Rage-злиті білки і способи їх застосування

1. Злитий білок, що містить фрагмент sRAGE людини, безпосередньо з'єднаний на своєму карбоксильному кінці з аміно-кінцем частини фрагмента важкого ланцюга фрагмента Fc імуноглобуліну, де (а) послідовність sRAGE людини наведена в SEQ ID NO: 5 або 6; (b) аміно-кінцева послідовність фрагмента sRAGE людини являє собою SEQ ID NO: 9 або SEQ ID NO: 10 або послідовність, щонайменше на 90 % ідентичну SEQ ID NO: 9 або 10; (с) послідовність карбоксильного кінця фрагмента sRAGE являє собою послідовність міждоменного лінкера RAGE людини; і (d) частина фрагмента важкого ланцюга фрагмента Fc імуноглобуліну містить домен СН2 або частину домену СН2 і домен СН3 важкого ланцюга. 2. Злитий білок за п. 1, де амінокислотна послідовність sRAGE людини наведена в SEQ ID NO: 5. 3. Злитий білок за п. 2, де аміно-кінцева послідовність фрагмента sRAGE людини наведена в SEQ ID NO: 9. 4. Злитий білок за п. 1, де амінокислотна послідовність sRAGE людини наведена в SEQ ID NO:6. 5. Злитий білок за п. 4, де аміно-кінцева послідовність фрагмента sRAGE людини наведена в SEQ ID NO: 10. 6. Злитий білок за п. 2, де амінокислотна послідовність фрагмента sRAGE людини наведена в будь-якому з SEQ ID NO: 13, 15, 17 і 19. 2 (19) 1 3 92154 4 чим здійснюється детектування модуляторів 25. Застосування за п. 24, де симптомом діабету RAGE. або симптомом пізнього ускладнення діабету є 21. Набір для детектування модуляторів RAGE, діабетична нефропатія, діабетична ретинопатія, який містить: діабетична виразка стопи, серцево-судинне ускла(а) сполуку, що має відому афінність зв'язування днення чи діабетична невропатія. відносно RAGE, як позитивного контролю; 26. Застосування за п. 22, де опосередкованим (b) RAGE-злитий білок за будь-яким з пп. 1-10; і RAGE порушенням є амілоїдоз, хвороба Альцгей(с) інструкції для застосування. мера, рак, запалення або ниркова недостатність. 22. Застосування злитого білка за будь-яким з пп. 27. Застосування за п. 26, де запаленням є запа1-10 для виробництва лікарського засобу для лікулення, зв'язане з аутоімунітетом, запальним завання опосередкованого RAGE порушення у сухворюванням кишечнику, ревматоїдним артритом, б'єкта. псоріазом, розсіяним склерозом, гіпоксією, інсуль23. Застосування за п. 22, де лікарський засіб притом, серцевим приступом, геморагічним шоком, значений для внутрішньовенного, внутрішньочесепсисом, трансплантацією органу або загоєнням ревинного або підшкірного введення. ран. 24. Застосування за п. 22, де опосередкованим RAGE порушенням є симптом діабету або симптом пізніх ускладнень діабету. В даній заявці заявлений пріоритет, згідно з Розділом 35 Кодексу законів США 119(2), по попередній заявці на патент США з реєстраційним номером 60/598362, поданій 3 серпня 2004 року. Опис попередньої заявки на патент США 60/598362 включений тут як посилання в повному об'ємі. Даний винахід стосується регуляції Рецептора для Просунутих Глікозильованих Кінцевих продуктів (RAGE, Receptor for Advanced Glycated Endproducts). Більш конкретно, даний винахід стосується злитих білків, то містять поліпептид RAGE, способів одержання таких злитих білків і застосування таких білків для лікування порушень на основі RAGE. Інкубування білків або ліпідів з альдозними цукрами приводить до неферментативного глікозилування і окислення аміногруп на білках з утворенням адуктів Амадорі. Згодом ці адукти зазнають додаткового перегрупування, дегідратацій і зшивання з іншими білками, з утворенням комплексів, відомих як Просунуті Кінцеві Продукти Глікозілування (AGE). Фактори, які стимулюють утворенням AGE, включають в себе уповільнене оновлення білка (наприклад, як при амілоїдозі), накопичення макромолекул з високим вмістом лізину, і високі рівні глюкози в крові (наприклад, як при діабеті) (Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752761, (1995)). Передбачалось, що AGE беруть участь в різних порушеннях, в тому числі ускладненнях, асоційованих з діабетом і нормальним старінням. AGE виявляють специфічне і насичуване зв'язування з рецепторами клітинної поверхні на моноцитах, макрофагах, ендотеліальних клітинах мікроциркуляторних судин, клітинах гладких м'язів, мезангіальних клітинах і нейронах. Рецептор для Просунутих Глікозільованих Кінцевих Продуктів (RAGE) є членом сімейства молекул супергенів імуноглобулінів. Позаклітинний (N-кінцевий) домен RAGE включає в себе три райони імуноглобулінового типу: один домен V (варіабельного) типу, за яким слідують два домени С (константного) типу (Neeper et al., J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al., Circ. (Suppl.) 96#194 (1997)). Єдиний трансмембранний (який прошиває мембрану) домен і короткий, високозаряджений цитозольний хвіст слідують за позаклітинним доменом. N-кінцевий, позаклітинний домен може бути виділений протеолізом RAGE абомолекулярнобіологічними підходами для генерування розчинного RAGE (sRAGE), що містить V- і С-домени. RAGE експресується на множинних типах клітин, включаючи лейкоцити, нейрони, мікрогліальні клітини та ендотелій судин (наприклад, Hori et al., J. Віоі. Chem. 270: 25752-761, (1995)). Збільшені рівні RAGE виявлені також у старіючих тканинах (Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99 (3): 457-468 (1997)) і в діабетичній сітківці, судинній мережі і нирці (Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1994)). Крім AGE, інші сполуки можуть зв'язуватись з RAGE і модулювати RAGE. RAGE зв'язується з множинними лігандами, які фракційно і структурно розрізнюються, включаючи амілоїд бета (Α ), сироватковий амілоїд A (SAA), Просунуті Кінцеві Продукти Глікозилування (AGE), S100 (прозапальний член сімейства кальгранулінів), карбоксиметиллізин (CML), амфотерин і CD11b/CD18 (Bucciarelli et al., Cell Mol. Life Sci., 59:1117-128 (2002); Chavakis et al., Microbes Infect., 6:1219-1225 (2004); Kokkola et al., Scand. J. Immunol.. 61:1-9 (2005); Scmidt et al., J. Clin. Invest., 108:949-955 (2001); Rocken et al., Am. J. Pathol., 162:1213-1220 (2003)). Було показано, що зв'язування лігандів, таких як AGE, S100/кальгранулін, -амілоїд, CML (N карбоксиметиллізин) і амфотерин, з RAGE модифікує експресію різних генів. Ці взаємодії можуть потім ініціювати механізми трансдукції сигналу, включаючи активацію р38, p21ras, МАР-кіназ, фосфорилування Erkl-2 і активацію транскрипційного медіатора передачі запального сигналу, NF- Β (Yeh et al., Diabetes, 50:1495-1504 (2001)). Наприклад, в багатьох типах клітин взаємодія між RAGE і його лігандами може генерувати окислювальний стрес, який тим самим приводить до активації чутливого до вільних радикалів фактора транскрипції 5 92154 6 Даний винахід містить також спосіб одержання NF- В і активації NF- В-регульованих генів, таких RAGE-злитого білка. В одному варіанті здійснення, як цитокіни IL-1 і TNF- . Крім того, експресія цей спосіб передбачає зв'язування поліпептиду RAGE негативно регулюється за допомогою NF- Β RAGE з другим, не-RAGE-поліпептидом. В одному і виявляє підвищену експресію в ділянках запаваріанті здійснення, поліпептид RAGE містить лілення або окислювального стресу (Tanaka et al., J. гандзв'язувальний сайт RAGE. Цей спосіб може Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)). Таким чином, передбачати зв'язування поліпептиду RAGE безвисхідна і часто шкідлива спіраль може збуджувапосередньо з поліпептидом, що містить Сн2-домен тись петлею позитивного зворотного зв'язку, ініціімуноглобуліну або частину цього Сн2-домену. йованого зв'язуванням ліганду. В інших варіантах здійснення, даний винахід Активація RAGE в різних тканинах і органах може містити способи і композиції для лікування може приводити до ряду патофізіологічних наслідRAGE-опосередкованого порушення у суб'єкта. ків. Передбачалось, що RAGE бере участь в ряді Цей спосіб може передбачати введення злитого станів, що включають в себе: гостре і хронічне білка даного винаходу суб'єкту. Ця композиція мозапалення (Hofmann et al., Cell 97:889-901 (1999)), же містити RAGE-злитий білок даного винаходу у розвиток пізніх діабетичних ускладнень, таких як фармацевтично прийнятному носії. збільшена проникність судин (Wautier et al., J. Clin. Є різні переваги, які можуть бути пов'язані з Invest., 97:238-243 (1995)), нефропатія (Teillet et конкретними варіантами здійснення даного винаal., J. Am. Soc. Nephrol., 11:1488-1497 (2000)), арходу. В одному варіанті здійснення, злиті білки теріосклероз (Vlassara et al., The Finnish Medical даного винаходу можуть бути метаболічно стабіSociety DUODECIM, Ann. Med., 28:419-426 (1996)) і льними при введенні суб'єкту. Злиті білки даного ретинопатія (Hammes et al.. Diabetologia, 42:603винаходу можуть також виявляти високоафінне 607 (1999)). Передбачалось, що RAGE бере зв'язування у відношенні лігандів RAGE. У деяких участь також в хворобі Альцгеймера (Yan et al., варіантах здійснення, злиті білки даного винаходу Nature, 382:685-691 (1996)) і пухлинній інвазії і мезв'язуються з лігандами RAGE з афінностями у тастазуванні (Taguchi et al., Nature, 405:354-357 високому наномолярному низькому мікромоляр(2000)). ному діапазоні. За допомогою зв'язування з висоНезважаючи на широку експресію RAGE і його кою афінністю з фізіологічними лігандами RAGE явну плейотропну роль у множинних різних модезлиті білки даного винаходу можуть бути викорислях захворювань, RAGE, мабуть, не відіграє важтані для зменшення інтенсивності RAGEливої ролі в нормальному розвитку. Наприклад, опосередкованих захворювань. миші з нокаутом RAGE не мають очевидного аноЗлиті білки даного винаходу можуть бути тамального фенотипу, який передбачає, що RAGE кож забезпечені у формі білка або формі нуклеїможе грати роль в патології захворювань, коли нової кислоти. В одному варіанті-прикладі, злитий інгібування RAGE, що хронічно стимулюється, мабілок може вводитись системно і залишатись в буть, не сприяє якому-небудь небажаному гостросудинній мережі для потенційного лікування суму фенотипу (Liliensiek et al., J. Clin. Invest. динних захворювань, часткове опосередковуваних 113:1641-50(2004)). RAGE. В іншому варіанті-прикладі, злитий білок Протидія зв'язуванню фізіологічних лігандів з може вводитись локально для лікування захворюRAGE може негативно регулювати патофізіологічні вань, в яких ліганди RAGE сприяють патології зазміни, що викликаються надмірними концентраціхворювання. Альтернативно, конструкція нуклеїями AGE та інших лігандів RAGE. За допомогою нової кислоти, що кодує злитий білок, може зменшення зв'язування ендогенних лігандів з доставлятись в певну ділянку з використанням RAGE, симптоми, асоційовані з RAGEвідповідного носія, такого як вірус або гола ДНК, опосередкованими порушеннями, можуть бути де транзиторна локальна експресія може локально зменшені. Розчинний RAGE (sRAGE) здатний інгібувати взаємодію між лігандами і рецепторами ефективно протидіяти зв'язуванню лігандів RAGE RAGE. Таким чином, введення може бути транзиз RAGE. Однак, sRAGE може мати напівперіод торним (наприклад, коли вводять цей злитий бііснування при введенні in vivo, який може бути лок) або більш перманентним за характером (надуже коротким, щоб бути терапевтично корисним, приклад, коли злитий білок вводять у вигляді для одного або декількох порушень. Таким чином, рекомбінантної ДНК). існує потреба в розвитку сполук, які протидіють Є додаткові ознаки цього винаходу, які будуть зв'язуванню AGE та інших фізіологічних лігандів з описані далі. Повинно бути зрозуміло, що даний рецептором RAGE, причому такі сполуки повинні винахід не обмежується в його застосуванні подмати бажаний фармакокінетичний профіль. робицями, представленими в наступній формулі Варіанти здійснення даного винаходу містять винаходу, описі і фігурах. Даний винахід може маRАGЕ-злиті білки і способи застосування таких ти інші варіанти здійснення і практикуватись або білків. Даний винахід може бути здійснений різнивиконуватись різними шляхами. ми шляхами. Варіанти здійснення даного винаходу Різні ознаки, аспекти і переваги даного винаможуть містити злитий білок, що містить поліпепходу стануть більш очевидними з посиланням на тид RAGE, пов'язаний з другим, нe-RAGEнаступні фігури. поліпептидом. В одному варіанті здійснення, цей Фіг. 1 показує різні послідовності RAGE відпозлитий білок містить сайт зв'язування ліганду відно до додаткових варіантів даного винаходу: RAGE. Цей злитий білок може додатково містити Панель A, SEQ ID NO:1, амінокислотна послідовполіпептид RAGE, безпосередньо пов'язаний з ність для RAGE людини; і SEQ ID NO:2, амінокисполіпептидом, що містить Сн2-домен імуноглобулотна послідовність для RAGE людини без сигналїну або частину цього Сн2-домену. 