Спосіб одержання штаммів бактерій – escherichia coli i pseudomonas purida – продуцентів креатінамідіногідролази

Изобретение касается генетической инженерии, а именно получения креатинамидиногидролазы в штаммах бактерий Escherichia coli и Pseudoraonas putida. Цель изобретения — получение штаммов, конститутивно продуцирующих креатинамидиногидролазу, Вьщеляют ДНК из Pseudomonas putida, расщепляют эндонуклеазой EcoRI, фраг*" мент размером 5,8 кВ обрабатывают эндонуклеазами EcoRI и PvuII и получают фрагмент размером 2,2 кВ, которьій клонируют в расщепленный эндонуклеазой вектор, трансформируют в штамм E.coli DSM 2102 и P.putida DSM 2106. 2 табл. разрушения клеток, наматывания ДНК на стеклянную палочку после двух обработок фенолом и осаждения этанолом, растворяют ее в концентрации 600 /иг/мл. 10 цт хромосомной ДНК обрабатывают 5 единицами EcoRI и анализируют степень переваривания в агарозном геле. 10 бактерий штамма E.coli ED DSM 2102 инкубируют в присутствии 5-Ю " А "фагов Шарон 10 в течение 20 мин при 37°С и затем оставляют для роста до начала лидирования бактерий в 500 мл полной среды с последующим выделением фага. 10 г г Ыарон 10 ДНК полностью расц щепляют 1 мг EcoRI эндонуклеазы, разрезанную хромосомную ДНК Pseudo СП Ю СО СП СП 1523055 monas putida инкубируют с 3 г расщепленного эндонуклеазой EcoRI ДНК фага Шарон 10 с 40 единицами фермента Т4 ДНК-лигазы. Упаковку связанных ДНК-фрагментов головные и хвостовые протеины фага ' производят в пробирЛ ке. Около 0,5 г г связанных ft и Pseuц domonas ДНК инкубируют посредством исходной смеси F B упаковке в пробирке; 10 "через 60 мин добавляют 0,5 мл SM буферного раствора, 1/200 объема (2,5 |ул) исходной смеси в упаковке инкубируют при помощи 200 л выдержан-юго в течение ночи штамма E.coli (в I (Г молярном сульфате магния) 10 мин при 37°С, Суспензию бактерий смешивают затем с 3 мл LB-агарозы (0,8%) и выливают на LB-пластины. Ка 1 /цг введенной ДНК получают около 5 \5" фаговых отверстий (тромбоцитов). 20 Для идентифицирования фагов, которые содержат кодирующий креатиназу ген, применяют иммунотест с ферментом. Индикаторная система состоит из 6 мг/мл тетраметилбензидина, 25 20 мг/мл диоктилнатриисульфосукцината и 0,01% Н^О^ в 6%—ной желатине. На 1000 тромбоцитов устанавливают два положительных сигнала, 30 Из пяти положительных в иммунотесте с ферментом тромбоцитов получают препарат фагов - ДНК о Ра оцепление і пяти различных ДНК посредством EcoRI позволило выявить ДНК-полосу 35 во всех пяти фагах ДНК 5,8 кВ. Приблизительно 5 [ г этого EcoRIU фрагмента расщепляют при'использовании PvuII эндонуклеазы и выделяют фрагмент размером 2 9 2 кВ.Образующиеся 40 фрагменты ДНК разделяют в ннзкоплавком геле агарозы по их размеру и выделяют фрагмент EcoRI - PvuII. Выделение ДНК-фрагментов из низкоплавких гелей агарозы производят 45 вырезанием соответствующих полос, переводом в пробирку (трубочку Эппендорфа) и смешиванием приблизительно с двухкратным объемом воды, затем инкубируют при 65°С до тех 50 пир (от 5 до 10 мин)р пока не расплавится агароза, пробу встряхивают в течение короткого времени и потом интенсивно встряхивают с половиной объема фенола (нейтрализованного 10 ммол ТРА-НС1.