Спосіб одержання еритропоетину людини

Изобретение относится к генетической инженерии и косается получения рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих гены эритропоэтэна человека, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии указанных генов и получения in vitro активного человеческого эритропоэтина. Целью изобретения является повышение активности эритропоэтина. Способ, описанный в данной заявке, раскрывает массовое производство белков, проявляющих биологическую активность человеческого ЭПО. При этом возможно получать белки, которые химически отличаются от аутентичного человеческого ЭПО, но проявляют свойства характерные для него и в некоторых случая х даже улучшенные, Настоящее изобретение касается клонирования гена, кодирующего ЭПО, и его экспрессии in vitro. Описаны пригодные векторы экспрессии клетки, трансформированные рекомбинантными плазмидными ДНК, кодирующими ЭПО, а также схема очистки ЭПО. Способ состоит в том, что предварительно ЭПО подвергают очистке до гомогенности и переваривают трипсином. Эти фрагменты очищают и определяют нуклеотидную последовательность ЭПО. Синтезируют олигонуклеотиды, зная эти последовательности. Олигонуклеотиды используют для скрининга человеческой геномной библиотеки, из которой ген выделяют ген ЭПО. Получают кДНК-библиотеку печени плода человека и подвергают ее скринингу. Получают три клона кДНК ЭПО (после скрининга > 750000 рекомбинантов). Два из этих трех клонов имеют полную длину. Эти кДНК клонируют в вектор экспрессии, трансформируют ими клетки вируса SV-40 обезьяны (клеточная линия COS-1), а также клетки яичника китайского хомячка (клеточная линия СНО). ЭПО, полученный из клеток COS, является биологически активными ЭПО In vitro и in vivo. ЭПО, полученный из клеток СНО, также биологически активен in vitro и in vi vo. кДНК-клон ЭПО имеет открытую рамку считывания из 14-15 аминокислот (аа) с ини-ациатором и терминатором из 20-30 нукле-отидов (ht) ввер х по направлению кодирующей области. Образец E.сoli, трансформированный клонированным геном ЭПО, депонирован в American Type Culture Colletction. Rock ville. Maryland, под номером АТСС 40153. Основные этапы способа состоят в следующем. Выделение геномного клона человеческого ЭЛО. 1. Человеческий ЭПО очищают до гомогенности из мочи пациентов, страдающих апластической анемией. Полное переваривание этого очищенного ЭПО трипсином протеазы дало фрагменты, которые разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией совращенной фазой, подвергают секвенированию (см. табл. 2 и 3). Две из аминокислотных последовательностей Val-Ash-Phe-Tyr-Aia-TrpLyy и Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, выбирают для конструирования олигонуклеотидных зондов. Олигонуклеотиды используют для скрининга человеческой геномной ДНК-библиотеки в векторе Ch4A. Фаг, гибридизирующий к 17 мег, отбирают распределяют на малые группы и гиб-ридизуют с 14 мег и 18 мег пулами. Фаг, гибридизирующий к 17 мег. 18 мег и 14 мег пулам, очищают от пятен, а фрагменты субклонируют в векторы Μ13 для секвенирова-ния путем дидезоксиметода, и получают два клона А-НРОІи АНЕРО 2. 2. Выделение клонов кДНК ЭПО, Northern анализ сыворотки плода теленка (возраст 20 недель) печеночной мРНК осуществляют с использованием 95 nt од-нонитиевого зонда, полученного из клона М13, содержащего участок 87 Ьр экзона, описанного в табл. 1. Далее мРН К ЭПО идентифицируют с использованием того же зонда для скрининга λ-кДНК библиотеки бактериофага мРНК сыворотки плода теленка. Несколько гибридизирующих клонов получают с частотой приблизительно 1 положительный на 250000 подвергнутых скрининг у рекомбинантов. Полная нуклеотидная и аминокислотная последовательности для этих mohob(A-HEPOF L13 и к -HEPOF L8) представлены в табл. 5 и 6. 3. Структура и последовательность гена ЭПО человека. Гибридизированный анализ этих клонированных ДНК при помощи олигонуклеотидных зондов и различных зондов позволил определить положение гена ЭПО внутри приблизительно3,3 кб области. Полный анализ секвенирования этой области и сравнение с клонами кДНК приводят к получению карты интронной и экзон-ной структуры гена ЭПО. Ген ЭПО имеет 5 экзонов. Часть экзона I, полныеэкзоны И, III и IV, а также экзон V содержит кодирующую белок информацию. Оставшиеся части экзонов I и V кодируют 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности. 