7 92154 8 льної послідовності амінокислот 1-22; Панель В, білка (ТТР-3000) відповідно до одного варіанту SEQ ID NO:3, амінокислотна послідовність для здійснення даного винаходу. Кодуюча послідовRAGE людини без сигнальної послідовності аміноність 1-408, виділена жирним шрифтом, кодує Nкислот 1-23; Панель С, SEQ ID NO:4, амінокислоткінцеву послідовність білка RAGE, тоді як послідона послідовність sRAGE людини; SEQ ID NO:5, вність 409-1041 кодує послідовність білка Fc IgG амінокислотна послідовність для sRAGE людини ( 1) людини. без сигнальної послідовності амінокислот 1-22, і Фіг. 4 показує амінокислотні послідовності, SEQ ID NO:6, амінокислотна послідовність sRAGE SEQ ID NO:32 (ТТР-4000), SEQ ID NO:33 і SEQ ID людини без сигнальної послідовності амінокислот NO:34, які. кожна, кодують RAGE-злитий білок з 1-23; Панель D. SEQ ID NO:7, амінокислотна посчотирьох доменів відповідно до альтернативних лідовність, що містить V-домен RAGE людини; варіантів здійснення даного винаходу. ПослідовSEQ ID NO:8, альтернативна амінокислотна посліність RAGE виділена жирним шрифтом. довність, що містить V-домен RAGE людини: SEQ Фіг. 5 показує амінокислотні послідовності, ID NO:9, N-кінцевий фрагмент V-домену RAGE SEQ ID NO:35 (ТТР-3000), SEQ ID NO:36 і SEQ ID людини; SEQ ID NO:10, альтернативний NNO:37, які, кожна, кодують RAGE-злитий білок з кінцевий фрагмент V-домену RAGE людини; SEQ трьох доменів відповідно до альтернативних варіID NO:11, амінокислотна послідовність для аміноантів здійснення даного винаходу. Послідовність кислот 124-221 RAGE людини: SEQ ID NO:12, аміRAGE виділена жирним шрифтом. нокислотна послідовність для амінокислот 227-317 Фіг. 6, Панель А, показує порівняння доменів RAGE людини; SEQ ID NO:13, амінокислотна посбілків в RAGE людини і Fc-білку Ig гамма-1 людилідовність для амінокислот 23-123 RAGE людини; ни, і точки розщеплення, використані для одерПанель Е, SEQ ID NO:14, амінокислотна послідовжання ТТР-3000 (в положенні 136) і ТТР-4000 (в ність для амінокислот 24-123 RAGE людини; SEQ положенні 251) відповідно до альтернативних ваID NO:15, амінокислотна послідовність для аміноріантів здійснення даного винаходу; і панель В кислот 23-136 RAGE людини; SEQ ID NO:16, аміпоказує структуру доменів для ТТР-3000 і ТТРнокислотна послідовність для амінокислот 24-136 4000 відповідно до альтернативних варіантів здійRAGE людини; SEQ ID NO:17, амінокислотна посснення даного винаходу. лідовність для амінокислот 23-226 RAGE людини; Фіг. 7 показує результати аналізу зв'язування SEQ ID NO:18, амінокислотна послідовність для in vitro для sRAGE і RAGE-злитих білків ТТР-4000 амінокислот 24-226 RAGE людини; Панель F, SEQ (ТТ4) і ТТР-3000 (TT3) з амілоїдом-бета (Α-бета), ID NO:19, амінокислотна послідовність для аміноS100b (S100) і амфотерином (Ampho), відповідно кислот 23-251 RAGE людини; SEQ ID NO:20, амідо одного варіанту здійснення даного винаходу. нокислотна послідовність для амінокислот 24-251 Фіг. 8 показує результати аналізу зв'язування RAGE людини; SEQ ID NO:21, міждоменний лінкер in vitro для RAGE-злитого білка ТТР-4000 (ТТ4) RAGE; SEQ ID NO:22. другий міждоменний лінкер ("Протеїн") з амілоїдом-бета у порівнянні з негатиRAGE; SEQ ID NO:23, третій міждоменний лінкер вним контролем, що включає в себе тільки реагенRAGE; SEQ ID NO:24, четвертий міждоменний ти імунодетектування ("Тільки комплекс"), і протилінкер RAGE; Панель G, SEQ ID NO:25, ДНК, що дію такому зв'язуванню за допомогою антагоніста кодує амінокислоти 1-118 RAGE людини; SEQ ID RAGE ("ліганду RAGE") відповідно до одного варіNO:26, ДНК, що кодує амінокислоти 1-123 RAGE анту здійснення даного винаходу. людини; і SEQ ID NO:27, ДНК, що кодує амінокисФіг. 9 показує результати аналізу зв'язування лоти 1-136 RAGE людини; Панель Н, SEQ ID in vitro для RAGE-злитого білка ТТР-3000 (TT3) NO:28, ДНК, що кодує амінокислоти 1-230 RAGE ("Протеїн") з амілоїдом-бета у порівнянні з негатилюдини; і SEQ ID NO:29, ДНК, що кодує амінокисвним контролем, що включає в себе тільки реагенлоти 1-251 RAGE людини; Панель І, SEQ ID ти імунодетектування ("Тільки комплекс"), і протиNO:38, часткова амінокислотна послідовність для дію такому зв'язуванню за допомогою антагоніста доменів Сн2 і Cн3 IgG людини; SEQ ID NO:39, RAGE ("ліганду RAGE") відповідно до одного варіДНК, що кодує частину доменів Сн2 і Cн3 IgG люанту здійснення даного винаходу. дини; SEQ ID NO:40, амінокислотна послідовність Фіг. 10 показує результати аналізу на основі для доменів Сн2 і Cн3 IgG людини; Панель J, SEQ клітин, вимірюючого інгібування S100b-RAGEID NO:41, ДНК, що кодує домени Сн2 і Cн3 IgG індукованого продукування TNF- RAGE-злитими людини; SEQ ID NO:42, амінокислотна послідовбілками ТТР-3000 (TT3) і ТТР-4000 (ТТ4) і sRAGE ність для домену Сн2 IgG людини; SEQ ID NO: 43, відповідно до одного варіанту даного винаходу. амінокислотна послідовність для домену Cн3 IgG Фіг. 11 показує фармакокінетичний профіль людини; і SEQ ID NO:44, п'ятий міждоменний ліндля RAGE-злитого білка ТТР-4000 відповідно до кер RAGE. варіанту здійснення даного винаходу, в якому кожФіг. 2 показує ДНК-послідовність (SEQ ID на крива представляє тварину, яка відрізняється, в NO:30) кодуючого району RAGE-злитого білка одних і тих же експериментальних умовах. (ТТР-4000) відповідно до одного варіанту здійсФіг. 12 показує відносні рівні вивільнення TNFнення даного винаходу. Кодуюча послідовність 1з клітин ТНР-1 внаслідок стимуляції RAGE753, виділена жирним шрифтом, кодує N-кінцеву злитим білком ТТР-4000 і стимуляції IgG людини послідовність білка RAGE, тоді як послідовність як міру запальної реакції відповідно до одного ва754-1386 кодує послідовність білка Fc IgG ( 1) люріанту даного винаходу. дини. Фіг. 13 показує застосування RAGE-злитого біФіг. 3 показує ДНК-послідовність (SEQ ID лка ТТР-4000 для зменшення рестенозу у діабетиNO:31) кодуючого району іншого RAGE-злитого чних тварин відповідно до альтернативних варіан 9 92154 10 тів даного винаходу, де панель А показує, що тин поліпептиду, нуклеїнової кислоти або іншої RAGE-злитий білок ТТР-4000 зменшував відномолекулярної конструкції. шення інтиму/медіа у порівнянні з негативним конВ даному контексті, термін «проти ходу» (злітролем (IgG), а панель В показує, що RAGEва, вище вибраного залишку) стосується залишку, злитий білок ТТР-4000 зменшував проліферацію який є N-кінцевим відносно другого залишку, коли клітин гладких м'язів залежним від дози чином. ця молекула є білком, або 5' відносно другого заФіг. 14 показує застосування RAGE-злитого білишку, коли ця молекула є нуклеїновою кислотою. лка ТТР-4000 для зменшення утворення амілоїду і У цьому контексті також, термін «по ходу» (правокогнітивної дисфункція у тварин з хворобою Альцруч, нижче вибраного залишку) стосується залишгеймера (AD) відповідно до альтернативних варіаку, який є С-кінцевим відносно другого залишку, нтів даного винаходу, де панель А показує, що коли ця молекула є білком, або 3' відносно другого RAGE-злитий білок ТТР-4000 зменшував амілоїдзалишку, коли ця молекула є нуклеїновою кислоне навантаження в головному мозку, а панель В тою. показує, що RAGE-злитий білок ТТР-4000 поліпЯкщо немає іншого визначення, всі технічні і шував когнітивну функцію. наукові терміни, що використовуються тут, мають Фіг. 15 показує криві насичення-зв'язування значення, що звичайно розуміється фахівцем зі ТТР-4000 з різними імобілізованими відомими лізвичайною кваліфікацією в даній галузі. Практики, гандами RAGE відповідно до одного варіанту здійзокрема, відсилаються до Current Protocols in снення даного винаходу. Molecular Biology (Ausubel) відносно визначень і Для цілей цього опису, якщо немає інших вкатермінів даної галузі. Абревіатури для амінокислозівок, всі числа, що виражають кількості інгредієнтних залишків є стандартними 3-буквеними і/або 1тів, умови реакцій і т.д., що використовуються в буквеними кодами, що використовуються в даній цьому описі, повинні розумітись як такі, що модигалузі для позначення однієї з 20 звичайних Lфікуються у всіх випадках терміном «приблизно». амінокислот. Таким чином, якщо немає протилежної вказівки, «Нуклеїнова кислота» являє собою полінуклечисельні параметри, представлені в наступному отид, такий як дезоксирибонуклеїнова кислота описі, є наближеннями, які можуть варіюватись в (ДНК) або рибонуклеїнова кислота (РНК). Цей тезалежності від бажаних властивостей, які автори рмін включає в себе одноланцюгові нуклеїнові прагнуть одержати з використанням даного винакислоти, двохланцюгові нуклеїнові кислоти і РНК і ходу. І, нарешті, і не як спроба обмеження застоДНК, одержані з нуклеотидних і нуклеозидних анасування доктрини еквівалентів до об'єму формули логів. винаходу, кожний чисельний параметр повинен Термін «вектор» стосується молекули нуклеїщонайменше розглядатись в світлі кількості повінової кислоти, яка може бути використана для домлених значущих чисел та із застосуванням транспорту другої нуклеїнової кислоти в клітину. В простих способів округлення. одному варіанті здійснення, цей вектор робить Не заперечуючи того, що чисельні діапазони і можливим реплікацію ДНК-послідовностей, вбудопараметри, що встановлюють широкий об'єм даваних в цей вектор. Цей вектор може містити проного винаходу, є наближеними, чисельні величимотор для посилення експресії цієї молекули нукни, представлені в конкретних прикладах, автори леїнової кислоти щонайменше в деяких клітинахповідомляють з максимальною можливою точнісхазяїнах. Вектори можуть реплікуватись автономтю. Однак будь-яка чисельна величина невід'ємно но (позахромосомно) або можуть бути інтегровані містить певні помилки, що обов'язково походять зі в хромосому клітини-хазяїна. В одному варіанті стандартних відхилень, що виявляються у відповіздійснення, вектор може бути експресійним (ексдних вимірюваннях випробувань. Крім того, потріпресуючим) вектором, здатним продукувати білок, бно розуміти, що всі описані тут діапазони вклюзроблений з щонайменше частини послідовності чають в себе будь-які і всі піддіапазони, укладені в нуклеїнової кислоти, вбудованої в цей вектор. них. Наприклад, потрібно розглядати, що вказаний Як відомо в даній галузі, умови для гібридизадіапазон «1-10» включає в себе будь-які і всі піддіції послідовностей нуклеїнових кислот можуть бути апазони між (і включно) мінімальною величиною 1 описані як такі, що знаходяться в діапазоні від ниі максимальною величиною 10; тобто всі піддіапазької до високої суворості. Звичайно, умовами гібзони, починаючи з мінімальної величини 1 або ридизації високої суворості називають промивання більше, наприклад, 1-6,1, і кінчаючи максимальгібридів в низькосольовому буфері при високих ною величиною 10 або менше, наприклад, 5,5-10. температурах. Гібридизація може полягати у фільКрім того, будь-яке посилання, про яке говориться, труванні пов'язаної ДНК з використанням умов що воно є «включеним тут», повинне розумітись як гібридизації, стандартних в даній галузі, таких як посилання, включене в його повному об'ємі. 0,5 Μ NaHPO4, 7% додецилсульфат натрію (ДСН), Додатково потрібно зазначити, що єдині форпри 65°С і промиванні в 0,25 Μ NaHPO4, 3,5% ДСН ми "a", "an" і "the", що використовуються в цьому з подальшим промиванням 0,1xSSC/0,1% ДСН при описі, включають в себе множинні референти температурі в діапазоні від кімнатної температури (слова, які відносяться до них), якщо вони не обдо 68°С в залежності від довжини зонду (див., намежуються явно і недвозначно одним референприклад, Ausubel, F.M. et al., Short Protocols in том. Термін «або» використовується взаємозамінMolecular Biology, 4th Ed., Chapter 2, John Wiley & но з терміном «і/або», якщо в контексті немає Sons, N.Y.). Наприклад, промивання високої сувоіншої вказівки. рості передбачає промивання в 6xSSC/0,05% піТерміни «частина» і «фрагмент» використорофосфат натрію при 37°С для олігонуклеотидновуються також взаємозамінно для позначення часго зонду з 14 основ, або при 48°С для 11 92154 12 олігонуклеотидного зонду з 17 основ, або при 55°С лідовностей, що порівнюються. Співставлення і для олігонуклеотидного зонду з 20 основ, або при порівняння послідовностей може проводитись з 60°С для олігонуклеотидного зонду з 25 основ, або використанням алгоритмів, стандартних в даній при 65°С для нуклеотидного зонду з довжиною галузі (наприклад, Smith and Waterman, 1981, Adv. приблизно 250 нуклеотидів. Зонди нуклеїнових Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch, 1970, J. кислот можуть бути помічені радіонуклеотидами Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444), або з використанкінцевим міченням, наприклад, [ -32P]ATP, або ням комп'ютеризованих версій цих алгоритмів включенням радіоактивно мічених нуклеотидів, (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, таких як [ -32P]dCTP випадковим міченням прайGenetics Computer Group, 575 Science Drive, мера. Альтернативно, зонди можуть бути помічені Madison, WI), публічно доступних у вигляді BLAST і включенням біотинільованих або міченими флуоFASTA. Для порівняння послідовностей може бути ресцеїном нуклеотидів, і цей зонд може бути детевикористана також програма ENTREZ, доступна ктований з використанням Стрептавідину або анчерез National Institutes of Health, Bethesda MD. В титіл проти флуоресцеїну. одному варіанті здійснення, процентна ідентичВ даному контексті, «малі органічні молекули» ність двох послідовностей може бути визначена з є молекулами з молекулярною масою, меншою, використанням GCG з вагою гепа 