначають також як CD154, gp39 і TRAP), представник суперсімейства TNF. CD40L являє собою трансмембранний білок, який експресується головним чином на активованих CD4 +-T-клітинах і невеликій підпопуляціі CD8 +-T-клітин (див. огляд Van Kooten C. і Banchereau, 2000). Взаємодія CD40 з CD40L індукує як гуморальні, так і клітинно-опосередковані відповіді. CD40 регулює здійснювану цією парою ліганд-рецептор активацію B-клітин та інших антігенпрезентуючих клітин (АПК), включаючи дендритні клітини (ДК) (див., огляд (Toubi і Shoenfeld, 2004); (Kiener та ін, 1995). Були проведені великі дослідження функції CD40 на Bклітинах. Активація CD40 на B-клітинах індукує проліферацію, диференціювання в антитіла які секретують клітини і перемикання ізотипу в гермінативних (зародкових) центрах вторинних лімфоїдних органів. Досліди in vitro продемонстрували безпосередні впливи активації CD40 на виробництво цитокінів (IL-6, IL-10, TNF-α, LT-α), експресію молекул адгезії і костімулюючих рецепторів (ICAM, CD23, CD80 та CD86) і підвищену експресію молекул ГКГ класу I, ГКГ класу II і TAP-транспортера B-лімфоцитами (Liu та ін, 1996). У більшості зазначених процесів CD40 діє або спільно з іншими цитокінами, або в поєднанні з іншими взаємодіями рецептор-ліганд. Передача сигналів CD40 на моноцитах і ДК призводить до підвищеної виживаності, а також до секреції цитокінів (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α і MIP-1α). Зшивання CD40 з цими АПК призводить також до підвищувальної регуляції костимулюючих молекул (таких як ICAM-1, LFA-3, CD80 та CD86). Активація CD40-рецепторів є одним з що мають вирішальне значення сигналів, які призводять до повного дозрівання ДК в ефективні АПК, що забезпечують T-клітинну активацію (Banchereau і Steinman, 1998) (Van Kooten C. і Banchereau, 2000). У сучасних дослідженнях на мишачих моделях встановлено, що передача сигналів CD40 на дендритних клітинах відіграє також важливу роль у створенні TH17-клітин, які вважаються медіаторами аутоімунітету при таких хворобах як артрит і розсіяний склероз (Iezzi та ін, 2009) (Perona-Wright і ін, 2009). Наявність мишей з "вимкненими" CD40 і CD40L, а також агоністичний і антагоністичних антімишіних антитіл створює можливість вивчати роль взаємодій CD40-CD40L на декількох моделях захворювань. Продемонстровано сприятливу дію застосування блокуючого антитіла до CD40L при дослідженні на декількох моделях аутоімунітету, включаючи спонтанні захворювання типу вовчакового нефриту у SNF1-мишей або діабету у NOD-мишей, або на експериментально індукованих формах хвороб типу індукованого колагеном артриту (CIA) або експериментального аутоімунного енцефаломієліту (EAE) (Toubi і Shoenfeld, 2004). Було виявлено інгібування CIA у мишей, обумовлене МАт до CD40L, яке блокувало розвиток запалення суглобів, титри сироваткових антитіл до колагену, інфільтрацію запальних клітин в субсіновіальну тканину, а також ерозію хряща і кістки (Durie та ін, 1993). Було продемонстровано, що як при вовчаковому нефриті, так і при EAE, антитіло до CD40L мало також здатність купірувати початок хвороби, що підтверджує роль CD40-CD40L на ефекторній фазі хвороби (Kalled та ін, 1998); (Howard та ін, 1999). Роль взаємодій CD40-CD40L вивчена також у відношенні EAE на мишах з дефіцитом CD40L, які несли трансгенний T-клітинний рецептор, специфічний щодо основного білка мієліну. У цих мишей не розвивався EAE після прімірування антигеном, і CD4 +-T-клітини залишалися в спокої і не продукували INF-γ (Grewal та ін, 1996). 1 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, для тих, що мають інгібуючу дію антитіл до CD40 продемонстровано їх сприятливу дію на моделях запальних захворювань, таких як EAE. Lamann з колегами продемонстрували, що антагоністичне мишаче МАт до людського CD40 mu5D12 і химерна версія цього МАт ефективно попереджали клінічний прояв хронічного демієлінізуючого EAE у аутбредних мавп мармозеток (ігрунки) (Laman та ін, 2002); (Boon та ін, 2001). Подальше дослідження продемонструвало, що терапевтичне лікування з використанням химерного антитіла до людського CD40 знижувало запалення що виявляється за допомогою ЯМРтомографії і уповільнювало збільшення раніше існуючих пошкоджень головного мозку на створеній на мармозетках моделі EAE (Hart та ін, 2005). Антитіла до CD40, що мають агоністичну активність, вивчали на мишачих моделях артриту, при цьому були отримані в певній мірі суперечливі результати. Як і слід було очікувати для імуностимулюючого агента, на створеній на мишах DBA / 1 моделі CIA було встановлено, що агоністичне антимишаче МАт до CD40 FGK45 загострювало захворювання (Tellander та ін, 2000). Однак при використанні іншої моделі хронічного CIA було встановлено, що FGK45 й інше агоністичне антимишаче МАт CD40, 3/23, обидва надавали позитивні терапевтичні впливи (Mauri та ін, 2000). Дана група дослідників висловила припущення про те, що агоністичні антитіла при їх застосуванні згідно із зазначеною терапевтичною схемою лікування надавали сприятливий вплив в результаті індукції зсуву імунної відповіді в бік Th2-відповіді, що супроводжувалося зниженими рівнями IFN-γ та підвищеними рівнями IL-4 і IL-10 (Mauri та ін, 2000). Опубліковані також дані про попередження відторгнення трансплантата шляхом блокування взаємодій CD40/CD154. У дослідах по алотрансплантації нирок макакам-резус було продемонстровано, що при застосуванні ch5D12, що представляє собою химерне антагоністичне антитіло до CD40, антагонізм відносно CD40 виявився достатнім для модифікації захворювання, і застосування антитіла забезпечувало подовження середнього часу життя, що становить більше 100 днів. Коли ch5D12 об'єднували з антитілом до CD86 і застосовували тільки на початку дослідів по аллотранслантаціі, після чого здійснювали тривале лікування циклоспорином, то досягали середнього часу життя, що перевищує 4 роки, це свідчить про те, що зазначена комбінація потенційно може індукувати переносимість (Haanstra та ін, 2005). Таким чином, відомо достатню кількість доклінічних досліджень, що свідчать про вирішальну роль діади CD40-CD40L в забезпеченні ефективного залежної від T-клітин імунної відповіді. Отже, блокування передачі сигналів CD40 розглядається як прийнятна і потрібна терапевтична стратегія придушення патогенної аутоімунної відповіді при таких хворобах як RA (ревматоїдний артрит), розсіяний склероз або псоріаз. Однак до теперішнього часу відсутні антитіла до CD40, дозволені для терапевтичного втручання при зазначених порушеннях через відомостей про те, що раніше розроблені антитіла до CD40 мають виражені побічні дії. Таким чином, зберігається виражена потреба в терапевтичних засобах, які можна застосовувати для втручання в дію CD40-CD40L і блокування передачі сигналів CD40. Цю задачу можна вирішувати за допомогою нових гуманізованих антитіл до CD40, які специфічно зв'язуються з CD40 і мають специфічність зв'язування антигену, аффінність і фармакокінетичні та фармакодинамічні властивості, що дозволяють застосовувати їх для терапевтичного втручання при пов'язаних з CD40 порушеннях. Короткий виклад суті винаходу У даному винаході запропоновано гуманізоване моноклональне антитіло, що специфічно зв'язується з людським CD40 і антагоністична активність якого характеризується значенням IC50, складовим менш 1нм, і яке при його застосуванні в концентрації аж до 100 мкг / мл не має агоністичну дію у відношенні B-клітинної проліферації, і при цьому зазначене антитіло відрізняється також тим, що час його напівжиття in vivo в організмі приматів крім людини становить щонайменше 10 днів. Гуманізоване моноклональне антитіло може відрізнятися також тим, що антитіло має час напівжиття в організмі мавп ціномолгус (яванський макак-крабоїд), що становить більше 8 днів при його застосуванні в дозі нижче, ніж 30 мг / кг. У наведених як приклад варіантах здійснення винаходу антитіло, пропоноване у винаході, містить послідовність важкого ланцюга, вибрану з групи, що включає будь-яку з SEQ ID NO: 1SEQ ID NO: 4, та послідовність легкого ланцюга, вибрану з групи, що включає будь-яку з SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 8. В інших варіантах здійснення винаходу антитіло являє собою гуманізоване антитіло або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке має амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену в будь-якій з SEQ ID NO: 1-4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID 2 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 або SEQ ID NO: 73. В інших варіантах здійснення винаходу антитіло являє собою гуманізоване антитіло або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке містить амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену в будь-якій з SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 або SEQ ID NO: 76. У конкретних варіантах здійснення винаходу моноклональне антитіло, представлене в цьому описі, відрізняється тим, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де послідовність CDR1 важкого ланцюга вибрана з групи, що включає SEQ ID NO: 9-SEQ ID NO: 11, послідовність CDR2 важкого ланцюга вибрана з групи, що включає SEQ ID NO: 12-SEQ ID NO: 15, та послідовність CDR3 важкого ланцюга вибрана з групи, що включає SEQ ID NO: 16-SEQ ID NO: 17; та послідовність CDR1 легкого ланцюга вибрана з групи, що включає SEQ ID NO: 18SEQ ID NO: 21, послідовність CDR2 легкого ланцюга вибрана з SEQ ID NO: 22-SEQ ID NO: 23 і послідовність CDR3 легкого ланцюга вибрана з групи, що включає SEQ ID NO: 24-SEQ ID NO: 25. У конкретних варіантах здійснення винаходу моноклональне антитіло, представлене в цьому описі, відрізняється тим, що воно містить послідовність CDR1 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 10, послідовність CDR2 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 13, та послідовність CDR3 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 16; та антитіло містить послідовність CDR1 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 19, послідовність CDR2 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 22, та послідовність CDR3 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 24. В інших варіантах здійснення винаходу моноклональне антитіло, представлене в цьому описі, відрізняється тим, що воно містить послідовність CDR1 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 9, послідовність CDR2 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 14, та послідовність CDR3 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 16; та антитіло містить послідовність CDR1 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 20, послідовність CDR2 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 22, та послідовність CDR3 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 24. В інших варіантах здійснення винаходу моноклональне антитіло, представлене в цьому описі, відрізняється тим, що воно містить послідовність CDR1 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 9, послідовність CDR2 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 14, та послідовність CDR3 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 16; та антитіло містить послідовність CDR1 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 20, послідовність CDR2 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 22, та послідовність CDR3 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 24. В інших варіантах здійснення винаходу моноклональне антитіло, представлене в цьому описі, відрізняється тим, що воно містить послідовність CDR1 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 11, послідовність CDR2 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 15, та послідовність CDR3 важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 17; та антитіло містить послідовність CDR1 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 21, послідовність CDR2 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 23, та послідовність CDR3 легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 25. У цьому описі представлені також індивідуальні послідовності важких ланцюгів бажаних антитіл, запропонованих у винаході. Винахід, наприклад, належить до антитіл до CD40, яке містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка представлена в будь-якій з SEQ ID NO: 1-4. Антитіло до CD40 відрізняється також тим, що містить послідовність варіабельної області легкого ланцюга, яка представлена в будь-якій з SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 8. Під обсяг винаходу підпадає гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельний область важкого ланцюга і варіабельний область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 27 і SEQ ID NO: 26 відповідно; SEQ ID NO: 28 і SEQ ID NO: 26 відповідно; SEQ ID NO: 29 і SEQ ID NO: 26 відповідно; SEQ ID NO: 30 і SEQ ID NO: 26 відповідно; SEQ ID NO: 32 і SEQ ID NO: 31 відповідно; SEQ ID NO: 33 і SEQ ID NO: 31 відповідно; SEQ ID NO: 34 і SEQ ID NO: 31 відповідно; SEQ ID NO: 35 і SEQ ID NO: 31 3 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідно; SEQ ID NO: 37 і SEQ ID NO: 36 відповідно; SEQ ID NO: 38 і SEQ ID NO: 36 відповідно; SEQ ID NO: 39 і SEQ ID NO: 36 відповідно; SEQ ID NO: 40 і SEQ ID NO: 36 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 27 і SEQ ID NO: 26 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 28 і SEQ ID NO: 26 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 29 і SEQ ID NO: 26 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 30 і SEQ ID NO: 26 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 32 і SEQ ID NO: 31 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 33 і SEQ ID NO: 31 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 34 і SEQ ID NO: 31 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 35 і SEQ ID NO: 31 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 37 і SEQ ID NO: 36 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 38 і SEQ ID NO: 36 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 39 і SEQ ID NO: 36 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що містять амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 40 і SEQ ID NO: 36 відповідно. Іншим варіантом здійснення винаходу є виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, яке / який специфічно зв'язується з людським CD40, що містить / містить гуманізовану варіабельну область важкого ланцюга, яка містить каркасну ділянку, амінокислотна послідовність якого щонайменше на 90 % ідентична амінокислотній послідовності каркасної ділянки людської варіабельної області важкого ланцюга, амінокислотна послідовність якої представлена в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 або SEQ ID NO: 30, та містить / містить амінокислотну послідовність легкого ланцюга, яка щонайменше на 90 % ідентична відповідній послідовності варіабельної області легкого ланцюга, яка представлена в SEQ ID NO: 26. Іншим варіантом здійснення винаходу є виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, яке / який специфічно зв'язується з людським CD40, що містить / містить гуманізовану варіабельну область важкого ланцюга, яка містить каркасну ділянку, амінокислотна послідовність якого щонайменше на 90 % ідентична амінокислотній послідовності каркасної ділянки людської варіабельної області важкого ланцюга, амінокислотна послідовність якої представлена в SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 або SEQ ID NO: 35, та містить / містить амінокислотну послідовність легкого ланцюга, яка щонайменше на 90 % ідентична відповідній послідовності варіабельної області легкого ланцюга, яка представлена в SEQ ID NO: 31. Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, яке / який зазначено в представленому безпосередньо вище варіанті здійснення винаходу, амінокислотна послідовність важкого ланцюга якого представлена в SEQ ID NO: 32; а в іншому 4 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіанті здійснення винаходу, амінокислотна послідовність важкого ланцюга якого представлена в SEQ ID NO: 33; в іншому варіанті здійснення винаходу, амінокислотна послідовність важкого ланцюга якого представлена в SEQ ID NO: 34; і в іншому варіанті здійснення винаходу, амінокислотна послідовність важкого ланцюга якого представлена в SEQ ID NO: 35. Винахід належить також до виділеного антитіла або його антигензв'язуючого фрагменту, яке / який специфічно зв'язується з людським CD40, що містить гуманізовану варіабельну область важкого ланцюга, яка містить каркасну ділянку, амінокислотна послідовність якого щонайменше на 90 % ідентична амінокислотній послідовності каркасної ділянки людської варіабельної області важкого ланцюга, амінокислотна послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 або SEQ ID NO: 40, та містить амінокислотну послідовність легкого ланцюга, яка щонайменше на 90 % ідентична відповідній послідовності легкого ланцюга, яка представлена в SEQ ID NO: 36. Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, вказаний / зазначений у представленому безпосередньо вище варіанті здійснення винаходу, в якому амінокислотна послідовність важкого ланцюга представлена в SEQ ID NO: 37; в іншому варіанті здійснення винаходу, амінокислотна послідовність важкого ланцюга представлена в SEQ ID NO: 38; в іншому варіанті здійснення винаходу, амінокислотна послідовність важкого ланцюга представлена в SEQ ID NO: 39; і в іншому варіанті здійснення винаходу, амінокислотна послідовність важкого ланцюга представлена в SEQ ID NO: 40. Антитіла, пропоновані в цьому винаході, можуть відрізнятися також тим, що зазначені антитіла не можуть стимулювати виробництво цитокінів B-клітинами у відсутності CD40L. Антитіла, пропоновані в цьому винаході, можуть відрізнятися також тим, що зазначені антитіла зв'язуються з людським CD40 в присутності 50 % людської сироватки зі зниженою менш ніж в 2 рази швидкістю реакції асоціації. Антитіла, запропоновані в цьому винаході, можуть відрізнятися також тим, що зазначені антитіла мають здатність інгібувати виробництво IgM і IgG в організмі ссавців при їх застосуванні в концентрації 1 мг / кг. Антитіла, запропоновані в цьому винаході, можна застосовувати в різних терапевтичних, профілактичних, діагностичних та інших методах. Наприклад, в цьому описі представлений спосіб блокування функції людського CD40 в організмі ссавців, що полягає в тому, що вводять вказаною ссавцю композицію, яка містить антитіло, запропоноване у винаході, в кількості, достатній для блокування опосередковуваної CD40 імунної відповіді у ссавця. Винахід належить також до способу лікування або полегшення реакції "трансплантат-протигосподаря" у ссавця, що полягає в тому, що вводять зазначеному ссавцю композицію, яка містить антитіло, запропоноване у винаході, в кількості, достатній для зменшення одного або декількох симптомів реакції "трансплантат -проти-господаря »у вказаної тварини. Наприклад, аутоімунне або запальне захворювання може являти собою (але, не обмежуючись тільки ними) ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, проліферативний вовчаковий гломерулонефрит, запальне захворювання кишечника (IBD), псоріаз, ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура (ITP), хвороба Крона і системний червоний вовчак (SLE), тиреоїдит Хашимото, первинну мікседему, тиреотоксикоз / хвороба Грейвса, Перніціозна анемію, автоімунний атрофічний гастрит, аутоімунний кардит, хвороба Аддісона, передчасну менопаузу, цукровий діабет типу 1, синдром Гудпасчера, важку псевдопаралітичну міастенію, аутоімунну гемолітичну анемію, ідіопатичну лейкопенію, первинний біліарний цироз, хронічний активний гепатит (негативний по поверхневого антигену гепатиту В (HBs Aг)), криптогенний цироз, синдром Шегрена, дерматоміозит, склеродермія, змішану сполучнотканинну хвороба, дискоїдний червоний вовчак та системний васкуліт. У наведених як приклад варіантах здійснення винаходу ссавець страждає на ревматоїдний артрит. Способи, запропоновані у винаході, можуть полягати також у тому, що вводиться другий терапевтичний засіб, вибране з групи, що включає антагоніст TNF, модифікуючу захворювання протиревматоідний засіб, антагоніст CTLA4, МАт до рецептора IL-6 і МАт до CD20. У конкретних варіантах здійснення винаходу запальне захворювання або аутоімунне захворювання являє собою запальне захворювання або аутоімунне захворювання, яке асоційовано з клітинами, що експресують ядо CD40, так і CD20. У конкретних варіантах способу лікування включає введення композиції антитіла парентеральним шляхом введення. У конкретних варіантах способу лікування включає введення композиції антитіла внутрішньовенно або підшкірно. Додаткові способи, запропоновані у винаході, які передбачають інгібування виробництва 5 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіл B-клітинами в організмі хворої людини, полягають у тому, що вводять хворій людині в ефективній кількості антитіло до CD40, запропоноване у винаході. Більш переважно хвора людина страждає запальним захворюванням або аутоімунним захворюванням, яке асоційовано з експресується CD40 клітинами. У наведених як приклад варіантах здійснення винаходу хвора людина страждає аутоімунним захворюванням, вибраним з групи, що включає аутоімунне або запальне захворювання, таке як ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, проліферативний вовчаковий гломерулонефрит, запальне захворювання кишечника (IBD), псоріаз, ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура (ITP), хвороба Крона і системна червона волчанка (SLE), тиреоїдит Хашимото, первинна мікседема, тиреотоксикоз / хвороба Грейвса, перніціозна анемія, аутоімунний атрофічний гастрит, аутоімунний кардит, хвороба Аддісона, передчасна менопауза, цукровий діабет типу 1, синдром Гудпасчера, тяжка псевдопаралітична міастенія, аутоімунна гемолітична анемія, ідіопатична лейкопенія, первинний біліарний цироз, хронічний активний гепатит (негативний по Аг HBs), криптогенний цироз, синдром Шегрена, дерматоміозит, склеродерма, змішана сполучнотканинна хвороба, дискоїдний червоний вовчак та системний васкуліт. Інший спосіб, запропонований у винаході, в якому інгібують ріст клітин, що експресують людський антиген CD40, полягає в тому, що вводять антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, пропоноване / пропонований у винаході, в клітини, де антитіло або антигензв'язуючий фрагмент специфічно зв'язується з людським розташованим на клітинній поверхні антигеном CD40, при цьому зв'язування антитіла або його антигензв'язуючих фрагмента з антигеном CD40 інгібує ріст або диференціювання клітин. Винахід належить також до способу лікування індивідуума, який страждає асоційованим з CD40 порушенням, полягає в тому, що вводять індивідууму антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, пропоноване / запропонований у винаході, де антитіло або антигензв'язуючий фрагмент специфічно зв'язується з людським CD40, при цьому зв'язування антитіла або його антигензв'язуючих фрагмента з антигеном CD40 інгібує ріст або диференціювання клітин, з якими пов'язане асоційоване з CD40 порушення. Клітини можуть являти собою (але, не обмежуючись тільки ними) B-лімфобластоідні клітини, клітини підшлункової залози, клітини легені, клітини молочної залози, клітини яєчника, клітини ободової кишки, клітини передміхурової залози, клітини шкіри, клітини голови і шиї, клітини сечового міхура, клітини кісткової тканини або клітини нирки. Спосіб лікування, що передбачає інгібування росту або диференціювання клітин, можна застосовувати для лікування хронічного лімфоцитарного лейкозу, лімфоми Беркітта, множинної мієломи, T-клітинної лімфоми, неходжкінської лімфоми, хвороби Ходжкіна, макроглобулінемія Вальденстрема або саркоми Капоші. Винахід належить також до способу індукції виснаження периферичних B-клітин, що полягає в тому, що вводять в клітини антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, пропоноване / запропонований у винаході, де антитіло або антигензв'язуючий фрагмент специфічно зв'язується з людським розташованим на клітинній поверхні антигеном CD40, при цьому зв'язування антитіла або його антигензв'язуючих фрагмента з антигеном CD40 індукує клітинне виснаження. У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло або антигензв'язуючий фрагмент вводять індивідууму, який страждає імунним порушенням. Наприклад, імунне порушення являє собою ревматоїдний артрит або системну червону вовчанку. Винахід належить також до способу лікування ревматоїдного артриту у індивідуума, що полягає в тому, що вводять індивідууму антитіло, пропоноване у винаході, де антитіло являє собою антагоністичне антитіло, яке блокує функцію CD40 у індивідуума. Бажано антитіло вводять у кількості, ефективній щодо інгібування диференціювання Bклітин і перемикання ізотипу антитіла у індивідуума. В інших варіантах здійснення винаходу антитіло вводять у кількості, ефективній щодо інгібування виробництва цитокінів та хемокінів і підвищувальній регуляції адгезійних молекул у T-клітинах і макрофагах у індивідуума. Бажано антитіло вводять у кількості, ефективній щодо інгібування активації дендритних клітин у індивідуума. В інших варіантах здійснення винаходу спосіб відрізняється також тим, що антитіло вводять у кількості, ефективній щодо інгібування виробництва прозапальних цитокінів, хемокінів, матриксних металопротеїназ, простагландинів і у відношенні знижуючої регуляції адгезійних молекул у неімунних клітинах у індивідуума. У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло вводять в поєднанні зі схемою лікування, що передбачає введення метотрексату (MTX) та / або введення енбрела / хуміри. 6 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Піддають лікуванню індивідуум що являє собою індивідуума, який страждає на ревматоїдний артрит і є нечутливим до лікування тільки метотрексатом. У конкретних варіантах здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що лікують індивідуума з використанням схеми лікування, яка включає введення метотрексату і / або введення енбрела / хуміри. Спосіб, запропонований у винаході, може також відрізнятися тим, що лікування індивідуума зазначеним антагоністичним антитілом до CD40 є більш ефективним, ніж лікування тільки метотрексатом, тільки енбрелом, комбінацією енбрел + метотрексат. Спосіб, запропонований у винаході, може також відрізнятися тим, що лікування індивідуума зазначеним антагоністичним антитілом до CD40 є більш ефективним, ніж лікування енбрелом + MTX пацієнтів, які дають невідповідну відповідь на лікування метотрексатом. У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло вводять в поєднанні зі схемою лікування, яке передбачає застосування анти-TNF агента. У конкретних варіантах здійснення винаходу індивідуум відрізняється тим, що являє собою індивідуума, який страждає на ревматоїдний артрит і є нечутливим до лікування з використанням тільки анти-TNF агента. У зазначених варіантах здійснення винаходу спосіб може передбачати лікування індивідуума з використанням схеми лікування, при якій анти-TNF агент вводять у поєднанні з антагоністичним антитілом до CD40. У конкретних варіантах здійснення винаходу лікування індивідуума зазначеним антагоністичним антитілом до CD40 є більш ефективним, ніж лікування за допомогою анти-TNF агента. У наступних варіантах здійснення винаходу спосіб відрізняється тим, що лікування індивідуума зазначеним антагоністичним антитілом до CD40 є більш ефективним, ніж лікування за допомогою препарату Orencia ® (оренція) або Рітуксан пацієнтів, які дають невідповідний відповідь на лікування тільки анти-TNF агентом. Даний винахід належить також до фармацевтичної композиції, яка містить: (I) антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, представлене / представлений в цьому описі; та (II) фармацевтично прийнятний ексципієнти. У зазначених композиціях антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент доцільно кон'югованих з другим агентом, таким, наприклад, як цитотоксичний агент, ПЕГ в якості носія, фермент або маркер. Винахід належить також до виділеного полінуклеотидів, який кодує амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену в будь-якій з наступних послідовностей: SEQ ID NO: 1-4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID. NO. 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 або SEQ ID NO: 73. Винахід належить також до виділеного полінуклеотидів, який кодує амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену в будь-якій з наступних послідовностей: SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 або SEQ ID NO: 76. Винахід належить також до застосування антитіл, представлених в цьому описі, для приготування лікарського засобу, призначеного для блокади функції людського CD40 у ссавця, де лікарський засіб блокує опосередковувану CD40 імунну відповідь у вказаного ссавця. Одним з варіантів здійснення винаходу є приготування лікарського засобу, призначеного для лікування або полегшення реакції "трансплантат-проти-господаря" у ссавця. У наведених як приклад варіантах здійснення винаходу лікарський засіб наготовлюють для лікування аутоімунного або запального захворювання, вибраного з групи, що включає ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, проліферативний вовчаковий гломерулонефрит, запальне захворювання кишечника (IBD), псоріаз, ідіопатичну тромбоцитопенічну пурпуру (ITP), хворобу Крона і системну червону вовчанку (SLE), тиреоїдит Хашимото, первинну мікседему, тиреотоксикоз / хвороба Грейвса, перніціозну анемію, автоімунний атрофічний гастрит, аутоімунний кардит, хвороба Аддісона, передчасну менопаузу, цукровий діабет типу 1, синдром Гудпасчера, важку псевдопаралітичну міастенію, аутоімунну гемолітичну анемію, ідіопатичну лейкопенію, первинний біліарний цироз, хронічний активний гепатит (негативний по Аг HBs), криптогенний цироз, синдром Шегрена, дерматоміозит, склеродермію, змішану 7 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сполучнотканинну хворобу, дискоїдну червону вовчанку та системний васкуліт. У деяких варіантах здійснення винаходу лікарський засіб може містити також другий терапевтичний засіб, вибране з групи, що включає антагоніст TNF, модифікуючу захворювання протиревматоідний засіб, антагоніст CTLA4, МАт до рецептора IL-6 і МАт до CD20. Можна готувати лікарський засіб, призначений для застосування з допомогою парентерального шляху введення. Можна готувати лікарський засіб, призначений для застосування внутрішньовенно або підшкірно. Іншим варіантом здійснення винаходу є застосування антитіл, представлених в цьому описі, для приготування лікарського засобу, призначеного для інгібування виробництва антитіл Bклітинами в організмі хворої людини. Іншим варіантом здійснення винаходу є застосування антитіл, представлених в цьому описі, для приготування лікарського засобу, призначеного для інгібування росту та / або диференціювання клітин, що експресують людський антиген CD40. Іншим варіантом здійснення винаходу є застосування антитіл, представлених в цьому описі, для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування індивідуума, який має асоційоване з CD40 порушення, при цьому зв'язування антитіла або антигензв'язуючих фрагмента, присутнього в зазначеному лікарському засобі, з CD40 інгібує ріст або диференціювання клітин, з якими пов'язане асоційоване з CD40 порушення. Можна готувати лікарський засіб, призначений для застосування з