4. Неустойчивая экспрессия ЭПО в клетках COS. Вектор р9 1023/В/ содержит основной поздний промотор аденовируса, последовательность полиаденелировзния SV40, SV40 - начало репликации, ген-усилитель SV40 и ген VA аденовируса. Вставку хДНК из X-HEPOR L13 встраивают в вектор р91023 и получают рекомбинантную плазмидную ДНК pPTF-L13, Полученный ДНКтрансфек-тируют штамм Мб клеток COS_1, клетки промывают, переносят в среды, не содержащие сыворотку, клетки собирают через 48 ч, С использованием количественного радиоиммунного анализа исследуют уровень экспрессии ЭПО в культуральную надосадочную жидкость. Вэктор, содержащий кДНК ЭПО из A-HEPOF L13, трансфектируют в клетки COS-1. Наличие ЭПО в культуральной среде определяют с помощью 3Н-тримидин и CFU-E методом или любым из двух анализов in vivo, а именно гипоксическая мышь и голодающая крыса. Эти результаты показывают, что биологически активный ЭПО продуцируется в клетках COS-1. Было установлено, что ЭПО, продуцируемый клетками COS, имеет подвижность на SDS-полиакриламидном геле, которая идентична подвижности нативного ЭПО, полученного из человеческой мочи. Различные векторы, содержащие другие промоторы, также могут быть использованы в клетках COS или в других млекопитающих или зукариотических клетках. Примеры зтих иных промоторов, которые могут быть использованы в заявленном способе, включают ранние и поздние промоторы SV40, генный промотор металлотеонина мыши, промотор, обнаруживаемый в длинных концевых повторах ретровирусов птиц или млекопитающих, полиэдральный генный промотор бакуловируса и другие. Примерами штаммовреципиентов, которые могут использоваться в заявленном способе, являются E.coli, дрожжи клетки млекопитающих, такие как СНО (яичник китайского хомячка), С127 (эпителий обезьяны), ЗТЗ (мышиный фибробласт), CV-1 (почка африканской зеленой мартышки) и клетки насекомых такие, как клетки от Spodoptera trugiperda и Drosophila metanogaster. Эти промоторы и типы клеток могут обеспечить возможность регулирования уровня экспрессии ЭПО. Вирус ядерного полиэдроза имеет геном двунитевой кольцевой ДНК размером 128 кб, Нуклеокапсид вируса имеет палочковидную форму и находится упакованным в двух формах. Эти вирусы могут быть обычным путем размножены в культуре клеток насекомых. Среды для культивирования этих клеток - это обычно питательный солевой раствор и 10%-ная фетальная телячья сыворотка. In vitro, вирусный рост инициируется, когда неокклюдированный вирус (НОВ) входит в клатку и продвигается к ядру, где он реплицируется. Репликация является ядерной. В течение начальной фазы (8-18 ч постинфекции) вирусной аппликации нуклеокапсиды собираются в ядре и впоследствии проходят через плазменную мембрану распространяя инфекцию по культуре клеток. Кроме того, некоторые нуклеокапсиды впоследствии (еще 18 ч поєтинфекции) остаются в ядре и закупориваются в белковой матрице, известной как полиэдральное внутриклеточное включение (ПВВ). Эта форма не является инфекционной в культуре клеток. Матрица состоит из белка, известного как полиэдрин, молекулярный вес 33 кд. Каждое ПВВ имеет приблизительно 1 мм в диаметре и в ядре могут быть до 100 ПВВ. Ясно, что большое количество полиэдрина продуцируется позже в цикле заражения и оно составляет до 25% общего количества клеточного белка. Так как ПВВ не играет роли в цикле репликации in vitro, полиэдриновый ген может быть убран из вирусной хромосомы без какого бы то ни было влияния на жизнеспособность In vitro. При использовании вируса в качестве вектора экспрессии заменяют область, кодирующую полиэдриновый ген, чужеродной ДНК и помещают ее под контроль полиэдринового промотора. Это приводит к вирусному фенотипу, не Образующему ПВВ, Описаны рекомбинантные плазмид-ные ДНК, содержащие ген ЭПО под контролем промотора вируса ядерного полиэдроза. В результате генетической рекомбинации происходит замещение области полиэдринового гена AsN PVC дезоксирибонуклемновой кислотой из плазмиды. Рекомбинатный ЭПО, полученный в клетках СНО, очищают традиционными методами колоночной хроматографии. Биологическую активность очищенного рекомбинантного ЭПО in vitro определяют известными методами (биопроба на пролиферацию клеток селезенки). Удельная активность in vitro полученного и очищенного рекомбинантного ЭПО составила 200000 ед./мг белка. Среднее значение находится в интервале 