Нові композиції вакцин

1. Імуногенна композиція, що є емульсією типу "масло-у-воді" (0/W), включає: (1) водний розчин, що містить антиген або імуноген, здатний індукувати імунну відповідь у хазяїні; (2) неіоногенний ліпофільний етоксилований С9С22 спирт жирного ряду, етоксилований 1-4 ЕО; (3) мінеральне масло, що містить лінійний або розгалужений вуглецевий ланцюг, що містить від 15 до 32 атомів вуглецю; (4) неіоногенна гідрофільна поверхнево-активна речовина, яка є етоксилованим С9-С22 спиртом жирного ряду, етоксилованим 5-21 ЕО, де сумарна концентрація поверхнево-активних речовин (по масі на об'єм емульсії) складає від 0,2 % до 6,5 %, концентрація масляної фази, що включає масло(а) і поверхнево-активні речовини, складає від 2 % до 50 % і температура інверсії фаз (PIT) складає від 25 °С до 65 °С. 2. Імуногенна композиція за п. 1, в якій етоксилований спирт жирного ряду вибраний з групи, що складається з олеїлового, цетилового, стеарилового, ізостеарилового, лаурилового спирту і їх комбінацій, переважно є олеїловим спиртом. 3. Імуногенна композиція за п. 1, в якій неіоногенний ліпофільний етоксилований спирт жирного ряду є Brij® 30, Brij® 92/93, Brij® 72, Brij® 52 (Uniqema), Volpo® L3, Volpo® N3, Volpo® L4 (Croda), Bs-4, Bd-2, Bd-4, Bt-3 (Nikko Chemicals) або будь-якою їх комбінацією. 4. Імуногенна композиція за п. 1, в якій неіоногенний гідрофільний етоксилований спирт жирного 2 (19) 1 3 94404 4 14. Імуногенна композиція за п. 1, в якій мінераль17. Імуногенна композиція за п. 16, в якій рослинне не масло є MARCOL® 52, MARCOL® 82 (Esso) або масло складає від 0,1 % до 33 % масляної фази, «DRAKEOL® 6VR» (Penreco). краще від 5 % до 15 % об./об. 15. Імуногенна композиція за п. 1, в якій масло є 18. Імуногенна композиція за п. 16 або п. 17, в якій сумішшю масел, що містить щонайменше два марослинним маслом є арахісове масло, горіхове сла в будь-якому співвідношенні. масло, соняшникова олія, сафлорове масло, соєве 16. Імуногенна композиція за п. 1, що додатково масло і масло енотери. містить щонайменше одне рослинне масло. 19. Імуногенна композиція за п. 1, в якій антиген або імуноген є Mycoplasma hyopneumoniae, свинячий цирковірус 2 або Helicobacter pylori. Споріднені заявки Дана заявка претендує на пріоритет заявки США № 11/107000, поданої 15 квітня 2005 p., зміст якої включений в дану заявку шляхом посилання. Посилання Попередні заявки та всі документи, які цитують в цих заявках або під час їх розгляду («документи, цитовані в заявці»), і всі документи, на які посилаються або які цитують в «документах, цитованих у заявці», і всі документи, на які посилаються тут або які цитують тут («цитовані тут документи»), всі документи, на які посилаються або які цитують в «цитованих тут документах», разом з будь-якими інструкціями виробника, описами, специфікаціями продуктів і технологічних карт для будь-яких продуктів, згаданих тут або в будь-якому документі, включеному сюди шляхом посилання, і тим самим включеним в дану заявку шляхом посилання, можуть використовуватися в практиці винаходу. Область техніки Даний винахід стосується емульсій типу «масло-у-воді», їх застосування як ад'ювантів та фармакологічних імунологічних композицій і композицій вакцин, що містять згадані емульсії. Попередній рівень техніки Застосування ад'ювантів у вакцинах добре відомо. Ад'ювант є сполукою, що при об'єднанні з імуногеном вакцини підсилює імунну відповідь на імуноген. Серед методів, які підсилюють імуногенність білка, глікопротеїну або пептиду, є методи, у яких емульгують імуногени [Nossal 1999, In: Fundamental Immunology. Paul (Ed.), LippincottRaven Publishers, Philadelphia, Pa.; Vofiel and Powell, 1995, In: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell and Newman (Eds.), Plenum Press, NY, N.Y. p 141]. Завдяки значній ролі, яку ад'юванти грають у підвищенні імуногенності імуногенів вакцин, застосування ад'ювантів в рецептурах вакцин є практично повсюдним [Nossal, 1999, supra; Voqel and Powell, 1995, supra; ідеї вищезгаданих робіт включені в дану заявку шляхом посилання]. Загальноприйняті ад'юванти, добре відомі в даній області техніки, є різними по своїй природі. Вони можуть складатися, наприклад, з нерозчинних у воді неорганічних солей, ліпосом, міцел або емульсій, тобто, ад'ювант Фрейда. Інші ад'юванти можна знайти у вищезгаданій роботі [Vogel and Powell, 1995, supra]. Хоча єдиного механізму дії ад'ювантів не існує, важливою характеристикою ад'ювантів є їх здатність значно підсилювати імунну відповідь на імуноген вакцини у порівнянні з відповіддю, індукованою тільки імуногеном вакцини [Nossal 1999, supra; Vogel and Powell, 1995, supra]. При цьому деякі ад'юванти більш ефективні у випадку наростаючих гуморальних імунних відповідей, інша група ад'ювантів більш ефективна при посиленні імунних клітинних відповідей. [Vogel and Powell, 1995, supra] і ще одна група ад'ювантів підсилює як гуморальну, так і клітинну імунні відповіді проти антигенів, використовуваних для приготування вакцин [Vogel and Powell, 1995, supra]. Емульсії, використовувані в рецептурі вакцин, містять суміш масла, водного розчину та поверхнево-активних речовин. Деякі емульсії включають ліпофільну поверхнево-активну речовину, таку як Span 80 і гідрофільну поверхнево-активну речовину, таку як Tween 80. Згадані емульсії можуть також містити такі сполуки, як лецитин або сапонін, що, як відомо, мають властивості іоногенних поверхнево-активних речовин. Однак, при роботі з емульсіями, використовуваними як ад'юванти вакцин, можуть виникати проблеми, зв'язані зі стабільністю емульсій. Ферментативна активність ліпази або естерази, що находяться у розчині або суспензії імуногена, може викликати гідроліз поверхнево-активних речовин емульсії 2Xnidi, що приводить до втрати стабільності ад'юванта. Ліпази та естерази можуть надходити, наприклад, із клітинної культури, використовуваної для вирощування вірусів або бактерій. Ці твердження особливо справедливі тоді, коли зазначені композиції містять концентровані імуногени, конкретно, неочищені концентровані імуногени. Звичайно це має місце у випадку ад'ювантів, використовуваних в інактивованих (убитих) вакцинах. Вищевказана проблема є ще більш важливою для композицій полівалентних вакцин, оскільки в такому саме об'ємі розріджувача вище концентрація імуногенів. Ще одна проблема застосування ад'ювантів пов'язана з ризиком небажаних явищ, таких як токсичність або локальне запалення в місці ін'єкції. Наприклад, після ін'єкції можливі локальна запальна відповідь та/або утворення гранулем. Для того, щоб обмежити таку небажану реакцію, можна зменшувати вміст поверхнево-активних речовин та інших компонентів в емульсії; однак, таке зменшення може привести до зниження стабільності композиції вакцини. Отже, існує потреба в нових ад'ювантах і композиціях вакцин, що містять такі ад'юванти, які мають підвищену стабільність та нешкідливість. Цитування або ідентифікація будь-якого документа в даній заявці не є визнанням того, що та 5 94404 6 кий документ пропонується як попередній рівень Емульсії, виготовлені за даним винаходом, батехніки відносно даного винаходу. зуються на комбінуванні, щонайменше, двох повеКороткий опис винаходу рхнево-активних речовин, вибраних з членів двох У першому варіанті здійснення даний винахід різних груп поверхнево-активних речовин (ліпофістосується нової емульсії типу «масло-у-воді» льних та гідрофільних поверхнево-активних речо(O/W), що має підвищену стабільність в присутновин), і можливе використання одного або декількох сті суспензій бактерій, паразитів або вірусів, особповерхнево-активних речовин, що належать до ливо, концентрованих, неочищених або погано кожної групи. очищених суспензій. У ще одному кращому варіанті здійснення виЩе один варіант здійснення даного винаходу находу даний винахід стосується композиції вакстосується стабільної, нешкідливої O/W емульсії, цини, що включає нову емульсію, яка