1, так що геп ніж 2000 Дальтон, які містять щонайменше один кожної амінокислоти є зваженим, як якби було неатом вуглецю. співпадання єдиної амінокислоти між цими двома «Поліпептид» і «білок» використовуються тут послідовностями. взаємозамінно для опису молекул білків, які місВ даному контексті, термін «консервативні затять часткові або повнорозмірні білки. лишки» стосується амінокислот, які є однаковими Термін «злитий білок» стосується білка або серед множини білків, що мають одну і ту ж струкполіпептиду, який має амінокислотну послідовтуру і/або функцію. Ділянка консервативних залиність, одержану з двох або більше білків. Злитий шків може бути важливою для структури і функції білок може також включати в себе зв'язувальні білка. Таким чином, суміжні консервативні залишрайони амінокислот між амінокислотними частики, ідентифіковані в трьохмірному білку, можуть нами, одержаними з окремих білків. бути важливими для структури і функції білка. Для В даному контексті, "не-RAGE-поліпептид" є знаходження консервативних залишків або консебудь-яким поліпептидом, який не зроблений з рвативних районів трьохмірної структури може RAGE або його фрагмента. Такі не-RAGEбути виконане порівняння послідовностей для одполіпептиди включають в себе пептиди імуноглоних і тих же або схожих білків з різних видів або буліну, димеризуючі поліпептиди, стабілізучі полііндивідуумів одного і того ж виду. пептиди, амфіфільние пептиди або поліпептиди, В даному контексті, термін «гомолог» означає які містять амінокислотні послідовності, що забезполіпептид, що має міру гомології з амінокислотпечують «мітки» для націлювання або очищення ною послідовністю дикого типу. Порівняння гомоцього білка. логії можуть проводитись візуально або, більш В даному контексті, «білки імуноглобулінів» часто, з використанням легко доступних програм можуть включати в себе важкий ланцюг імуноглопорівняння послідовностей. Ці комерційно доступні буліну або її частину. В одному варіанті здійсненкомп'ютерні програми можуть розраховувати проня, частиною важкого ланцюга може бути Fcцентну гомологію між двома або більш послідовфрагмент або його частина. В даному контексті, ностями (наприклад, Wilbur, WJ. and Lipman, D.J., Fc-фрагмент містить шарнірний поліпептид важко1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730). Наго ланцюга і домени Сн2 і Cн3 важкого ланцюга приклад, гомологічними послідовностями можуть імуноглобуліну, в мономерній або димерній формі. вважатись послідовності, які включають в себе Або СН1 і Fc-фрагмент можуть бути використані як амінокислотні послідовності, які в альтернативних імуноглобуліновий поліпептид. Важкий ланцюг варіантах здійснення є ідентичними щонайменше (або його частина) може бути одержаний з будьна 75%, ідентичними на 85%, ідентичними на 90%, якого з відомих ізотипів важкого ланцюга: IgG ( ), ідентичними на 95% або ідентичними на 98% відIgM ( ), IgD ( ), IgE ( ) або IgA ( ). Крім того, важносно один одного. кий ланцюг (або його частина) може бути одержаВ даному контексті, «домен» поліпептиду або ний з будь-якого з відомих підтипів важкого ланцюбілка містить район вздовж поліпептиду або білка, га: lgG1 ( 1), IgG2 ( 2), IgG3 ( 3), IgG4 ( 4), IgA1 який містить незалежну одиницю. Домени можуть ( 1), IgA2 ( 2) або мутацій цих ізотипів або підтивизначатись по структурі, послідовності і/або біопів, які змінюють біологічну активність. Приклад логічній активності. В одному варіанті здійснення, біологічної активності, яка може бути змінена, домен поліпептиду може містити район білка, який включає в себе зменшення здатності ізотипу зв'яукладається таким чином, що він є по суті незалезуватись з деякими Fc-рецепторами, наприклад, жним від іншої частини цього білка. Домени момодифікацією шарнірної ділянки. жуть бути ідентифіковані з використанням баз даТерміни «Ідентичність» або «процентна іденних доменів, таких як, але не тільки, PFAM, тичність» стосується ідентичності послідовності PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE. між двома амінокислотними послідовностями або ISREC PROFILES, SAMRT і PROCLASS. між двома послідовностями нуклеїнових кислот. В даному контексті, «імуноглобуліновим домеПроцентна ідентичність може бути визначена співном» є послідовність амінокислот, яка є структурно ставленням двох послідовностей і стосується кільгомологічною, або ідентичною, домену імуноглокості ідентичних залишків (наприклад, амінокислот буліну. Довжина цієї послідовності амінокислот або нуклеотидів) в положеннях, спільних для пос 13 92154 14 імуноглобулінового домену може бути будь-якою гідрофобних взаємодій, або вона може бути ковадовжиною. У варіанті здійснення, імуноглобулінолентною. вий домен може бути меншим по довжині, ніж 250 В даному контексті, «ліганд» означає молекулу амінокислот. У варіанті-прикладі, імуноглобуліноабо сполуки або молекулярну частку, які взаємовий домен може мати довжину приблизно 80-150 діють з лігандзв'язувальним сайтом, в тому числі амінокислот. Наприклад, варіабельний район і субстрати або аналоги або їх частини. Як описано райони СН1, Сн2 і Cн3 IgG, кожний, є імуноглобутут, термін «ліганд» може означати сполуки, які ліновими доменами. В іншому прикладі, варіабезв'язуються з білком, який представляє інтерес. льний район, райони СH1, Сн2, Cн3 і СН4 IgM, кожЛігандом може бути агоніст, антагоніст або модуний, є імуноглобуліновими доменами. лятор. Або ліганд може не мати біологічної дії. В даному контексті, «імуноглобуліновий домен Ліганди можуть включати в себе, але не обмежуRAGE» є послідовністю амінокислот з білка RAGE, ються ними, інгібітори з малими молекулами. Ці яка є структурно гомологічною, або ідентичною, малі молекули можуть включати в себе пептиди, домену імуноглобуліну. Наприклад, імуноглобуліпептидоміметики, органічні сполуки і т.п. Ліганди новий домен RAGE може містити V-домен RAGE, можуть включати в себе також поліпептиди і/або Ig-подібний домен С2-типу 1 RAGE ("С1-домен") білки. або Ig-подібний домен С2-типу 2 RAGE ("С2В даному контексті, "модуляторна сполука" домен"). означає молекулу, яка змінює або переробляє В даному контексті, "міждоменний лінкер" місбіологічну активність молекули, яка представляє тить поліпептид, який з'єднує два домени разом. інтерес. Модуляторна сполука може збільшувати Fc-шарнірна частина є прикладом міждоменного або зменшувати активність або змінювати фізичні лінкера в IgG. або хімічні характеристики або функціональні або В даному контексті, термін "безпосередньо поімунологічні властивості молекули, яка представв'язаний" ідентифікує ковалентний зв'язок між ляє інтерес. Для RAGE, модуляторна сполука модвома різними групами (наприклад, послідовносже збільшувати або зменшувати активність або тями нуклеїнових кислот, поліпептидами, доменазмінювати характеристики або функціональні або ми поліпептидів), який не має проміжних атомів імунологічний властивості RAGE або його частини. між двома групами, які зв'язуються. Модуляторна сполука може включати в себе приВ даному контексті, "лігандзв'язувальний дородні і/або хімічно синтезовані або штучні пептиди, мен" означає домен білка, відповідальний за зв'ямодифіковані пептиди (наприклад, фосфопептизування ліганду. Термін лігандзв'язувальний доди), антитіла, вуглеводи, моносахариди, олігосамен включає в себе гомологи лігандзв'язувального хариди, полісахариди, гліколіпіди, гетероциклічні домену або його частини. У цьому відношенні, сполуки, нуклеозиди або нуклеотиди або їх частидовільні амінокислотні заміни можуть бути зробни, і малі органічні або неорганічні молекули. Молені в лігандзв'язувальному сайті на основі схожодуляторна сполука може бути ендогенною фізіолості в полярності, заряді, розчинності, гідрофобносгічною сполукою або вона може бути природною ті або гідрофільності залишків, поки зберігається або синтетичною сполукою. Або ця модуляторна специфічність зв'язування цього лігандзв'язувальсполука може бути малою органічною молекулою. ного домену. Термін "модуляторна сполука" включає в себе В даному контексті, "лігандзв'язувальний сайт" також хімічно модифіковані ліганд або сполуку і містить залишки в білку, які безпосередньо взаєвключає в себе ізомери і рацемічні форми. модіють з лігандом, або залишки, що беруть "Агоніст" є сполукою, яка зв'язується з рецепучасть в позиціонуванні цього лігнаду в тісній блитором з утворенням комплексу, який індукує фарзькості до тих залишків, які безпосередньо взаємакологічну реакцію, специфічну відносно рецепмодіють з цим лігандом. Взаємодія залишків в літора, що бере участь. гандзв'язувальному сайті може визначатись "Антагоніст" є сполукою, яка зв'язується з агопросторовою близькістю цих залишків до ліганду в ністом або рецептором з утворенням комплексу, моделі або структурі. Термін лігандзв'язувальний який не викликає фармакологічної реакції і може сайт включає в себе гомологи лігандзв'язувальноінгібувати біологічну реакцію, індуковану агонісго сайту або його частини. У цьому відношенні, том. довільні амінокислотні заміни можуть бути зробТаким чином, агоністи RAGE можуть зв'язувалені в лігандзв'язувальному сайті на основі схожотись з RAGE і стимулювати RAGE-опосередковані сті в полярності, заряді, розчинності, гідрофобносклітинні процеси, а антагоністи RAGE можуть інгіті або гідрофільності залишків, поки зберігається бувати RAGE-опосередковані клітинні процеси, специфічність зв'язування цього лігандзв'язувальперешкоджаючи їх стимуляції агоністом RAGE. ного сайту. Лігандзв'язувальний сайт може існуваНаприклад, в одному варіанті здійснення, клітинти в одному або декількох лігандзв'язувальних ний процес, що стимулюється агоністами RAGE, доменах білка або поліпептиду. включає в себе активацію транскрипції гена TNF- . В даному контексті, термін «взаємодіють» стоТермін "пептидоміметики" означає структури, сується стану близькості між лігандом або сполуякі служать як замінники пептидів у взаємодіях між кою, або їх частинами або фрагментами, і частимолекулами (Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. ною другої молекули, яка представляє інтерес. Ця Chem., 24:243-252). Пептидоміметики можуть взаємодія може бути нековалентною, наприклад, включати в себе синтетичні структури, які можуть внаслідок утворення водневого зв'язку, вандервамістити або можуть не містити амінокислоти і/або альсових взаємодій або електростатичних або пептидні зв'язки, але зберігають структурні і функціональні ознаки пептиду або агоністу або антаго 15 92154 16 ністу. Пептидоміметики включають в себе також Наприклад, варіанти здійснення даного винапептоїди, олігопептоїди (Simon et al., 1972, Proc. ходу забезпечують злиті білки, що містять поліпеNatl. Acad. Sci. USA, 89:9367); і пептидні бібліотептид RAGE, пов'язаний з другим, не-RAGEки, що містять пептиди сконструйованої довжини, поліпептидом. В одному варіанті здійснення, злиякі представляють всі можливі послідовності амітий білок може містити лігандзв'язувальний сайт нокислот, відповідні пептиду, агоністу або антагоRAGE. В одному варіанті здійснення, лігандзв'язуністу даного винаходу. вальний сайт містить найбільш N-кінцевий домен Термін «лікування» стосується поліпшення злитого білка. Лігандзв'язувальний сайт RAGE симптому захворювання або порушення і може може містити V-домен RAGE або його частину. В включати в себе лікування даного порушення, по одному варіанті здійснення, лігандзв'язувальний суті запобігання виникненню цього порушення або сайт RAGE містить SEQ ID NO:9 або послідовполіпшення стану суб'єкта. Термін «лікування» ність, ідентичну їй на 90%, або SEQ ID NO:10 або означає в даному контексті повний спектр способів послідовність, ідентичну їй на 90%. лікування для конкретного порушення, від якого В одному варіанті здійснення, поліпептид страждає пацієнт, в тому числі ослаблення одного RAGE може бути пов'язаний з поліпептидом, що симптому або більшості симптомів, що викликамістить імуноглобуліновий домен або частину (нається цим порушенням, лікування конкретного поприклад, його фрагмент) імуноглобулінового дорушення або запобігання виникненню цього порумену. В одному варіанті здійснення, поліпептид, шення. що містить імуноглобуліновий домен, містить часВ даному контексті, термін «ЕС50» визначаєтьтину щонайменше одного з доменів Сн2 або Cн3 ся як концентрація агента, яка приводить до 50% IgG людини. виміряної біологічної дії. Наприклад, ЕС50 терапеБілок або поліпептид RAGE може містити поввтичного агенти, що має вимірну біологічну дію, норозмірний білок RAGE людини (наприклад, SEQ може бути величиною, при якій цей агент викликає ID NO:1) або фрагмент RAGE людини. В даному 50% цієї біологічної дії. контексті, фрагмент поліпептиду RAGE має щоВ даному контексті, термін "ІС50" визначається найменше 5 амінокислот в довжину, може бути як концентрація агента, яка приводить до 50% інгібільшим, ніж 30 амінокислот в довжину, але є бування дії, що вимірюються. Наприклад, ІС50 анменшим, ніж повна амінокислотна послідовність. В тагоніста зв'язування RAGE може бути величиною, альтернативних варіантах здійснення, поліпептид при якій цей антагоніст зменшує зв'язування ліганRAGE може містити послідовність, яка є на 70%, ду з лігандзв'язувальним сайтом RAGE на 50%. або 80%, або 85%, або 90% ідентичною RAGE В даному контексті, "ефективна кількість" людини або його фрагменту. Наприклад, в одному означає кількість агента, яка є ефективною для варіанті здійснення, поліпептид RAGE може містиодержання бажаної дії у суб'єкта. Термін "терапевти RAGE людини або його фрагмент, з гліцином як тично ефективна кількість" означає кількість лікарперший залишок, а не з метіоніном (див., наприського засобу або фармацевтичного агента, яка клад, Neeper et al., (1992)). Або RAGE людини мобуде індукувати терапевтичну реакцію тварини же містити повнорозмірний RAGE з видаленою або людини, яку прагнуть одержати. Фактична досигнальною послідовністю (наприклад, SEQ ID за, яка містить цю ефективну кількість, може заNO:2 або SEQ ID NO:3) (Фіг. 1А і 1В) або частиною лежати від способу введення, розміру і здоров'я цієї амінокислотної послідовності. суб'єкта, порушення, що підлягає лікуванню, і т.