275000-300000 ед./мл белка, Наблюдались значения выше чем 300000. Отношения активности In vivo к активности in vitro, исследуемые для рекомбинантного ЭПО, равны 0,7-1 Д Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. ЭПО очищают от мочи пациентов, страдающи х аппластической анемией, известным методом за исключением того, что опускают фенольную обработку и заменяют термообработкой при 80°С в течение 5 мин для инактивации нейраминидазы. Конечную стадию очистки проводят путем фракционирования на колонке С-4 VyLac высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием от 0 до 95% ацетонитрильного градиента с 0,1% трифто-руксусной кислоты (ТФК) в течение 100 мин. Положение ЭГЮ в градиенте определяют электрофорезом в геле и анализом N-концевой последовательностью основных пиков. ЭПО элюируют при 53% ацетонитрила и обнаруживают приблизительно 40% белка, подвергаемого высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЭПО, выпаривают до 100 мкл, доводят до рН 7 бикарбоната аммония и обрабатывают2%-ымТРСК-обработан-ным трипсином в течение 18 ч при 37°С. Полученные фрагменты подвергают ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано выше. Хорошо отделенные пики выпаривают почти до сухости и подвергают непосредственно анализу N-концевой аминокислотой последовательности, используя газофазный секвениатор модели 480А. Определяют последовательность, приведенную в табл. 2 и 3. Два фрагмента, полученные в результате обработки трипсином, отбирают для синтеза олигонуклеотидных зондов. Из последовательности Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-TrP-L ys получают 17 мег со следующей нуклеотидной последовательностью. и 16 мег со следующей нуклеотидной последовательностью Из последовательности, Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg получают два пула 14-меров. Олигонуклеотиды метят в 5-конце 32Р, используя полинуклеотидную киназу и гамма ^Р-АТР. Удельная активность олигонуклео-тидов варьирует между 1000 и 3000 дюйм 3/ммол олигонуклеотида. Геномную ДНКбиблиотеку человека в бактериофаге лямба подвергают скринингу. Приблизительно 3,5x10 фага высевают с плотностью 6000 фага на Т50 мм чашку Петри со средней NZCYM и инкубируют при 37°С до тех пор, пока пятна не станут видными, однако маленькими (приблизительно 0,5 мм). После охлаждения при 4°С в течение 1 ч дубликатные реплики переносят на найлоновые мембраны и инкубируют в течение ночи при 37°С на чашках со свежими средами NZCYM. Затем фильтры денатурируют и нейтрализуют в течение 10 мин каждого на тонкой пленке 0,5Н NaOH-1M NaCI и 0,5М Tris (pH8}-1M NaCI соответственно. Вслед за вакуумной сушкой при 80°С в течение 2 ч фильтры промывают в 5 х SSC, 0,5% SDS в течение 1 ч и клеточные остатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухой тканью. Это соскабливание снижает фоновое связывание зонда с фильтрами. Фильтры затем промывают водой и предварительно гибридизируют от 4 до 8 ч при 48°С в ЗМ растворе тетраметиламмонийхлорида, 10 мМ NaPO4 (рН 6,8), 5 х Denhardt's , 0,5% SDS и 10 мМ ЭДТК. 17 мег, меченый 32Р, затем прибавляют при концентрации 0,1 пмол/мл и гибридизацию осуществляют при 48°С в течение 72 ч. Вслед за гибридизацией фильтры промывают экстенсивно в 2 χ SSC (0,3 Μ NaCI - О.ОЗМ цитрат натрия, рН 7) при комнатной температуре и затем в течение 1 ч в ЗМ ТМАСР-10 мМ NaPO4 (рН 6,8) при комнатной температуре и от 5 до 15 мин при температуре гибридизации. Приблизительно 120 сильных дупликатных сигналов обнаруживают вслед за 2-х дневной авторадиографией усиливающим экраном. Положительные сигналы отбирают, группируют в пулы из 8, пересевают и вновь подвергают скринингу с использованием 1/2 14 мег пула на каждом из двух фильтров и 127 мег на третьем фильтре. Условия высева и гибридизации при этом те же, но гибридизацию осуществляют при 37°С. Вслед за авторадиографией зонд с фильтра переносят в 50%-ном формамиде в течение 20 мин при комнатной температуре и фильтр повторно гибридизируют при 52°С 18 мег зондом. Два независимых фага гибридизируют со всеми тремя зондами. ДНК из одного из этих фагов обозначают здесь l-HEPOI. Переворачивают рестриктазой Sau3A и субклонируют в Μ13 для анализа ДНК-последовательности. Пример 2. 