може містищо легко вводиться (конкретно, шляхом ін'єкції), ти, щонайменше, один імуноген, придатний для яка діє як середовище для доставки фармацевтиіндукування імунної відповіді у вакцинованого сучної композиції, що містить, щонайменше, один б'єкта. Крім того, винахід стосується таких компоактивний інгредієнт, який, більш конкретно, може зицій, у яких емульсія діє як ад'ювант для посибути імуногеном. лення імунної відповіді, індукованої імуногеном, Ще один варіант здійснення даного винаходу конкретно, для посилення клітинної імунної відпостосується стабільної, нешкідливої O/W емульсії, віді, гуморальної імунної відповіді або, краще, що легко вводиться шляхом ін'єкції, яка діє як обох. ад'ювант для посилення імунної відповіді, індукоУ кращому варіанті здійснення винаходу антиваної імуногеном. Конкретно, даний винахід стосуген або імуноген є Mycoplasma, краще, ється нового ад'юванту, який при використанні Mycoplasma hyopneumoniae, свинячим цирковірукомпозиції вакцини, що містить імуноген, підсилює сом, краще, свинячим цирковірусом-2 або клітинну імунну відповідь вакцинованого суб'єкта, Helicobacter, краще, Helicobacter cerdo або гуморальну імунну відповідь або, краще, обидва Helicobacter pylori, або їх похідними. типи відповіді на імуноген. У ще одному кращому варіанті здійснення даЩе один варіант здійснення даного винаходу ний винахід стосується способу приготування комстосується стабільної, безпечної та імуногенної позиції вакцини, де імуноген, особливо, імуноген у композиції або вакцини, що містить O/W емульсію. ліофілізованій формі або у водному розчині, зміЩе один варіант здійснення даного винаходу шують із ад'ювантом за розглянутим винаходом стосується способу виготовлення композиції вакІмуноген може бути вибраний з групи, що складацини з використанням ад'юванта за даним винається з інактивованих патогенів, ослаблених патоходом, композиції вакцини, одержаної таким спогенів, субодиниць антигенів ослаблених патогенів, собом, і способів її застосування. субодиниць антигенів, рекомбінантних експресуюЩе один варіант здійснення даного винаходу чих векторів, що включають плазміди і т.п. Патоген стосується набору, що містить імуноген або інший може мати бактеріальне, вірусне, протозоальне, фармацевтичний продукт у першому флаконі та паразитичне чи грибкове походження, або імуноад'ювант, приготовлений за даним винаходом, у ген може бути токсоїдом. другому флаконі, причому мається на увазі, що У ще одному кращому варіанті здійснення даперед використанням ад'ювант змішують з імуноний винахід стосується способу індукування імунгеном або іншим продуктом вакцини. ної відповіді у вакцинованого проти патогена суДаний винахід в одному варіанті здійснення б'єкта, який включає введення суб'єкту композиції винаходу стосується емульсії типу «масло-у-воді» вакцини за даним винаходом. (O/W), яка може включати: У ще одному кращому варіанті здійснення да(1) водний розчин, що містить імуноген, ний винахід стосується наборів, що містять, що(2) мінеральне масло, найменше, два флакони, у першому флаконі на(3) неіоногенний гідрофільний етоксилований ходиться імуноген, головним чином, імуноген у спирт жирного ряду, ліофілізованій формі або в розчині у водному се(4) неіоногенну гідрофільну поверхневоредовищі, а в другому флаконі находиться ад'юактивну речовину, вибрану з групи етоксилованого вант або емульсія за даним винаходом. спирту жирного ряду, блок-співполімеру поліоксіеВідзначимо, що в даному описі та конкретно у тилен-поліоксипропілен та/або будь-якої їх комбіформулі винаходу терміни, такі як «містить», «що нації. міститься» та «вмісний» і т.п., можуть мати знаДаний винахід у ще одному варіанті здійсненчення, приписані таким термінам у Патентному ня винаходу стосується емульсії типу «масло-узаконі США, наприклад, вони можуть означати воді» (O/W), яка може включати: «включає», «включений», «що включає» і т.п.; те(1) водний розчин, що містить імуноген, рміни, такі як «такий, що складається по суті з» та (2) неіоногенну ліпофільну поверхнево«складається по суті з» мають значення, приписуактивну речовину, вибрану з групи етоксилованого ване ним Патентним законом США, наприклад, спирту жирного ряду, блок-співполімеру поліоксіевони передбачають елементи, що викладаються тилен-поліоксипропілен та/або будь-якої їх комбіне у прямій формі, але виключають елементи, які нації, були виявлені на попередньому рівні техніки або (3) мінеральне масло, які впливають на основну чи нову характеристику (4) неіоногенний гідрофільний етоксилований винаходу. спирт жирного ряду. Згадані варіанти здійснення винаходу та інші варіанти розкриваються в нижченаведеному до 7 94404 8 кладному описі або є очевидними та включені в бінантний вектор, що містить вставку з імуногендокладний опис. ними властивостями, шматок фрагмента ДНК, Докладний опис винаходу здатний індукувати імунну відповідь при знахоДля зручності тут наведені деякі терміни, що дженні у тварині-хазяїні, білок, глікопротеїн, ліпопвикористовуються в описі, прикладах і доповненротеїн, поліпептид, пептид, епітоп, гаптен або нях та у формулі винаходу. будь-яку їх комбінацію. Альтернативно імуноген Термін «тварина», використовуваний тут, або антиген можуть містити токсин або антитоквключає всіх хребетних тварин, у тому числі люсин. дину. Він також включає особину тварини на всіх Термін «полівалентний» тут використовують стадіях розвитку, включаючи ембріональну та федля позначення вакцини, що містить більше однотальну стадії. Конкретно, термін «хребетна твариго антигену або одного й того самого виду (наприна» включає (але не обмежується переліченим клад, різні ізоляти Mycoplasma hyopneumoniae), нижче) людину, сімейство псових (наприклад, соабо різних видів (наприклад, ізоляти як з баки), сімейство котячих (наприклад, кішки), сімейPasteurella hemolytica, так і з Pasteurella multocida), ство коней (наприклад, коні), жуйних тварин (наабо вакцини, що містить комбінацію антигенів різприклад, велика рогата худоба), сімейство свиней них родів (наприклад, вакцини, що містить антиге(наприклад, свині), сімейство овець (наприклад, ни з Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia вівці), сімейство кіз (наприклад, кози), кроликів, а соli, Haemophilus somnus та Clostridium). також птахів. Термін «птах» використовують тут Термін «ад'ювант» тут використовують для подля позначення будь-яких видів або підвидів такзначення речовини, яку додають до вакцини для сономічного класу Aves, наприклад, курей (племінзбільшення її імуногенності. Механізм дії ад'юванних, м'ясних і несучок), індиків, уток, гусаків, перета погано зрозумілий. Гадають, що деякі ад'юванти пелів, фазанів, папуг, співочих птахів, ворон і підсилюють імунну відповідь, повільно вивільняюбескільових птахів, включаючи страуса, ему та чи антиген, тоді як інші ад'юванти можуть опосредказуара. ковувати їх ефекти за будь-яким з нижчевказаних Використовуваний тут термін «свиня» або механізмів: збільшенням клітинної інфільтрації, «порося» стосується тварини, що походить із сізапаленням і перенесенням до місця ін'єкції, конкмейства свиней, тоді як термін «свиноматка» сторетно, для антигенпрезентуючих клітин (АРС), сується самки свині в репродуктивному віці, здатпромотуванням стану активації АРС шляхом підної до репродукції. вищення регуляції співстимулюючих сигналів або Використовуваний тут термін «вірулентний» експресії головного комплексу гістосумісності стосується ізоляту, що зберігає свою здатність (МНС), збільшенням презентації антигенів або інфікувати у тварині-хазяїні. індукуванням вивільнення цитокінів для непрямої Використовуваний тут термін «інактивована дії. Найбільш придатний ад'ювант для даного імувакцина» стосується композиції вакцини, що місногена вакцини буде у великому ступені залежати тить інфекційний організм або патоген, більше не від типу імунної відповіді, потрібної для захисного здатний до реплікації або росту. Патоген