п. Злиті білки даного винаходу можуть також місТермін "фармацевтично прийнятний носій" тити sRAGE (наприклад, SEQ ID NO:4), поліпепможе стосуватись в даному контексті сполук і комтид, на 90% ідентчиний sRAGE, або фрагмент позицій, які придатні для застосування у суб'єктівsRAGE. В даному контексті, sRAGE є білком людей і суб'єктів-тварин, наприклад, терапевтичRAGE, який не включає в себе трансмембранний них композицій, що вводяться для лікування район або цитоплазматичний хвіст (Park et al.. RAGE-опосередкованого порушення або захворюNature Med., 4:1025-1031 (1998)). Наприклад, полівання. пептид RAGE може містити sRAGE людини, або Термін "фармацевтична композиція" означає в його фрагмент, з гліцином як перший залишок, а даному контексті композицію, яка може вводитись не з метіоніном (див., наприклад, Neeper et al., ссавцеві-хазяїну, наприклад, перорально, парен(1992)). Або поліпептид RAGE може містити терально, топічно, інгаляцією, у вигляді спрею, sRAGE людини з видаленою сигнальною послідоінтраназально або ректально, в уніфікованих довністю (наприклад, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:6) зованих готових формах, що містять загальноп(Фіг. 1С) або частиною цієї амінокислотної послірийняті нетоксичні носії, розріджувачі, ад'юванти, довності. ексципієнти і т.п. В інших варіантах здійснення, білок RAGE моТермін "парентеральні" включає в себе, в даже містити V-домен RAGE (наприклад, SEQ ID ному контексті, підшкірні ін'єкції, внутрішньовенні, NO:7 або SEQ ID NO:8: Фіг. 1D) (Neeper et al., внутрішньом'язові, внутрішньопорожнинні ін'єкції (1992); Schmidt et al. (1997)). Або може бути викоабо інфузійні способи. ристана послідовність, на 90% ідентична V-домену RAGE-злиті білки RAGE або його фрагменту. Варіанти здійснення даного винаходу включаАбо білок RAGE може містити фрагмент Vють в себе RAGE-злиті білки, способи одержання домену RAGE (наприклад, SEQ ID NO:9 або SEQ таких злитих білків і способи застосування таких ID NO:10: Фіг. 1D). В одному варіанті здійснення, злитих білків. Даний винахід може бути здійснений білок RAGE може містити лігандзв'язувальний різними шляхами. сайт. В одному варіанті здійснення, цей лігандзв'я 17 92154 18 зувальний сайт може містити SEQ ID NO:9 або мера. Цей важкий ланцюг (або його частина) може послідовність, на 90% ідентичну їй, або SEQ ID бути одержаний з будь-якого з відомих ізотипів NO:10 або послідовність, на 90% ідентичну їй. Ще важкого ланцюга: IgG ( ), IgM ( ), IgD ( ), IgE ( ) в одному варіанті здійснення, цей фрагмент RAGE або IgA ( ). Крім того, важкий ланцюг (або його є синтетичним пептидом. частина) може бути одержаний з будь-кого з відоТаким чином, поліпептид RAGE, що викорисмих підтипів важкого ланцюга: lgG1 ( 1), IgG2 ( 2), товується в злитих білках даного винаходу, може IgG3 ( 3), IgG4 ( 4), lgA1 ( 1), IgA2 ( 2) або мутамістити фрагмент повнорозмірного RAGE. Як віцій цих ізотипів або підтипів, які змінюють біологічдомо в даній галузі, RAGE містить три імуноглобуну активність. Другий поліпептид може містити лін-подібних поліпептидних домени, V- домен і С1домени Сн2 і Cн3 lgG1 людини або частини будьі С2-домени, кожний з яких пов'язаний з кожним якого, або обох, з цих доменів. Як варіантиіншим міждоменним лінкером. Повнорозмірний приклади, поліпептид, що містить домени Сн2 і RAGE включає в себе також трансмембранний Cн3 lgG1 людини або їх частину, може містити поліпептид і цитоплазматичний хвіст праворуч (СSEQ ID NO:38 або SEQ ID NO:40. кінцевий) від С2-домену і пов'язаний з С2Fc-частина ланцюга імуноглобуліну може бути домeном. прозапальною in vivo. Таким чином, в одному варіВ одному варіанті здійснення, поліпептид анті здійснення, RAGE-злитий білок даного винаRAGE не включає в себе ніякої сигнальної посліходу містить міждоменний лінкер, одержаний з довності. Сигнальна послідовність RAGE може RAGE, а не міждоменний шарнірний поліпептид, містити або залишки 1-22, або залишки 1-23 поводержаний з імуноглобуліну. норозмірного RAGE. Таким чином, в одному варіанті здійснення, Наприклад, поліпептид RAGE може містити злитий білок може додатково містити поліпептид амінокислоти 23-116 RAGE людини (SEQ ID NO:7) RAGE, безпосередньо пов'язаний з поліпептидом, або послідовність, на 90% ідентичну їй, або амінощо містить домен Сн2 імуноглобуліну, або фрагкислоти 24-116 RAGE людини (SEQ ID NO:8) або мент або частину домену Сн2 імуноглобуліну. В послідовність, на 90% ідентичну їй, відповідну Vодному варіанті здійснення, цей домен Сн2 або домену RAGE. Або поліпептид RAGE може містити його фрагмент, містить SEQ ID NO:42. В одному амінокислоти 124-221 RAGE людини (SEQ ID варіанті здійснення, поліпептид RAGE може містиNO:11) або послідовність, на 90% ідентичну їй, ти лігандзв'язувальний сайт. Лігандзв'язувальний відповідну C1-домену RAGE. В іншому варіанті сайт RAGE може містити V-домен RAGE або його здійснення, поліпептид RAGE може містити аміночастину. В одному варіанті здійснення, лігандзв'якислоти 227-317 RAGE людини (SEQ ID NO:12) зувальний сайт RAGE містить SEQ ID NO:9 або або послідовність, на 90% ідентичну їй, відповідну послідовність, на 90% ідентичну їй, або SEQ ID С2-домену RAGE людини. Або поліпептид RAGE NO:10 або послідовність, на 90% ідентичну їй. може містити амінокислоти 23-123 RAGE людини Поліпептид RAGE, що використовується в (SEQ ID NO:13) або послідовність, на 90% ідентизлитих білках даного винаходу, може містити імучну їй, або амінокислоти 24-123 RAGE людини ноглобуліновий домен RAGE. Додатково або аль(SEQ ID NO:14) або послідовність на 90% ідентичтернативно, цей фрагмент RAGE може містити ну їй, відповідну V-домену RAGE людини і міждоміждоменний лінкер. Або поліпептид RAGE може менному лінкеру праворуч. Або поліпептид RAGE містити імуноглобуліновий домен RAGE, пов'язаможе містити амінокислоти 23-226 RAGE людини ний з лівим (тобто більш близьким до N-кінця) або (SEQ ID NO:17) або послідовність, на 90% ідентиправим (тобто більш близьким до С-кінця) міждочну їй, або амінокислоти 24-226 RAGE людини менним лінкером. Ще в одному варіанті здійснен(SEQ ID NO:18) або послідовність на 90% ідентичня, поліпептид RAGE може містити два (або більну їй, відповідну V-домену, C1-домену і міждоменше) імуноглобулінових домени RAGE, кожний з ному лінкеру, який зв'язує ці два домени. Або пояких пов'язаний з кожним іншим міждоменним лінліпептид RAGE може містити амінокислоти 23-339 кером. Крім того, поліпептид RAGE може містити RAGE людини (SEQ ID NO:5) або послідовність, на множинні імуноглобулінові домени RAGE, пов'яза90% ідентичну їй, або 24-339 RAGE людини (SEQ ні один з одним одним або декількома міждоменID NO:6) або послідовність, на 90% ідентичну їй, ними лінкерами, і що мають кінцевий міждоменний відповідну sRAGE (тобто кодуючу V-, C1- і С2лінкер, приєднаний до N-кінцевого імуноглобулінодомени і міждоменні лінкери). Або можуть бути вого домену RAGE і/або С-кінцевого імуноглобулівикористані фрагменти кожної з цих послідовноснового домену. Додаткові комбінації імуноглобулітей. нових доменів RAGE і міждоменних лінкерів Злитий білок може включати в себе декілька знаходяться в об'ємі даного винаходу. типів пептидів, які не зроблені з RAGE або його В одному варіанті здійснення, поліпептид фрагмента. Другий поліпептид злитого білка може RAGE містить міждоменний лінкер RAGE, пов'язамістити поліпептид, зроблений з імуноглобуліну. В ний з імуноглобуліновим доменом RAGE таким одному варіанті здійснення, цей імуноглобуліновий чином, що С-кінцева амінокислота цього імуноглополіпептид може містити важкий ланцюг імуноглобулінового домену RAGE пов'язана з N-кінцевою буліну або його частину (тобто фрагмент). Наприамінокислотою міждоменного лінкера, а С-кінцева клад, фрагмент важкого ланцюга може містити амінокислота міждоменного лінкера RAGE безпополіпептид, зроблений з Fc-фрагмента імуноглосередньо пов'язана з N-кінцевою амінокислотою буліну, де цей Fc-фрагмент містить шарнірний поліпептиду, що містить домен Сн2 імуноглобуліполіпептид важкого ланцюга і домени Сн2 і Cн3 ну, або його фрагмент. Поліпептид, що містить важкого ланцюга імуноглобуліну у вигляді монодомен Сн2 імуноглобуліну, може містити домени 19 92154 20 Сн2 і Cн3 lgG1 людини або частину будь-кого, або RAGE і, отже пов'язана з ним. Наприклад, для Vобох, з цих доменів. Наприклад, поліпептид, що домену RAGE, цей міждоменний лінкер може місмістить домени Сн2 і Cн3, або їх частину, lgG1 тити амінокислотні послідовності, які знаходяться людини, може містити SEQ ID NO:38 або SEQ ID природно праворуч від V-домену. В одному варіаNO:40. нті здійснення, цей лінкер може містити SEQ ID Як описано вище, злитий білок даного винахоNO:21, відповідний амінокислотам 117-123 повноду може містити єдиний домен або множинні дорозмірного RAGE. Або цей лінкер може містити мени з RAGE. Поліпептид RAGE, що містить міжпептид, що має додаткові частини природної посдоменний лінкер, пов'язаний з доменом лідовності RAGE. Наприклад, може бути викорисполіпептиду RAGE, може також містити фрагмент таний міждоменний лінкер, що містить декілька повнорозмірного білка RAGE. Наприклад, поліпепамінокислот (наприклад, 1-3, 1-5 або 1-10 або 1-15 тид RAGE може містити амінокислоти 23-136 амінокислот) зліва і праворуч від SEQ ID NO:21. RAGE людини (SEQ ID NO:15) або послідовність, Так, в одному варіанті здійснення, міждоменний на 90% ідентичну їй, або амінокислоти 24-136 лінкер містить SEQ ID NO:23, що містить амінокиRAGE людини (SEQ ID NO:16) або послідовність, слоти 117-136 повнорозмірного RAGE. Або можуть на 90% ідентичну їй, відповідну V-домену RAGE і бути використані фрагменти SEQ ID NO:21 з деміждоменному лінкеру праворуч. Або поліпептид лецією, наприклад, 1, 2 або 3 амінокислот з будьRAGE може містити амінокислоти 23-251 RAGE якого кінця цього лінкера. В альтернативних варіалюдини (SEQ ID NO: 19) або послідовність, на 90% нтах здійснення, цей лінкер може містити послідоідентичну їй, або амінокислоти 24-251 RAGE лювність, яка на 70% ідентична або на 80% ідентична дини (SEQ ID NO:20) або послідовність, на 90% або на 90% ідентична SEQ ID NO:21 або SEQ ID ідентичну їй. відповідну V-домену, C1-домену, міNO:23. ждоменному лінкеру, який зв'язує ці два домени, і Для C1-домену RAGE, цей лінкер може містидругому міждоменному лінкеру праворуч від С1. ти пептидну послідовність, яка знаходиться приНаприклад, в одному варіанті здійснення, цей родно праворуч від цього C1-домену. В одному злитий білок може містити два імуноглобулінових варіанті здійснення, цей лінкер може містити SEQ домени, одержаних з білка RAGE, і два імуноглоID NO:22, відповідну амінокислотам 222-251 повбулінових домени, одержаних з Fc-поліпептиду норозмірного RAGE. Або цей лінкер може містити людини. Цей злитий білок може містити перший пептид, що має додаткові частини природної посімуноглобуліновий домен RAGE і перший міждолідовності RAGE. Наприклад, може бути викорисменний лінкер RAGE, пов'язаний з другим імуногтаний лінкер, що містить декілька амінокислот (1лобуліновим доменом RAGE і другим міждомен3, 1-5 або 1-10 або 1-15 амінокислот) зліва і праним лінкером RAGE, так що N-кінцева воруч від SEQ ID NO:22. Або можуть бути викориамінокислота першого міждоменного лінкера постані фрагменти SEQ ID NO:22 з делецією, наприв'язана з С-кінцевою амінокислотою першого імуклад, 1-3, 1-5 або 1-10 або 1-15 амінокислот з ноглобулінового домену RAGE, N-кінцева амінокибудь-якого кінця цього лінкера. Наприклад, в одслота другого імуноглобулінового домену RAGE ному варіанті здійснення, міждоменний лінкер пов'язана з С-кінцевою амінокислотою першого RAGE може містити SEQ ID NO:24, відповідну аміміждоменного лінкера, N-кінцева амінокислота нокислотам 222-226. Або міждоменний лінкер модругого міждоменного лінкера пов'язана з Сже містити SEQ ID NO:44, відповідну амінокислокінцевою амінокислотою другого імуноглобуліновотам 318-342 RAGE. го домену RAGE і С-кінцева амінокислота другого Способи одержання RAGE-злитих білків міждоменного лінкера RAGE безпосередньо