5 мкг мРНК человеческой печени эмбриона имРНК печени взрослого человека подвергают электрофорезу в 0,8%-ом агарозном формальдегидном геле и переносят на нитроцеллюлозу. Однонитевый зонд получают, из матрицы Μ13, содержащей вставку, показанную в табл. 1. Праймером является 20 мег, происходящий из того же фрагмента, что и первоначальный 17 мег зонд. Получают зонд за исключением того, что вслед за расщеплением Smal малый фрагмент очищают от М13 хроматографией на колонке с Сефарозой С14В и 0,1 N NaOH - 0,2 Μ NaCI. Фильтр гибридизируют приблизительно до 5 χ 106 отсчетов в минуту с этим зондом в течение 12 ч при 68°С, промывают в 2 х SSC при 68°С. Пример 3. Зонд, идентичный описанному в примере 2, получают и используют для скрининга библиотеки кДНК печени эмбриона, полученной в векторе A-Ch21A,используя стандартные методики скрининга бляшек, Три самостоятельных положительных клона - обозначены здесь A -HEPOF L6 (1350 пар оснований), A-HEPOF L8 (700 п.о.) и A-HEPOF L13{1400 п.о.) выделяют вслед за скринингом 1x10 бляшек. Полную вставк у A-HEPOF L 13 и A-HEPOF L6 секвенируются вслед за субклонированием в М13 (табл. 7 и 5 соответственно). Только часть вставки A-HEPOF L8 секвенируют. Остальные фрагменты считают идентичными двум другим клонам (табл. 7). 5'- и 3'- нетранслируемые последовательности представлены строчными буквами. Кодирующая область представлена прописными буквами. В отношении табл. 2 и 3 следует упомянуть, что определенная аминокислотная последовательность, показанная ниже нуклеотидной последовательности, пронумерована начиная с цифры 1 для первой аминокислоты созревшего белка. Остатки цистеина в созревшем белке дополнительно указаны SH, и потенциальные N-сайты гликолизирования обозначены звездочкой. кДНК-клоны A-HEPOF L6, A-HEPOF 1_8 и A-HEPOF L13 задепонированы в American Type Culture Collektion, Pokvtlle, Maryland под номерами АТСС 40156, АТСС 40152 и АТСС 40153 соответственно. Пример 4. Геномные клоны А-НЕ-РО1, А-НЕРО2, А-НЕРОЗ и А-НЕРО6 депонированы в American Type Culture Collection. PockvUle. Maryland под номерами АТСС 40154, АТСС 40155, АТСС 40150 и АТСС 40151 соответственно. Используют вектор pALD26 ЗА рА(3), эта плазмида содержит кДНК-ген дигидрофо-лятредуктазы мыши (DFHP), который находится под контролем позднего промотора аденовируса 2(Ad2), 5'-часть аденовирусной ДНК и 3'-часть гена иммуноглобулина, между поздним промотором аденовируса 2 и DFHPкодирующей последовательностью. pALD26 pA(3) превращают в плазмиду pCVSVL12. pALD26VS pA(3) превращают в плазмиду pALD26SVp A(3) (L) делецией одного из двух сайтов Ρ st 1 в плазмиде рАШ26 SVp A (3) путем частичного переваривания Pst 1 и получают субпопуляцию плазмид, в которой только один сайт Pst 1 расщеплен, затем осуществляют обработку, и лигирова-ние ферментом Кленова. Плазмиду pALD26SVpA (3) (L) расщепляют Pvu 11. Плазмиду plAW43 переваривают Xhol, обрабатывают фрагментом Кленова, переваривают Pvu 11 и выделяют электрофорезом в акриламидном геле фрагмент размером 140 п.о. Фрагмент 140 п.о. лигиру-ют с плазмидной pALD26SV pA(3), обработанной с рестриктазой Pvull. Продукт лигирования используют для трансформации E.coli, колонии подвергают скринингу с помощью зонда, меченого Р, комплементарного к фрагменту из 140 п.о. ДНК получают из положительно гибридизирующи хся колоний. Фрагмент Ava11D вируса SV40, содержащего последовательность энхансера SV40, получают путем обработки ДНК SV40 ферментом Ava 11, фрагментом Кленова Pol 1 с последующей лигацией Хпо 1линкеров. Xhol-фрагментом и выделением фрагмента электрофорезом в геле. Этот фрагмент затем лигируют обработанной рестриктазой Xhol плазмидой pTPL и получают плазмиду pCVSyL2-TPL. Ориентация фрагмента DSY40 и pCYSYL 2-TPL такова, что поздний промотор вируса SV40 находится в такой же ориентации, что и основной поздний промотор аденовируса. Для интродуцирования генов VA в pC YSYL 2-TPL вначале конструируют плазмиду pBR322, которая содержит в Hindill-сайте фрагмент В аденовируса типа 2. ДНК аденовируса типа 2 переваривают HindlH и фрагмент В выделяют электрофорезом в геле. Этот фрагмент встраивают в плазмиду pBR322, которая предварительно была обработана Hindlll. После трансформации Е.