метою обробки клітин, з якими пов'язано асоційоване з CD40 порушення, вибраних з таких клітин, як B-лімфобластоідні клітини, клітини підшлункової залози, клітини легені, клітини молочної залози, клітини яєчника, клітини ободової кишки, клітини передміхурової залози, клітини шкіри, клітини голови і шиї, клітини сечового міхура, клітини кісткової тканини або клітини нирки. Можна готувати лікарський засіб, призначений для застосування з метою лікування хронічного лімфоцитарного лейкозу, лімфоми Беркітта, множинної мієломи, T-клітинної лімфоми, неходжкінської лімфоми, хвороби Ходжкіна, макроглобулінемія Вальденстрема або саркоми Капоші. Іншим варіантом здійснення винаходу є застосування антитіл, запропонованих у винаході, для приготування лікарського засобу, призначеного для індукції виснаження периферичних Вклітин, де антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, що входить в лікарський засіб, специфічно зв'язується з людським розташованим на клітинній поверхні антигеном CD40, при цьому зв'язування антитіла або антигензв'язуючих фрагмента з антигеном CD40 індукує клітинне виснаження. Можна готувати лікарський засіб, призначений для застосування з метою лікування індивідуума, що має імунне порушення. Можна готувати лікарський засіб, призначений для застосування з метою лікування ревматоїдного артриту або системної червоної волчанки. Іншим варіантом здійснення винаходу є застосування антитіл, запропонованих у винаході, для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування ревматоїдного артриту у індивідуума. Можна готувати лікарський засіб, призначений для застосування з метою інгібування диференціювання B-клітин і перемикання ізотипу антитіла у індивідуума. Можна готувати лікарський засіб, призначений для застосування з метою інгібування виробництва цитокінів та хемокінів і підвищувальній регуляції адгезійних молекул у T-клітинах і макрофагах у індивідуума. Можна готувати лікарський засіб, призначений для застосування з метою інгібування активації дендритних клітин у індивідуума. Можна готувати лікарський засіб, призначений для застосування з метою інгібування виробництва прозапальних цитокінів, хемокінів, матриксних металопротеїназ, простагландинів і у відношенні знижуючої регуляції адгезійних молекул у неімунних клітинах у індивідуума. У конкретних варіантах здійснення винаходу лікарський засіб наготовлюють у вигляді комбінованого лікарського засобу, призначеного для застосування у поєднанні зі схемою лікування, що передбачає використання метотрексату і / або використання енбрела / хуміри. В інших варіантах здійснення винаходу лікарський засіб наготовлюють у вигляді комбінованого лікарського засобу, і лікарський засіб крім антитіл, запропонованих у винаході, містить також анти-TNF агент. Короткий опис деяких аспектів креслень На кресленнях показано: на фіг. 1 - А: криві зв'язування і відповідні значення EC50 гуманізованих антитіл з трансфектованними CD40 HEK-293-клітинами, для визначення яких застосовували проточну 8 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цитометрію. Б. Порівняння зв'язування антитіла A, антитіла B і антитіла C з трансфектованними CD40 HEK-клітинами, яке визначали за допомогою проточної цитометрії. Представлені репрезентативні дані, отримані в одному експерименті; на фіг. 2 - криві зв'язування і відповідні значення EC50 гуманізованих антитіл з RAMOSклітинами, для визначення яких застосовували проточну цитометрію. Представлені репрезентативні дані, отримані в одному експерименті; на фіг. 3 - дані оцінки антагоністичної активності мишачих і гуманізованих антитіл, отримані за допомогою аналізу проліферації первинних B-клітин. (A) Представлені репрезентативні криві титрування антитіл і отримані значення IC50 для кожного мишачого антитіла-попередника. Представлені репрезентативні дані, отримані для одного донора. (Б) Представлені накладені один на одного криві інгібування, що демонструють антагонізм різних гуманізованих антитіл до CD40 у порівнянні з 4D11; на фіг. 4 - узагальнення результатів оцінки антагоністичної (IC50) і агоністичної (SI = показник стимуляції) активності гуманізованих антитіл, які отримували за допомогою аналізу проліферації людських первинних B-клітин. Для порівняння представлені результати, отримані для різних антитіл до CD4, а саме, 4D11, G28.5 і 5D12; на фіг. 5 - дані оцінки здатності антитіла B, антитіла A і антитіла C інгібувати індуковану CD40 підвищувальну регуляцію CD86, отримані за допомогою аналізів цільної крові людини. Для порівняння представлені результати, отримані для антитіла до CD40 4D11. У цьому аналізі у застосовуваного в якості контролю ізотипу IgG1 ефективність не виявлена. Представлені репрезентативні дані, отримані для одного донора; на фіг. 6 - узагальнення результатів оцінки здатності антитіла B інгібувати індуковану CD40 підвищувальну регуляцію CD86, отриману з використанням людських очищених B-клітин і цільної крові людини. Дані представлені як у вигляді значень IC50 (A), так і у вигляді значень IC90 (Б). У цьому аналізі у застосовуваного в якості контролю ізотипу IgG1 не виявлена ефективність. У таблиці узагальнено результати, отримані для декількох (n=4-5) донорів; на фіг. 7 - дані оцінки здатності антитіла B, антитіла A і антитіла C інгібувати індуковану CD40 підвищувальну регуляцію CD86, отримані за допомогою аналізів цільної крові мавпи ціномолгус. У цьому аналізі у застосовуваного в якості контролю ізотипу IgG1 ефективність не виявлена. Представлені репрезентативні дані, отримані для одного донора; на фіг. 8 - криві залежності концентрації в плазмі від часу для антитіла A (ліва панель) і антитіла B (права панель) у мавпи ціномолгус після введення кожного антитіла у дозах 1 і 10 мг / кг. Результати являють собою узагальнені дані для трьох тварин для кожного введення кожного антитіла; на фіг. 9 - дані про зміну відсотка CD86-позитивних B-клітин мавп ціномолгус перед введенням (антитіла B) і (антитіла A) і в 3 моменту часу після введення кожного антитіла. Антитіло B (верхні панелі) і антитіло A вводили трьом тваринам кожен в дозі 1 мг / кг (ліві панелі) або 10 мг / кг (праві панелі); на фіг. 10 - рівні (A): людського IgG і (Б) людського IgM в NSG-мишах через 2 тижні після 6 ін'єкції 1,25 × 10 людських PBMC. Мишей обробляли наповнювачем, застосовуваним для контролю ізотипу антитілом і антитілом A, антитілом B і антитілом C в дозі 1 мг / кг за 1 день до перенесення людських PBMC; на фіг. 11 - дані про зв'язуванні різних мишачих антитіл до людського CD40 з людськими тромбоцитами; на фіг. 12 - узагальнення результатів про порівняльному зв'язуванні антитіла B з МАт до CD40 4D11 на людських B-клітинах і тромбоцитах в цільної крові; на фіг. 13-ADCC-активність при застосуванні IgG1-конструкцій дикого типу і несучих "нокаут»-мутації конструкцій. Детальний опис винаходу В даний час встановлено, що опосередкована CD40 передача сигналів бере участь в різних цільових порушеннях. Незважаючи на наявність результатів ряду доклінічних досліджень, що демонструють, що втручання в ці порушення може володіти терапевтичної корисністю, зберігається потреба в антагоністичних антитіла до CD40, які можна застосовувати для лікування аутоімунних захворювань. Переважними варіантами здійснення цього винаходу є гуманізовані антитіла, які розпізнають CD40. У конкретних варіантах здійснення винаходу ідентифікована послідовність зазначених гуманізованих антитіл на основі послідовностей певних найбільш перспективних ("лідерних") мишачих антитіл. Поняття "CD40" і "поверхневий антиген СD40" відносяться до такого, що має масу приблизно 48 кДа глікопротеїну, експресується на поверхні здорових і неопластичних B-клітин, який діє в якості рецептора для сигналів, що беруть участь у проліферації та диференціювання клітин (Ledbetter та ін, J. Immunol. 138, 1987, сс. 788-785). Молекула кДНК, що кодує CD40, 9 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виділена з бібліотеки, створеної на основі клітинної лінії Raji лімфоми Беркетта (Stamenkovic та ін, EMBO J. 8, 1989, с.1403). У контексті цього опису клітина, яка ендогенно експресує CD40, являє собою будь-яку клітину, для якої характерна експресія CD40 на їх поверхні, включаючи (але не обмежуючись лише ними) здорові та неопластичні B-клітини, інтердігітатні клітини, епітеліальні базальні клітини, клітини карциноми, макрофаги, ендотеліальні клітини, фолікулярні дендритні клітини, клітини мигдаликів і віднайдені кістковим мозком плазматичні клітини. У деяких варіантах здійснення винаходу молекула CD40 являє собою молекулу людського CD40. Антитіла, запропоновані у винаході, специфічно зв'язуються з людським рекомбінантним і нативним CD40. Гуманізоване моноклональне антитіло являє собою антитіло, яке специфічно зв'язується з людським CD40, володіє антагоністичною активністю, характеризується значенням IC50, складовим менш 1нM, і при його застосуванні в концентрації аж до 100 мкг / мл не має агоністичну дію у відношенні B-клітинної проліферації, і зазначене антитіло відрізняється також тим, що антитіло має час напівжиття in vivo в організмі приматів крім людини, що становить щонайменше 10 днів. Бажано антитіло специфічно зв'язується з CD40 з утворенням кон'югату CD40-Fc, що характеризується значенням EC50, складовим менш 1нM, і з CD40 на експресують CD40 клітинах, що характеризується значенням EC50, складовим менше 2,5 Нm. Антагоністичні властивості антитіл визначаються тим, що вони володіють антагоністичною активністю відносно B-клітин або дендритних клітин, що характеризується значенням IC50, складовим мерее 1нM. Антитіло має також поліпшеними фармакокінетичними властивостями, володіючи подовженим часом напівжиття in vivo у порівнянні з іншими антитілами до CD40 (наприклад, антитілом до CD40 4D11). У контексті цього опису клітина, яка експресує CD40, являє собою будь-яку клітину, для якої характерна експресія CD40 на її поверхні, включаючи (але не обмежуючись лише ними) здорові та неопластичні B-клітини, інтердігітатні клітини, епітеліальні базальні клітини, клітини карциноми, макрофаги, ендотеліальні клітини, фолікулярні дендритні клітини, клітини мигдаликів і віднайдені кістковим мозком плазматичні клітини. У деяких варіантах здійснення винаходу молекула CD40 являє собою молекулу людського CD40. Антитіла, запропоновані в цьому винаході, розпізнають специфічний "епітоп антигену CD40" і "CD40-епітоп". У контексті цього опису ці поняття відносяться до молекули (наприклад, пептиду) або фрагменту молекули, що володіє іммореактівностью щодо антитіла до CD40 і, наприклад, включає антигенну детермінанту CD40, розпізнавану будь антитілом, яке має комбінацію послідовностей важкого ланцюга / легкого ланцюга, таку як комбінація легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 26, з важким ланцюгом, послідовність якої представлена в будь-якій з SEQ ID NO: 27, 28, 29 або 30; або легкого ланцюга, послідовність якої представлена в SEQ ID NO: 31, з важким ланцюгом, послідовність якого представлена в будь-якій з SEQ ID NO: 32, 33, 34 або 35; або легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 36 з важким ланцюгом, послідовність якого представлена в будь-якій з SEQ ID NO: 37, 38, 39 або 40. Епітопи антигену CD40 можуть бути включені в білки, білкові фрагменти, пептиди або т.п. Етітопи найбільш часто являють собою білки, короткі олігопептиди, олігопептидні міметики (тобто органічні сполуки, які імітують антитілозвязуючі властивості антигену CD40) або їх комбінації. Загальна структура антитіл або імуноглобуліну добре відома фахівцям в даній галузі, ці молекули являють собою гетеротетрамерні глікопротеїни, як правило з молекулярною масою приблизно 150000 Та, що складаються з двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких (H) ланцюгів. Кожен легкий ланцюг ковалентно пов'язано з важким ланцюгом за допомогою одного дисульфідного зв'язку з утворенням гетеродімер, і гетеротетрамерна молекула утворюється за допомогою ковалентного дисульфідного зв'язку між двома ідентичними важкими ланцюгами гетеродімер. Хоча легкі і важкі ланцюги зв'язані за допомогою одного дисульфідного зв'язку, кількість дисульфідних зв'язків між двома важкими ланцюгами варіюється в залежності від ізотипу імуноглобуліну. Кожен важкий і легкий ланцюг має також рівномірно розподілені внутрішньоланцюгові дисульфідні містки. Кожен важкий ланцюг має амінокінцеву варіабельну область (VH), за якою розташовані три або чотири константних домена (CH1, CH2, CH3 і CH4), а також шарнірна ділянка між CH1 і CH2. Кожен легкий ланцюг має дві області, амінокінцеву варіабельну область (VL) і карбоксіконцевий константний домен (CL). VL-область нековалентно пов'язано з VH-областю, а CL-домен, як правило, ковалентно пов'язано з CH1-доменом через дисульфідні зв'язки. Ймовірно, певні амінокислотні залишки утворюють поверхню розділу між варіабельними областями легких і важких ланцюгів (Chothia та ін, J. Mol. Biol. 186, 1985, сс. 651-663). 10 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Певні ділянки в варіабельних областях значно розрізняються у різних антитіл, тобто вони є "гіперваріабельні". Ці гіперваріабельні ділянки містять залишки, які безпосередньо беруть участь у зв'язуванні і визначають специфічність кожного конкретного антитіла відносно специфічною для нього антигенної детермінанти… Гіперваріабельну в варіабельних областях, як легкого ланцюга, так і важкого ланцюга, концентрується в трьох сегментах, які позначають як визначальні комплементарність ділянки (гіперваріабельні ділянки) (CDR) або гіперваріабельні петлі (HVL). CDR визначають шляхом порівняння послідовностей згідно методу, описаного у Kabat та ін, в: Sequences of Proteins of Immunological Interest, п'ятий вид., Вид-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991, а HVL структурно визначають на основі тривимірної структури варіабельної області згідно методу, описаного у Chothia іd Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917. Якщо ці два методи призводять до деяких відмінностей при ідентифікації CDR, то кращим є визначення на основі структурі. Згідно номенклатурі Кебота CDR-L1 розташований приблизно на залишках 24-34, CDR-L2 приблизно на залишках 50-56 і CDR-L3 приблизно на залишках 89-97 в варіабельної області легкого ланцюга; CDR-H1 розташований приблизно на залишках 31-35, CDR-H2 приблизно на залишках 50-65 і CDR-H3 приблизно на залишках 95-102 в варіабельної області важкого ланцюга. Таким чином, CDR1, CDR2, CDR3 важких і легких ланцюгів визначають унікальні і функціональні властивості, специфічні для даного антитіла. Три CDR в кожному з важких і легких ланцюгів розділені каркасними ділянками (FR), які містять послідовності, в меншій мірі мають тенденцію до варіабельності. Починаючи з амінокінця у напрямку до карбоксикінця варіабельних областей важких і легких ланцюгів FR і CDR впорядковані наступним чином: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. У значній мірі βскладчаста конформація FR дозволяє CDR в кожному з ланцюгів знаходитися в безпосередній близькості один з одним, а також з СDR з іншого ланцюга. Отримана конформація притаманна антигензв'язуючого центу (див. Kabat та ін, NIH Publ. № o. 91-3242, т. I, 1991, сс. 647-669), хоча не є необхідною умова, щоб всі залишки CDR безпосередньо брали участь у зв'язуванні антигену. Залишки FR і константні домени Ig не залучені безпосередньо у зв'язуванні антигену, але беруть участь у пов'язаній з антигеном і / або опосередкованої антигеном ефекторній функції. Деякі залишки FR, ймовірно, роблять виражений вплив на зв'язування антигену щонайменше трьома шляхами: шляхом нековалентно зв'язування безпосередньо з епітопом, шляхом взаємодії