може імунітету. Можливо, вибір ад'юванта є певною мібути бактеріального, вірусного, протозойного, парою емпіричним. Відомі ад'юванти для вакцин разитичного або грибкового походження. Інактивключають (але не обмежуються переліченими вація може бути здійснена безліччю методів, які нижче) масляні та водні емульсії (наприклад, поввключають високий тиск, хімічну обробку (наприний ад'ювант Фрейда та неповний ад'ювант Фрейклад, обробку тимеросалом або формаліном), да), конкретно, емульсії типу «масло-у-воді», емуруйнування ультразвуком, опромінення, нагріванльсії типу «вода-у-маслі», емульсії типу «вода-уня або будь-які інші загальноприйняті засоби, досмаслі-у-воді». Вони також включають, наприклад, татні для того, щоб не допустити реплікації або сапонін, гідроксид алюмінію, сульфат декстрану, росту організму при збереженні його імуногенності. карбомер, альгінат натрію, "AVRIDINE" (N,NВикористовуваний тут термін «імуногенність» діоктадецил-N',N'-біс-(2-гідроксіетил)означає здатність продукувати імунну відповідь у пропандіамін), парафінове масло, мурамілдипептварині-хазяїні проти імуногена або імуногенів. тид, катіонні ліпіди (наприклад, DMRIE, DOPE та їх Зазначена імунна відповідь створює основу захискомбінації) і т.п. ного імунітету, викликуваного вакциною проти конВикористовувані тут терміни «фармацевтично кретного інфекційного організму. прийнятний носій» та «фармацевтично прийнятна Використовуваний тут термін «імунна відпооснова (середовище)» є взаємозамінними та стовідь» стосується відповіді, викликуваної у тварині. суються рідкої основи (середовища) для імуногеІмунна відповідь може належати до клітинного нів вакцини, які можна вводити хазяїну без значімунітету (СМІ), гуморальному імунітету або може них несприятливих ефектів. Придатні включати обидва типи. Даний винахід також розгфармацевтично прийнятні носії, відомі в даній облядає відповідь, обмежену частиною імунної сисласті техніки, включають (але не обмежуються теми. Наприклад, композиція вакцини за даним ними) стерильну воду, фізіологічний розчин, глювинаходом може конкретно викликати збільшену козу або буферні розчини. Носії можуть включати відповідь гамма-інтерфероном. допоміжні речовини, які включають (але не обмеВикористовуваний тут термін «антиген» або жуються переліченими нижче) розріджувачі, стабі«імуноген» означає речовину, що індукує специфілізатори (наприклад, цукри та амінокислоти), кончну імунну відповідь у тварині-хазяїні. Антиген мосерванти, зволожуючі речовини, емульгатори, же містити цілий організм, убитий, ослаблений або буфери, агенти регулювання рН, добавки, що збіживий; субодиницю або порцію організму, рекомльшують в'язкість, барвники і т.п. Фармацевтично 9 94404 10 прийнятні або прийнятні для ветеринарії носії або Даний винахід у ще одному варіанті здійсненсередовища або ексципієнти добре відомі фахівцю ня винаходу стосується нового ад'юванту або в даній області техніки. Наприклад, фармацевтичемульсії типу «масло-у-воді» (O/W), що може місно прийнятним або прийнятним для ветеринарії тити: носієм або середовищем або ексципієнтом може (1) водний розчин, який містить антиген, викобути 0,9% розчин NaCI (наприклад, фізіологічний ристовуваний для приготування вакцини, або імурозчин) або фосфатний буфер. Дози та об'єми доз ноген, здатні індукувати імунну відповідь у хазяїні, обговорюються тут в описі даної заявки і також (2) неіоногенну гідрофільну поверхневоможуть бути визначені фахівцем із зазначеного активну речовину, вибрану з групи етоксилованого опису в сполученні зі знаннями в даній області без спирту жирного ряду, блок-співполімеру поліоксіепроведення відповідних експериментів. тилен-поліоксипропілен (блок-співполімер РОЕТермін «композиція вакцини» тут використоPOP) та/або будь-якої їх комбінації, вують для позначення композиції, яка включає, (3) мінеральне масло, щонайменше, один антиген або імуноген у фарма(4) неіоногенний ліпофільний етоксилований цевтично прийнятному носії (середовищі) для інспирт жирного ряду. дукування імунної відповіді в хазяїні. Композиції Емульсії, виготовлені за даним винаходом, бавакцин можна вводити в дозах і за методиками, зуються на комбінації, щонайменше, двох поверхдобре відомими фахівцям у медицині та ветеринево-активних речовин, вибраних із двох різних нарії, беручи до уваги такі фактори, як вік, стать, груп поверхнево-активних речовин (ліпофільних та масу тіла, вид і стан тварини-реципієнта та шлях гідрофільних поверхнево-активних речовин), і мовведення. Шлях введення може бути черезшкіржливе використання одного або декількох поверхним, введенням через слизову (наприклад, перонево-активних речовин, що належать до кожної ральний, назальний, очний) або парентеральним групи. (наприклад, внутрішньошкірний, внутрішньом'язоЛіпофільний етоксилований спирт жирного рявий, підшкірний). Для парентерального введення ду може бути етоксилованим спиртом жирного продукту хазяїну можна використати або шприц із ряду, який може містити приблизно 43% молекуголкою, або безголковий пристрій для ін'єкцій. лярної маси (мас/мас.) чи менше етиленоксиду Композиції вакцини можна вводити окремо або їх (ЕО). Ліпофільний блок-співполімер поліоксіетиможна вводити спільно чи послідовно з іншими лен-поліоксипропілен (блок-співполімер РОЕ-POP) препаратами та видами лікування. Форми для є співполімером, що може містити приблизно 35% введення можуть включати суспензії та препарати (мас/мас.) чи менше етиленоксиду. для парентерального, підшкірного, інтрадермальГідрофільний етоксилований спирт жирного ного або внутрішньом'язового введення (наприряду може бути етоксилованим спиртом жирного клад, введення шляхом ін'єкції), такі як стерильні ряду, що містить більше приблизно 43% (мас/мас.) суспензії та емульсії. Композиції вакцин можна етиленоксиду (ЕО). Гідрофільний блок-співполімер вводити у вигляді спрея або в суміші з їжею та/або поліоксіетилен-поліоксипропілен (блок-співполімер водою або доставляти в суміші з придатним носіРОЕ-POP) є співполімером, що може містити приєм, розріджувачем або ексципієнтом, таким як близно 55% (мас/мас.) чи менше етиленоксиду. стерильна вода, фізіологічний розчин, глюкоза і Для неіоногенних гідрофільних поверхневот.п. Композиції можуть містити допоміжні речовиактивних речовин етоксилований спирт жирного ни, такі як зволожуючі речовини або емульгатори, ряду є С9-С22 спиртом жирного ряду, краще, виббуферні агенти, що регулюють рН, ад'юванти, гераним з групи, що складається з олеїлового, цетилеутворювачі або агенти, що збільшують в'язкість, лового, стеарилового, ізостеарилового, лаурилоконсерванти, речовини, що надають смак та арового спирту та їх комбінацій, краще, олеїлового мат, барвники і т.п., залежно від шляху введення спирту, та, ще краще, олеїлового спирту, етоксита необхідного препарату. лованого 5-21 ЕО. MM блок-співполімеру РОЕМожна звернутися за довідкою до нормативPOP становить від приблизно 3000 до приблизно них фармакологічних довідників, таких, наприклад, 16000. як "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1990), Група неіоногенних гідрофільних поверхневодля того, щоб одержати придатні препарати без активних речовин включає (але не обмежується зайвого експериментування. переліченими нижче) етоксиловані спирти жирного Даний винахід в одному варіанті здійснення ряду: Brij 76 [Steareth-10], Brij 56 [Ceteth-10], Brij винаходу стосується нового ад'юванту або емуль96/97 [Oleth-10], Brij 98 [Oleth-20], Brij 721 сії типу «масло-у-воді» (O/W), що може містити: [Steareth-21], Brij 58 [Ceteth-20], Brij 35 [Laureth(1) водний розчин, який містить антиген або 23], Brij 78 [Steareth-20], (Uniqema) Volpo N5 імуноген вакцини, здатні індукувати імунну відпо[Oleth-5], Volpo CS6 [Ceteareth-6], Volpo CS12 відь у хазяїні, [Ceteareth-12], Volpo CS20 [Ceteareth-20], Volpo (2) неіоногенний ліпофільний етоксилований CS25 [Ceteareth-25], Volpo CS23 [Ceteareth-23] спирт жирного ряду, (Croda), BL9-EX [Laureth-9], BC-7 [Ceteth-7], BT-5 (3) мінеральне масло, [C12-14 Pareth-5], BT-7 [C12-14 Pareth-7], BT-9 (4) неіоногенну гідрофільну поверхнево[C12-14 Pareth-9], BT-12 [C12-14 Pareth-12], BD-10 активну речовину, вибрану з групи етоксилованого [C12-15 Pareth-10], BO-7V [Oleth-7], BC5,5 [Cetehtспирту жирного ряду, блок-співполімеру полюксіе6], BL-21 [Laureth-21], BL-25 [Laureth-25], BC-15TX тилен-поліоксипропілен (блок-співполімер РОЕ[Ceteth-15], BC-23 [Ceteth-23], BC-25TX [Ceteth-25], POP) та/або будь-якої їх комбінації. BO-15V [Oleth-15], BO-50V [Oleth-50], BB-20 [Beheneth-20], (Nikko Chemicals) та їх комбінації; 11 94404 12 (5) неіоногенний гідрофільний етоксилований блок-співполімери РОЕ-POP: Lutrol F127 спирт жирного ряду, що містить приблизно 71% [Poloxamer 407], Lutrol F68 [Poloxamer 188], (мас/мас.) чи більше етиленоксиду. Lutrol F108 [Poloxamer 338], Lutrol F98  Етоксилований спирт жирного ряду, що міс[Poloxamer 278], Lutrol F87 [Poloxamer 227], тить більше приблизно 43% і менше приблизно Lutrol F88 [Poloxamer 228], Lutrol F77 [Poloxamer 71% (мас./мас.) етиленоксиду є, краще, олеїловим 207], Lutrol F38 [Poloxamer 108] (BASF), Tetronics спиртом, етоксилованим (5-14 ЕО). Спирт жирного   T1307, Tetronics T1107, Tetronics T908 (BASF) та ряду, що містить приблизно 71% (мас/мас.) чи біїх комбінації. льше етиленоксиду, є, краще, олеїловим спирт, Для неіоногенних ліпофільних поверхневоетоксилованим 15 ЕО чи більше. активних речовин етоксилований спирт жирного У зазначеному кращому варіанті здійснення ряду є С9-С22 спиртом жирного ряду, краще, вибвинаходу концентрація неіоногенного гідрофільнораним з групи, що складається з олеїлового, цетиго етоксилованого спирту жирного ряду звичайно лового, стеарилового, ізостеарилового, лаурилостановить від приблизно 1,0% до приблизно 5,0%, вого спирту та їх комбінацій, краще і ще краще, конкретно, від приблизно 1,5% до приблизно 4,5%, олеїлового спирту, етоксилованого 1-4 ЕО. MM ще краще, від приблизно 2,0% до приблизно 3,5%, блок-співполімеру РОЕ-POP становить від прибвиражена в процентах маси до об'єму емульсії лизно 1000 до приблизно 8000. (мас/об.). Для неіоногенних високогідрофільних Група неіоногенних ліпофільних поверхневоетоксилованих спиртів жирного ряду концентрація активних речовин включає (але не обмежується звичайно становить від приблизно 0,01% до прибпереліченими нижче) етоксиловані спирти жирного лизно 3,0%, конкретно, від приблизно 0,05% до    ряду: Brij 30 [Laureth-4], Brij 92/93 [Oleth-2], Brij приблизно 2,5%, ще краще, від приблизно 0,1% до   72 [Steareth-2], Brij 52 [Ceteth-2] (Uniqema), Volpo приблизно 2,0% (мас/об.). Концентрація неіоноL3 [C12-13 Pareth-3], Volpo N3 [Oleth-3], Volpo L4 генного ліпофільного етоксилованого спирту жир[C12-13 Pareth-4] (Croda), BS-4 [Steareth-4], BD-2 ного ряду становить звичайно від приблизно 0,1% [C12-15 Pareth-2], BD-4 [C12-15 Pareth-4], BT-3 до приблизно 2,5%, конкретно, від приблизно 0,2% [C12-14 Pareth-3] (Nikko Chemicals), їх комбінації; до приблизно 2,0%, краще, від приблизно 0,2% до  блок-співполімери РОЕ-POP: Pluronic L121 приблизно 1,5%, ще краще, від приблизно 0,2% до [Poloxamer 401], Pluronic L101 [Poloxamer 331], приблизно 1,2% (мас/об.). Pluronic L81 [Poloxamer 221], Pluronic L62 У кращому варіанті здійснення винаходу даний [Poloxamer 182], Pluronic L43 [Poloxamer 123], винахід стосується емульсії типу «масло-у-воді» Pluronic P103 [Poloxamer 333], Pluronic L123 (O/W), що може містити: (1) водний розчин, який містить антиген або [Poloxamer 403], Lutrol L63 [Poloxamer 183], імуноген вакцини, здатний індукувати імунну відLutrol Ρ122 [Poloxamer 402], Lutrol L92 повідь у хазяїні, [Poloxamer 272], Lutrol L72 [Poloxamer 202], (2) неіоногенний ліпофільний етоксилований Lutrol L42 [Poloxamer 122], Lutrol L61 [Poloxamer спирт жирного ряду, 181] (BASF), Tetronics T1301, Tetronics T701, (3) мінеральне масло, Tetronics T901 (BASF) та їх комбінації. (4) неіоногенний гідрофільний етоксилований Поверхнево-активні речовини за винаходом спирт жирного ряду. можуть містити спирти жирного ряду тваринного та (5) неіоногенний гідрофільний блокрослинного походження. Зміну речовини одного співполімер поліоксіетилен-поліоксипропілен. типу походження на речовину іншого типу похоГідрофільний етоксилований спирт жирного дження можна здійснити просто шляхом незначноряду є, краще, спиртом жирного ряду, що містить го регулювання складу емульсії. більше приблизно 43% і менше, ніж приблизно Загальна концентрація поверхнево-активних 71% (мас/мас.) етиленоксиду, ще краще, олеїлоречовин в емульсії за винаходом (по масі на об'єм вим спиртом, етоксилованим 5-14 ЕО. Неіоногенемульсії) становить від приблизно 0,2% до прибний блок-співполімер РОЕ-POP може, краще, міслизно 6,5%, конкретно, від приблизно 1% до прибтити 70% (мас/мас.) етиленоксиду чи більше. лизно 6%, краще, від приблизно 1,5% до приблизУ зазначеному кращому варіанті здійснення но 5%, ще краще, від приблизно 2% до приблизно винаходу, концентрація неіоногенного гідрофіль3%. ного етоксилованого спирту жирного ряду, вираТакі емульсії мають низьку в'язкість та їх легко жена в процентах маси на об'єм емульсії (мас/об.), вводити шляхом ін'єкцій. становить звичайно від приблизно 1,0% до прибУ кращому варіанті здійснення даний винахід лизно 5,0%, конкретно, від приблизно 1,5% до стосується емульсії типу «масло-у-воді» (O/W), що приблизно 4,5%, ще краще, від приблизно 2,0% до може містити: приблизно 3,5%. Для неіоногенного блок(1) водний розчин, який містить антиген або співполімеру концентрація звичайно становить від імуноген вакцини, здатний індукувати імунну відприблизно 0,01% до приблизно 2,0%, більш конкповідь у хазяїні; ретно, від приблизно 0,1% до приблизно 1,5% (2) неіоногенний ліпофільний етоксилований (мас/об.). Концентрація неіоногенного ліпофільноспирт жирного ряду; го етоксилованого спирту жирного ряду звичайно (3) мінеральне масло; становить від приблизно 0,1% до приблизно 2,5%, (4) неіоногенний гідрофільний етоксилований конкретно, від приблизно 0,2% до приблизно 2,0%, спирт жирного ряду, що містить більше приблизно краще, від приблизно 0,2% до приблизно 1,5%, ще 43% і менше приблизно 71% (мас/мас.) етиленоксиду; 13 94404 14 краще, від приблизно 0,2% до приблизно 1,2% одне масло, вибране з масел, описаних вище, і, (мас/об.)· щонайменше, одне рослинне масло, і згадане роЕмульсія за винаходом звичайно може мати слинне масло складає від приблизно 0,1% до притемпературу інверсії фаз (PIT) більше або рівну 25 близно 33% масляної фази, краще, від приблизно °С, конкретно, в інтервалі від приблизно 28 °С до 5% до приблизно 15% об./об. Згадані рослинні приблизно 65 °С, більш конкретно, від приблизно масла є ненасиченими маслами з високим вмістом 33 °С до приблизно 60 °С. олеїнової кислоти, які здатні до біологічного розкPIT є температурою, при якій емульсія типу ладання та, краще, є рідкими при температурі збе«вода-у-маслі» перетворюється на емульсію типу рігання (приблизно +4 °С) або, щонайменше, до«масло-у-воді» або руйнується (руйнування емузволяють одержувати емульсії, які є рідкими при льсії та розділення 2 фаз). Величину PIT можна зазначеній температурі. Рослинне масло може, виміряти різними засобами, наприклад, візуально наприклад, бути арахісовою олією, горіховою оліабо шляхом вимірювання провідності. Емульсію єю, соняшниковою олією, сафлоровою олією, соєпоміщають на водну баню при температурі нижче, вою олією, олією енотери і т.п. ніж PIT даної емульсії, наприклад, приблизно 25 Даний винахід звичайно передбачає застосу°С. Температуру поступово підвищують. Спостерівання водного розчину, що містить придатні для гають зміни зовнішнього вигляду емульсії, тобто, ветеринарії та фармацевтичних цілей носій, ексзміну плинності, розділення на дві фази, зміну зоципієнт або розріджувач, що включають стерильну внішнього вигляду поверхні, обумовлену міграцією воду, фізіологічний розчин, глюкозу, буфер і т.