соli отбирают рекомбинанты и ориентировку встроенных фрагментов определяют путем обработки рестриктазами. pBR322-AL Hindlll В содержит фрагмент В HindlH аденовируса типа 2. Плазмиду pBR322 - AL Hindlll В обрабатывают Нра I. добавляют линкеры ECoR1 и гидролизуют EcoRI. Фрагмент, имеющий липкие концы EcoRI, встраивают в EcoRl·caйт плазмиду PTL, гидролизованной EcoRI. После трансформации штамма E.coli HB 101 отбирают колонии, устойчивые к тетрациклину, далее на фильтрах колонии подвергают скринингу посредством гибридизации. ДНК получают из положительно гибридизирующих клонов и гидролизуют рестриктазами, Полученную плазмиду обозначают р91023, Плазмиду р91О23 гидролизуют рестриктазой EcoRI и получают два фрагмента, один около 7 кВ и другой около 1,3 кВ. Последний фрагмент содержит гены VA. Концы обоих фрагментов заполняют с ис-пользова'нием фрагмента Кленова Pol! и два фрагмента затем лигируют один к другому. Плазмиду р91023/А/, содержащую гены VA, являющуюся аналогичной плазмиде р91023, однако потерявшую два сайта EcoRI, идентифицируют посредством скрининга фрагментом гена VA. Один Pst 1-сайт в плазмиде р91023/А/ заменяют на EcoRI-сайт. р91023/А/ гидро-лизуют рестриктазой Pst I и обрабатывают фрагментом Кленова Poll для восстановления концов. EcoRI-линкеры лигируют с тупым сайтом Pstl плазмиды р91043/А/. Линейную плазмиду р91023/А/ с EcoRl-лин-керами, присоединенными к тупым сайтам Pstl, отделяют от несшившихся линкеров и гидролизуют EcoRI рестриктазами, после чего повторно лигируют. Иденти фицируют плазмиду р91023/В/, которая аналогична р91023/В/, которая аналогична р91023/А/, но вместо прежнего сайта Pstl в ней содержится сайт EcoRI. Плазмида р91023/В/ депонирована и доступна из American Type Culture Collection, под номером АТСС 39754. Пример 5. кДНК-клоны ( A-EPOF L6 и A -EPGF L13) встраивают в плазмиду р91023/В/, получают плазмиды pPTF L 6 и pFTF L13,8 мгк каждой из очищенных ДНК затем используют для трансфекции 5x10 клеток COS, используя DEAE-декстран-метод (ниже). Через 12 ч клетки промывают и обрабатывают Хлорохином (0,1 мМ) в течение 2 ч, промывают вновь и выдерживают в течение 24 ч в 10 мл средах, содержащих 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку. Среду заменяют на 4 мл среды, свободной от сыворотки, и собирают через 48 ч. Иммунологически активный ЭПО определяют количественно радиоиммунным анализом. Йодированный изотопноый индикатор получают из гомогенного ЭПО. Чувствительность пробы составляет приблизительно 1 нг/мл. Результаты приведены ниже в табл. 8. Пример 6. кДНК ЭПО (A-HEFO L13) вставляют в плазмиду р91023/В/, трансфек-тируют в клетки COS-1 и собирают, как описано выше. Однако хлорохинную обработку опускают. Биологическую активность ЭПО in vitro измеряют с использованием либо колониеобразующей пробы с клетками фетальной печени мыши в качестве источника CFV-E, либо пробы поглощения с Н-тимидином, используя клетки селезенки от мышей, инъекцированных фенилгидразином. Чувствительность этих анализов составляет приблизительно 25 единиц/мл. Кроме того, биологическую активность ЭПО In vivo измеряют с использованием либо метода гипоксической мыши, либо метода голодающей крысы. Чувствительность этих анализов составляет приблизительно 100 единиц/мл. Никакой активности не обнаружено ни в одной из этих опытов с имитированной средой. Данные об активности ЭПО, экспрессированно-го клоном EPOF L13, показаны в табл. 9, где приведенные активности выражены в единицах/мл, с использованием торгового ЭПО (Toyobo. Inc.) в качестве стандарта. Пример 7. Гель-анализ полиакрила-мида SDS ЭПО из клеток COS. 180 нг ЭПО, выделенный из среды клеток COS, трансфекцированных кДНК ЭПО (A -HEPOF L13) в векторе 91023(В), подвергают электрофорезу, на 10%-ном полиакри-ламидном геле. НПО обнаруживают с антителом антиЭПО и белком А 1251-ста ф. Фильтр авторадиографируют в течение двух дней. Гомогенный ЭПО подвергают электрофорезу перед или после йодирования. Используемые маркеры включают метионин, меченый 35S, сывороточный альбумин (68000 д) и яичный альбумин (45 000 д). Пример 8. Фрагмент BamHI-Pvull из плазмиды Psv 2DHFR, содержащий ранний промотор SV40, смежный с геном дигидро-фолятредуктазы мыши (D HFR), энхансер SV40, малый интрон t и последовательность полиаденилирования SV40 выделяют (фрагмент А). Оставшиеся фрагменты получают из вектора р91023/А/ (вы ше) следующим образом, р91О23/А/ гидролизуют Pst І в единственном сайте Pst I около промотора аденовируса для линеаризации плазмиды, и либо лигируют с синтетическими линкерами Pst l-EcoRI и обрабатывают с помощью ДНК лигазы или обрабатывают большим фрагментом ДНК-полимеразы 1 для разрушения сайтов Pst I и сшивают с синтетическим ЕсоРЬлинкером и замыкают плазмиду. Каждую из двух полученных плазмид 91023/В/ и 91023/В7, обрабатывают ХЬа и EcoRI для получения двух фрагментов (F и G). П утем соединения фрагмента G из плазмиды р91023/В/ и фрагмента F из плазмиды р91023/В7, а также фрагмента G из плазмиды р9Ю23/В/ и фрагмента F из плазмиды р91023/В7 создают две новые плазмиды, которые содержат либо сайт EcoRI-Pst I, либо сайт Pst l-EcoRI. Вектор р91023/С/ гидролизуют и полученную с липкими концами затупляют и путем заполнения концов с фрагментом E.coli ДНК-полимеразы 1. К этой ДНК лигируют с фрагментом Hindlil-EcoRI размером 340 п.