з одним або декількома залишками CDR і шляхом впливу на поверхню розділу між важкими і легкими ланцюгами. Константні домени не беруть участь безпосередньо у зв'язуванні антигену, але опосередковують різні ефекторні функції Ig, такі як участь антитіла в антитілообумовленій клітинозалежній цитотоксичності (ADCC), комплементзалежній цитотоксичності (CDC) і антитіло-обумовленому клітинному фагоцитозі (ADCP). Легкі ланцюги імуноглобулінів хребетних тварин відносять до одного або двох чітко помітних класів, каппа (κ) і лямбда (λ), на основі амінокислотної послідовності константного домену. Для порівняння, важкі ланцюги імуноглобулінів ссавців відносять до одного з п'яти основних класів з урахуванням послідовності константних доменів: IgA, IgD, IgE, IgG та IgM. IgG та IgA додатково підрозділяють на підкласи (ізотипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2. Константні домени важких ланцюгів, які відповідають різним класам імуноглобулінів, позначають як α, δ, ε, γ і μ відповідно. Структури субодиниць і тривимірні конфігурації класів нативних імуноглобулінів добре відомі. У контексті цього опису поняття "антитіло", "антитіло до CD40", "гуманізоване антитіло до CD40" і "варіант гуманізованого антитіла до CD40" застосовують в найбільш широкому сенсі, і вони належать, зокрема, до моноклональним антитілам (включаючи повнорозмірні моноклональні антитіла), поліклональних антитіл, мультіспецифічним антитілам (наприклад, біспецифічним антитілам) і фрагменти антитіл, таким як варіабельні області та інші ділянки антитіл, які володіють необхідною біологічною активністю, наприклад, здатністю зв'язуватися з CD40. Поняття "моноклональне антитіло" (мат) належить до антитілу з популяції практично гомогенних антитіл; тобто індивідуальні антитіла в зазначеній популяції є ідентичними за винятком що зустрічаються в природних умовах мутацій, які можуть бути присутніми в дуже невеликих кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, їх мішенню є індивідуальна антигенна детермінанта, "епітоп". Таким чином, прикметник "моноклональні" є відмітною ознакою практично гомогенної популяції антитіл, мішенню яких є ідентичний епітоп, і поняття не обмежено вимогою до отримання антитіл за допомогою якого-небудь конкретного методу. Має бути очевидно, що моноклональні антитіла можна отримувати за допомогою будьякої техніки або методології, відомої в даній області; включаючи, наприклад, метод гібридом 11 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Kohler та ін, Nature 256, 1975, с. 495), або методи рекомбінантних ДНК, відомі в даній області (див., наприклад, US 4816567), або методи виділення моноклональних отриманих за допомогою рекомбінантної ДНК антитіл з використанням фагових бібліотек антитіл, які описані у Clackson та ін, Nature 352, 1991, сс. 624-628 і у Marks та ін, J. Mol. Biol. 222, 1991, сс. 581-597. Химерні антитіла складаються з варіабельних областей важкого і легкого ланцюга антитіл з одного виду (наприклад, з ссавця крім людини, такого як миша) і константних областей легкого і важкого ланцюга антитіла з інших видів (наприклад, людини), і їх можна отримувати шляхом з'єднання послідовностей ДНК, що кодують варіабельні області антитіла з першого виду (наприклад, миші), з послідовностями ДНК константних областей антитіла з другого виду (наприклад, людини), і трансформації господаря експресійним вектором, що містить пов'язані послідовності, що дозволяє господареві продукувати химерне антитіло. В альтернативному варіанті химерне антитіло може також являти собою антитіло, в якому одна або декілька областей або доменів важкого і / або легкого ланцюга ідентичні, гомологічні або є варіантом відповідної послідовності в моноклональному антитілі з іншого класу або ізотипи імуноглобуліну або з консенсусної послідовності або послідовності зародків лінії. Химерні антитіла можуть включати фрагменти зазначених антитіл за умови, що фрагмент антитіла володіє необхідною біологічною активністю батьківського антитіла, наприклад здатністю зв'язуватися з одним і тим же епітопом (див., наприклад, US 4816567; та Morrison та ін, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс. 6851-6855). Поняття "фрагмент антитіла", "фрагмент антитіла до CD40", "фрагмент гуманізованого антитіла до CD40" і "фрагмент варіанту гуманізованого антитіла до CD40" належать до частини повнорозмірного антитіла до CD40, в якому зберігається варіабельна область або її функціональна здатність, наприклад, специфічність зв'язування з епітопом CD40. Прикладами фрагментів антитіл є (але, не обмежуючись тільки ними) Fab-, Fab'-, F (ab ') 2 -, Fd-, Fv-, scFv-й scFv-Fc-фрагмент, димерне антитіло (діабоді), лінійне антитіло, одноланцюгове антитіло, мінітіло, димерне антитіло, утворене з фрагментів антитіла, і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Повнорозмірні антитіла можна обробляти ферментами, такими як папаїн або пепсин, з отриманням необхідних фрагментів антитіл. Розщеплення папаїном застосовують для отримання двох ідентичних антигензв'язуючих фрагментів, які називають "Fab»-фрагментами, кожен з одним антигензв'язуючих центром, при цьому частину, що залишилася позначають як "Fc»-фрагмент. Fab-фрагмент містить також константний домен легкого ланцюга і CH1-домен важкого ланцюга. Після обробки пепсином отримують F (ab ') 2-фрагмент, який несе два антигензв'язуючих центру і все ще зберігає здатність до перехресного зшивання з антигеном. Fab'-фрагменти відрізняються від Fab-фрагментів присутністю додаткових залишків, включаючи один або кілька залишків цистеїну з шарнірною області антитіла на C-кінці CH1домену. F (ab ') 2-фрагменти антитіл являють собою пари Fab'-фрагментів, пов'язаних з допомогою залишків цистеїну в шарнірній області. Відомі інші хімічні поєднання фрагментів антитіл. "Fv"-фрагмент містить повний антиген-що розпізнає і антиген-зв'язуючий центр, що складається з димера, що включає варіабельну область одного важкого і одного легкого ланцюга в тісній нековалентній асоціації. У цій конфігурації три CDR кожної варіабельної області взаємодіють з певним антигензв'язуючим центром на поверхні димеру VH-VL. В цілому, шість CDR обумовлюють специфічність антитіла відносно зв'язування антигену. "Одноланцюговий Fv" або "scFv»-фрагмент антитіла являє собою одноланцюговий Fvваріант, що містить VH-та VL-області антитіла, при цьому галузі присутні в одному поліпептидному ланцюзі. Одноланцюговий Fv має здатність розпізнавати антиген і зв'язуватися з ним. Поліпептид scFv необов'язково може містити також поліпептидний лінкер, розташований між VH-та VL-областями для полегшення утворення тривимірної структури, необхідної для зв'язування антигену за допомогою scFv (див., наприклад, Pluckthun, в: The Pharmacology of monoclonal Antibodies, т. 113, під ред. Rosenburg і Moore, вид-во Springer-Verlag, New York, 1991, сс. 269-315). Інші що мають здатність до розпізнавання фрагменти антитіл включають фрагменти, які містять пару розташованих у вигляді тандему Fd-сегментів (VH-CH1-VH-CH1), що утворюють пару антигензв'язуючих ділянок. Зазначені "лінійні антитіла" можуть бути біспецифічними або моноспецифічними, що описано, наприклад, у Zapata та ін, Protein Eng. 8 (10), 1995, сс. 10571062. Гуманізоване антитіло або фрагмент гуманізованого антитіла являє собою специфічний тип химерного антитіла, яке включає варіант амінокислотної послідовності імуноглобуліну або його фрагмента, який має здатність зв'язуватися з попередньо визначеним антигеном і який містить 12 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 один або кілька FR, який (і) має (ють) амінокислотну послідовність, практично відповідну послідовності людського імуноглобуліну, і один або декілька CDR, який (і) має (ють) амінокислотну послідовність, яка практично відповідає амінокислотній послідовності нелюдського імуноглобуліну. Вказану нелюдську амінокислотну послідовність, яку часто позначають як "імпортна" послідовність, як правило, отримують з "імпортної" області антитіла, зокрема, варіабельної області. В цілому, гуманізоване антитіло включає щонайменше CDR або HVL нелюдського антитіла, вбудовані між FR варіабельної області людської важкої або легкої ланцюга. У справжньому винаході описані специфічні гуманізовані антитіла до CD40, які містять CDR, отримані з мишачих моноклональних антитіл, які представлені в таблицях 3 і 4, вбудовані між FR послідовностей варіабельних областей важкого і легкого ланцюга людської зародкової лінії. Має бути очевидно, що певні залишки мишачого FR можна імпортувати для забезпечення функції гуманізованих антитіл, і отже, певні залишки послідовностей варіабельних областей важкого і легкого ланцюга людської зародкової лінії модифікують для того, щоб вони були такими ж як у відповідній мишачій послідовності. В іншому об'єкті винаходу гуманізоване антитіло до CD40 містить практично всі з щонайменше однієї і, як правило, двох варіабельних областей (таких, наприклад, як вхідні в Fab-, Fab'-, F (ab ') 2 -, Fabc-і Fv-фрагменти), в яких всі або практично всі CDR відповідають CDR нелюдських імуноглобулінів, і згідно з цим винаходу все CDR являють собою мишачі послідовності, докладно описані в представлених нижче таблицях 1-4, та все або практично все FR являють собою FR, які мають консенсусну послідовність або послідовність зародкової лінії людського імуноглобуліну. В іншому об'єкті винаходу гуманізоване антитіло до CD40 включає також щонайменше частину Fc-області імуноглобуліну, як правило, людського імуноглобуліну. Як правило, антитіло повинне містити як легкий ланцюг, так і по меншій мірі варіабельну область важкого ланцюга. Антитіло може включати також при необхідності один або декілька з наступних ділянок: CH1, шарнірна область, CH2, CH3 і / або CH4 важкого ланцюга. Гуманізоване антитіло до CD40 можна вибирати з будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи IgM, IgG, IgD, IgA і IgE, і будь-якого ізотипу, включаючи IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2. Наприклад, константний домен може являти собою комплементфіксуючий константний домен, якщо потрібно, щоб гуманізоване антитіло мало цитотоксичну активність, і ізотип, як правило, являє собою IgG1. Якщо цитотоксична активність не потрібна, то константний домен може відноситися до іншого ізотипу, наприклад, IgG2. В альтернативному варіанті гуманізоване антитіло до CD40 може містити послідовності з більш ніж одного класу або ізотипи імуноглобулінів, і вибір конкретних константних доменів для оптимізації необхідних ефекторних функцій знаходиться в компетенції звичайного фахівця в даній області. Конкретними варіантами здійснення цього винаходу є антитіла, які являють собою антитіла ізотипи IgG1 і більш конкретно антитіла ізотипи IgG1, в яких "вимкнені" ефекторні функції. FR і CDR або HVL гуманізованого антитіла до CD40 не обов'язково повинні точно відповідати батьківським послідовностям. Наприклад, один або кілька залишків в імпортному CDR або HVL або в консенсусній послідовності або послідовності зародкової лінії FR можна змінювати (наприклад, за допомогою мутагенезу) шляхом заміни, інсерцій або делеції, в результаті чого отриманий амінокислотний залишок стає не ідентичним вихідному залишку у відповідному положенні будь-якої батьківської послідовності, але, тим не менш, антитіло зберігає функцію, таку як здатність зв'язуватися з CD40. Вказана зміна, як правило, не повинно бути великим і має представляти собою консервативні зміни. Як правило, щонайменше 75 % залишків, частіше щонайменше 90 % і найбільш часто понад 95 % або більше 98 % або більше 99 %, гуманізованого антитіла повинно відповідати залишкам батьківської консенсусної послідовності або послідовності зародкової лінії FR і імпортних послідовностей CDR. Залишки імуноглобуліну, які впливають на поверхню розділу між варіабельними областями важкого і легкого ланцюга ("поверхня розділу VL-VH"), являють собою залишки, які впливають на близькість або орієнтацію двох ланцюгів відносно один одного. Конкретними залишками, які можуть брати участь у взаємодіях між ланцюгами, є залишки VL 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 і 98 та залишки VH 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 і 103 (відповідно до системи нумерації, запропонованої Kabat та ін, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). У US 6407213 обговорюється також, що в зазначеному взаємодія можуть брати участь такі залишки як залишки VL 43 і 85 і залишки VH 43 і 60. Хоча зазначені залишки вказані тільки для людського IgG, їх можна розглядати і для інших видів. Важливі залишки антитіла, які, як очікується, можуть брати участь у взаємодіях між ланцюгами, відбирають для заміни в консенсусній послідовності. Поняття "консенсусна послідовність" і "консенсусне антитіло" належать до амінокислотної послідовності, яка містить що найчастіше зустрічається амінокислотний залишок в кожному 13 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 положенні у всіх імуноглобулінів будь-якого класу, ізотипу або в будь-якій суб'одиничної структурі, наприклад, варіабельній області людського імуноглобуліну. Консенсусна послідовність може базуватися на імуноглобулінів конкретних видів або безлічі видів. Під "консенсусною / консенсусним" послідовністю, структурою або антитілом увазі консенсусну людську послідовність, зазначену в конкретних варіантах здійснення винаходу, і поняття відноситься до амінокислотної послідовності, яка містить найбільш часто зустрічаються залишки в кожному положенні у всіх людських імуноглобулінів конкретного класу, ізотипу або суб'одиничної структури. Таким чином, консенсусна послідовність містить амінокислотну послідовність, яка має в кожному положенні амінокислоту, яка присутня в одному або декількох відомих імуноглобулінів, але яка може не представляти собою точну копію повної амінокислотної послідовності будь-якого індивідуального імуноглобуліну. Варіабельна область консенсусної послідовності не отримують з якогось зустрічається в природних умовах антитіла або імуноглобуліну (Kabat та ін, Sequences of Proteins of Immunological Interest, п'ятий вид., Видво Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) і його варіантів. Консенсусні послідовності FR важкого і легкого ланцюга і їх варіанти являють собою цінні послідовності для отримання гуманізованого антитіла до CD40 (див., наприклад, US 6037454 та 6054297). Людські послідовності зародкової лінії присутні в природних умовах в популяції людських антитіл. Комбінація цих генів зародкової лінії створює різноманітність антитіл. Послідовності зародкової лінії антитіла легкого ланцюга антитіла отримують з консервативних людських vгенів і j-генів зародкової лінії каппа або лямбда. Аналогічно цьому послідовності важкого ланцюга отримують з v-, d-і j-генів зародкової лінії (LeFranc MP і LeFranc G, "The Immunoglobulin Facts Book", вид-во Academic Press, 2001). У контексті цього опису поняття "варіант", "варіант антитіла до CD40", "гуманізований варіант антитіла до CD40" або "варіант гуманізованого антитіла до CD40" все означають гуманізоване антитіло до CD40, яке містить щонайменше мишачий CDR варіабельної області важкого ланцюга, який має будь-яку з послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 1-4, або послідовність мишачого CDR легкого ланцюга, отриману з мишачого моноклонального антитіла, яка представлена в будь-якій з SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 8, і послідовності FR, отримані з людських консенсусних послідовностей. До варіантів відносяться послідовності, що мають одну або кілька амінокислотних замін в варіабельних областях однієї або обох легких ланцюгів або важких ланцюгів, за умови, що зміна