пов'яДаний винахід стосується також способу одезана з N-кінцевою амінокислотою імуноглобуліноржання RAGE-злитого білка. Таким чином, в однового домену Сн2. В одному варіанті здійснення, му варіанті здійснення, даний винахід стосується RAGE-злитий білок з чотирьох доменів може місспособу одержання RAGE-злитого білка, що петити SEQ ID NO:32. В альтернативних варіантах редбачає стадію ковалентного зв'язування поліпездійснення, RAGE-злитий білок з чотирьох доменів птиду RAGE, пов'язаного з другим, не-RAGEмістить SEQ ID NO:33 або SEQ ID NO:34. поліпептидом, де поліпептид RAGE містить ліганАльтернативно, злитий білок з трьох доменів дзв'язувальний сайт RAGE. Наприклад, ці пов'язаможе містити один імуноглобуліновий домен, одені поліпептид RAGE і другий, не-RAGE-поліпептид, ржаний з RAGE, і два імуноглобулінових домени, можуть кодуватись рекомбінантною конструкцією одержаних з Fc-поліпептиду людини. Наприклад, ДНК. Цей спосіб може додатково передбачати цей злитий білок може містити єдиний імуноглобустадію включення цієї конструкції ДНК в експресуліновий домен RAGE, пов'язаний через міждоменючий вектор. Цей спосіб може також передбачати ний лінкер RAGE з N-кінцевою амінокислотою імустадію введення цього експресуючого вектора в ноглобулінового домену Сн2 або частиною клітину-хазяїн. імуноглобулінового домену Сн2. В одному варіанті Наприклад, варіанти даного винаходу забезздійснення, RAGE-злитий білок з трьох доменів печують злиті білки, що містять поліпептид RAGE, може містити SEQ ID NO:35. В альтернативних пов'язаний з другим, не-RAGE-поліпептидом. В варіантах здійснення, RAGE-злитий білок з трьох одному варіанті здійснення, цей злитий білок може доменів може містити SEQ ID NO:36 або SEQ ID містити лігандзв'язувальний сайт RAGE. В одному NO:37. варіанті здійснення, лігандзв'язувальний сайт місМіждоменний лінкерний фрагмент RAGE може тить найбільш N-кінцевий домен злитого білка. містити пептидну послідовність, яка знаходиться Лігандзв'язувальний сайт RAGE може містити Vприродно праворуч від імуноглобулінового домену домен RAGE або його частину. В одному варіанті 21 92154 22 здійснення, лігандзв'язувальний сайт RAGE місристана для кодування амінокислот 1-116 RAGE тить SEQ ID NO:9 або послідовність, на 90% іденлюдини. Або ця нуклеїнова кислота може містити тичну їй, або SEQ ID NO:10 або послідовність, на SEQ ID NO:26 для кодування амінокислот 1-123 90% ідентичну їй. RAGE людини. Або ця нуклеїнова кислота може В одному варіанті здійснення, поліпептид містити SEQ ID NO:27 для кодування амінокислот RAGE може бути пов'язаний з поліпептидом, що 1-136 RAGE людини. Або ця нуклеїнова кислота містить імуноглобуліновий домен або частину (наможе містити SEQ ID NO:28 для кодування аміноприклад, його фрагмент) імуноглобулінового докислот 1-230 RAGE людини. Або ця нуклеїнова мену. В одному варіанті здійснення, поліпептид, кислота може містити SEQ ID NO:29 для кодуванщо містить імуноглобуліновий домен, містить часня амінокислот 1-251 RAGE людини. Або фрагметину щонайменше одного з доменів Сн2 або Cн3 нти цих послідовностей нуклеїнових кислот моIgG людини. жуть бути використані для кодування фрагментів Цей злитий білок може бути сконструйований поліпептиду RAGE. способами рекомбінантних ДНК. Наприклад, в одЗлитий білок може включати в себе декілька ному варіанті здійснення, даний винахід може містипів пептидів, які не зроблені з RAGE або його тити виділену послідовність нуклеїнової кислоти, фрагмента. Другий поліпептид цього злитого білка кодуючої поліпептид RAGE, пов'язаного з другим, може містити поліпептид, одержаний з імуноглоне-RAGE-поліпептидом. В одному варіанті здійсбуліну. Важкий ланцюг (або його частина) може нення, поліпептид RAGE може містити лігандзв'ябути одержаний з будь-якого з відомих ізотипів зувальний сайт RAGE. важкого ланцюга: IgG ( ), IgM ( ), IgD ( ), IgE ( ) Білок або поліпептид RAGE може містити повабо IgA ( ). Крім того, важкий ланцюг (або його норозмірний RAGE (наприклад, SEQ ID NO:1) або частина) може бути одержаний з будь-кого з відофрагмент RAGE людини. В одному варіанті здійсмих підтипів важкого ланцюга: lgG1 ( 1), IgG2 ( 2), нення, поліпептид RAGE не містить ніяких залишIgG3 ( 3), IgG4 ( 4), lgA1 ( 1), IgA2 ( 2) або мутаків сигнальної послідовності. Сигнальна послідовцій цих ізотипів або підтипів, які змінюють біологічність RAGE може містити або залишки 1-22, або ну активність. Другий поліпептид може містити залишки 1-23 повнорозмірного RAGE (SEQ ID домени Сн2 і Cн3 lgG1 людини або частини будьNO:1). В альтернативних варіантах здійснення, якого, або обох, з цих доменів. Як варіантиполіпептид RAGE може містити послідовність, на приклади, поліпептид, що містить домени Сн2 і 70% або 80% або 90% ідентичну RAGE людини Cн3 lgG1 людини або їх частину, може містити або його фрагменту. Наприклад, в одному варіанті SEQ ID NO:38 або SEQ ID NO:40. Цей пептид імуздійснення, поліпептид RAGE може містити RAGE ноглобуліну може кодуватись послідовністю нуклелюдини або його фрагмент, з гліцином як перший їнової кислоти SEQ ID NO:39 або SEQ ID NO:41. залишок, а не з метіоніном (див., наприклад, Fc-частина ланцюга імуноглобуліну може бути Neeper et al., (1992)). Або RAGE людини може міспрозапальною in vivo. Таким чином, в одному варітити повнорозмірний RAGE з видаленою сигнальанті здійснення, RAGE-злитий білок даного винаною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO:2 або ходу містить міждоменний лінкер, одержаний з SEQ ID NO:3) (Фіг. 1А і 1В) або частиною цієї аміRAGE, а не міждоменний шарнірний поліпептид, нокислотної послідовності. Злиті білки даного виодержаний з імуноглобуліну. Наприклад, в одному находу можуть також містити sRAGE (наприклад, варіанті здійснення, злитий білок може кодуватись SEQ ID NO:4), поліпептид, на 90% ідентичний рекомбінантною конструкцією ДНК. Цей спосіб sRAGE, або фрагмент sRAGE. Наприклад, поліпеможе також передбачати стадію включення ДНКптид RAGE може містити sRAGE людини, або його конструкції в експресуючий вектор. Цей спосіб мофрагмент, з гліцином як перший залишок, а не з же також включати в себе трансфекцію цього ексметіоніном (див., наприклад, Neeper et al., (1997)). пресуючого вектора в клітину-хазяїна. Або RAGE людини може містити sRAGE з видалеТаким чином, в одному варіанті здійснення, ною сигнальною послідовністю (наприклад, SEQ даний винахід стосується способу одержання ID NO:5 або SEQ ID NO:6) (Фіг. 1С) або частиною RAGE-злитого білка, що передбачає стадію ковацієї амінокислотної послідовності. В інших варіанлентного зв'язування поліпептиду RAGE з поліпептах здійснення, білок RAGE може містити V-домен тидом, що містить Сн2-домен імуноглобуліну або (наприклад, SEQ ID NO:7 або SEQ ID NO:8; Фіг. частину Сн2-домену імуноглобуліну. В одному 1D). Або може бути використана послідовність, на варіанті здійснення, цей злитий білок може містити 90% ідентична V-домену або його фрагменту. Або лігандзв'язувальний сайт RAGE. Лігандзв'язувальбілок RAGE може містити фрагмент RAGE, що ний сайт RAGE може містити V-домен RAGE або містить частину V-домену RAGE (наприклад, SEQ його частину. В одному варіанті здійснення, ліганID NO:9 або SEQ ID NO:10, Фіг. 1D). В одному вадзв'язувальний сайт RAGE містить SEQ ID NO:9 ріанті здійснення, лігандзв'язувальний сайт може або послідовність, на 90% ідентичну їй, або SEQ містити SEQ ID NO:9 або послідовність, на 90% ID NO:10 або послідовність, на 90% ідентичну їй. ідентичну їй, або SEQ ID NO:10 або послідовність, Наприклад, в одному варіанті здійснення, дана 90% ідентичну їй. Ще в одному варіанті здійсний винахід містить нуклеїнову кислоту, що кодує нення фрагмент RAGE є синтетичним пептидом. поліпептид RAGE, безпосередньо пов'язаний з В одному варіанті здійснення, послідовність поліпептидом, що містить Сн2-домен імуноглобунуклеїнової кислоти містить SEQ ID NO:25, що ліну або його фрагмент. В одному варіанті здійскодує амінокислоти 1-118 RAGE людини, або її нення, цей Сн2-домен, або його фрагмент, містить фрагмент. Наприклад, послідовність, що містить SEQ ID NO:42. Цей другий поліпептид може містинуклеотиди 1-348 SEQ ID NO:25, може бути викоти домени Сн2 і Cн3 lgG1 людини. Як варіант 23 92154 24 приклад, поліпептид, що містить домени Сн2 і Cн3 ліпептиду, що містить імуноглобуліновий домен lgG1 людини, може містити SEQ ID NO:38 або SEQ Сн2 або його фрагмент. Наприклад, цей поліпепID NO:40. Цей пептид імуноглобуліну може кодутид RAGE може містити амінокислоти 23-136 ватись послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID RAGE людини (SEQ ID NO:15) або послідовність, NO:39 або SEQ ID NO:41. на 90% ідентичну їй, або амінокислоти 24-136 В одному варіанті здійснення, поліпептид RAGE людини (SEQ ID NO:16) або послідовність, RAGE може містити міждоменний лінкер RAGE, на 90% ідентичну їй, відповідну V-домену RAGE і пов'язаний з імуноглобуліновим доменом RAGE міждоменному лінкеру праворуч. В одному варіантаким чином, що С-кінцева амінокислота цього ті здійснення, конструкція нуклеїнової кислоти, яка імуноглобулінового домену RAGE пов'язана з Nмістить SEQ ID NO:31 або її фрагмент, може кодукінпевою амінокислотою міждоменного лінкера, а вати RAGE-злитий білок з трьох доменів. С-кінцева амінокислота міждоменного лінкера Міждоменний лінкерний фрагмент RAGE може RAGE безпосередньо пов'язана з N-кінцевою амімістити пептидну послідовність, яка знаходиться нокислотою поліпептиду, що містить домен Сн2 природно праворуч від імуноглобулінового домену імуноглобуліну, або його фрагмент. Поліпептид, RAGE і, отже, пов'язана з ним. Наприклад, для Vщо містить домен Сн2 імуноглобуліну, може містидомену RAGE, цей міждоменний лінкер може місти поліпептид, що містить домени Сн2 і Cн3 lgG1 тити амінокислотні послідовності, які знаходяться людини або частину будь-якого, або обох, з цих природно праворуч від V-домену. В одному варіадоменів. Наприклад, поліпептид, що містить доменті здійснення, цей лінкер може містити SEQ ID ни Сн2 і Cн3 lgG1 людини, або їх частину, може NO:21, відповідну амінокислотам 117-123 повномістити SEQ ID NO:38 або SEQ ID NO:40. розмірного RAGE. Або цей лінкер може містити Злитий білок даного винаходу може містити пептид, що має додаткові частини природної посєдиний домен або множинні домени з RAGE. Полілідовності RAGE. Наприклад, може бути викориспептид RAGE, що містить міждоменний лінкер, таний міждоменний лінкер, що містить декілька пов'язаний з імуноглобуліновим доменом RAGE, амінокислот (наприклад, 1-3, 1-5 або 1-10 або 1-15 може також містити фрагмент повнорозмірного амінокислот) зліва і праворуч від SEQ ID NO:21. білка RAGE. Наприклад, в одному варіанті здійсТаким чином, в одному варіанті здійснення, міжнення, цей злитий білок може містити два імуногдоменний лінкер містить SEQ ID NO:23, що містить лобулінових домени, одержаних з білка RAGE, і амінокислоти 117-136 повнорозмірного RAGE. Або два імуноглобулінових домени, одержаних з Fcможуть бути використані фрагменти SEQ ID NO:21 поліпептиду людини. Цей злитий білок може містиз делецією, наприклад, 1, 2 або 3 амінокислот з ти перший імуноглобуліновий домен RAGE і пербудь-якого кінця цього лінкера. В альтернативних ший міждоменний лінкер RAGE, пов'язаний з друваріантах здійснення, цей лінкер може містити гим імуноглобуліновим доменом RAGE і другим послідовність, яка на 70% ідентична або на 80% міждоменним лінкером RAGE, так що N-кіннева ідентична або на 90% ідентична SEQ ID NO:21 або амінокислота першого міждоменного лінкера поSEQ ID NO:23. в'язана з С-кінцевою амінокислотою першого імуДля C1-домену RAGE, цей лінкер може містиноглобулінового домену RAGE, N-кінцева амінокити пептидну послідовність, яка знаходиться прислота другого імуноглобулінового домену RAGE родно праворуч від цього C1-домену. В одному пов'язана з С-кінцевою амінокислотою першого варіанті здійснення, цей лінкер може містити SEQ міждоменного лінкера, N-кінцева амінокислота ID NO:22, відповідну амінокислотам 222-251 повдругого міждоменного лінкера пов'язана з Снорозмірного RAGE. Або цей лінкер може містити кінцевою амінокислотою другого імуноглобуліновопептид, що має додаткові частини природної посго домену RAGE і С-кінцева амінокислота другого лідовності RAGE. Наприклад, може бути викорисміждоменного лінкера RAGE безпосередньо пов'ятаний лінкер, що містить декілька амінокислот (1зана з N-кінцевою амінокислотою поліпептиду, що 3, 1-5 або 1-10 або 1-15 амінокислот) зліва і прамістить імуноглобуліновий домен Сн2, або його воруч від SEQ ID NO:22. Або можуть бути викорифрагмент. Наприклад, поліпептид RAGE може стані фрагменти SEQ ID NO:22 з делецією, напримістити амінокислоти 23-251 RAGE людини (SEQ клад, 1-3, 1-5 або 1-10 або 1-15 амінокислот з ID NO:19) або послідовність, на 90% ідентичну їй, будь-якого кінця цього лінкера. Наприклад, в одабо амінокислоти 24-251 RAGE людини (SEQ ID ному варіанті здійснення, міждоменний лінкер NO:20) або послідовність, на 90% ідентичну їй, RAGE може містити SEQ ID NO:24, відповідну амівідповідну V-домену, C1-домену, міждоменному нокислотам 222-226. Або міждоменний