о., содержащим энхансер SV40, полученный следующим образом. Фрагмент Hindlll-Pvull из вируса SV40, который содержит основу SV40, а также энхансер вставляют в плазмиду с Іас пролго-ром. Вектор с lac получают гидролизом ДНК с BamHI эндонуклеазой, заполнением липкого конца с помощью фрагмента ДНК-пол-имеразы 1 и обработкой ДНК Hindlll. В полученной плазмиде восстанавливают BamHI-сайт путем лигирования с Pvu и II линкером. Фрагмент EcoRI-Hindlll получают из SV HP lac и сшивают с фрагментом EcoRI-HfndlH Psv Od. который содержит плазмид-ную основу репликации, и отбирают полученную плазмиду PsvHPOd. Затем получают фрагмент EcoRI-Hindlll размером 340 п.о. плазмиды PsvHPOd, содержащий 5\/40/энхансер, затупляют с обоих концов при помощи большого фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и сшивают вектором р91023/С/, гидролизованным Xhol/p91023/C//Xho/ и EcoRI/Hlndlll SV40 энхансер/, в которой ориентация фрагмента HindiII-EcoRI такова, что BamHI-сайт внутри фрагмента является близлежащим к гену VA, называют pES105. Плазмиду PES105 обрабатывают BamHt и Pvuli, а также Pvull, и выделяют фрагмент BamHl-Pvull, содержащий основной поздний промотор аденовируса (фрагмент В), и фрагмент Pvull с геном устойчивости к тетрациклину, а также другие последовательности (фрагмент С). Фрагменты А, В и С лигируют и полученную плазмиду выделяют и обозначают RKI-4. Плазмида RKI-4 депонирована American Type Culture Collection. Rockville. Maryland, где под номером АТСС 39940. Пример 9. ДНК (20 мкг) из плазмиды pPTF L13, гидролизуют рестрикционной эндонуклеазой СІа І и лигируют с обработанной Clal ДНК из плазмиды pALO265SVp/A/ 1/2 мкг/, которая содержит интактный гендигидрофолятредуктазы (DHF R), под контролем основного позднего промотора аденовируса. Эту ДНК используют для трансфекцми DHFR-CHO и после двухдневного выращивания клетки, которые содержат по крайней мере один ген DHR R, отбирэют в альфа-средах, не имеющих н ук-леотиды, и пополняют 10%-ой диализиро-взнной фетальной эмбриональной бычьей сывороткой. Извлекают колонии из первоначальных чашек, объединяют по группам из 10-100 колоний на пул, повторно высевают и выращивают до слияния в альфа-средах, не имеющих нуклеотиды. Отстоявшиеся среды из этих пулов проверяют на ЭПО посредством радиоиммуноанализа (RIA). П улы, которые экспрессируют ЭПО выращивают в присутствии метатрекса (0,02 мкМ) и затем субклонируют и анализируют повторно. СІа 4 4,04-7 экспресшруют 460 мг/мл ЭПО. Он депонирован в American Type Culture Collection под номером АТСС CPI 8695. Этот клон подвергают поэтапному отбору при возрастающих концентрациях МТХ. Ступенчатую селекцию с метотрексаном (МТХ) достигают повторными циклами культивирования клеток в присутствии возрастающих концентраций метотраксата и селекции для выживших микроорганизмов. При каждом цикле ЭПО наличие ЭПО определяют в недостаточном слое культуры посредством RIA и определяют биологическую активность in vitro. Уровень используемого метотрексата в каждой ступенчатой амплификации составляет 0,04, 0,1 и 0,5 мкМ, Как показано в табл. 10 после первого цикла селекции при 0,02 мкМ МТХ в к ультуральные среды высвобождаются значительные уровни ЭПО, Пример 10. ДНК из клона A-HEPOF L13 гидролизуют EcoRI и малый фрагмент RI, содержащий ген ЭПО, субклонируют в EcoRI-сайт плазмиды RKI-4. Эту ДНК (RKF L13) затем используют для трансфекции DHF R-отрицательных клеток СНО, а селекцию и амплификацию осуществляют, как описано в примере 9 выше. ДНК RKF L13 также трансформируют в клетки СНО путем слияния протопластов и микроинъекции. Плазмида PKF L13 депонирована в American Type Culture Collection Rockville. Maryland под номером АТСС 39989. Предпочтительный клон депонирован в American Type Culture