амінокислоти не робить істотного впливу на зв'язування антитіла з CD40. Прикладами гуманізованих антитіл, отриманих згідно з цим винаходом, є антитіла, позначені як антитіло A, антитіло B і антитіло C, і різні послідовності їх важких і легких ланцюгів, представлені в SEQ ID NO: 26-SEQ ID NO: 40. "Виділене" антитіло являє собою антитіло, яка ідентифікована і відокремлене і / або очищено від компонента його природного оточення. Забруднюючі компоненти природного оточення антитіла являють собою субстанції, які можуть впливати на діагностичне або терапевтичне застосування антитіла і можуть являти собою ферменти, гормони або інші білкові або небілкові розчинені речовини. В одному з об'єктів винаходу виділене антитіло повинне являти собою антитіло, очищене до ступеня, що перевищує 95 мас. %. Виділене антитіло являє собою антитіло in situ всередині рекомбінантних клітин, в яких воно продукувало, якщо в ньому не присутній жоден компонент природного оточення антитіла. Однак, як правило, виділене антитіло одержують за допомогою щонайменше однієї стадії очищення, під час якої видаляють рекомбінантний клітинний матеріал. Поняття "характеристика антитіла" відноситься до факторів, які описують розпізнавання антитілом антигену або ефективність антитіла in vivo. Зміни в амінокислотної послідовності антитіла можуть впливати на властивості антитіла, такі як фолдінг, і можуть впливати на фізичні фактори, такі як початкова швидкість зв'язування антитіла з антигеном (ka), константа дисоціації антитіла від антигену (kd), константа афінності антитіла до антигену (Kd), конформація антитіла, стабільність білка і час напівжиття антитіла. У контексті цього опису поняття "епітопне мічення" належить до антитіла до CD40, злитим з "епітопною міткою". "Епітопна мітка" являє собою поліпептид, що складається з достатньої кількості амінокислот для створення епітопів для виробництва антитіла, при цьому її створюють так, щоб вона не чинила впливу на необхідну активність гуманізованого антитіла до CD40. Епітопна мітка, як правило, є в значній мірі унікальною, в результаті чого антитіло, яке утворюється проти епітопної мітки, не дає виражену перехресну реакцію з іншими епітопами. Прийнятні поліпептиди-мітки, як правило, містять щонайменше 6 амінокислотних залишків і, як правило, містять приблизно 8-50 амінокислотних залишків або приблизно 9-30 залишків. Прикладами епітопних міток і антитіл, які зв'язуються з епітопом, є поліпептид-мітка flu HA (HA 14 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вірусу грипу) і відповідне йому антитіло 12CA5 (Field і ін, Mol. Cell. Biol. 8, 1988 2159-2165); cmyc -мітка і відповідні антитіла 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 і 9E10 (Evan та ін, Mol. Cell. Biol. 5 (12), 1985,, сс. 3610-3616); та мітка, яка включає глікопротеїн D (gD) вірусу герпесу простого, і відповідне антитіло (Paborsky та ін Protein Engineering 3 (6), 1990, сс. 547-553). У конкретних варіантах здійснення винаходу епітопна мітка являє собою "зв'язуючий антитіло епітоп-« рятувальник ». У контексті цього опису поняття "зв'язуючий антитіло епітоп-« рятувальник »належить до епітопів Fc-області молекули IgG (такий як IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4), відповідальному за подовження часу напівжиття молекули IgG in vivo в сироватці. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, пропоновані в даному винаході, можна кон'югувати з цитотоксичним агентом. Він може являти собою субстанцію, яка інгібує або перешкоджає функції клітин і / або викликає деструкцію клітин. Під поняття підпадають радіоактивні ізотопи (такі як I131, I125, Y90, і Re186), хіміотерапевтичні засоби і токсини, такі як що володіють ферментативною активністю токсини, отримані з бактерій, грибів, рослин або тварин, і їх фрагменти. Зазначені цитотоксичні агенти можна зшивати з гуманізувати антитіла, пропонованими в цьому винаході, за допомогою стандартних процедур і застосовувати, наприклад, для лікування пацієнта, якому показана терапія на основі антитіла. "Хіміотерапевтичний засіб" являє собою хімічну сполуку, яку можна застосовувати для лікування раку. Відомі численні приклади хіміотерапевтичних засобів, які можна кон'югувати з терапевтичними антитілами, пропонованими в цьому винаході. Прикладами вказаних хіміотерапевтичних засобів є алкілуючі засоби, такі як тіотепа і циклофосфамід; алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азірідіни, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа і уредопа; етиленімін і метіламеламіни, включаючи алтретамін, тріетіленмеламін, тріетіленфосфорамід, тріетілентіофосфорамід і тріметілоломеламін; ацетогеніни (насамперед буллатацін і буллатацінон); камптотецин (включаючи синтетичний аналог топотекан); бріостатін; каллістатін; CC-1065 (включаючи його синтетичні аналоги адозелесін, карзелесін і бізелесін); кріптофіціни (насамперед кріптофіцін 1 і кріптофіцін 8); доластатін, аурістатіни (включаючи такі аналоги, як монометіл-аурістатін E і монометілаурістатін F); дуокарміцін (включаючи синтетичні аналоги KW-2189 і CBI-TMI); елеутeробін; панкратістатін; саркодіктіін; спонгістатін; аналоги азотистого іприту, такі як хлорамбуціл, хломафазін, хлорфосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, гідрохлорид оксиду мехлорметаміна, мелфалан, новембіхін, фенестерін, преднімустін, трофосфамід, урамустін (азотістоіпрітовое похідне урацилу); нітрозмочевіни, такі як кармустін, хлорзотоцін, фотемустін, ломустін, німустін, ранімустін; антибіотики, такі як енедіїнові антибіотики (наприклад, каліхеамінцін, насамперед каліхеаміцін гамма 1I і каліхеамінцін phiI1 (див., наприклад, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33, сс. 183-186); дінеміцін, включаючи дінеміцін A; бісфосфонати, такі як клодронат; еспераміцін; а також неокарзіностатиновий хромофор і споріднений хромопротеін хромофоров енедіїнових антибіотиків), аклаціномізіни, актиноміцин, аутраміцін, азасерін, блеоміцин, кактіноміцін, карабіцін, карміноміціна, карзінофелін, хромоміціни, дактіноміцін, даунорубіцин, деторубіцін, 6-Діаз -5-оксо-L-норлейцін, доксорубіцин (Adriamycin ™) (включаючи морфоліно-доксорубіцин, ціанморфоліно-доксорубіцин, 2-пірроліно-доксорубіцин і дезоксідоксорубіцін), епірубіцин, езорубіцін, ідарубіцин, марцелломіцін, мітоміцін, такі як мітоміцін C, мікофенольна кислота, ногаламіцін, олівоміціни, пепломіцін, потфіроміцін, пуромицин, хеломіцін, родарубіцін, стрептонігрін, стрептозоцін, туберцідін, убенімекс, зіностатін, зорубіцін; антиметаболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерін, метотрексат, птероптерін, триметрексат; пуринові аналоги, такі як флударабіну, 6-меркаптопурин, тіамітрін, тіогуанін; піримідинові аналоги, такі як анцітабін, азацітідін, 6-азаурідін, кармофур, цитарабін, дідезоксіуредін, доксіфлурідін, еноцітабін, флоксурідін; андрогени, такі як калустерон, дромостанолонпропіонат, епітіостанол, мепітіостан, тестолактон; антіадренергетікі, такі як аміноглутетимід, мітотан, трілостан; замінник фолієвої кислоти, такої як фроліновая кислота; ацеглатон; альдофосфамідглікозід; амінолевулінова кислота; енілураціл; амсакрін; бестрабуціл; бісантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцін; діазіхон; елформітін; елліптінія ацетат; епотілон; етоглюцід; нітрат галію; гидроксимочевина; лентинан; лонідамін; майтансіноіди, такі як майтансін і ансамітоціни; мітогуазон; мітоксантрон; мопідамол; нітракрін; пентостатін; фенамед; пірарубіцін; лосоксантрон; подафілліновая кислота; 2-етілгідразід; прокарбазин; PSK ®; разоксан; різоксін; сізофуран; спірогерманій; тенуазоновая кислота; тріазіхон; 2,2 ', 2''-тріхлортріетіламін; тріхотецени (насамперед токсин T-2, верракурін A, рорідін A і ангуідін); уретан; віндесін; Дакарбазин; манномустрін; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацітозін; арабінозід ("Ara-С"); циклофосфамід; тіотепа; таксоіди, наприклад паклітаксел (TAXOL ®, фірма Bristol-Myers Squibb Oncology, Прінстон, штат Нью-Джерсі) і доцетаксел (TAXOTERE ®, фірма Rhone-Poulenc Rorer, Ентоні, Франція); хлорамбуціл; 15 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гемцитабін (Gemzar ™); 6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платини, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбластин; платина; етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоксантрон; вінкристин; вінорелбін (Navelbine ™); Новантрон; теніпозід; едатрексат; дауноміцину; аміноптерін; кселода; ібандронат; СРТ-11; інгітор топоізомерази RFS-2000; діфторметілорнітін (ДМПО); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота; капецитабін, і їх фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого із зазначених вище сполук. Також під обсяг цього визначення підпадають антігормональні агенти, які регулюють або інгібують дію гормону на пухлини, такі як антиестрогени і селективні модулятори рецепторів естрогену (SERM), включаючи, наприклад, тамоксифен (включаючи Nolvadex™), ралоксифен, дролоксіфен, 4-гідроксітамоксіфен, тріоксіфен, кеоксіфен, LY117018, онапрістон і тореміфен (Fareston™); інгібітори ароматази, які інгібують фермент ароматазу, регулюють виробництво естрогену наднирковими, такі, наприклад, як 4 (5)-імідазолу, аміноглутетимід, мегестрол ацетат (Megace™), ексеместан, форместан, фадрозол, ворозол (Rivisor™), летрозол (Femara™) і анастрозол (Arimidex™); і антиандрогени, такі як флутамід, нілутамід, бікалутамід, леупролід і госерелін, а також фармацевтично прийнятні солі, кислоти і похідні будь-якого із зазначених вище сполук. Будь-яке одне або кілька цих засобів можна кон'югувати з гуманізованими антитілами, пропонованими в цьому винаході, з отриманням цінного терапевтичного засобу, який можна застосовувати для лікування різних порушень. Антитіла можна кон'югувати також з проліками. "проліки" являє собою попередник або похідне фармацевтично активної субстанції, які менш цитотоксичних для пухлинних клітин у порівнянні з вихідним лікарським засобом і мають здатність активуватися або перетворюватися в більш активну вихідну форму за допомогою ферментів (див., наприклад, Wilman в: "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemicals Society Transactions, 14, 1986, сс. 375-382, 615-й симпозіум у Белфасті (1986); та Stella та ін в:« Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery », Directed Drug Delivery, під ред. Borchardt та ін, вид-во Humana Press, 1985, сс. 247267). Придатні проліки включають (але, не обмежуючись ними) фосфатвмісні проліки, тіофосфатовмісні проліки, сульфатовмісні проліки, пептидовмісні проліки, модифіковані Dамінокислотою проліки, глікозильовані проліки, β-лактамовмісні проліки, проліки, що містять необов'язково заміщений феноксіацетамід, або проліки, що містять необов'язково заміщений фенілацетамід, 5-Фторцітозін-та інші 5-фторурідиновмісні проліки, які можуть перетворюватися у більш активну цитотоксичну вільну лікарську форму. Приклади цитотоксичних лікарських засобів, які можуть утворювати похідні у вигляді проліки, включають (але, не обмежуючись ними) описані вище хіміотерапевтичні засоби. Для діагностичних цілей, а також для моніторингу лікування антитіла, пропоновані у винаході, можна кон'югувати також з міткою, або тільки з міткою, або з міткою в поєднанні з додатковим другим агентом (проліки, хіміотерапевтичний засіб і т.п.). Мітка на відміну від другого додатково агента являє собою субстанцію, яка являє собою сполуку, що виявляється або виявляти композицію, і її можна кон'югувати прямо або побічно з гуманізованим антитілом, пропонованим у цьому винаході. Мітка сама по собі може являти собою виявляєму субстанцію (наприклад, радіоізотопні мітки або флуоресцентні мітки) або, як у випадку ферментативної мітки, вона може каталізувати хімічну зміну сполуки або композиції, що представляє / представляє собою субстрат, що можна виявляти. Мічене гуманізоване антитіло до CD40 можна готувати і застосовувати для різних цілей, включаючи діагностику in vitro і in vivo. Антитіла, пропоновані в цьому винаході, можна готувати таким чином, щоб вони являли собою частину препарату у вигляді ліпосоми, для їх ефективного запровадження in vivo. "Ліпосоми" являє собою невеликий пухирець, що складається з різного типу ліпідів, фосфоліпідів і / або поверхнево-активна речовина, який можна застосовувати для введення ссавцю сполуки або композиції, наприклад, гуманізованого антитіла до CD40, представленого в цьому описі, в поєднанні або в комбінації з одним або декількома фармацевтичними діючими речовинами і / або мітками. Компоненти ліпосом зазвичай впорядковані у вигляді двошарової структури, аналогічної ліпідній структурі біологічних мембран. Конкретними об'єктами цього винаходу є виділені нуклеїнові кислоти, які кодують один або декілька доменів гуманізованого антитіла, пропонованих в цьому винаході. "Виділена" молекула нуклеїнової кислоти являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка ідентифікована і відділена щонайменше від однієї молекули нуклеїнової кислоти-домішки, з якою вона зазвичай пов'язана в природному джерелі нуклеїновоїкислоти антитіла. Виділена молекула нуклеїнової кислоти відрізняється від молекули нуклеїнової кислоти, яка існує в таких, що зустрічаються в природних умовах клітинах. Згідно різним об'єктам цього винаходу можна здійснювати рекомбінантну експресію одного або декількох доменів гуманізованого антитіла. Для здійснення зазначеної рекомбінантної 16 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресії можна застосовувати одну або декілька контролюючих послідовностей, тобто полінуклеотидних послідовностей, необхідних для експресії функціонально зв'язаної послідовності, що кодує в конкретному організмі-хазяїні. Придатні для прокаріотів клітин контролюючі послідовності включають, наприклад, послідовності промотору, оператора і сайту зв'язування рибосоми. В еукаріотичних клітинах контролюючі послідовності включають (але, не обмежуючись тільки ними) промотори, сигнали поліаденілірованія і енхансери. Зазначені контролюючі послідовності можна застосовувати для експресії та виробництва гуманізованого антитіла до CD40 в прокаріотичних і еукаріотичних клітинах-господарях. Нуклеїнова кислота "функціонально пов'язана", якщо вона знаходиться у функціональному зв'язку з іншою нуклеотидною послідовністю. Наприклад, нуклеїнова кислота передпослідовності або секреторного лідера функціонально пов'язана з нуклеїнової кислотою, що кодує поліпептид, якщо вона експресується у вигляді предпротеіна, який бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансери функціонально пов'язані з кодуючою послідовністю, якщо він надає дію на транскрипцію послідовності; або сайт зв'язування рибосоми функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він розташований так, що може полегшувати трансляцію. Як правило, "функціонально зв'язаний" позначає, що пов'язані послідовності ДНК є суміжними, а в разі секреторного лідера, є суміжними і знаходяться в рамці зчитування. Однак енхансери не обов'язково повинні бути суміжними. Зв'язування здійснюють шляхом вбудовування лігування у відповідний сайт рестрикції. Якщо такі сайти не існують, то можна застосовувати синтетичні олігонуклеотидні адаптери або лінкери. У контексті цього опису поняття "клітина", "лінія клітин" і "культура клітин" використовуються як взаємозамінні, і всі такі поняття включають потомство. Так, поняття "трансформація" і "трансформовані клітини" включають первинну що представляє інтерес клітину і отримані з неї культури, незалежно від кількості пересівань. Поняття "ссавець", що підлягає лікуванню, належить до будь-якої тварини, що належить до класу ссавців, включаючи людей, домашніх і сільськогосподарських тварин, а також живуть у зоопарку тварин, призначених для спорту або кімнатних тварин, таких як собаки, коні, кішки, корови і т.