лінкер молінкеру, який зв'язує ці два домени, і другому міжже містити SEQ ID NO:44, відповідну амінокислодоменному лінкеру, праворуч від C1. В одному там 318-342 RAGE. варіанті здійснення, конструкція нуклеїнової кислоЦей спосіб може додатково передбачати стати, яка містить SEQ ID NO:30 або її фрагмент, модію включення конструкції ДНК в експресуючий же кодувати RAGE-злитий білок з чотирьох домевектор. Таким чином, в одному варіанті здійсненнів. ня, даний винахід стосується експресуючого векАльтернативно, злитий білок з трьох доменів тора, який кодує злитий білок, що містить поліпепможе містити один імуноглобуліновий домен, одетид RAGE, безпосередньо пов'язаний з ржаний з RAGE, і два імуноглобулінових домени, поліпептидом, що містить Сн2-домен імуноглобуодержаних з Fc-поліпептиду людини. Наприклад, ліну або частину Сн2-домену імуноглобуліну. В цей злитий білок може містити єдиний імуноглобуодному варіанті здійснення, поліпептид RAGE місліновий домен RAGE, пов'язаний через міждоментить конструкції, такі як описані тут, які мають міжний лінкер RAGE з N-кінцевою амінокислотою подоменний лінкер RAGE, пов'язаний з імуноглобу 25 92154 26 ліновим доменом RAGE, так що С-кінцева амінобільш низьким, ніж температура плавлення (Тт) кислота імуноглобулінового домену RAGE пов'яДНК-дуплекса в 1 Μ солі). зана з N-кінцевою амінокислотою міждоменного Кодуюча послідовність може бути експресовалінкера, а С-кінцева амінокислота міждоменного на трансфекцією експресуючого вектора у відповілінкера RAGE безпосередньо пов'язана з Nдного хазяїна. Наприклад, рекомбінантні вектори кінцевою амінокислотою поліпептиду, що містить можуть бути стабільно трансфіковані в клітини Сн2-домен імуноглобуліну або його частину. Наяєчника Китайського хом'ячка (СНО), і клітини, які приклад, експресуючий вектор, що використовуекспресують злитий білок, можуть бути відібрані і ється для трансфекції клітин, може містити посліклоновані. В одному варіанті здійснення, клітини, довність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:30, або її які експресують рекомбінантну конструкцію, відбифрагмент, або SEQ ID NO:31, або її фрагмент. рають на кодовану плазмідою стійкість до неоміКрім того, цей спосіб може додатково передцину, з використанням антибіотика G418. Індивідубачати стадію трансфекції клітини експресуючим альні клони можуть бути відібрані, і клони, які вектором даного винаходу. Таким чином, в одному експресуть високі рівні рекомбінантного білка, деваріанті здійснення, даний винахід містить клітину, тектовані за допомогою Вестерн-блот-аналізу клітрансфіковану експресуючим вектором, який екстинного супернатанту, можуть бути розмножені, і пресував RAGE-злитий білок даного винаходу, так продукт цього гену може бути обчищений афінною що ця клітина експресує злитий білок, що містить хроматографією з використанням Білок А-колонок. поліпептид RAGE, безпосередньо пов'язаний з Варіанти проб рекомбінантних нуклеїнових киполіпептидом, що містить Сн2-домен імуноглобуслот, які кодують злиті білки даного винаходу, поліну або частину Сн2-домену імуноглобуліну. В казані на Фігурах 2-5. Наприклад, як описано виодному варіанті здійснення, поліпептид RAGE місще, злитий білок, продукований рекомбінантною тить конструкції, такі як конструкції, описані вище, ДНК-конструкцією, може містити поліпептид RAGE, які мають міждоменний лінкер RAGE, пов'язаний з злитий з другим, не-RAGE-поліпептидом. Цей злиімуноглобуліновим доменом RAGE, так що Стий білок може містити два домени, одержані з кінцева амінокислота імуноглобулінового домену білка RAGE, і два домени, одержані з імуноглобуRAGE пов'язана з N-кінцевою амінокислотою міжліну. Приклад конструкції нуклеїнової кислоти, що доменного лінкера, а С-кінцева амінокислота міжкодує злитий білок, ТТР-4000 (ТТ4), який має цей доменного лінкера RAGE безпосередньо пов'язана тип структури, показаний у вигляді Фіг. 2 (SEQ ID з N-кінцевою амінокислотою поліпептиду, що місNO:30). Як показано на Фіг. 2, кодуюча послідовтить Сн2-домен імуноглобуліну або його частину. ність 1-743 (виділена жирним шрифтом), кодує NНаприклад, експресуючий вектор, що використокінцеву послідовність RAGE, тоді як послідовність вується для трансфекції клітин, може містити пос754-1386 кодує послідовність білка Fc IgG. лідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:30, або Злитий білок, що походить від SEQ ID NO:30 її фрагмент, або SEQ ID NO:31, або її фрагмент. або послідовності, на 90% ідентичної їй, може місНаприклад, можуть бути сконструйовані плазтити амінокислотну послідовність з чотирьох доміди для експресії злитих білків RAGE-IgG Fc менів SEQ ID NO:32 або поліпептид з видаленою злиттям різних довжин 5'-кДНК-послідовності сигнальною послідовністю (наприклад, SEQ ID RAGE людини з 3'-кДНК-послідовністю lgG1 Fc (1) NO:33 або SEQ ID NO:34) (Фіг. 4). На Фіг. 4 амінолюдини. Ці послідовності експресійної касети мокислотна послідовність RAGE виділена жирним жуть бути вбудовані в експресуючий вектор, такий шрифтом. Імуноглобулінова послідовність є Сн2- і як експресуючий вектор pcDNA3.1 (Invitrogen, СА), Cн3-іммуноглобуліновимі доменами IgG. Як показ використанням стандартних рекомбінантних спозано на Фіг. 6В, перші 251 амінокислота повнорозсобів. мірного RAGE-злитого білка ТТР-4000 містять як Цей спосіб може також включати в себе транпослідовність поліпептиду RAGE сигнальну послісфекцію експресуючого вектора в клітину-хазяїна. довність, яка містить амінокислоти 1-22/23, VВ одному варіанті здійснення, рекомбінант може домен імуноглобуліну (в тому числі лігандзв'язубути трансфікований в клітини яєчника Китайськовальний сайт), який містить амінокислоти 23/24го хом'ячка і оптимізований для експресії. В альте116, міждоменний лінкер, який містить амінокислорнативних варіантах здійснення, ці клітини можуть ти 117-123, другий імуноглобуліновий домен (C1), продукувати 0,1-20 г/л або 0,5-10 г/л або приблизякий містить амінокислоти 124-221, і праворуч міно 1-2 г/л. ждоменний лінкер, який містить амінокислоти 222Як відомо в даній галузі, такі конструкції нукле251. їнових кислот можуть бути модифіковані мутацією, В одному варіанті здійснення, злитий білок наприклад, за допомогою ПЛР-ампліфікації нуклеможе необов'язково містити другий імуноглобуліїнової кислоти-матриці з праймерами, що містять новий домен RAGE. Наприклад, злитий білок може мутацію, яка представляє інтерес. Таким шляхом містити один імуноглобуліновий домен, що похоможуть бути сконструйовані поліпептиди, що мадить від RAGE, і два імуноглобулінових домени, ють афінність, що варіюється у відношенні лігандів що походять від Fc-поліпептиду людини. Приклад RAGE. В одному варіанті здійснення, мутовані конструкції нуклеїнової кислоти, що кодує цей тип послідовності можуть бути на 90% або більше ідезлитого білка, показаний у вигляді Фіг. 3 (SEQ ID нтичними з вихідною ДНК. Такі варіанти можуть NO:31). Як показано на Фіг. 3, кодуюча послідоввключати в себе нуклеотидні послідовності, які ність, що містить нуклеотиди 1-408 (виділені жиргібридизуються при суворих умовах (тобто еквіваним шрифтом), кодує N-кінцеву послідовність біллентних температурам, на приблизно 20-27°С ка RAGE, тоді як послідовність, що містить 27 92154 28 нуклеотиди 409-1041, кодує послідовність білка Fc для застосування. В одному варіанті здійснення, lgG1 (1). лігандзв'язувальний сайт містить найбільш NЗлитий білок, який походить від SEQ ID NO:31 кінцевий домен злитого білка. або послідовності, на 90% ідентичної їй. може місБілок або поліпептид RAGE може містити повтити амінокислотну послідовність з трьох доменів норозмірний RAGE людини (наприклад, SEQ ID SEQ ID NO:35 або поліпептид з видаленою сигнаNO:1) або фрагмент RAGE людини. В одному вальною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO:36 ріанті здійснення, поліпептид RAGE не містить або SEQ ID NO:37) (Фіг. 5). На Фіг. 5 амінокислотна ніяких залишків сигнальної послідовності. Сигнапослідовність RAGE виділена жирним шрифтом. льна послідовність RAGE може містити або залиЯк показано на Фіг. 6В, перші 136 амінокислот пошки 1-22, або залишки 1-23 повнорозмірного внорозмірного RAGE-злитого білка ТТР-3000 місRAGE (SEQ ID NO:1). В альтернативних варіантах тять як послідовність поліпептиду RAGE сигнальну здійснення, поліпептид RAGE може містити посліпослідовність, яка містить амінокислоти 1-22/23, довність, на 70% або 80% або 90% ідентичну імуноглобуліновий V-домен (в тому числі лігандзRAGE людини або його фрагменту. Наприклад, в в'язувальний сайт), який містить амінокислоти одному варіанті здійснення, поліпептид RAGE мо23/24-116, міждоменний лінкер, який містить аміже містити RAGE людини або його фрагмент, з нокислоти 117-136. Послідовність 137-346 включає гліцином як перший залишок, а не з метіоніном в себе імуноглобулінові домени Сн2 і Cн3 IgG. (див., наприклад, Neeper et al., (1992)). Або RAGE Злиті білки даного винаходу можуть мати полюдини може містити повнорозмірний RAGE з виліпшену стабільність in vivo у порівнянні з поліпепдаленою сигнальною послідовністю (наприклад, тидами RAGE, що не містять другого поліпептиду. SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3) (Фіг. 1А і 1B) або Цей злитий білок може бути додатково модифікочастиною цієї амінокислотної послідовності. Злиті ваний для збільшення стабільності, ефективності, білки даного винаходу можуть також містити активності і біодоступності. Таким чином, злиті sRAGE (наприклад, SEQ ID NO:4), поліпептид, на білки даного винаходу можуть бути модифіковані 90% ідентичний sRAGE, або фрагмент sRAGE. посттрансляційним процесингом або хімічною моНаприклад, поліпептид RAGE може містити дифікацією. Наприклад, злитий білок може бути sRAGE людини, або його фрагмент, з гліцином як одержаний синтетично для включення L-, D- або перший залишок, а не з метіоніном (див., напринеприродних амінокислот, альфа-дизаміщених клад, Neeper et al., (1997)). Або RAGE людини моамінокислот або N-алкіламінокислот. Крім того, же містити sRAGE з видаленою сигнальною послібілки можуть бути модифіковані ацетилуванням, довністю (наприклад, SEQ ID NO:5 або SEQ ID ацилуванням, АДФ-рибозилуванням, амідуванням, NO:6) (Фіг. 1С) або частиною цієї амінокислотної приєднанням ліпідів, таких як фосфатидилінозит, послідовності, В інших варіантах здійснення, білок утворенням дисульфідних зв'язків, і т.п. Крім того, RAGE може містити V-домен (наприклад, SEQ ID може бути доданий поліетиленгліколь для збільNO:7 або SEQ ID NO:8, Фіг. 1D). Або може бути шення біологічної стабільності злитого білка. використана послідовність, на 90% ідентична VЗв'язування антагоністів RAGE з RAGEдомену або його фрагменту. Або білок RAGE може злитими білками містити фрагмент RAGE, що містить частину VЗлиті білки даного винаходу можуть мати ряд домену RAGE (наприклад, SEQ ID NO:9 або SEQ застосувань. Наприклад, злиті білки даного винаID NO:10: Фіг. 1D). В одному варіанті здійснення, ходу можуть бути використані в аналізі зв'язування лігандзв'язувальний сайт може містити SEQ ID для ідентифікації лігандів RAGE, таких як агоністи, NO:9 або послідовність, на 90% ідентичну їй, або антагоністи або модулятори RAGE. SEQ ID NO:10 або послідовність, на 90% ідентичну Наприклад, в одному варіанті здійснення, даїй. Ще в одному варіанті здійснення фрагмент ний винахід забезпечує спосіб детектування модуRAGE є синтетичним пептидом. ляторів RAGE, що передбачає: (а) забезпечення Злитий білок може включати в себе декілька злитого білка, який містить поліпептид RAGE, потипів пептидів, які не зроблені з RAGE або його в'язаний з другим, не-RAGE-поліпептидом, де цей фрагмента. Другий поліпептид цього злитого білка поліпептид RAGE містить лігандзв'язувальний може містити поліпептид, одержаний з імуноглосайт; (b) змішування сполуки, яка представляє буліну. Важкий ланцюг (або його частина) може інтерес, і ліганду, який має відому активність зв'ябути одержаний з будь-кого з відомих ізотипів важзування у відношенні RAGE, зі злитим білком; і (с) кого ланцюга: IgG ( ), IgM ( ), IgD ( ), IgE ( ) або вимірювання зв'язування відомого ліганду RAGE з IgA ( ). Крім того, важкий ланцюг (або його частиRAGE-злитим білком у присутності сполуки, яка на) може бути одержаний з будь-кого з відомих представляє інтерес. В одному варіанті здійсненпідтипів важкого ланцюга: lgG1 ( 1), IgG2 ( 2), IgG3 ня, лігандзв'язувальний сайт містить найбільш N( 3), IgG4 ( 4), lgA1 ( 1), IgA2 ( 2) або мутацій цих кінцевий домен злитого білка. ізотипів або підтипів, які змінюють біологічну актиRAGE-злиті білки можуть також забезпечувати вність. Другий поліпептид може містити домени набори для детектування модуляторів RAGE. НаСн2 і Cн3 lgG1 людини або частину будь-якого, приклад, в одному варіанті здійснення, набір даноабо обох, з цих доменів. Як варіанти-приклади, го винаходу може містити (а) сполуку, що має віполіпептид, що містить домени Сн2 і Cн3 lgG1 людому афінність зв'язування у відношенні RAGE як дини або їх частину, може містити SEQ ID NO:38 позитивний контроль; (b) RAGE-злитий білок, що або SEQ ID NO:40. Цей