п., масляної фази до поверхні, і порівнюють із контале не обмежені ними. Носій, ексципієнт або розрольною емульсією. Температура, для якої візуаріджувач можуть також включати поліоли, глюциди льно спостерігають таку зміну зовнішнього вигляабо агенти, що регулюють рН. Носій, ексципієнт ду, є величиною PIT емульсії. Альтернативно, PIT або розріджувач можуть також містити, наприклад, визначають швидким переходом від величини амінокислоти, пептиди, антиоксиданти, бактерипровідності, рівної приблизно 5-15 мілісицид, бактеріостатичну сполуку. До масла додають менс/сантиметр (mS/см) (емульсія типу «масло-уводний розчин і поверхнево-активні речовини в воді), до величини, приблизно рівної 0 mS/см кількості, необхідній для одержання 100% об'єму (емульсія типу «вода-у-маслі») для фізіологічного емульсії за винаходом. розчину як водної фази, вимірюваної зондом, поДаний винахід передбачає емульсію, що місміщеним в емульсію поблизу її поверхні. Температить парафінове масло, етоксилований олеїловий тура, для якої спостерігається перехід, є PIT для спирт (2-3 ЕО) як неіоногенну ліпофільну поверхданої емульсії. Фахівець середньої кваліфікації в нево-активну речовину, етоксилований олеїловий даній області техніки зможе визначити комбінації спирт (5-6 ЕО) як неіоногенну гідрофільну поверхповерхнево-активних речовин і масла, включаючи нево-активну речовину та блок-співполімер РОЕїх відносні концентрації, для того, щоб одержати POP, що містить приблизно 70-80% ЕО та має MM емульсії за винаходом та, конкретно, емульсії, що приблизно 9800-16000, як неіоногенну гідрофільну мають PIT в інтервалах, визначених вище, без поверхнево-активну речовину. Конкретно, концензайвого експериментування. трація парафінового масла становить від приблиЯк правило, емульсії за даним винаходом мозно 5% до приблизно 50%, і краще, від приблизно жуть містити по об'єму на об'єм емульсії (об./об.) 15% до приблизно 30% (об./об.), концентрація етовід приблизно 2% до приблизно 50% масляної ксилованого (2-3 ЕО) олеїлового спирту становить фази, що включає масло(а) і поверхнево-активні від 0,1% до 1,5%, краще, від 0,1% до 1,2% речовини, конкретно, від приблизно 4% до приб(мас/об.), концентрація етоксилованого (5-6 ЕО) лизно 40%, краще, від приблизно 8% до приблизолеїлового спирту становить від 1% до 5%, краще, но 35% і, ще краще, від приблизно 15% до прибвід 1% до 4% (мас/об.), і концентрація блоклизно 30%, масляної фази. За визначенням, співполімеру РОЕ-POP, що містить приблизно 70інтервали значень в даному описі завжди включа80% ЕО та має MM приблизно 9800-16000, станоють границю інтервалу, якщо не зазначене інше. вить від 0,01% до 2%, краще, від 0,05% до 1,5% Застосовуване масло може бути мінеральним (мас/об.). маслом, що включає парафінове масло, таке як У другому варіанті здійснення даного винаходу ізопарафінове масло та/або нафтенове масло, емульсія включає парафінове масло, етоксиловасквалан, сквален, пристан, поліізобутен, гідрований (2-3 ЕО) олеїловий спирт як неіоногенну ліпоний поліізобутен, полідецен, поліізопрен і т.п. Одфільну поверхнево-активну речовину, етоксиловане краще мінеральне масло, застосовне в даному ний (10 ЕО) олеїловий спирт як неіоногенну винаході, може включати масло, що містить лінійгідрофільну поверхнево-активну речовину та блокний або розгалужений вуглецевий ланцюг, який співполімер РОЕ-POP, що містить приблизно 70містить більше 15 атомів вуглецю, краще, від 15 80% ЕО та має MM приблизно 9800-16000, як неідо 32, і не містить ароматичних сполук. Такі масла оногенну гідрофільну поверхнево-активну речовиможуть, наприклад, бути маслами, які позиціонону. Конкретно, концентрація парафінового масла становить від 5% до 50%, краще, від 15% до 30% вані на ринку під назвою MARCOL 52 або (об./об.); концентрація етоксилованого (2-3 ЕО) MARCOL 82 (Esso) або "DRAKEOL 6VR" олеїлового спирту становить від 0,2% до 3%, кра(Реnrесо). ще, від 0,5% до 3% (мас/об.); концентрація етокМасло може також бути сумішшю масел, що силованого (10 ЕО) олеїлового спирту становить містить, щонайменше, 2 масла, вибрані з масел, 0,2% до 3%, краще, від 0,5% до 3% (мас./об.) і описаних тут, узяті в будь-якому співвідношенні. концентрація блок-співполімеру РОЕ-POP, що Суміш масел може також містити, щонайменше, 15 94404 16 містить приблизно 70-80% ЕО та має MM приблиті здійснення даного винаходу емульсію можна зно 9800-16000, становить від 0,01% до 2%, краприготувати при температурі, що нижче PIT емуще, від 0,05% до 1,5% (мас/об.). льсії, зокрема, при кімнатній температурі, наприУ третьому варіанті здійснення даного винаклад, при температурі близько 30 °С. Водну фазу ходу емульсія включає парафінове масло, етоксита масляну фазу змішують шляхом механічного лований (2-3 ЕО) олеїловий спирт як неіоногенну перемішування, наприклад, турбінною мішалкою, ліпофільну поверхнево-активну речовину, етоксиобладнаною ротором-статором, здатною створюлований (5-6 ЕО) олеїловий спирт як неіоногенну вати велике зсувне зусилля. Краще, перемішувангідрофільну поверхнево-активну речовину. Конкня починають при низькій швидкості обертання та ретно, концентрація парафінового масла станоповільно її збільшують при поступовому додаванні вить від 5% до 50%, краще, від 15% до 35% звичайно водного розчину до масла. Краще, щоб (об./об.); концентрація етоксилованого (2-3 ЕО) водний розчин поступово додавали до масла. Відолеїлового спирту становить від 0,5% до 2% ношення масло/водний розчин може бути адапто(мас/об.); концентрація етоксилованого (5-6 ЕО) ване для одержання емульсії типу «вода-у-маслі» олеїлового спирту становить від 1% до 5%, краще, (W/O), наприклад, при концентрації від приблизно від 2,0% до 4,5% (мас/об.). 40% до приблизно 55% масла (об./об.)· Коли пеДо емульсії можуть бути необов'язково додані ремішування припиняють, емульсія поступово зміяк співад'юванти інші сполуки, що включають (але нюється, перетворюючись на емульсію типу «масне обмежені переліченим нижче) алюміній, CpGло-у-воді» при охолодженні при кімнатній олігонуклеотиди (ODN), конкретно, ODN 2006, температурі (інверсія фаз). Після інверсії, якщо 2007, 2059, 2216 або 2135 [Pontarollo R. A. et al. необхідно, емульсію розбавляють шляхом додаVet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; вання водного розчину для одержання потрібної Wemette CM. et aL Vet. Immunol. Immunopath, концентрації масла в кінцевій емульсії. Емульсію 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al. Vet. Immunol. можна зберігати при температурі приблизно 5 °С. Immunopath, 2003, 91: 89-103; Kerkmann M. et al., У ще одному варіанті здійснення винаходу, J. Immunol, 2003, 170: 4465-4474]; поліА-полі емульсію можна одержувати при температурі ви["Vaccine Design The Subunit and Adjuvant ще, ніж PIT емульсії. На першій стадії змішують Approach", edited by Michael F. Powell and Mark J. водну фазу та масляну фазу при температурі виNewman, Pharmaceutical Biotechnology, 6:03]; броще, ніж PIT емульсії. Краще, поступово додавати мід диметилдіоктадециламонію (DDA) ["Vaccine водний розчин до масла. Відношення масDesign: The Subunit and Adjuvant Approach", edited ло/водний розчин може бути адаптоване для одеby Michael F. Powell and Mark J. Newman, ржання емульсії типу «вода-у-маслі» (W/O), наприPharmaceutical Biotechnology, volume 6: 157], N,Nклад, при концентрації від приблизно 40% до діоктадецил-N’,N’-біс(2-гідроксіетил)-пропандіамін приблизно 55% масла (об./об.). Емульгування можна здійснити шляхом перемішування з низьким (наприклад, Avridine) [Ibid, p. 148], карбомер, хітозсувним зусиллям або без зсувного зусилля, назан [див. наприклад, патент США № 5980912]. приклад, за допомогою статичного міксера або Даний винахід також стосується способу вигомішалки пропелерного або турбінного типу з дуже товлення композиції вакцин або імунологічної комнизькою швидкістю обертання. Одержана емульсія позиції, яка