д. Переважно ссавець являє собою людину. У контексті цього опису поняття "порушення" означає будь-який стан, що можна полегшувати за допомогою лікування гуманізованим антитілом до CD40, представленим в цьому описі. Воно включає хронічні і гострі порушення або захворювання, зокрема патологічні стани, які призводять до схильності ссавця до розглянутого порушення. Прикладами порушень, які можна лікувати згідно винаходу, є (але, не обмежуючись тільки ними) рак, злоякісні гематологічні захворювання, доброякісні та злоякісні пухлини; лейкози і лімфоїдні злоякісні захворювання; а також запальні, ангіогенні, аутоімунні та імунологічні порушення. Поняття "рак" і "раковий" відносяться або описують фізіологічний стан у ссавця, що, як правило, відрізняється нерегульованим ростом клітин. Прикладами раку є (але, не обмежуючись тільки ними) карцинома, лімфома, бластома, саркома і лейкоз. У контексті цього опису поняття "асоційоване з CD40 порушення" або "асоційоване з CD40 захворювання" відноситься до стану, при якому показана модифікація або елімінація клітин, експресуються CD40. Вони включають експресують CD40 клітини, для яких характерна аномальна проліферація, або експресують CD40 клітини, які асоційовані з раковим або злоякісним ростом. Більш конкретними прикладами видів раку, для яких характерна аномальна експресія антигену CD40, є B-лімфобластоідний клітини, лімфома Беркетта, множинна мієлома, T-клітинні лімфоми, саркома Капоші, остеосаркома, епідермальні і ендотеліальні пухлини, рак підшлункової залози, легені, молочної залози, яєчника, ободової кишки, передміхурової залози, голови та шиї, шкіри (меланома), сечового міхура і нирки. Зазначені порушення включають (але, не обмежуючись тільки ними) лейкози, лімфоми, включаючи B-клітинну лімфому і неходжкінських лімфом, множинної мієломи, макроглобулінемія Вальденстрема; щільні (солідні) пухлини, включаючи саркоми, такі як остеосаркома, саркома Юінга, злоякісна меланома, аденокарцинома, включаючи аденокарциному яєчника, саркому Капоші / пухлина Капоші і пласкоклітинну карциному. Асоційоване з CD40 порушення включає також захворювання і порушення імунної системи, такі як аутоімунні порушення і запальні порушення. Такі стани включають (але, не обмежуючись тільки ними), ревматоїдний артрит (RA), системний червоний вовчак (SLE), склеродермія, синдром Шегрена, розсіяний склероз, псоріаз, запальне захворювання кишечника (наприклад, неспецифічний виразковий коліт і хвороба Крона), запалення легенів, астму та ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура (ITP). У контексті цього опису фраза "припинення росту" або "інгібування росту" відноситься до інгібування росту або проліферації клітини, перш за все клітини неопластичного типу, що 17 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресує антиген CD40. Таким чином, інгібування росту, наприклад, призводить до значного зменшення відсотка неопластичних клітин, що знаходяться на S-фазі. Поняття "внутрішньовенна інфузія" належить до інтродукції агента в вену хворого тварини або людини протягом періоду часу, що перевищує приблизно 15 хв, як правило, протягом приблизно 30-90 хв. Поняття "внутрішньовенний болюс" або "внутрішньовенний імпульс" належить до введення лікарського засобу тварини або людини таким чином, щоб лікарський засіб надходило в організм протягом приблизно 15 хв або менше, як правило, 5 хв або менше. Поняття "підшкірне введення" належить до інтродукції агента під шкіру хворого тварини або людини, переважно в кишеню між шкірою і низлежачого тканиною, шляхом відносно повільного пролонгованої введення з такого, що містить лікарський засіб резервуара. Пощипування або відтягування шкіри вгору вниз від низлежачої тканини може створювати кишеню. Поняття "підшкірна інфузія" належить до інтродукції лікарського засобу під шкіру хворого тварини або людини, переважно в кишеню між шкірою і низлежачою тканиною, шляхом відносно повільного пролонгованого введення з що містить лікарський засіб резервуара протягом періоду часу, що складає (але, не обмежуючись тільки зазначеним) 30 хв або менше або 90 хв або менше. Необов'язково інфузію можна здійснювати шляхом підшкірної імплантації насоса для введення лікарського засобу, імплантованого під шкіру хворого тварини або людини, при цьому насос забезпечує введення лікарського засобу в заздалегідь певній кількості протягом попередньо визначеного періоду часу, що складає 30 хв, 90 хв або періоду часу, відповідного тривалості схеми лікування. Поняття "підшкірний болюс" належить до введення лікарського засобу під шкіру хворого тварини або людини, при цьому тривалість введення лікарського засобу у вигляді болюсу складає менше приблизно 15 хв; в іншому об'єкті винаходу менше 5 хв, а ще в одному об'єкті винаходу протягом менше 60 с. У наступному об'єкті винаходу введення здійснюють в кишеню між шкірою і низлежачою тканиною, де кишеню можна створювати шляхом пощипування або відтягування шкіри вгору вниз від низлежачої тканини. У контексті цього опису поняття "терапевтично ефективну кількість" відноситься до кількості діючої речовини, при використанні якого відбувається ослаблення або полегшення одного або декількох симптомів порушення, що підлягає лікуванню. Діючу речовину застосовують таким чином, що в зазначеній кількості вона надає сприятливу дію на пацієнта, наприклад, дію, що виявляється у припиненні зростання або приводить до елімінації клітин. В одному з об'єктів винаходу діючу речовину, взяте в терапевтично ефективній кількості, має апоптозну активність або здатність індукувати клітинну загибель. В іншому об'єкті винаходу терапевтично ефективна кількість належить до концентрації в сироватці пацієнта, при якій, як встановлено, діюча речовина є ефективним щодо уповільнення розвитку хвороби. Ефективність можна оцінювати загальноприйнятими шляхами в залежності від що підлягає лікуванню стану. Наприклад, при неопластичних захворюваннях або порушеннях, що відрізняються присутністю клітин, які експресують CD40, ефективність можна оцінювати по часу до прогресування захворювання або за рівнями відповідей. У контексті цього опису поняття "лікування" і "терапія" і т.п. належать до терапевтичним, а також профілактичним або переважним заходам щодо захворювання або порушення, які призводять до будь клінічно важливої або сприятливої дії, включаючи (але не обмежуючись лише ними) полегшення або ослаблення одного або декількох симптомів, регрес, уповільнення або припинення розвитку захворювання або порушення. Таким чином, наприклад, під поняття "лікування" підпадає введення агента до або після початку прояву симптому захворювання або порушення, що призводить до попередження або усунення одного або декількох ознак захворювання або порушення. В іншому прикладі поняття відноситься до введення агента після клінічного прояву хвороби для боротьби з симптомами хвороби. Крім того, в контексті цього опису поняття "лікування" або "терапія" належать до введення агента після виникнення і після розвитку клінічних симптомів, де введення впливає на клінічні параметри захворювання або порушення, такі як ступінь пошкодження тканини або кількість і поширення метастазів, поза залежно від того призводить чи ні лікування до полегшення захворювання. Крім того, якщо застосування композицій, пропонованих у винаході, або індивідуально, або в поєднанні з іншим терапевтичним засобом усуває або полегшує щонайменше один з симптомів що підлягає лікуванню порушення в порівнянні з вказаним симптомом без застосування містить гуманізоване антитіло до CD40 композиції, результат слід розглядати як ефективне лікування необхідного порушення незалежно від того, відбувається чи ні полегшення всіх симптомів порушення. Поняття "листівка-вкладиш в упаковці" належить до інструкцій, які прийнято включати в 18 UA 107827 C2 5 10 15 20 призначені для продажу упаковки терапевтичних продуктів, які містять інформацію про свідчення, методи застосування, введення, протипоказання і / або запобіжні заходи при застосуванні зазначених терапевтичних продуктів. Антитіла У даному винаході описані і запропоновані гуманізовані антитіла до CD40 і композиції і одержані вироби, що містять одне або декілька гуманізованих антитіл до CD40, пропонованих в цьому винаході. Описані також агенти що зв'язують, які включають антигензв'язуючий фрагмент гуманізованого антитіла до CD40. Гуманізовані антитіла до CD40 і агенти що зв'язують можуть припиняти ріст клітин, що призводить до елімінації клітин, експресуються CD40, або іншим чином індукувати або викликати цитотоксичну або цитостатичну дію щодо клітин-мішеней. Гуманізовані антитіла до CD40 і зв'язуючі агенти можна застосовувати для лікування різних захворювань або порушень, що відрізняються проліферацією клітин, які експресують поверхневий антиген CD40. Гуманізоване антитіло до CD40 і CD40-зв'язуючий агент кожне / кожен включає область, яка специфічно розпізнає епітоп CD40 (тобто антигензв'язуючий фрагмент). При первинній оцінці відібрані мишачі антитіла на основі їх характеристик зв'язування з CD40. На етапі початкових досліджень відбирали мишачі антитіла, які мали варіабельні області важких ланцюгів, які представлені нижче в таблиці 1, варіабельні області легких ланцюгів, які представлені в таблиці 2: Таблиця 1: Мишачі "лідерні" антитіла до CD40 - послідовності VH 2H11 10F2 19B10 20E2 EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYVHWVKQRPEKGLEWIGR IDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCTTSY YVGTYGYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 1) EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVKQRPEKGLEWIGR IDPEDGDTKYDPKFQGKATMTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCTTSY YVGTYGYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO: 2) EVQLQQSGAELVRPGASVQLSCTASGFNIKDYYVHWVKQRPEKGLEWIGR IDPEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSSNTVYLHLSSLTSEDTAVYYCTTSY YVGTYGYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO: 3) EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAY ISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTALYYCARQD GYRYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 4) Таблиця 2: Мишачі "лідерні" антитіла до CD40 - послідовності VK 2H11 10F2 19B10 20E2 25 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGTSPKLWIYST SNLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRTFYPYTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO: 5) QIVLTQSPTIMSASPGEKVIITCSATSSVSYILWFQQKPGTSPKLWIYST SNLASGVPARFSGSGSGASYSLTISRMEAEDAATYYCQQRTFYPYTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO: 6) QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGTSPKLWIYST SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRTFYPYTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO: 7) DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPP KLLIYWTSTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNLQAEDLAVYYCQNDYTY PLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 8) Послідовності людських каркасних ділянок відбирали для кожного мишачого "лідерного" антитіла на основі гомології каркасних ділянок, структури CDR, консервативних канонічних залишків, консервативних залишків, що утворюють поверхню розділу, та інших параметрів. Відібрані CDR мишачих важких ланцюга і легких ланцюгів різних мишачих антитіл представлені в таблиці 3 і таблиці 4 відповідно: 19 UA 107827 C2 Таблиця 3 Послідовності CDR важких ланцюгів Позначення конструкції 2H11 10F2 19B10 20E2 5 H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 GFNIKDYYVH SEQ ID NO: 9 GFNIKDYYIH SEQ ID NO: 10 GFNIKDYYVH SEQ ID NO: 9 GFTFSDYGMH SEQ ID NO: 11 RIDPEDGDSKYAPKFQG SEQ ID NO: 12 RIDPEDGDTKYDPKFQG SEQ ID NO: 13 RIDPEDGDTKFAPKFQG SEQ ID NO: 14 YISSGNRIIYYADTVKG SEQ ID NO: 15 SYYVGTYGY SEQ ID NO: 16 SYYVGTYGY SEQ ID NO: 16 SYYVGTYGY SEQ ID NO: 16 QDGYRYAMDY SEQ ID NO: 17 Представлені вище послідовності H-CDR1 визначені згідно з номенклатурою Хотіа (AlLazikani та ін, JMB 273, 1997, сс. 927-948). Послідовності CDR1 і CDR2, визначені згідно з номенклатурою Кебота виділені жирним шрифтом та курсивом, а залишки, визначені згідно з номенклатурою IMGT, підкреслені у зазначеній вище таблиці. Послідовності H-CDR3 для кожного з антитіл 2H11, 10F2 і 19B10 являє собою TTSYYVGTYGY (SEQ ID NO: 77), а для 20E2 являє собою ARQDGYRYAMDY (SEQ ID NO: 78). Таблиця 4 Послідовності CDR легких ланцюгів Позначення конструкції 2H11 10F2 19B10 20E2 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3 SASSSVSYML SEQ ID NO: 18 SATSSVSYIL SEQ ID NO: 19 SASSSVSYML SEQ ID NO: 20 KSSQSLLNSGNQKNYLT SEQ ID NO: 21 STSNLAS SEQ ID NO: 22 STSNLAS SEQ ID NO: 22 STSNLAS SEQ ID NO: 22 WTSTRES SEQ ID NO: 23 QQRTFYPYT SEQ ID NO: 24 QQRTFYPYT SEQ ID NO: 24 QQRTFYPYT SEQ ID NO: 24 QNDYTYPLT SEQ ID NO: 25 10 15 20 І в цьому випадку також у таблиці 4 застосовували номенклатуру Хотіа, при цьому послідовності, визначені згідно з номенклатурою Кебота, виділені жирним шрифтом та курсивом, а певні згідно з номенклатурою IMGT, підкреслені. Fab-фрагменти, для яких виявлено покращене або еквівалентне зв'язування в порівнянні з химерним батьківським Fab-фрагментом, відбирали для конверсії в IgG. Клони з 20E2-серій перетворювали на два різних формату IgG: a) IgG4DM (подвійний мутанат (double mutant)) мав дві мутації в Fc / шарнірній області, а саме, мутацію Ser228Pro, яка призводить до зниження утворення половинок молекул, і мутацію Leu235Glu, яка додатково знижує зв'язування FcγR. б) IgG1KO ("вимкнення" (knock-out) ефекторних функцій) мав дві мутації в Fc-області, а саме, Leu234Ala і Leu235Ala, які знижують ефекторних функцію, таку як зв'язування FcγR і комплементу. Обидва формати IgG описані в літературі. У прикладі 1 більш докладно описана гуманізація трьох антитіл-"кандидатів". В результаті здійснення вказаної гуманізації вдалося створити послідовності гуманізованих антитіл, послідовності легких і важких ланцюгів яких представлені нижче: 25 Позначення Антитіло A (легкий ланцюг) Послідовність SEQ ID NO: DIVMTQSPDSLAVSLGERATMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTW HQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIKRtvaapsvfi 26 fppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgn sqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthq glsspvtksfnrgec 20 UA 107827 C2 Позначення Послідовність SEQ ID NO: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSSastk gpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsga Антитіло A ltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvn (важкий ланцюг, hkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfp 27 IgG1KO) pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevh naktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnk alpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltc lvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSSastk gpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsga ltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvn Антитіло A (важкий hkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeLLggpsvflfp 28 ланцюг, IgG1) pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevh naktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnk alpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltc lvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSSastk gpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsga ltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvd Антитіло A (важкий hkpsntkvdkrveskygppcppcpapefeggpsvflfppkp 29 ланцюг, IgG4DM) kdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnak tkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglp ssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvk gfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrlt vdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk evqlvesggglvkpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqap gkglewvayissgnriiyyadtvkgrftisrdnaknslylq mnslraedtalyycarqdgyryamdywaqgtlvtvssastk gpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsga ltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvn Антитіло A (важкий hkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfp ланцюг, IgG1KOb) pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevh naktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnk alpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltc lvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTINCKSSQSLLNSGNQKNYL TWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFT Антитіло B (легкий LTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIKRtva ланцюг) apsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkv dnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekh kvyacevthqglsspvtksfnrgec 21 30 31 UA 107827 C2 Позначення Послідовність SEQ ID NO: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSSastk gpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsga ltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvn Антитіло B (важкий hkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfp 32 ланцюг, IgG1KO) pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevh naktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnk alpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltc lvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSSastk gpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsga ltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvn Антитіло B (важкий hkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeLLggpsvflfp ланцюг, IgG1) pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevh naktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnk alpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltc lvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSSastk gpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsga ltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvd Антитіло B (важкий hkpsntkvdkrveskygppcppcpapefeggpsvflfppkp ланцюг, IgG4 DM) kdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnak tkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglp ssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvk gfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrlt vdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk evqlvesggglvkpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqap gkglewvayissgnriiyyadtvkgrftisrdnaknslylq mnslraedtavyycarqdgyryamdywgqgtlvtvssastk gpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsga ltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvn Антитіло B (важкий hkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfp ланцюг, IgG1KOb) pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevh naktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnk alpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltc lvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk Антитіло ланцюг) C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQ QKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIKRt (легкий vaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreak vqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltl skadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec 22 33 34 35 36 UA 107827 C2 Позначення Послідовність SEQ ID NO: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAP GQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYME LSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSSastkg psvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgal tsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnh Антитіло C (важкий kpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfpp 37 ланцюг, IgG1KO) kpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhn aktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnka lpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltcl vkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysk ltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAP GQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYME LSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSSastkg psvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgal tsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnh Антитіло C (важкий kpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeLLggpsvflfpp ланцюг, IgG1) kpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhn aktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnka lpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltcl vkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysk ltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAP GQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYME LSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSSastkg psvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgal tsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdh Антитіло C (важкий kpsntkvdkrveskygppcppcpapefeggpsvflfppkpk ланцюг, IgG4 DM) dtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnakt kpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglps siektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkg fypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltv dksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgfnikdyyvhwvkqap gqglewmgridpedgdskyapkfqgkatmtadtststvyme lsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgtlvtvssastkg psvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgal tsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnh Антитіло C (важкий kpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfpp ланцюг, IgG1KOb) kpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhn aktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnka lpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltcl vkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysk ltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk 5 10 38 39 40 Згідно конкретних варіантів здійснення винаходу антигензв'язуючий фрагмент може, наприклад, блокувати проліферацію або іншим чином припиняти ріст клітин або викликати їх виснаження, загибель, елімінувати їх іншим шляхом, наприклад, за допомогою зв'язування з поверхневим антигеном CD40. Наприклад, при T-і B-клітинних злоякісних захворюваннях частим результатом є протипухлинні впливи (наприклад, припинення росту з елімінацією або апоптозом клітин або без них), коли злоякісні клітини піддають дії стимулів, які призводять до активації здорових лімфоцитів. Це припинення індукованого активацією зростання виявлено у присутності сигналів, що проходять або через рецептори антигенів, або через костимулюючі рецептори (див., наприклад, Ashwell та ін, Science 237, 1987, с. 61; Bridges та ін, J. Immunol. 139, 1987, с. 4242; Page й Defranco, J. Immunol. 140, 1988, с. 3717; та Beckwith та ін, J. Natl. Cancer 23 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Inst. 82, 1990, с. 501). Стимуляція CD40 в результаті специфічного зв'язування або з антитілом, або з розчинним лігандом інгібує ріст B-клітинної лімфоми (див., наприклад, Funakoshi та ін, Blood 83, 1994, сс. 2787-2794). Агенти, які таким чином інгібують ріст злоякісних клітин і безпосередній мішенню яких є поверхневий антиген CD40, є прикладами придатних агентів. CD40-специфічні агенти включають антигензв'язуючий фрагмент гуманізованого антитіла до CD40, яке зв'язується з CD40 (наприклад, людським CD40 або його варіантом). CD40специфічні агенти і антитіла необов'язково можна кон'югувати або зливати з цитотоксичним або хіміотерапевтичним засобом. У тих об'єктах винаходи, в яких гуманізоване антитіло зв'язується з поверхневим антигеном CD40 і викликає виснаження експресують CD40 типів клітин, зв'язування, як правило, відрізняється хомінг до несучої поверхневий антиген CD40 клітині in vivo. Прийнятні зв'язуючі агенти, які зв'язуються з антигеном CD40 з достатньою аффінністю і / або авідністю, наприклад, CD40-специфічний агент, можна застосовувати в якості терапевтичного засобу шляхом специфічного спрямованого переносу до клітини, що експресує антиген. У деяких об'єктах винаходу гуманізоване антитіло зменшує зв'язування ліганда CD40 з CD40 щонайменше на 45 %, щонайменше на 50 %, щонайменше на 60 % або щонайменше на 75 % або щонайменше на 80 %, або по меншій мірі на 90 %, або щонайменше на 95 %. У деяких варіантах здійснення винаходу гуманізовані антитіла до CD40, включаючи їх антигензв'язуючі фрагменти, такі як варіабельні області важких і легких ланцюгів, містять амінокислотну послідовність, яка включає залишки, одержані з CDR антитіла A (послідовність важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29 або SEQ ID NO: 30; послідовність легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 26), антитіла B (послідовність важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34 або SEQ ID NO: 35; послідовність легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 31) і антитіла C (послідовність важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 або SEQ ID NO: 40; послідовність легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 36), які описані вище, і амінокислотні залишки, одержані з каркасних ділянок людського імуноглобуліну. Гуманізовані антитіла до CD40 необов'язково включають специфічні амінокислотні заміни в консенсусних каркасних ділянках або каркасних ділянках зародкової лінії. Специфічна заміна амінокислотних залишків у цих каркасних ділянках може покращувати різні аспекти дії антитіл, такі як афінність зв'язування і / або стабільність, в порівнянні з встановленими у гуманізованих антитіл, отриманих шляхом «безпосереднього обміну" CDR або HVL на каркасні ділянки людської зародкової лінії, що продемонстровано нижче в прикладах. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є інші моноклональні антитіла, послідовності важких ланцюгів (VH) яких представлені в SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 4, а послідовності легких ланцюгів (VL) яких представлені в SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 8 (див. вище таблиці 1 і 2). CDR-послідовності цих мишачих антитіл представлені в таблицях 3 і 4, інтродукція зазначених CDR в FR людських консенсусних варіабельних областей важких і легких ланцюгів може призводити до отримання прийнятних гуманізованих антитіл, пропонованих в цьому винаході. У деяких конкретних варіантах здійснення винаходу гуманізовані антитіла до CD40, представлені в цьому описі, містять щонайменше варіабельну область важкого або легкого ланцюга, що містить CDR або HVL мишачих моноклональних антитіл, представлених вище в таблицях 1-4, та FR варіабельних областей важких і легких ланцюгів людської зародкової лінії. У наведених як приклад варіантах здійснення винаходу створені гуманізовані антитіла являють собою: антитіло A, антитіло B і антитіло C і їх різні послідовності важких і легких ланцюгів, які наведені в SEQ ID NO: 26-SEQ ID NO: 40. Конкретними варіантами здійснення винаходу є антитіла, які мають послідовність важкого ланцюга, представлену в будь-якій з SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 або SEQ ID NO: 30, в поєднанні з послідовністю легкого ланцюга, представленої в SEQ ID NO: 26. В іншому варіанті антитіла мають послідовність важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 або SEQ ID NO: 35, в поєднанні з послідовністю легкого ланцюга, представленої в SEQ ID NO: 31. Додатковими варіантами здійснення винаходу є гуманізовані антитіла, які мають послідовність важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 або SEQ ID NO: 40, в поєднанні з послідовністю легкого ланцюга, представленої в SEQ ID NO: 36. CDR зазначених послідовностей наведені в таблицях 3 і 4. У конкретних варіантах здійснення винаходу мається на увазі, що химерні антитіла із замінами CDR-ділянок (тобто наприклад, заміна одного або двох CDR в антитілі A на аналогічні CDR з антитіла C) між цими наведеними в якості прикладів імуноглобулінами, можуть призводити до отримання придатних 24 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіл. У конкретних варіантах здійснення винаходу гуманізоване антитіло до CD40 являє собою фрагмент антитіла. Різні фрагменти антитіл в цілому описані вище, а також описано методи, розроблені для отримання фрагментів антитіл. Фрагменти можна отримувати шляхом протеолітичного розщеплення інтактних антитіл (див., наприклад, Morimoto та ін, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 1992, сс. 107-117 і Brennan та ін, Science 229, 1985, с. 81). В альтернативному варіанті фрагменти можна отримувати безпосередньо в рекомбінантних клітинах-господарях. Наприклад, Fab'-SH-фрагменти можна виділяти безпосередньо з E. coli і хімічно зшивати з отриманням F (ab ') 2-фрагментів (див., наприклад, Carter та ін, Bio / Technology 10, 1992, сс. 163-167). Згідно з іншим підходом F (ab ') 2-фрагменти можна виділяти безпосередньо з культури рекомбінантної клітини-господаря. Інші методики отримання фрагментів антитіл повинні бути очевидні фахівцеві в даній галузі. До конкретних варіантів здійснення винаходу належить F (ab ') 2-фрагмент гуманізованого антитіла до CD40, який має послідовність важкого ланцюга, представлену в будь-якій з SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 або SEQ ID NO: 30, в поєднанні з послідовністю легкого ланцюга, представленої в SEQ ID NO: 26. Іншим варіантом є антитіла, які мають послідовність важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 або SEQ ID NO: 35, в поєднанні з послідовністю легкого ланцюга, представленої в SEQ ID NO: 31. Додатковими варіантами здійснення винаходу є гуманізовані антитіла, які мають послідовність важкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 або SEQ ID NO: 40, в поєднанні з послідовністю легкого ланцюга, представленої в SEQ ID NO: 36. Зазначені варіанти здійснення винаходу можуть включати інтактне антитіло, що містить зазначені F (ab ') 2-фрагменти. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло або фрагмент антитіла включає константну область, яка опосередковує ефекторну функцію. Константна область може опосередковувати відповіді, що представляють собою антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (ADCC), антитіло-обумовлений клітинний фагоцитоз (ADCP) та / або комплементзалежну цитотоксичність (CDC) щодо експресуючої CD40 клітини-мішені. Ефекторний (і) домен (и) може (можуть) являти собою, наприклад, Fc-область молекули Ig. Як правило, CD40-зв'язуючий агент рекрутує і / або активує цитотоксичні лейкоцити крові (наприклад, природні клітини-кілери (NK), фагоцитарні клітини (наприклад, макрофаги) і / або сироваткові компоненти системи комплементу). Ефекторний домен антитіла можна одержувати з організму будь-яких прийнятних видів хребетних тварин і будь-яких ізотипів. Ізотипи з організму різних видів тварин відрізняються за здатністю опосередковувати ефекторні функції. Наприклад, здатність людського імуноглобуліну опосередковувати CDC і ADCC / ADCP, як правило, відповідає наступному порядку IgM≈IgG1≈IgG3>IgG2>IgG4 і IgG1≈IgG3>IgG2/IgM/IgG4 відповідно. Здатність мишачих імуноглобулінів опосередковувати CDC і ADCC / ADCP, як правило, відповідає наступному порядку: мишачий IgM≈IgG3>>IgG2b>IgG2a>>IgG1 і IgG2b>IgG2a>IgG1>>IgG3 відповідно. В іншому прикладі мишачий IgG2a опосередковує ADCC, а мишачий IgG2a і IgM опосередковує CDC. Модифікації антитіл Гуманізовані антитіла до CD40 і агенти можуть включати модифікації гуманізованого антитіла до CD40 або його антигензв'язуючого фрагмента. Наприклад, може вимагатися модифікувати антитіло щодо його ефекторної функції, підвищуючи тим самим ефективність антитіла при лікуванні раку. Однією такою модифікацією є інтродукція залишку (ів) цистеїну в Fc-область, що призводить до утворення в цій області дисульфідного зв'язку між ланцюгами. Отримане таким чином гомодимерне антитіло може мати поліпшену здатність до інтерналізації та / або підвищену комплементзалежну цитотоксичність і антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (ADCC) (див. Caron та ін., J. Exp. Med., 176, 1992, сс. 1191-1195 і Shopes, J. Immunol., 148, 1992, сс. 2918-2922). Гомодимерні антитіла з підвищеною протипухлинною активністю можна отримувати також з використанням гетеробіфункціональних перехрестнозшиваючих лінкерів, згідно з методикою, описаною у Wolff та ін, Cancer Research, 53, 1993, сс. 2560-2565. В іншому варіанті можна сконструювати антитіло, яке має подвійну кількість Fc-областей, завдяки чому воно може мати підвищену здатність до залежного від комплементу лізису і ADCC (див. Stevenson та ін, Ant-Cancer Drug Design, 3, 1989, сс. 219-230). Антитіла з підвищеною здатністю підтримувати ADCC отримували шляхом модифікації схеми глікозилювання їх Fc-області. Це є можливим, оскільки глікозилювання антитіла на залишку аспарагіну, N297, в CH2-домені бере участь у взаємодії між IgG і Fcγ-рецепторами, що необхідно для ADCC. Конструювали лінії клітин-господарів для експресії антитіл із зміненим глікозилювання, наприклад, з підвищеним рівнем бере участь в утворенні бісекціонной 25 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 структури N-ацетилглюкозамін або зниженим рівнем фукози. Підвищений рівень фукози забезпечує більш значне підвищення ADCC-активності, ніж збільшення рівня бере участь в утворенні бісекційної структури N-ацетилглюкозамін. Крім того, підвищена ADCC-активність антитіл з низьким рівнем фукози не залежить від V / F-поліморфізму FcγRIIIa. Модифікація амінокислотної послідовності Fc-області антитіл є альтернативою глікозилювання відносно підвищення ADCC-активності. Сайт зв'язування на людському IgG1 Fcγ-рецепторів був визначений за допомогою розширеного аналізу мутацій. Це дозволило створювати гуманізовані антитіла ізотипу IgG1 з мутаціями в Fc-області, які підвищували афінність зв'язування з FcγRIIIa і посилювали ADCC-активність in vitro. Крім того, отримували варіанти Fc з численними різними пермутації здатності до зв'язування, наприклад, з підвищеною здатністю до зв'язування зі специфічними FcγR-рецепторами, але з незміненою або зниженою здатністю до зв'язування з іншими FcγR-рецепторами. Іншим об'єктом винаходу є імунокон'югати, що містять гуманізоване антитіло або його фрагмент, кон'югованого / кон'югований з цитотоксичним агентом, таким як хіміотерапевтичний засіб, токсин (наприклад, має ферментативну активність токсин бактеріального, грибного, рослинного або тваринного походження або їх фрагменти) або радіоактивний ізотоп (т. тобто радіокон'югат). Хіміотерапевтичні засоби, які можна застосовувати для отримання таких імунокон'югатів, описані вище. Мають ферментативну активність токсини та їх фрагменти, які можна застосовувати, включають ланцюг A дифтерійного токсину, незвязуючі активні фрагменти дифтерійного токсину, ланцюг A екзотоксину (із Pseudomonas aeruginosa), ланцюг A рицину, ланцюг A абріна, ланцюг A модецціна, альфа-сарцини, білки Aleurites fordii, білки діантину, білки Phytolaca americana (PAPI, PAPII і PAP-S), інгібітор із Momordica charantia, курцин, кротин, інгібітор із Sapaonaria officinalis, гелонін, мітогеллін, рестріктоцін, феноміцін, еноміцін, трікотецени і т.п. Для отримання радіокон'югатов гуманізованих антитіл до CD40 можна 212 131 131 90 186 застосовувати різні радіонукліди. Їх прикладами є Bi, I, In, Y і Re. Кон'югати гуманізованого антитіла до CD40 і цитотоксичного або хіміотерапевтичного засобу можна отримувати відомими методами, з використанням цілого ряду біфункціональних зв'язуючих білки агентів, таких як N-сукцініміди-3-(2-піріділдітіол) пропіонат (SPDP), імінотіолан (IT), біфункціональні похідні складних імідоефірів (такі як диметіладіпімідат • HCl), активні складні ефіри (такі як дисукцініміділсуберат), альдегіди (такі як глутаровий альдегід), бісазідосполуки (такі як біс (пара-азидобензоіл)гександіамін), похідні бісдіазонію (такі як біс (пара-діазонійбензоіл) етилендіамін), діїзоцианата (такі як толуол-2,6-діїзоцианат) і біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-діфтор-2,4-динітробензолу). Наприклад, іммунотоксін рицину можна отримувати згідно методу, описаного у Vitetta та ін, Science, 238, 1987, с. 1098). Мічена за допомогою С14 кислота (MX-DTPA) є прикладом хелатуючих агентів для кон'югації радіонуклеотиду з антитілом. Кон'югати можна отримувати також з використанням лінкера, що розщеплюється. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло можна кон'югувати з "рецептором" (таким як стрептавідін) для використання в попередньому направленому перенесенні в пухлину. При здійсненні цієї процедури кон'югат антитіло-рецептор вводять пацієнту з подальшим видаленням незв'язаного кон'югату з кровотоку за допомогою агента для кліренсу і потім вводять "ліганд" (наприклад, авідин), кон'югований з цитотоксичним агентом (наприклад, радіонуклеотидом). На основі гуманізуваного антитіла до CD40, представлених в цьому описі, можна готувати форми типу іммуноліпосом. Ліпосоми, що містять антитіло одержують за допомогою добре відомих в даній області методів, наприклад, описаних у Epstein та ін, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 82, 1995, с. 3688; Hwang та ін, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 77, 1980, с. 4030; US 4485045 та 4544545. Ліпосоми з подовженим часом життя в кровотоку описані в US 5013556. Найбільш переважні ліпосоми можна отримувати методом упарювання з оберненою фазою з використанням ліпідної композиції, що включає фосфатидилхолін, холестерин і деріватизований за допомогою ПЕГ фосфатидилетаноламін (ПЕГ-ФЕ). Ліпосоми екструдують через фільтри з певним розміром пор, отримуючи ліпосоми необхідного діаметра. Fab'фрагменти антитіла, пропонованого в цьому винаході, можна включати в ліпосоми згідно методу, описаного у Martin і ін, J. Biol. Che., 257, 1982, сс. 286-288, за допомогою реакції утворення дисульфідного зв'язку. У ліпосоми необов'язково можна включати хіміотерапевтичний агент (такий як доксорубіцин) (див. Gabizon та ін, J. National Cancer Inst., 81 (19), 1989, с. 1484). Антитіла, пропоновані у винаході та представлені в цьому описі, можна застосовувати в ADEPT (процедури на основі антитіло-направленого ферменту пролыкарської терапії) шляхом 26 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кон'югації антитіла з активуючим проліки ферментом, який перетворює проліки (наприклад, пептідильний хіміотерапевтичний агент) в активний протираковий лікарський засіб (див., наприклад, WO 81/01145, WO 88/07378 і US 4975278). Компонент імунокон'югата, що представляє собою фермент, який можна застосовувати в ADEPT, може включати будь-який фермент, який має здатність надавати такий вплив на проліки, в результаті якого вони перетворюється в більш активну цитотоксичну форму. Конкретні ферменти, які можна застосовувати в ADEPT, включають (але, не обмежуючись тільки ними) лужну фосфатазу, що може перетворювати що містять фосфат проліків у вільні лікарські субстанції; арилсульфатазу, що може перетворювати містять сульфат проліків у вільні лікарські субстанції; цітозіндеаміназу, що може перетворювати нетоксичний 5-Фторцітозін в протиракову лікарську субстанцію 5фторурацил; протеази, такі як протеїназ Serratia, термолізін, субтілізін, карбоксипептидази і катепсинів (такі як катепсини B і L), які можна застосовувати для перетворення містять пептид проліків у вільні лікарські субстанції; D-аланілкарбоксіпептідази, які можуть перетворювати проліки, що містять D-амінокислотні заступники; розщеплюють вуглеводи ферменти, такі як βгалактозидаза і нейрамінідазу, які можна застосовувати для перетворення глікозильованих проліків у вільні лікарські субстанції; β-лактамазу, яку можна застосовувати для перетворення проліків, деріватизованих β-лактамами, у вільні лікарські субстанції; та амідази пеніциліну, такі як амідаза пеніциліну V або амідазу пеніциліну G, які можна застосовувати для перетворення лікарських субстанцій, деріватизованих по азоту аміну феноксіацетильної або фенілацетильної групами, відповідно, у вільні лікарські субстанції. В іншому варіанті можна застосовувати антитіла з ферментативною активністю ("абзими") для перетворення проліків у вільні активні лікарські субстанції (див., наприклад, Massey, Nature 328, 1987, сс. 457-458). Кон'югати антитілоабзими можна отримувати за допомогою відомих в даній області методів, призначених для введення абзими в популяцію пухлинних клітин, наприклад, шляхом ковалентного зв'язування ферменту з гуманізованим антитілом до CD40/гетеробіфункціональними перехреснозшиваючими реагентами, які описані вище. В іншому варіанті злиті білки, які містять щонайменше антигензв'язуючий центр антитіла, зчеплений щонайменше з функціонально активною областю ферменту, представленого в цьому описі, можна конструювати з використанням методу рекомбінантної ДНК (див., наприклад, Neuberger та ін, Nature 312, 1984, сс. 604-608). У конкретних варіантах здійснення винаходу може вимагатися застосування фрагмента гуманізованого антитіла до CD40 замість інтактного антитіла, наприклад, для підвищення здатності проникати в пухлину. Може знадобитися модифікувати фрагмент антитіла для подовження часу напівжиття в сироватці. Для цієї мети можна, наприклад, включати зв'язується з рецептором епітоп-«рятувальник" в фрагмент антитіла. Відповідно до одного з методів відповідну область антитіла можна змінювати (наприклад, піддавати мутації) або епітоп можна вбудовувати в пептидну позначку, яку потім зливають з фрагментом антитіла на будь-якому кінці або в середині, наприклад, з використанням ДНК або пептидного синтезу (див., наприклад, WO 96/32478). В інших варіантах здійснення винаходу можна застосовувати також ковалентні модифікації гуманізованого антитіла до CD40. Ковалентні модифікації включають модифікацію цистеінільних залишків, гістідільних залишків, лізінільних і амінокінцевих залишків, аргінільних залишків, тірозільних залишків, карбоксильних бічних груп (аспартам або глутаміл), глутамінільних і аспарагінільних залишків, або серільних, або треонільних залишків. Інший тип ковалентної модифікації включає хімічне або ферментативне зшивання глікозидів з антитілом. Зазначені модифікації можна здійснювати за допомогою хімічного синтезу або шляхом ферментативного або хімічного розщеплення антитіла, якщо це можливо. Для інтродукції інших типів ковалентних модифікацій в молекулу антитіла можна застосовувати взаємодію мічених амінокислотних залишків антитіла з органічним дериватизуючим агентом, який може взаємодіяти з вибраними бічними ланцюгами або амінокінцевими або карбоксікінцевими залишками. Видалення будь-яких вуглеводних фрагментів, присутніх на антитілі, можна здійснювати хімічним або ферментативним шляхом. Хімічне деглікозилювання описано у Hakimuddin та ін, Arch. Biochem. Biophys. 259, 1987, с. 52 і у Edge і ін, Anal. Biochem., 118, 1981, с. 131. Ферментативне відщеплення вуглеводних фрагментів на антитіла можна здійснювати за допомогою ендо-та екзоглікозидаз згідно методу, описаного у Thotakura та ін, Meth. Enzymol., 138, 1987, с. 350. Інший тип придатної ковалентної модифікації передбачає зв'язування антитіла з одним з численних небілкових полімерів, таких, наприклад, як поліетиленгліколь (ПЕГ), поліпропіленгліколь або поліоксіалкілени, за допомогою методів, описаних в одному або 27 UA 107827 C2 5 10 15 20 25 30 35 декількох US 4640835, US 4496689, US 4301144, US 4670417, US 4791192 і US 4179337. Гуманізація і варіанти амінокислотної послідовності Варіанти амінокислотної послідовності антитіла до CD40 можна повчати шляхом інтродукції відповідних нуклеотидних змін в ДНК антитіла до CD40 або за допомогою пептидного синтезу. Зазначені варіанти включають, наприклад, делеції та / або інсерції і / або заміни залишків у амінокислотних послідовностях антитіл до CD40, представлених в якості прикладу в цьому описі. Для отримання кінцевої конструкції застосовують будь-яку комбінацію делецій, інсерцій і замін за умови, що кінцева конструкція володіє необхідними характеристиками. Амінокислотні зміни можуть також змінювати пост-трансляційний процесинг гуманізованого антитіла до CD40 або його варіанту, наприклад, зміна кількості або положення сайтів глікозилювання. Придатним методом ідентифікації конкретних залишків або областей в антитіла до CD40, які являють собою переважні сайти для мутагенезу, є так званий "аланін-скануючий мутагенез", описаний у Cunningham і Wells, Science, 244, 1989, сс. 1081-1085). З його допомогою ідентифікують залишок або групу залишків-мішеней (наприклад, заряджені залишки, такі як arg, asp, his, lys і glu) і замінюють на нейтральну або негативно заряджену амінокислоту (як правило, на аланін) для впливу на взаємодію амінокислот з антигеном CD40. Ті положення амінокислот, для яких продемонстрована функціональначутливість до замін, потім вдосконалять шляхом інтродукції додаткових або інших варіантів в сайти заміни або сайтів заміни. При цьому, хоча сайт для інтродукції варіації амінокислотної послідовності є зумовленим, природа самої мутації не є визначеною. Наприклад, для аналізу ефективності мутації в розглянутому сайті здійснюють сканування аланіном або неспецифічний мутагенез кодону-мішені або області-мішені і отримані в результаті експресії варіанти антитіла до CD40 піддають скринінгу щодо необхідної активності. Інсерції в амінокислотну послідовність включають аміно-і / або карбоксикінцеві злиття різної довжини від одного залишку до поліпептидів, які містять сто чи більшу кількість залишків, а також інсерції всередину послідовності одного або декількох амінокислотних залишків. Прикладами кінцевих інсерцій є антитіло до CD40, злиток з епітопом-міткою. Інші інсерційні варіанти молекули антитіла до CD40 включають злиття з N-або C-кінцем антитіла до CD40 ферменту або поліпептиду, який збільшує час напівжиття антитіла в сироватці. Іншим типом варіанту є варіант, що включає амінокислотну заміну. У цих варіантах щонайменше один амінокислотний залишок в молекулі антитіла до CD40 видалений, а інший залишок вбудований на його місце. Представляючими найбільший інтерес сайтами для мутагенезу шляхом замін є гіперваріабельні ділянки, але можна здійснювати також зміни в FR. Консервативні заміни представлені в таблиці 5 під назвою "переважні заміни". Якщо такі заміни приводять до зміни біологічної активності, то можна інтродуціювати більш істотні заміни, позначені як "Приклади замін", або інші заміни, описані нижче при посиланні на клас амінокислот, і потім продукти можна піддавати скринінгу. Таблиця 5 Вихідний залишок Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) Ile (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Приклади замін Val; Leu; Ile Lys; Gln; Asn Gln; His; Asp; Lys; Arg Glu; Ser; Ala Asn; Glu Asp; Gln Ala Asn; Gln; Lys; Arg Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe Arg; Phe; Ile Leu; Phe; Ile Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Ala Thr Ser 40 28 Бажані заміни Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu Ile Arg Leu Tyr Ala Thr Ser