пептид імуноглобуліну містить поліпептид RAGE, пов'язаний з другим, неможе кодуватись послідовністю нуклеїнової кислоRAGE-поліпептидом, де цей поліпептид RAGE ти SEQ ID NO:39 або SEQ ID NO:41. містить лігандзв'язувальний сайт; і (с) інструкції 29 92154 30 Fc-частина ланцюга імуноглобуліну може бути цей злитий білок може містити єдиний імуноглобупрозапальною in vivo. Таким чином, RAGE-злитий ліновий домен RAGE, пов'язаний через міждоменбілок даного винаходу може містити Fcний лінкер RAGE з N-кінцевою амінокислотою попослідовність, одержану з RAGE, а не з ланцюга ліпептиду, що містить імуноглобуліновий домен імуноглобуліну. В одному варіанті здійснення, злиСн2 або його фрагмент. Наприклад, цей поліпептий білок може містити імуноглобуліновий домен тид RAGE може містити амінокислоти 23-136 RAGE, пов'язаний з поліпептидом, що містить Сн2RAGE людини (SEQ ID NO:15) або послідовність, домен імуноглобуліну або його фрагмент. В однона 90% ідентичну їй, або амінокислоти 24-136 му варіанті здійснення, поліпептид RAGE може RAGE людини (SEQ ID NO:16) або послідовність, містити міждоменний лінкер RAGE, пов'язаний з на 90% ідентичну їй, відповідну V-домену RAGE і імуноглобуліновим доменом RAGE, так що Сміж доменному лінкеру праворуч. В одному варіакінцева амінокислота цього імуноглобулінового нті здійснення, конструкція нуклеїнової кислоти, домену RAGE пов'язана з N-кінцевою амінокислояка містить SEQ ID NO:31 або її фрагмент, може тою міждоменного лінкера, а С-кінцева амінокискодувати RAGE-злитий білок з трьох доменів. лота міждоменного лінкера RAGE безпосередньо Як описано тут, міждоменний линкерний фрапов'язана з N-кінцевою амінокислотою поліпептигмент RAGE може містити пептидну послідовність, ду, що містить домен Сн2 імуноглобуліну, або його яка знаходиться природно праворуч від імуноглофрагмент. Поліпептид, що містить домен Сн2 імубулінового домену RAGE і, отже, пов'язана з ним. ноглобуліну. може містити поліпептид, що містить Наприклад, для V-домену RAGE, цей міждоменний домени Сн2 і Cн3 lgG1 людини або частину будьлінкер може містити амінокислотні послідовності, якого, або обох, з цих доменів. Наприклад, поліпеякі знаходяться природно праворуч від V-домену. птид, що містить домени Сн2 і Cн3 lgG1 людини, В одному варіанті здійснення, цей лінкер може або їх частину, може містити SEQ ID NO:38 або містити SEQ ID NO:21, відповідну амінокислотам SEQ ID NO:40. 117-23 повнорозмірного RAGE. Або цей лінкер Злитий білок даного винаходу може містити може містити пептид, що має додаткові частини єдиний домен або множинні домени з RAGE. Поліприродної послідовності RAGE. Наприклад, може пептид RAGE, що містить міждоменний лінкер, бути використаний міждоменний лінкер, що міспов'язаний з імуноглобуліновим доменом RAGE, тить декілька амінокислот (наприклад, 1-3, 1-5 або може також містити фрагмент повнорозмірного 1-10 або 1-15 амінокислот) зліва і праворуч від білка RAGE. Наприклад, в одному варіанті здійсSEQ ID NO:21. Таким чином, в одному варіанті нення, цей злитий білок може містити два імуногздійснення, міждоменний лінкер містить SEQ ID лобулінових домени, одержаних з білка RAGE, і NO:23. що містить амінокислоти 117-136 повнородва імуноглобулінових домени, одержаних з Fcзмірного RAGE. Або можуть бути використані фраполіпептиду людини. Цей злитий білок може містигменти SEQ ID NO:21 з делецією, наприклад, 1, 2 ти перший імуноглобуліновий домен RAGE і перабо З амінокислот з будь-якого кінця цього лінкеший міждоменний лінкер RAGE, пов'язаний з друра. В альтернативних варіантах здійснення, цей гим імуноглобуліновим доменом RAGE і другим лінкер може містити послідовність, яка на 70% міждоменним лінкером RAGE, так що N-кінцева ідентична або на 80% ідентична або на 90% іденамінокислота першого міждоменного лінкера потична SEQ ID NO:21 або SEQ ID NO:23. в'язана з С-кінцевою амінокислотою першого імуДля C1-домену RAGE, цей лінкер може містиноглобулінового домену RAGE, N-кінцева амінокити пептидну послідовність, яка знаходиться прислота другого імуноглобулінового домену RAGE родно праворуч від цього C1-домену. В одному пов'язана з С-кінцевою амінокислотою першого варіанті здійснення, цей лінкер може містити SEQ міждоменного лінкера, N-кінцева амінокислота ID NO:22, відповідну амінокислотам 222-251 повдругого міждоменного лінкера пов'язана з Снорозмірного RAGE. Або цей лінкер може містити кінцевою амінокислотою другого імуноглобуліновопептид, що має додаткові частини природної посго домену RAGE і С-кінцева амінокислота другого лідовності RAGE. Наприклад, може бути викорисміждоменного лінкера RAGE безпосередньо пов'ятаний лінкер, який містить декілька амінокислот (1зана з N-кінцевою амінокислотою поліпептиду, що 3, 1-5 або 1-10 або 1-15 амінокислот) зліва і прамістить імуноглобуліновий домен Сн2, або його воруч від SEQ ID NO:22. Або можуть бути викорифрагмент. Наприклад, поліпептид RAGE може стані фрагменти SEQ ID NO:22 з делецією, напримістити амінокислоти 23-251 RAGE людини (SEQ клад, 1-3, 1-5 або 1-10 або 1-15 амінокислот з ID NO:19) або послідовність, на 90% ідентичну їй, будь-якого кінця цього лінкера. Наприклад, в одабо амінокислоти 24-251 RAGE людини (SEQ ID ному варіанті здійснення, міждоменний лінкер NO:20) або послідовність, на 90% ідентичну їй, RAGE може містити SEQ ID NO:24, відповідну амівідповідну V-домену, C1-домену, міждоменному нокислотам 222-226. Або міждоменний лінкер молінкеру, який зв'язує ці два домени, і другому міжже містити SEQ ID NO:44, відповідну амінокислодоменному лінкеру, праворуч від C1. В одному там 318-342 RAGE. варіанті здійснення, конструкція нуклеїнової кислоНаприклад, RAGE-злитий білок може бути вити, яка містить SEQ ID NO:30 або її фрагмент, мокористаний в аналізі зв'язування для ідентифікації же кодувати RAGE-злитий білок з чотирьох домепотенційних лігандів RAGE. В одному варіантінів. прикладі такого аналізу зв'язування, відомий ліАльтернативно, злитий білок з трьох доменів ганд RAGE може бути нанесений на твердий субможе містити один імуноглобуліновий домен, одестрат (наприклад, планшети Maxisorb) в концентржаний з RAGE, і два імуноглобулінових домени, рації приблизно 5 мікрограмів на ямку, де кожна одержаних з Fc-поліпептиду людини. Наприклад, ямка містить загальний об'єм приблизно 100 мік 31 92154 32 ролітрів (мкл). Планшети можуть інкубуватись при амфотерином (Ampho), приводячи до збільшення 4°С протягом ночі для абсорбції ліганду. Альтероптичної щільності. За відсутності ліганду (тобто нативно, можуть бути використані більш короткі тільки з покриттям БСА) не було збільшення оптиперіоди інкубації при більш високій температурі чної щільності. (наприклад, при кімнатній температурі). Після деАналіз зв'язування даного винаходу може бути якого періоду часу, необхідного для зв'язування використаний для кількісного визначення зв'язуліганду з субстратом, тест-ямки можуть бути аспівання ліганду з RAGE. В альтернативних варіанровані і може бути доданий блокуючий буфер (натах здійснення, ліганди RAGE можуть зв'язуватись приклад, 1% БСА в 50 мМ імідазоловому буфері, зі злитим білком даного винаходу з афінностями рН 7,2) для блокування неспецифічного зв'язуванзв'язування в діапазоні 0,1-1000 наномолярних ня. Наприклад, блокуючий буфер може бути додаконцентрацій (нМ) або 1-500 нМ або 10-80 нМ. ний до планшетів і залишений в планшетах на 1 Злитий білок даного винаходу може бути тагодину при кімнатній температурі. Потім планшети кож використаний для ідентифікації сполук, здатаспірують і/або промивають промивальним буфених зв'язуватись з RAGE. Як показано на Фігурах 8 ром. В одному варіанті здійснення, як промивальі 9, відповідно, ліганд RAGE може аналізуватись ний буфер може бути використаний буфер, що на його здатність конкурувати з імобілізованим містить 20 мМ імідазолу, 150 мМ NaCl, 0,05% Твінамілоїдом бета за зв'язування зі злитими білками 20, 5 мМ СаСl2 і 5 мМ MgCl2, рН 7.2. Потім в ці ТТР-4000 (ТТ4) або ТТР-3000 (TT3). Таким чином, тест-ямки додають злитий білок в розведенні, що можна бачити, що ліганд RAGE в кінцевій тестзбільшується. Потім RAGE-злитому білку може концентрації (FAC) 10 мкМ може замінювати зв'ябути дозволено інкубуватись з імобілізованим лізування RAGE-злитого білка з амілоїдом-бета в гандом в тест-ямці для досягнення урівноваження концентраціях 1:3, 1:10, 1:30 і 1:100 вихідного роззв'язування. В одному варіанті здійснення, RAGEчину ТТР-4000 (Фіг. 8) або ТТР-3000 (Фіг. 9). злитому білку дають інкубуватись з імобілізованим Модуляція клітинних ефекторів лігандом протягом приблизно однієї години при Варіанти злитих білків даного винаходу мо37°С. В альтернативних варіантах здійснення, можуть бути використані для модуляції біологічної жуть бути використані більш тривалі періоди інкуреакції, опосередковуваної RAGE. Наприклад, бації при більш низьких температурах. Після інкуможуть бути сконструйовані злиті білки для модубації злитого білка та імобілізованого ліганду, ляції RAGE-індукованих збільшень експресії генів. планшет може бути промитий для видалення Таким чином, в одному варіанті здійснення, злиті будь-якого непов'язаного злитого білка. Злитий білки даного винаходу можуть бути використані білок, пов'язаний з імобілізованим лігандом, може для модуляції функції біологічних ферментів. Надетектуватись різними шляхами. В одному варіанті приклад, взаємодія між RAGE і його лігандами здійснення, детектування використовує ELISA. може генерувати окислювальний стрес і активацію Таким чином, в одному варіанті здійснення, комNF- Β і NF- В-регульованих генів, таких як гени плекс для імунодетектування, що містить монокцитокінів IL-1 , TNF- і т.п. Крім того, було показалональне мишаче антитіло проти lgG1 людини, но, що декілька інших регуляторних шляхів, таких біотинільоване козяче антитіло проти мишачого як шляхи за участю p21ras, МАР-кіназ, ERK1 і IgG і пов'язану з авидином лужну фосфатазу, моERK2, активуються зв'язуванням AGE та інших же бути доданий до злитого білка, імобілізованого лігандів з RAGE. в тест-ямці. Комплексу для імунодетектування Застосування злитих білків даного винаходу дають зв'язуватись з імобілізованим злитим білком для модуляції експресії клітинного ефектора TNFтак, щоб зв'язування між злитим білком і комплекпоказане на Фіг. 10. Мієлоїдні клітини ТНР-1 мосом для імунодетектування досягло рівноваги. жуть культивуватись в середовищі RPMI-1640, Наприклад, цьому комплексу дають зв'язуватись зі доповненому 10% ФТС, та індукуватись для секзлитим білком протягом однієї години при кімнатреції TNF- за допомогою стимуляції RAGE за ній температурі. У цій часовій точці будь-який недопомогою S100b. Коли така стимуляція відбувапов'язаний комплекс може бути видалений промиється у присутності RAGE-злитого білка, індукція ванням тест-ямки промивальним буфером. TNF- за допомогою зв'язування S100b з RAGE Пов'язаний комплекс може детектуватись додаможе бути інгібована. Таким чином, як показано на ванням субстрату лужної фосфатази, параФіг. 10, додавання 10 мкг злитого білка ТТР-3000 нітрофенілфосфату (PNPP), і вимірюванням пере(TT3) або ТТР-4000 (ТТ4) зменшує індукцію TNFтворення PNPP в пара-нітрофенол (PNP) у вигляді за допомогою S100b на приблизно 50%-75%. Злизбільшення оптичної щільності при 405 нм. тий білок ТТР-4000 може бути щонайменше таким В одному варіанті здійснення, ліганд RAGE же ефективним у блокуванні індукції TNF- за дозв'язується з RAGE-злитим білком з наномолярпомогою S100b, яким є sRAGE (Фіг. 10). Специфіною (нМ) або мікромолярною (мкМ) афінністю. чність інгібування для RAGE-послідовностей ТТРЕксперимент, що ілюструє зв'язування лігандів 4000 і ТТР-3000 показана експериментом, в якому RAGE з RAGE-злитими білками даного винаходу, до S100b-стимульованих клітин додавали тільки показаний на Фіг. 7. Еотували розчини ТТР-3000 IgG. Додавання IgG і S100b в аналіз показує ті ж (TT3) і ТТР-4000 (ТТ4), що мають вихідні концентсамі рівні TNF- , що і додавання тільки S100b. рації 1,082 мг/мл і 370 мкг/мл, відповідно. Як покаФізіологічні характеристики RAGE-злитих білзано на Фіг. 7, при різному розведенні, злиті білки ків ТТР-3000 і ТТР-4000 здатні зв'язуватись з імобіліХоча sRAGE може мати терапевтичну користь зованими лігандами RAGE амілоїдом-бета (Abeta) в модуляції RAGE-опосередкованих захворювань, (Amyloid Beta (1-40), Biosource), S100b (S100) і 33 92154 34 sRAGE людини може мати недоліки як незалежпов'язаний з імуноглобуліновим доменом (імуногний терапевтичний засіб внаслідок відносно коротлобуліновими доменами), де Fc-шарнірна ділянка кого напівперіоду існування sRAGE в плазмі. Наз імуноглобуліну видалена і замінена поліпептиприклад, в той час, як sRAGE гризуна має дом RAGE. Таким шляхом може бути мінімізована напівперіод існування в нормальних і діабетичних взаємодія RAGE-злитого білка і Fc-рецепторів на щурах приблизно 20 годин, sRAGE людини має запальних клітинах. Однак, може бути важливим напівперіод існування, менший, ніж 2 години, при підтримка правильного стекінгу та інших трьохміроцінці по збереженню імунореактивності sRAGE них структурних взаємодій між