включає, щонайменше, один антиген є емульсію типу «вода-у-маслі» (W/O). На другій або імуноген та ад'ювант чи емульсію, приготовстадії емульсію поступово охолоджують нижче лену згідно з даним винаходом. Імуноген може PIT. На цій стадії емульсія змінюється, перетвобути уведений під час утворення емульсії або, в рюючись на емульсію типу O/W (інверсія фаз). альтернативному варіанті здійснення винаходу, Після інверсії, якщо необхідно, емульсію розбавімуноген можна додавати до емульсії пізніше, наляють шляхом додавання водного розчину для приклад, безпосередньо перед використанням. одержання потрібної концентрації масла в кінцевій Вся кількість використовуваного водного роземульсії. Емульсію можна зберігати при темперачину може находитися в емульсії, одержаної спотурі приблизно 5 °С. чатку. Або, можливо, тільки частину зазначеного Розмір краплин масла в емульсії може становодного розчину використовують для утворення вити від приблизно 100 нм до приблизно 500 нм. емульсії, а решту водного розчину додають із Емульсію можна використовувати, наприклад, як включенням імуногена. Імуноген або антиген може ад'ювант для складання композиції вакцини або бути в ліофілізованій формі або в деяких інших фармацевтичної композиції. Емульсію можна тапридатних твердих формах, і потім його змішують кож використовувати як розчинник для розчинення із емульсією або, альтернативно, антиген може висушеного продукту, особливо, ліофілізованого перебувати в розчині, конкретно, у водному розчипродукту, що містить, наприклад, ослаблені мікроні, і цей розчин змішують із емульсією. організми або живі рекомбінантні вектори. Поверхнево-активні речовини, краще, додають У конкретному варіанті здійснення винаходу або до масла або до водного розчину відповідно попередню емульсію одержують тільки із частидо їх розчинності. Наприклад, неіоногенні ліпофіною водного розчину. Зазначену попередню емульні поверхнево-активні речовини додають до мальсію можна розбавляти, щоб одержати кінцеву сла, за винаходом, тоді як неіоногенні гідрофільні композицію, додаючи суспензію активного інгредіповерхнево-активні речовини додають до водного єнта, такого як лікарський засіб або імуноген, крарозчину. ще, імуноген. Альтернативно, попередню емульЕмульгування може бути здійснене звичайнисію можна розбавляти водним розчином і ми способами, відомими середньому фахівцю в даній області техніки. Наприклад, в одному варіан 17 94404 18 використовувати для розчинення висушеного прочно прийнятному носії. Імуногени, що включають дукту, такого як ліофілізований продукт. віруси, бактерії, гриби і т.п., можна продукувати Імуноген або антиген, придатні для застосуметодами культивування in vitro, використовуючи вання за даним винаходом, можуть бути вибрані з відповідне культуральне середовище або лінії клігрупи, що складається з інактивованих патогенів, тин хазяїна та звичайні методики, добре відомі ослаблених патогенів, імуногенних субодиниць середнім фахівцям в даній області техніки. Напри(наприклад, білки, поліпептиди, пептиди, епітопи, клад, PRRS можна культивувати у відповідній лінії гаптени) або рекомбінантних експресуючих вектоклітин, такій як лінія клітин МА-104 [див. патенти рів, що включають плазміди, які містять імуногенні США №№ 5587164; 5866401; 5840563; 6251404, вставки. В одному варіанті здійснення даного висеред інших]. PCV-2 може бути культивований находу імуноген є інактивованим або вбитим оргааналогічно з використанням лінії клітин РК-15 [див. нізмом. У ще одному варіанті здійснення даного патент США № 6391314], SIV можна культивувати винаходу композиція вакцини містить імуноген, на яйцях [патент США № 6048537], та Mycoplasma вибраний з групи пташиних патогенів, які включаhyopneumoniae можна культивувати у відповідноють (але не обмежені переліченими нижче) му культуральному середовищі [патенти США № Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, вірус 5968525 та № 5338543; Ross R. F. et al., Am. J. Vet. інфекційного бронхіту (IBV), вірус ньюкасльсько Res., 1984,45: 1899-1905]. хвороби (NDV), вірус синдрому зниження несучості Для одержання інактивованих імунологічних (EDS) або вірус інфекційного захворювання синокомпозицій або композицій вакцин патоген, краще, віальної сумки (IBDV), вірус пташиного грипу і т.п. інактивують після харвестування або необов'язкота їх комбінації. во піддають очищенню засобами хімічної обробки, Альтернативно, композиція вакцини містить використовуючи, наприклад, формальдегід, бетаімуноген, вибраний з котячих патогенів, таких як пропіолактон, етиленімін, бінарний етиленімін (але не обмежених ними) вірус герпесу кішок (ВЕІ), тимеросал і т.п. та/або обробляють фізич(FHV), каліковірус кішок (FCV), вірус лейкозу кішок ними методами (наприклад, піддають нагріванню (FeLV), вірус імунодефіциту кішок (FIV), вірус сказу або дії ультразвуку). Способи інактивації добре і т.п. та їх комбінації. відомі фахівцям у даній області техніки. НаприУ ще одному варіанті здійснення винаходу, клад, вірус PRRS може бути інактивирований обкомпозиція вакцини за даним винаходом містить робкою бета-пропіолактоном [Plana-Duran ef al., імуноген, вибраний із собачих патогенів, що вклюVet. Microbiol., 1997, 55: 361-370] або обробкою чають (але не обмежені переліченими нижче) вірус ВЕІ [патент США № 5587164], інактивацію вірусу сказу, вірус герпесу собак (CHV), парвовірус собак PCV-2 можна здійснити шляхом обробки етилені(CPV), коронавірус собак, Leptospira canicola, міном або шляхом обробки бета-пропіолактоном Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira [Патент США № 6391314]; вірус свинячого грипу grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella можна інактивувати за допомогою детергенту типу bronchiseptica і т.п. та їх комбінації. Triton або обробкою формальдегідом [Патент США У ще одному варіанті здійснення винаходу, № 6048537], Mycoplasma hyopneumoniae bacterium композиція містить імуноген, вибраний з патогенів можна інактивувати обробкою формальдегідом коней, таких як вірус герпесу коней (типу-1 або [Ross R. F. supra], етиленіміном або ВЕІ [див. WO типу-4), вірус грипу коней, правця, вірус «Західного 91/18627] або обробкою тимеросалом [патенти Нила» і т.п. та/або їх комбінації. США № 5968525 та № 5338543]. У ще одному варіанті здійснення винаходу Інактивований патоген можна концентрувати композиція містить імуноген, вибраний з бичачих загальноприйнятими методами концентрування, патогенів, таких як вірус сказу, бичачий ротавірус, конкретно, ультрафільтрацією, та/або очищати вірус бичачого парагрипу типу 3 (bPIV-З), бичачий звичайними методами, конкретно, хроматографічкоронавірус, вірус бичачої вірусної діареї (BVDV), ними прийомами, що включають (але не обмежені вірус захворювання ніг і рота (FMDV), бичачий переліченими нижче) гель-фільтрацію, ультраценреспіраторний синтиціальний вірус (BRSV), бичатрифугування на градієнті сахарози або селективчий вірус інфекційного ринотрахеїту (IBR), не осадження, зокрема, з використанням поліетиEscherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella ленгліколю (PEG). haeniolytica і т.п. та їх комбінації. Імуногени, застосовні в композиціях вакцин за У ще одному варіанті здійснення даного винаданим винаходом, включають також експресуючі ходу композиція містить імуноген, вибраний зі свивектори. Термін "вектор" стосується плазміди або нячих патогенів (але не обмежений переліченими вірусу рекомбінантної ДНК або РНК, наприклад, нижче), таких як вірус грипу свиней (SIV), свинячий вірусів віспи, аденовірусів, вірусів герпесу, які місцирковірус типу 2 (PCV-2), вірус репродуктивного тять гетерологічний полінуклеотид, що доставляреспіраторного синдрому свиней (PRRS), вірус ється до клітини-мішені in vitro або in vivo. Гетеропсевдосказу (PRV), свинячий парвовірус (PPV), логічний полінуклеотид може містити FMDV, чуму свиней (HCV), Mycoplasma послідовність, що представляє інтерес для тераhyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, певтичних цілей, і може необов'язково мати вигляд Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, полігенного експресуючого кластера. Для викорисEscherichia coli , Helicobacter cerdo. Helicobacter тання тут немає необхідності в тому, щоб вектор pylori і т.