Collection. Rockvifle. Maryland под номером АТСС СРГ 8695. Пример 11. ДНК из pSVOD обрабатывают эндонуклеазой Hindlll и затупляют с помощью большого фрагмента ДНК-пол-имераэы 1. Клон ЭПО и фага l-НЕРОЗ, гидролизуют EcoRI и Hindlll, выделяют фрагмент, размером 4,0 кВ, содержащий ген ЭПО, делают тупыми концы. Фрагмент гена ЭПО вставляют в плазмидный фрагмент psVOd. Плазмида CZ 2-1 имеет ген ЭПО и ориентации "а" (т. е. с 5'-концом ЭПО, который ближе к SV40) и плазмида CZ1-3 находится в противоположной ориентации (ориентация "Ь"). Плазмиды CZ1-3 и CZ2-1 трансфекциру-ют в клетки COS-1, и среды собирают и анализируют на иммунологически реактивный ЭПО. Пример 12. Плазмиду, содержащую кДНК-последователъность ЭПО под контролем металлотеонинового промотора мыши и связанную с полной ДНК вируса бычьей папилломы, получают следующим образом pEPO49f. Эту плазмиду гидролизуют EcoRI, и фрагмент EcoRI длиной 1340 п.о. из A-HEPOF L13 встраивают в нее с помощью ДНК-лигазы. Полученную плазмиду, в которой 5'-конец гена ЭПО является ближайшим к промотору SP6, обозначают pEPO49F. В этой ориентации сайт BamHI и полилинкере PS P6/5 непосредственно примыкает к 5'-концу гена ЭПО. Плазмиду рММТ neo BPV обрабатывают BamHI. Получают два фрагмента - большой фрагмент размером ~8 кб, содержащий геном ВРУ, и меньший фрагмент размером ~6,5 кб, содержащий начало репликации и ген устойчивости к амплициллину металло-геиониновый промотор, ген устойчивости и неомицину и сигнала полиаденилирования SV40 из плазмиды рН 42 ДН К обрабатывают ДНК-лигазой, и плазмиды, которые содержат фрагмент размером ~6,8 кб. Одну такую плазмиду обозначают pMMTheo ВРУ. рЕРО15а. рММТпеоВРУ гидролизуют BglH. рЕ-PO49f обрабатывают BamHI и BglH, и выделяют фрагмент размером 700 п.о., содержащий целую область, кодирующую ЭПО. Плазмиду pMMTheo В Ρ гидролизуют рестрикта-зой ВдШ и выделяют фрагмент BamHI/BgIN ЭПО размером 700 п.о., лигируют и полученные плазмиды, содержащие кДНК ЭПО, идентифицируют гибридизацией при помощи олиго-нуклеотидного зонда. Отбирают плазмиду рЕР015а, которая содержит кДНК ЭПО, при этом 5'-конец кДНК ЭПО является близлежащим к металлотеонино-вому промотору. рВРУ-ЭПО. Плазмиду рЕР015А гидролизуют BamHI для линеаризации плазмиды. Плазмиду pdBPy-MMTheo (34212) обрабатывают эндонуклеазой BamHf, получают два фрагмента размером 6,5 и 8 кб. Первый фрагмент содержит целый геном вируса бычьей папилломы, pEPO15a/BamHI и фрагмент BamHI размером 8 кб лигируют др уг с др угом, и плазмиду (рВРУ-ЭПО), содержащую фрагмент ВПУ, идентифицируют гибридизацией с использованием олигонуклеотидного зонда d(P-CCACACCCGGTACAC A-OH). Гидролиз ДНК плазмиды рВРУ-ЭПО эндонуклеазой подтверждает, что HlndHI транскрипции генома ВРУ является таким же, как и направление транскрипции металлотеонинового промотора (как в pdBPy-MMTneo 1342/12. Плазмида pdBPy-MMTneo/342-12/ в American Type Culture Collection. Rockville. Maryland под номером АТСС 37224. Пример 13. Получают ДНК плазмиду рВРУ-ЭПО и приблизительно 25 мкг используют для трансфекции 1х106 клеток С127, СНО. Через 5 ч после трансфекции тране-фекционные среды удаляют, клетки обрабатывают глицерином, промывают и прибавляют свежую α-среду, содержащую 10%-ную сыворотку плода коровы. Через 48 ч клетки трипсинизируют и расщепляют в отношении 1:10 в DME среде, содержащей 500 мкг/мл G 418, и клетки выращивают в течение двух-трех недель. G418 - устойчивые колонии выделяют индивидуально в микротитровальную лунку и выращивают до сублизирования в присутствии G418. Клетки затем промывают, прибавляют свежие среды, содержащие 10%-ную сыворотку плода коровы, и среды собирают через 24 ч. Клетки С127 и ЗТЗ трансфецируют 25 мкг рВРУ-ЭПО и 2 мкг pSV2neo. Клетки С127 трансфецируют 30.мкг рВРУ-ЭПО. Вслед за трансфекцией, свежие среды меняют каждые три дня. Приблизительно через 2 недели собирают ВРУ трансформирование клетки в микротитровальные лунки, выращивают и анализируют на активность ЭПО. Пример 14. Плазмидный вектор pIVEY депонирован в American Type Culture Collection. Rockville. Maryland под номером АТСС 3991. Вектор модифицируют следующим образом. plYEYN I рІУЕУ обрабатывают EcoRI для линеаризации плазмиды, затупляют с использованием большого фрагмента ДНК-полиме-разы}, и лигируют одиночным линкером Not f. Полученную плазмиду обозначают pIVKYN I. рІУЕУ гидролизуют Smal для линеаризации плазмиды, и сшивают с линкером Полученную плазмиду обозначают рІУЕУБІ. рІУУЕУБІВд Кр Плазмиду ріУЕУЗІ гидролизуют Κρni для линеаризации плазмиды, и фрагменты размером от 0 до 100 п.