С рН 7,5 и 1 мм ЕДТА, ТЕ), Фазы разделяют центрифугированием эа 10 мин при 15000 g и верхнюю водную фазу снова экстрагируют встря—( хиванием с фенолом. После центрифугирования в течение 10 мин при 15000 g верхнюю фазу дважды экстрагируют путем встряхивания с простым эфиром (по * * 1 м л ) , простой эфир выпаривают при 65 С и ДНК осаждают при помощи 1/10 объема З М ацетата натрия с рН 7,2 и 2,5-кратного объема этанола при 20°С. ДНК осаждают центрифугировакием за 10 мин при 15000 g, сушат в вакууме и вводят в 10|цл ТЕ, Все описанные дальше выделения фрагментов производят аналогично. Около 4 гцг pBR 322 ДНК расщепляют посредством EcoRI и PvuII и выделяют фрагмент размером 2,3 кВ, 0,2 іцг этого pBR 322-фрагмента инкубируют в течение ночи в присутствии пяти единиц Т4 ДНК-лигазы и 0,5 Щ г EcoRI PvuII-фрагмента размером 2,2 кВ из описанных * -фагов. Полученную плаз-: Д миду называют рВТ-3-2, она кодирует в E.coli биологически активную креати™ назу. П р и м е р 2. Фрагмент ДНК, кодирующий креатиназу из плазмиды рВТ—3— 2, обрабатывают нитроэогуанидином. Выделяют плазмидную ДНК после лизиро- ' вания клеток при помощи метода CSCIзтилбромира. Клетки штамма E.coli ED 8654 трансформируют при помощи ллазмидкой ДНК и помещают на пластинах полной среды (LB)p содержащих 20 (&г/мл ампициллина» После инкубации в течение ночи при 37°С на LB-ппастины помещают нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу. После инкубации в течение 12-18 ч при 37 С китроцеллюлозный фильтр с K O J лониями снимают и переводят в стеклянную чашку Петри ( $ 2 0 см), в которую был добавлен 1 мл смеси хлороформа с толуолом (1:1), Инкубацию проводят за 20 мин прії 37°С. Затем нитроцеллюлоз нын фильтр накладывают на индика-4 торную агарозную пластину таким образом, чтобы возникал прямой контакт между клетками и индикаторной пластиной. Цветная реакция происходит в зависи-* мости от времени и количества синтези^ ровакной в отдельных клонах креатина— зы» Из описанной системы фильтрования выделяют клон ЕД с плазмидой рВТ 2а-1, DSM 3143. Эта плазмида колирует креатиназу, которая составляет около 50% растворенного протеина клеток. Как альтернативу к описанному прямому NC-мутагеиезу увеличение уровня 5 1523055 Упомянутая индикаторная агарозная экспрессивности креатиназы можно доспластина представляет тест-систему тигнуть с помощью lac-промотора (подля отбора активности, принцип котоследний можно выделять из имеющихся рой состоит в том, что креатин расщепв продаже плазмид, например pUCD ляют ферментами креатинамидиногидролаплазмид). Для этого плазмиду зы и сарказиноксилазы на образования рВт-3—2 обрабатывают EcoRI-эндонук— Н 4 0 2 через пероксидазу в 1/2 0^ и Н^О леазой, обрабатывают эндоиуклеазой и осуществляет реакцию кислорода с Bal 31 таким образом, что удаляют около 10^100 вр с каждой стороны.' JQ системой цветного индикатора„ например, из 4-аминоантипирииа (4ААН) и Затем lac-промотор при помощи ферменN-этил—Ы-(сульфоэтил)-3-метиланилина,. та Т4—лигазы, связывающего концы, соли EST. Образуется голубовато-фиолевводят в укороченную плазмиду ВТ 3-2. товое окрашивание, которое при избытке Эту ДНК мутагенизируют с нитрозогуанидином, после этого применяют для J5 'ферментов сарказиноксилазы и лерокси— дазы представляет степень синтезиро--трансформации штамма ED и клоны исванной в колониях креаткнамидиногидропытывают на высокую экспрессивность лазы. гена. Тест-принцип: креатинамидиноКреатин + гидролаза Саркозин + О, + Н 2 0 4-ААР + EST саркозин + мочевина Sarc - CD *- глицин + формальдегид + POD краситель + 2Н„0 Состав системы фильтрующей активнои идентифицируют кодирующие креатинаэу сти креатинамидиногидролазы показан клоны при помощи отбора активности на в табл.I. 30 пластинах. Из одного из положительных клонов получают по методу с CSCI-этнлбромидом плазмиднуго ДНК. Плазмида Указанные в пунктах 1~7 реактивы имеет название рВТ 306,16, DSM 3149 Р. растворяют и смешивают с одинаковым объемом низкоплавкой агарозы (2%) s