п. та їх комбінації. був здатний до реплікації у віддаленій клітинціКращий варіант здійснення даного винаходу мішені або суб'єкті. Термін включає клонуючий стосується композицій вакцин, що містять, щонайвектор для трансляції кодуючої послідовності поменше, один імуноген та емульсію у фармацевтилінуклеотиду. Вірусні вектори також включені. 19 94404 20 Термин «рекомбінантний» позначає полінукДозування композиції вакцини, приготовленої леотид геномної сДНК напівсинтетичного або синза даним винаходом, буде залежати від виду, потетичного походження, який або не зустрічається в роди, віку, розміру, історії вакцинації, стану здороприроді або в'язаний із ще одним полінуклеотидом в'я вакцинованої тварини. Інші фактори, такі як у систему, що не виявлена в природі. концентрація антигену, додаткові компоненти вакВідповідно до ще одного варіанта здійснення цини та шлях введення (тобто підшкірне, інтрадевинаходу, експресуючі вектори є експресуючими рмальне, пероральне та внутрішньом'язове ввевекторами, використовуваними для in vitro експредення) також будуть впливати на ефективну дозу. сії білків у відповідній клітинній системі. ЕкспресоДозу вакцини для введення легко визначити, вивані білки можна збирати в супернатанті культури ходячи з концентрації антигену у вакцині, шляху або із супернатанта культури після (або не після) введення і віку та стану тварини, що підлягає ваксекреції (якщо немає секреції, коли лізис клітин цинації. Альтернативно, систематичні випробувідбувається або його здійснюють), необов'язково вання імуногенності різних доз, а також досліконцентрувати методами концентрування, такими дження LD50 та інші методики скринінгу можна як ультрафільтрація, та/або очищати такими мевикористовувати для визначення ефективної дози тодами очищення, як афінна, іонообменна або для композиції вакцини за даним винаходом без гель-фільтраційна хроматографія, і використовупроведення зайвих експериментів. вати для приготування емульсії за даним винахоІз прикладів, представлених нижче, легко зродом. зуміти, яка приблизна доза і який приблизний Даний винахід також охоплює рецептури поліоб'єм будуть придатними для застосування комповалентних імунологічних композицій або композизиції вакцини, описаної в даній заявці. Вирішальцій комбінованих вакцин. Наприклад, антигени, ним фактором є те, що доза забезпечує, щонайзастосовні в комбінації бичачої вбитої бактеріальменше, частковий захисний ефект проти ної вакцини, виготовленої за даним винаходом, природної інфекції, що підтверджується зменшенвключають (але не обмежені переліченими нижче) ням смертності та захворюваності, пов'язаними із Mycoplasma bovis, Pasteurella sp., особливо, P. природною інфекцією. Відповідний об'єм також multocida та P. haemolytica, Haemophilus sp., особлегко визначається середнім фахівцем у даній ливо, Η. somnus, Clostridium sp., Salmonella, області техніки. Наприклад, для видів птахів об'єм Corynebacterium, Streptococcus, Staphylococcus, дози може становити від приблизно 0,1 мл до приMoraxella, E. coli і т.п. близно 0,5 мл і краще, від приблизно 0,3 мл до Даний винахід, крім того, стосується способів приблизно 0,5 мл. Для тварин сімейства котячих, індукування імунної відповіді у хазяїна, наприклад, псових і коней об'єм дози може становити від притварини, які включають введення хазяїну імунолоблизно 0,2 мл до приблизно 3,0 мл, краще, від гічної композиції або композиції вакцини за винаприблизно 0,3 мл до приблизно 2,0 мл, і ще краще, ходом. Імунні відповіді, викликані таким чином, є в від приблизно 0,5 мл до приблизно 1,0 мл. Для основному антительними та/або клітинними імунвеликої рогатої худоби та свиней об'єм дози може ними відповідями і, зокрема, відповіддю гаммастановити приблизно від 0,2 мл до приблизно 5,0 інтерфероном. мл, краще, від приблизно 0,3 мл до приблизно 3,0 Конкретно, даний винахід стосується способів мл, і ще краще, від 0,5 мл до приблизно 2,0 мл. імунізації патогенним організмом проти інфекції Повторна вакцинація через регулярні інтерваабо для запобігання чи зменшення симптомів, вили часу може бути кращою для посилення імунної кликаних інфекцією тварини патогенним організвідповіді первинної вакцинації або тоді, коли мом (наприклад, інфекцією вірусом, бактеріями, пройшов тривалий період часу після введення грибами або найпростішими паразитами). Спосіб останньої дози. В одному варіанті здійснення даза даним винаходом є застосовним для хребетних ного винаходу композицію вакцини вводять шлятварин, що включають (але не обмежені перелічехом парентеральної ін'єкції (тобто підшкірно, інними нижче) людину, сімейство псових (напритрадермально або внутрішньом'язово). клад, собаки), сімейство котячих (наприклад, кішКомпозицію можна вводити у вигляді однієї дози ки), сімейство коней (наприклад, коня), жуйних або в альтернативних варіантах здійснення винатварин (наприклад, велика рогата худоба), сімейсходу - у вигляді повторюваних доз від приблизно тво свиней (наприклад, свині), сімейство овець двох до приблизно п'яти через задані інтервали, (наприклад, вівці), сімейство кіз (наприклад, кози), протягом періоду часу від приблизно двох до прикроликів, а також птахів, що включають (але не близно шести тижнів, краще, від приблизно двох обмежені ними) курей, індиків, уток, гусаків, передо приблизно п'яти тижнів. Однак фахівець у даній пелів, фазанів, папуг, співочих птахів, соколів, вообласті техніки повинен усвідомлювати, що кільрон і бескільових птахів (страуси, ему та казуари). кість доз та інтервали часу між вакцинаціями заУ конкретному аспекті винаходу зазначені сполежать від ряду факторів, які включають (але не соби полягають у вакцинації вагітних жіночих осообмежені переліченими нижче) вік вакцинованої бин перед пологами шляхом введення композиції тварини, стан тварини, зокрема, в присутності мавакцини, приготовленої за винаходом. Зазначені теринських антитіл, шлях імунізації, кількість антиспособи додатково включають індукування захисгену, наявного в дозі і т.п. Для первинної вакцинаних антитіл, викликуване протоколом вакцинації та ції період становить звичайно більше тижня і, перенесенням згаданих захисних антитіл від ваккраще, складає від приблизно двох до приблизно цинованих вагітних жіночих особин до їхнього поп'яти тижнів. Для раніше вакцинованих тварин томства. Перенесення таких материнських антитіл повторну вакцинацію до або під час вагітності мозгодом захищає потомство від захворювання. жна проводити з інтервалом приблизно в рік. 21 94404 22 Даний винахід також припускає введення ком- Oleth-2 (Brij 92) : 1,8% мас/об., позиції вакцини за допомогою безголкового при- Oleth-5 (Volpo N5) : 8,2% мас/об., строю для ін'єкцій, такого як Pigjet, Avijet, - Парафінове масло (МагсоІ 82) : 87,5% Dermojet або Biojector (Bioject, Oregon, USA), об./об., але не обмеженого переліченими вище. Середній - Консервант : 2,5% об./об. фахівець у даній області техніки здатний пристоВодна фаза #1 (108 мл): сувати технічні умови пристрою для ін'єкцій до - Poloxamer 407 (Lutrol F127) : 0,58% мас /об., необхідного за такими факторами, як вид вакцино- ізотонічний буфер, що містить динатрійфосваної тварини, вік та маса тварини і т.п., без профат і монокалійфосфат 0,02 Μ (рН7,8) :q.s. до ведення зайвих експериментів. 