о. отщепляют от каждого конца путем обработки андонуклеазой ВаІ3І. Полученные концы затупляют с использованием большого фрагмента ДНК-полимеразы 1 и сшивают полилинкером. Полилинкер встраивают в обеих ориентациях. Плазмиду, в которой полилинкер ориентирован таким образом, что сайт Bgll! внутри полилинкера является близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют plYEVS IBgKp. Плазмиду, в которой сайт Крп I внутри полилинкера является близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют рІУЕУЗІКрВд, рІУЕУБІВдКр депонирована в American Type Culture Collection. Rockville. Maryland, под номером АТСС 39988. pIEYSIBgKpNI рІУЕУ N1 переваривают эндонуклеазами Kpnl и Pstl. Получают больший фрагмент, который содержит начало репликации и 3'-конец полиэдрального гена, рІУЕУЗІВдКр гидролизуют эндонуклеазами Pstl и Крп для получения двух фрагментов. Причем меньший фрагмент содержит полиэдральный промотор и полилинкер (фрагмент В). Фрагменты А и В объединяют ДНК-лигазой и получают плазмиду рІУЕУБІВдКр N1. рІУЕРО рІУЕУ SI BGKp N1 гидролизуют рестрик-тазой EcoRI для линеаризации плазмиды, и вставляют фрагмент EcoRI размером 1340 п,о., изА-HEPOF L13. Плазмиды, содержащие 5'-конец гена ЭПО в непосредственной близости к полиэдральному промотору и 3'-концу полиэдрального гена, идентифицируют путем переваривания Bglll, Одну из этих плазмид в ориентации, описанной выше, обозначают как рІУЕРО. Экспрессия ЭПО в клетках насекомых. Плазмидную ДНК выделяют из E.coll 1M1Q1-tgl и подвергают дальнейшей очистке CSClцентрифугированием. ДНК штамма L-1 вируса полиэдррза Autographa californica дикого типа (AcN РУ) получают фенольной экстракцией вирусных частиц и последующей очисткой вируской ДНК. Эти две ДНК контрасфецируют в клетки IPI B-SF-21 Spodoptero frugiperda, используя методику трансфекции с фосфатом кальция. Для каждой чашки контрасфецируемых клеток используют ДНК AcNPy дикого типа и 10 мкг pIVEPO. Чашки инкубируют при 27°С в течение 5 дней. Затем собирают надосадочную жидкость, экспрессию ЭПО в надосадочном слое подтверждают радиоиммунным анализом и биологической пробой in vitro. Пример 15. Среды клеток COS (121) с концентрациями ЭПО до 200 мкг/л концентрируют до 600 мл с использованием ультрафильтрационных мембран с молекулярным весом 10000. Концентрированные и диафильтрованные кондиционированные среды содержит 2,5 мг ЭПО в 380 мг общего белка. Раствор ЭПО дополнительно концентрируют до 186 мл, и осажденные белки извлекают центрифугированием при 110000g в течение 30 мин. Надосадочный слой, который содержит ЭПО (2 мг), доводят до рН 5.5 50%-ной уксусной кислотой, перемешивают при 4°С в течение 30 мин. осадок извлекают центрифугированием при 13000д в течение 30 мин. Хроматография на карбонилметильной сефарозе. Отстаявшийся слой, содержащий 200 мкл (24 мг общего белка), помещают колонку, с С М-Сефарозой (20 мл), уравновешенную в 10 мМ ацетатом натрия, рН 5,5, промывают 40 мл того же буферного раствора. ЭПО, связанный с СМ-Сефарозой, элюируют 100 мл градиента Nav (0-1) в 10 мМ растворе фосфата натрия, рН 5,5. Фракции, содержащие ЭПО (общее количество 50 мкг в 2 мг общих белков), объединяют по группам и концентрируют до 2 мл с использованием ультрафильтрационной мембраны. ВЭЖХ с обращенной фазой. Концентрированные фракции, содержащие ЭПО, подвергают дальнейшей очистке ВЭЖХ с обращенной фазой, используя колонку Vydac C-4. ЭПО подают на колонку, уравновешенную в 10%-ном растворителе В (Растворитель А представляет собой 0,1% CF3CO2H в воде: растворитель В представляет собой 0,1 % CF3CO2H в CF 3Cll), с низкой степенью подачи 1 м/мин. Колонку промывают 10% в течение 10 мин и ЭПО эллюируют линейным градиентом В (10-70% в течение 60 мин). Фракции, содержащее ЭПО, объединяют по группам (~40 мкг ЭПО в 120 мкг общих белков) и лиофилизируют. Лиофилизированный ЭПО повторно структурируют в 0,1 Μ растворе Tris-CHI при рН 7,5, содержащем 0,15М NaCI, и повторно хроматографируют ВЭЖХ с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЭПО, объединяют по группами анализируют электрофорезом в SDS-полиакриламидном(10%) геле. Объединенные фракции ЭПО содержат 15,5 мкг ЭПО в 25 мкг общего протеина.