Трансформируют плазмидную ДНК 6 мл выливают в чашку Петри, пластины в Fseudomonas putida 2440. можно хранить около 2 недель при 4°С 35 При помощи фильтрования с отбором в темноте. активности на пластинах идентифицируП р и м е р 3 . Для клонирования и ют положительные клоны. Это возможно обеспечения экспрессивности клонироу Pseudomonas putida 2440, хотя этот ванной креатинамидиногидролазы в штамм содержит хромосомнокодированную Pseudomonas p u t i d a применяют плазмикреатинамидиногидролазу, так как эксду RSF 1010. RSF 1010 линеаризируют прессивность кодированной плазмидной ' посредством P s t T I и из плазмиды рАСУС креатинамидиногидролазы проявляется 177 после НАЕ11 - расщепления выделяют структурно. Этот отличительный признак 1,4 кВ-фрагмент, 0,2 |цг RSF 1010 ДНК позволяет проводить различие между 45 связывают с 1 мг Иае ІІ-фрагмента кодированной хромосомой и кодирован" при использовании Т4-лигазы, получаю* ной плазмидной креатинамидиногидрола— і щаяся плазмида представляет собой рВТ ЗОЙ. 306,J RSF 1010 и производные этой плазмиды отличаются широким диапазоном50 П р и м е р 4, Определение активхозяина и пригодны, например, для ности креатинамидиногидролазы произPseudomonaden и E . c o l i . Плазмиду рБТ водят обнаружением образованных в ре2а*-1 расщепляют посредством Pvul и зультате реакций с уреазой ионов аммоI P v u I I , вьщеляют 2,8 кВ-фрагмент. ния с тест-комбинацией '"мочевина1! рВТ 306,1 плазмиду расщепляют посред- „ Дикий тип Pseudomonas putida ством Pvul и Smal и выделяют фрагмент 2440 для определения активности креа— размером 10 кВ. 0,5 nj г векторной тинамидиногидролазы инкубируют при ДНК связывают с 0 в 5 л*г Pvu I - P v u I I 30 С в течение ночи в В-среде (5 мл). фрагмента. E . c o l i ED трансформируют которая содержит 1% креатина. 1523055 Клетки собирают центрифугированием и промывают один раз в 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 7,5, Клетки в первоначальном объеме вводят в фосфатный буферный раствор (50 мМ с рН 7,5) и растворяют обработкой ультразвуком (4?30 с ) . Выращивание и растворение клеток, которые, содержат плазмиду, кодирующую креатинамидиногидролазу, проводят опи санным способом, с тем исключением, что среда не содержит креатина для индукции и что отбирают с добавкой ампициллина (20 йдг/мл для плаамиды рВТ 2а-1) или стрептомицина (20 njr/мл для плазмиды рВТ 306*16). Рост культур происходит для Pseuclomonas puti~ da при 30°С, для Е-соІІ - при 37°С« Данные показывают, что в результат те клонирования креатинамидиногидро- но лазы в E.coli бактерии получают новое свойство синтезировать креатинамиди— ногидролазу и эта экспрессивность в противоположность исходному штамму 25 Pseudomonas putida проявляется структурно как для E.coli, так и для Pseudomonas putida. Благодаря мутагенезу ДНК, кодирующих креатинамидиногидро" лазу, можно достигнуть особенно высокой экспрессивности* В E.coli' ЕД/рВТ 2А-1 DSM 3143 активность составляет 500 ед./г биомассы (влажной), удельная активность 4,5 ед,/мг протеина. Так как удельная активность высокоочищенного протеина ' составляет 9 ед./мг ( это означает, что креатипамидиногидролаза в E.coii составляет 50% растворимого протеина. Анализ сырого экстракта в DSS-ren-e показывает, что креатинамидиногидрола 40 за представляет основную полосу фракции растворимого протеина. ляет около 600 ед/г сырой массы или 4,5 ед./мг протеина. Плазмиду рВТ 306.16 трансформируют в клетки Pseudomonas putida штамма 2440, причем получают Р, putida DSM H3U7. После очистки отдельных колоний инкубируют культуру в DYT-среде, которая содержит 200 /кг/мл стрептомицина при 30°С в течение ночи. Ферментационную среду (ДУТ) засевают •(инокулят 1%) и оставляют культуру для роста на 20-30 ч при 30°С. Активность после 25 ч составляет около 220 ед./г сырой массы, активность !,8 ед о /мг протеинао Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Способ получения штаммов ба терий Escherichia coli и Pseudomonas putida - продуцентов креатинамидиногидролазы, заключающийся в том, что хромосомную ДНК из Pseudomonas putida DSM 2106 и ДНК фага Шарон 10 обраба- . тывают эндонуклеазой Eco.RI, лигируют полученные фрагменты, упаковывают гибридные ДНК в присутствии 2-х протеинов оболочки фага, трасдуцируют полученными гибридными фагами клетки E.coli DSM 2102, которые предварительно обрабатывают в течение ночи 0,2%-ным раствором мальтозы и растворяют в 0,1 М/л MgSCb, далее идентифицируют фаги, экспрессирующие креатинамидиногидролазу с помощью индикаторной системы, содержащей 6 мг/мл тетраметилбензидинл, 20 мг/мл диоктилнатрийсукцината и 0,01% гід0а в 6%-ной желатине, выделяют фаги, дающие положительную реакцию, ДНК этих фагов об-f рабатывают эндонуклеазой Eco.RI с последующим выделением фрагмента размером 5,8 кВ, которые обрабатывают эндонуклеазой PvuII, выделяют Eco.RI П р и м е р 5. Для культивировании.^ PvuII - фрагмент размером 2,2 кБ, в ферментере применяют три различных который лигируют с расщепленным Г системы хозяина E 0 coli s а именно Eco o RI и PvuII вектором pBR 322, поE.coli W 3350, E.coli ЕД 8654 и E.coli' лученной рекомбинантной ДНК трансфорСНІ. Ппязмиду рБТ 2а-1 трансформируют мируют клетки бактерий E.coli DSM в соответствующие компетентные клетки. 2102, отбирают клетки, конститутивно Отдельные колонии культуры выращивают продуцирующие креатиназу, полученные в DYT-среде, которая содержит 20 [Цг/мл клетки обрабатывают 25 мг/мл нитрозо- . ампициллина^ в течение ночи при 37°С„ гуанидиыом, выделяют плазмидную ДИК, Ферментационную среду (DYT) засевают которой трансформируют клетки Е»coпредварительной культурой (инокулят li DSM 2102 s отбирают бактерии, со1%) и без отбора на содержание плазми-*35 держащие плазмиду рВТ 2а-1, полученды оставляют на 20-30 ч при 37 С дляной плазмидной ДНК трансформируют роста. Активность креатинамидиногидроE.coli DSM 2102 к обрабатывают ее лазы после 25 ч инкубирования состав 523055 эндонуклеазами Pvul и PvuII, выделяют фрагмент размером 2,8 кВ, который лигирутот с фрагментом Pvul - Smal размером 10 кВ вектора рБТ 306,1, полученного в результате обработки плазмнды pSE 103 0 и лигирования с 10 фрагментом 1,4 кБ НаеІЇ плазмиды рАСУС177, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют клетки P.putida DSM 2440 и выделяют клоны» конститутивно продуцирующие креатинамидиногидролаяу. Та Номер 1 2 3 4 5 6 7 Состав Креатин NaN0 3 Trie HC1 с рН 7,8 Саркозиноксилаз а Пероксидаза 4 m AAH EST б л и ц а . 1 .. . . Содержание Концентрация 10 мм 0,5 мм 20 мм 5 ед./мп 2,5 ед./мл 0,25 мг/мп 1,5 мг/мл Конечная То же - " - " - " - " Т а б л и ц а Креатинамидиногидролаза в Pseudomonas putida и E.coli Ш амм/плаз мид т 1 2 Pseudomonas putida 2440 То же 3 Pseudomonas putida рБТ 306,16 Е. coli ED , Е. coli ED/pBT 3-2 E.coli ED/pBT 2a-l 4 5 6 Редактор М„Петрова 2 Активность ед/л Выращивание 1 250 - креатин 1800 ± ' 30 2800 •• креатин * креатин креатин креатин креатин Составитель Н,Кузенкова Техред Л.Сердюкова Корректор О о Кравцова Заказ_6985/59 Тираж 501 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР W3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Цроизводственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101