100,0% об./об. В одному варіанті здійснення даного винаходу Розчин (5% мас/об.) Lutrol F 127 у такому ж спосіб включає однократне введення композиції буфері як вакцину, наприклад, в ізотонічному бувакцини, приготовленої з емульсією за винаходом. фері, що містить динатрійфосфат і монокалійфоНаприклад, в одному варіанті здійснення винаходу сфат 0,02 Μ (ρΗ 7,8), використовують для пригокомпозиція вакцини є вакциною інактивованого тування водної фази #1. Mycoplasma hyopneumoniae, тоді як альтернативКоли перемішування припиняють, емульсія ний варіант здійснення винаходу передбачає вакзмінюється, перетворюючись на емульсію типу цину, що містить композицію інактивованого вірусу «масло-у-воді». Емульсію поміщають у холодну PCV2. Інші імунологічні композиції або вакцини є камеру (5 °С), щонайменше, на 4 години. На даній придатними для застосування за схемою з однокстадії емульсія є попередньою емульсією, що місратною дозою, що включають інактивовані PRRS тить 40% масляної фази. та SIV, але не обмежені ними. Вакцину також можДруга стадія. Водну фазу #2 готують з 180 мл на вводити в присутності антитіл, що існують до фосфатного ізотонічного буфера, що містить дивведення. натрійфосфат і монокалійфосфат 0,02 Μ (ρΗ 7,8) з Крім того, винахід стосується способів лікуімуногеном(ами) (інактивованим імуногеном вання хазяїна, наприклад, тварини, які включають Mycoplasma hyopneumoniae або імуногеном PCVвведення хазяїну фармацевтичної композиції, яка 2, як описано нижче). Попередню емульсію, як приготовлена за винаходом та містить, щонаймеописано на першій стадії, охолоджують до приблинше, один імуноген, вибраний з групи, що складазно 5 °С, розбавляють, додаючи такий саме об'єм ється з білків або пептидів, антитіл, алергенів, водної фази #2 при тій самій температурі та переCpG ODN, факторів росту, цитокінів або антибіомішують обертанням магнітного стрижня протягом тиків, і конкретно, CpG ODN або цитокінів. Згадані 1 хвилини. Кінцева концентрація поверхневофармацевтичні композиції можна використовувати активної речовини в емульсії LR4 становила 2,18% для підвищення ефективності росту у тварин, та(мас/об.). ких як кури, свині та корови. Одержані, як описано тут, вакцини LR4 є стаКрім того, даний винахід стосується набору, більними, щонайменше, протягом одного року при що включає два флакони, перший з них містить 5 °С. такий інгредієнт, як імуноген, або фармацевтичну Використовуючи таку ж методику готування, композицію, а другий флакон містить емульсію, можна одержувати інші емульсії, як описано нижприготовлену за даним винаходом. Імуноген може че: перебувати в ліофілізованому виді, у висушеному Емульсія LR3 виді або у водному розчині, як описано в даній Перша стадія. Кінцева емульсія LR3 є емульзаявці. сію типу O/W, що містить 33% масляної фази. х Далі винахід буде додатково описаний на наМасляна фаза (120 мл):  ступних прикладах, які не обмежують обсяг вина- OIeth-2 (Brij 92) : 6,24% мас/об., ходу. - Oleth-10 (Brij 96) : 2,76% мас/об., Приклади - Парафінове масло (МагсоІ 82) : 89,50% Приклад 1. Спосіб виготовлення емульсії об./об., Емульсію одержують у дві стадії, як описано - Консервант : 1,50% об./об. Водна фаза #1 нижче. (120 мл): Перша стадія. Для приготування рецептур ви- Poloxamer 407 (Lutrol F127) : 1,20% мас/об., користовують емульгатор «Silverson» (типу L4RT з - ізотонічний буфер, що містить динатрійфосдезінтегруючою головкою діаметром 10 мм) з вефат і монокалійфосфат 0,02 Μ (рН 7,8) : q.s. до ликим зсувом ротора-статора. Для одержання 100,0% об./об. емульсії один об'єм масляної фази емульгують Розчин (5% мас/об.) Lutrol F 127 в тому ж бупри 35 °С з одним об'ємом водної фази #1. Водну фері, наприклад, в 0,02 Μ ізотонічному буфері, що фазу додають до масляної фази при перемішумістить динатрійфосфат і монокалійфосфат 0,02 ванні 5000 об./хв. (обертів за хвилину) протягом 1 Μ (рН 7,8), використовують як вакцину для пригохвилини. Швидкість обертання поступово збільтування водної фази #1. шують по мірі збільшення об'єму до 8300 об./хв. Коли перемішування припиняють, емульсія протягом 1 хвилини. Під час зазначеної стадії змінюється, перетворюючись на емульсію типу емульсія є емульсію типу «вода-у-маслі». Кінцева «масло-у-воді». Емульсію поміщають у холодну емульсія LR4 є емульсією типу O/W, що містить камеру (5 °С), щонайменше, на 4 години. На даній 20% масляної фази. Для емульсії LR4 композиція стадії емульсія є попередньою емульсію, що місфаз була такою: тить 50% масляної фази. Масляна фаза (72 мл): 23 94404 24 Друга стадія. Водну фазу #2 (120 мл) наготовВЕ1 не розбавляють перед використанням. Кінцелюють із ізотонічного буфера, що містить динатва концентрація поверхнево-активної речовини в рійфосфат і монокалійфосфат 0,02 Μ (рН 7,8), та емульсії ВЕІ становила 4% (мас/об.). імуногена(ів). Приклад 2. Стабільність емульсій Попередню емульсію, як описано на першій Композиції LR4 та LR3 стабільні навіть у пристадії, охолоджують до приблизно 5 °С, розбавлясутності концентрованого(их) імуногена(ів) при 21 ють, додаючи половину об'єму водної фази #2, °С протягом, щонайменше, 9 місяців. Розподіл при такій саме температурі та перемішують оберчастинок за розміром в емульсіях не змінюється танням магнітного стрижня протягом 1 хвилини. протягом зазначеного періоду часу. Кінцева концентрація поверхнево-активної речоПриклад 3. Комбінована вакцина проти вини в емульсії LR3 становила 3,40% (мас/об.). Mycoplasma hyopneumoniae та PCV-2 - Композиція Одержані, як описано тут, вакцини LR3 є стата нешкідливість на поросятах більними, щонайменше, протягом одного року при Матеріали та методи. Дві вакцини, одержані, 5 °С. як описано в прикладі 1, що містять або емульсію Емульсія ВЕ1 Кінцева емульсія ВЕ1 є емульLR3, або емульсію LR4, 12 антигенних одиниць сію типу O/W, що містить 33% масляної фази. інактивованого Mycoplasma hyopneumoniae та 2,4 Масляна фаза (120 мл): log10 (антигенних одиниць) інактивованого свинячого цирковірусу типу 2 / на дозу. Двадцять чотири - Oleth-2 (Brij 92) : 3,0% мас/об., (24) поросяти, вік яких становив три тижні (24), - Oleth-5 (Volpo N5) : 9,1 % мас/об., розділяють за випадковою схемою на дві групи. - Парафінове масло (Marcol 82) : 86,4% Групу 2 із дванадцяти (12) поросят вакцинують в 0 об./об., день композицією вакцини LR3 (4 мл) внутрішньо- Консервант : 1,5% об./об. м'язово, тоді як групу 3 із дванадцяти (12) поросят Водна Фаза #1 (240 мл): вакцинують в 0 день композицією вакцини LR4 (4 - ізотонічний буфер, що містить динатрійфосмл) внутрішньом'язово. Група 1 відповідає невакфат і монокалійфосфат 0,02 Μ (рН7,8) :q.s. до цинованій контрольній групі. Щодня проводять 100,0% об./об. огляд поросят. Через два тижні після ін'єкції споВодна фаза #1 містить ізотонічний буфер, що стерігають місце ін'єкції та місцеві ураження. містить динатрійфосфат і монокалійфосфат 0,02 Μ (рН 7,8) 98,5% об./об. та імуноген(и). Емульсію Обробка Група 1(контроль) Група 2 (LR3) Група 3(LR4) Шок і загальні реакції Реакція відсутня Реакція відсутня Реакція відсутня Гіпертермія -0,10,3* 0,60,5 0,10,2 Відносне середнє Розмір місцевої реащоденне збільшення кції маси 6,51,9 0,00,0 6,31,3 1,82,8 6,41,7 8,411,4 * Середнє  стандартний відхил Результати. Ад'юванти LR3 та LR4 демонструють гарні показники нешкідливості. Приклад 4. Результати серологічних досліджень після введення однієї дози вакцини проти PCV-2 з емульсією LR4 як ад'ювантом Матеріали та методи Вакцину, одержану, як описано в прикладі 1, що містить емульсію LR4, CpG ODN #2216 50 мкг/на дозу, 1,5 антигенних одиниць інактивованого Mycoplasma hyopneumoniae та 1,5 log10 (антигенних одиниць) інактивованого свинячого цирковірусу типу 2 / на Обробка Група 1 Група 2 D0 3,080,58 2,910,52 D21 2,570,50 2,350,52 дозу. Сорок (40) поросят у віці трьох тижнів (24), які мають антитіла материнського походження, що існували до експерименту, розділяють за випадковою схемою на дві групи. Групу 2 із двадцяти (20) поросят вакцинують в 0 день композицією вакцини LR4 (0,5 мл) інтрадермально за допомогою безголкового пристрою для ін'єкцій. Група 1 відповідає невакцинованій контрольній групі. Відбирають зразки крові на D0, D21, D41, D63, D84, D126, D153 та D180 дні після вакцинації для титрування антитіл PCV-2 ORF2 методом ELISA. D41 D63 D84 D126 D153 D180 2,150,58