різними імуногло(Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 290:1458буліновими доменами цього злитого білка. Таким 1466 (1999)). чином, варіанти злитих білків даного винаходу Для одержання терапевтичного агента на осможуть замінювати біологічно інертний, але струкнові RAGE, який має такі ж характеристики зв'язутурно схожий міждоменний лінкер RAGE, який ровання, які має sRAGE, але більш стабільний фарзділяє V- і C1-домени RAGE, або лінкер, який розмакокінетичний профіль, може бути використаний діляє C1- і С2-домени RAGE, замість нормальної RAGE-злитий білок, що містить лігандзв'язувальшарнірної ділянки важкого ланцюга імуноглобуліний сайт RAGE, пов'язаний з одним або декількону. Таким чином, поліпептид RAGE цього злитого ма імуноглобуліновими доменами людини. Як вібілка може містити міждоменну лінкерну послідовдомо в даній галузі, ці імуноглобулінові домени ність, яка природно виявляється праворуч від імуможуть включати в себе Fc-частину важкого ланноглобулінового домену RAGE, з утворенням фрацюга імуноглобуліну. гменту імуноглобуліновий домен RAGE/лінкер. Fc-частина імуноглобуліну може повідомляти Таким шляхом можуть підтримуватись трьохмірні декілька характерних ознак злитому білку. Напривзаємодії між імуноглобуліновими доменами, яким клад, Fc-злитий білок може збільшувати напівперісприяють або RAGE, або імуноглобулін. од існування в сироватці такого злитого білка, часВ одному варіанті здійснення, RAGE-злитий то від годин до декількох днів. Збільшення білок даного винаходу може мати суттєве збільфармакокінетичної стабільності звичайно є решення фармакокінетичної стабільності у порівнянзультатом взаємодії лінкера між Сн2- і Cн3ні з sRAGE. Наприклад, Фіг. 11 показує, що як тільрайонами Fc-фрагмента з FcRn-рецептором ки RAGE-злитий білок ТТР-4000 наситив його (Wines et al., J. Immunol., 164:5213-5318 (2000)). ліганди, він може зберігати напівперіод існування, Хоча злиті білки, що містять Fc-поліпептид більший, ніж 300 годин. Це може бути протиставімуноглобуліну, можуть забезпечувати перевагу лене напівперіоду існування для sRAGE, який стазбільшеної стабільності, імуноглобулін-злиті білки новить тільки декілька годин в плазмі людини. можуть індукувати запальну реакцію при введенні Таким чином, в одному варіанті здійснення, в хазяїна. Ця запальна реакція може бути зумовRAGE-злиті білки даного винаходу можуть бути лена, значною мірою, Fc-частиною імуноглобуліну використані для протидії зв'язуванню фізіологічних цього злитого білка. Прозапальна реакція може лігандів з RAGE як засіб для лікування RAGEбути бажаною ознакою, якщо передбачувана міопосередковуваних захворювань без генерування шень експресується на патологічному типі клітин, неприйнятної міри запалення. Злиті білки даного який повинен бути елімінований (наприклад, на винаходу можуть виявляти суттєве зменшення раковій клітині або популяції лімфоцитів, що спригенерування протизапальної реакції у порівнянні з чиняє аутоімунне захворювання). Прозапальна IgG. Наприклад, як показано на Фіг. 12, RAGEреакція може бути нейтральною ознакою, якщо злитий білок ТТР-4000 не стимулює вивільнення мішенню є розчинний білок, оскільки більшість TNF- з клітин в умовах, в яких детектується стирозчинних білків не активують імуноглобуліни. муляція вивільнення TNF- за допомогою IgG люОднак, ця прозапальна реакція може бути негатидини. вною ознакою, якщо ця мішень експресується на Лікування захворювання RAGE-злитими білтипах клітин, руйнування яких привело б до шкідками ливих побічних ефектів. Прозапальна реакція моДаний винахід може також включати в себе же бути також негативною ознакою, якщо запальспособи для лікування RAGE-опосередковуваного ний каскад встановлюється в місці зв'язування порушення у суб'єкта-людини. В одному варіанті злитого білка з тканиною-мішенню, оскільки багато здійснення, цей спосіб може передбачати введенякі медіатори запалення можуть бути шкідливими ня суб'єкту злитого білка, який містить поліпептид для навколишньої тканини і/або можуть викликати RAGE, що містить лігандзв'язувальний сайт RAGE, системні ефекти. пов'язаний з другим, не-RAGE-поліпептидом. В Первинний прозапальний сайт Fc-фрагментів одному варіанті здійснення, цей злитий білок може імуноглобуліну знаходиться на шарнірній ділянці містити лігандзв'язувальний сайт RAGE. В одному між СН1 і Сн2. Ця шарнірна ділянка взаємодіє з варіанті здійснення, цей лігандзв'язувальний сайт FcR1-3 на різних лейкоцитах і запускає ці клітини містить найбільш N-кінцевий домен цього злитого до атаки мішені (Wines et al., J. Immunol., 164:5313білка. Лігандзв'язувальний сайт RAGE може місти5318 (2000)). ти V-домен RAGE або його частину. В одному ваЯк терапевтичні засоби для RAGEріанті здійснення, лігандзв'язувальний сайт RAGE опосередковуваних захворювань, RAGE-злиті білмістить SEQ ID NO:9 або послідовність, на 90% ки даного винаходу можуть не вимагати генеруідентичну їй, або SEQ ID NO:10 або послідовність, вання запальної реакції. Таким чином, варіанти на 90% ідентичну їй. RAGE-злитих білків даного винаходу можуть місВ одному варіанті здійснення, поліпептид тити злитий білок, що містить поліпептид RAGE, RAGE може бути пов'язаний з поліпептидом, який 35 92154 36 містить імуноглобуліновий домен або частину (наноглобуліну може кодуватись послідовністю нуклеприклад, його фрагмент) імуноглобулінового доїнової кислоти SEQ ID NO:39 або SEQ ID NO:41. мену. В одному варіанті здійснення, поліпептид, Наприклад, поліпептид RAGE може містити що містить імуноглобуліновий домен, містить часамінокислоти 23-116 RAGE людини (SEQ ID NO:7) тину щонайменше одного з доменів Сн2 або Cн3 або послідовність, на 90% ідентичну їй, або аміноIgG людини. кислоти 24-116 RAGE людини (SEQ ID NO:8) або Білок або поліпептид RAGE може містити повпослідовність, на 90% ідентичну їй, відповідну Vнорозмірний RAGE (наприклад, SEQ ID NO:1) або домену RAGE. Або поліпептид RAGE може містити фрагмент RAGE людини. В одному варіанті здійсамінокислоти 124-221 RAGE людини (SEQ ID нення, поліпептид RAGE не містить ніяких залишNO:11) або послідовність, на 90% ідентичну їй, ків сигнальної послідовності. Сигнальна послідоввідповідну C1-домену RAGE. В іншому варіанті ність RAGE може містити або залишки 1-22, або здійснення, поліпептид RAGE може містити амінозалишки 1-23 повнорозмірного RAGE (SEQ ID кислоти 227-317 RAGE людини (SEQ ID NO:12) NO:1). В альтернативних варіантах здійснення, або послідовність, на 90% ідентичну їй, відповідну поліпептид RAGE може містити послідовність, на С2-домену RAGE людини. Або поліпептид RAGE 70% або 80% або 90% ідентичну RAGE людини може містити амінокислоти 23-123 RAGE людини або його фрагменту. Наприклад, в одному варіанті (SEQ ID NO:13) або послідовність, на 90% ідентиздійснення, поліпептид RAGE може містити RAGE чну їй, або амінокислоти 24-123 RAGE людини людини, або його фрагмент, з гліцином як перший (SEQ ID NO:14) або послідовність на 90% ідентичзалишок, а не з метіоніном (див., наприклад, ну їй, відповідну V-домену RAGE людини і міждоNeeper et al., (1992)). Або RAGE людини може місменному лінкеру праворуч. Або поліпептид RAGE тити повнорозмірний RAGE з видаленою сигнальможе містити амінокислоти 23-226 RAGE людини ною послідовністю (наприклад, SEQ ID NO:2 або (SEQ ID NO:17) або послідовність, на 90% ідентиSEQ ID NO:3) (Фіг. 1А і 1B) або частиною цієї амічну їй, або амінокислоти 24-226 RAGE людини нокислотної послідовності. Злиті білки даного ви(SEQ ID NO:18) або послідовність на 90% ідентичнаходу можуть також містити sRAGE (наприклад. ну їй, відповідну V-домену, C1-домену і міждоменSEQ ID NO:4), поліпептид, на 90% ідентичний ному лінкеру, який зв'язує ці два домени. Або поsRAGE, або фрагмент sRAGE. Наприклад, поліпеліпептид RAGE може містити амінокислоти 23-339 птид RAGE може містити sRAGE людини або. його RAGE людини (SEQ ID NO:5) або послідовність, на фрагмент, з гліцином як перший залишок, а не з 90% ідентичну їй, або 24-339 RAGE людини (SEQ метіоніном (див., наприклад, Neeper et al., (1997)). ID NO:6) або послідовність, на 90% ідентичну їй, Або RAGE людини може містити повнорозмірний відповідну sRAGE (тобто кодуючу V-, C1- і С2sRAGE з видаленою сигнальною послідовністю домени і міждоменні лінкери). Або можуть бути (наприклад, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:6) (Фіг. використані фрагменти кожної з цих послідовнос1С) або частиною цієї амінокислотної послідовностей. ті. В інших варіантах здійснення, білок RAGE може Fc-частина ланцюга імуноглобуліну може бути містити V-домен (наприклад, SEQ ID NO:7 або прозапальною in vivo. Таким чином, в одному варіSEQ ID NO:8; Фіг. 1D). Або може бути використана анті здійснення, RAGE-злитий білок даного винапослідовність, на 90% ідентична V-домену або ходу містить міждоменний лінкер, одержаний з його фрагменту. Або білок RAGE може містити RAGE, а не міждоменний шарнірний поліпептид, фрагмент RAGE, що містить частину V-домену одержаний з імуноглобуліну. RAGE (наприклад, SEQ ID NO:9 або SEQ ID Таким чином, в одному варіанті здійснення, NO:10, Фіг. 1D). В одному варіанті здійснення, лізлитий білок може додатково містити поліпептид гандзв'язувальний сайт може містити SEQ ID NO:9 RAGE, безпосередньо злитий з поліпептидом, що або послідовність, на 90% ідентичну їй, або SEQ містить домен Сн2 імуноглобуліну або його фрагID NO:10 або послідовність, на 90% ідентичну їй. мент. В одному варіанті здійснення, цей домен Ще в одному варіанті здійснення фрагмент RAGE Сн2 або його фрагмент містить SEQ ID NO:42. є синтетичним пептидом. В одному варіанті здійснення, поліпептид Злитий білок може включати в себе декілька RAGE містить міждоменний лінкер RAGE, пов'язатипів пептидів, які не зроблені з RAGE або його ний з імуноглобуліновим доменом RAGE таким фрагмента. Другий поліпептид цього злитого білка чином, що С-кінцева амінокислота цього імуногломоже містити поліпептид, одержаний з імуноглобулінового домену RAGE пов'язана з N-кінцевою буліну. Важкий ланцюг (або його частина) може амінокислотою міждоменного лінкера, а С-кінцева бути одержаний з будь-якого з відомих ізотипів амінокислота міждоменного лінкера RAGE безпосередньо пов'язана з N-кінцевою амінокислотою важкого ланцюга: IgG ( ), IgM ( ), IgD ( ), IgE ( ) поліпептиду, що містить домен Сн2 імуноглобуліну або IgA ( ). Крім того, важкий ланцюг (або його або його фрагмент. Поліпептид, що містить домен частина) може бути одержаний з будь-кого з відоСн2 імуноглобуліну, може містити домени Сн2 і мих підтипів важкого ланцюга: lgG1 ( 1), IgG2 ( 2), Cн3 lgG1 людини. Наприклад, поліпептид, що місIgG3 ( 3), IgG4 ( 4), lgA1 ( 1), IgA2 ( 2) або мутатить домени Сн2 і Cн3 lgG1 людини, може містити цій цих ізотипів або підтипів, які змінюють біологічSEQ ID NO:38 або SEQ ID NO:40. ну активність. Другий поліпептид може містити Злитий білок даного винаходу може містити домени Сн2 і Cн3 lgG1 людини або частину будьєдиний домен або множинні домени з RAGE. Поліякого, або обох, з цих доменів. Як варіантипептид RAGE, що містить міждоменний лінкер, приклади, поліпептид, що містить домени Сн2 і пов'язаний з доменом поліпептиду RAGE, може Cн3 lgG1 людини або їх частину, може містити також містити фрагмент повнорозмірного білка SEQ ID NO:38 або SEQ ID NO:40. Цей пептид іму 37 92154 38 RAGE. Наприклад, в одному варіанті здійснення, Таким чином, в одному варіанті здійснення, міжцей злитий білок може містити два імуноглобулідоменний лінкер містить SEQ ID NO:23, що містить нових домени, одержаних з білка RAGE, і два імуамінокислоти 117-136 повнорозмірного RAGE. Або ноглобулінових домени, одержаних з Fcможуть бути використані фрагменти SEQ ID NO:21 поліпептиду людини. Цей злитий білок може містиз делецією, наприклад, 1, 2 або 3 амінокислот з ти перший імуноглобуліновий домен RAGE і пербудь-якого кінця цього лінкера. В альтернативних ший міждоменний лінкер RAGE, пов'язаний з друваріантах здійснення, цей лінкер може містити гим імуноглобуліновим доменом RAGE і другим послідовність, яка на 70% ідентична або на 80% міждоменним лінкером RAGE, так що N-кінцева ідентична або на 90% ідентична SEQ ID NO:21 або амінокислота першого міждоменного лінкера поSEQ ID NO:23. в'язана з С-кінцевою амінокислотою першого імуДля C1-домену RAGE, цей лінкер може містиноглобулінового домену RAGE, N-кінцева амінокити пептидну послідовність, яка знаходиться прислота другого імуноглобулінового домену RAGE родно праворуч від цього C1-домену. В одному пов'язана з С-кінцевою амінокислотою першого варіанті здійснення, цей лінкер може містити SEQ міждоменного лінкера, N-кінцева амінокислота ID NO:22, відповідну амінокислотам 222-251 повдругого міждоменного лінкера пов'язана з Снорозмірного RAGE. Або цей лінкер може містити кінцевою амінокислотою другого імуноглобуліновопептид, що має додаткові частини природної посго домену RAGE і С-кінцева амінокислота другого лідовності RAGE. Наприклад, може бути викорисміждоменного лінкера RAGE безпосередньо пов'ятаний лінкер, що містить декілька амінокислот (1зана з N-кінцевою амінокислотою поліпептиду, що 3, 1-5 або 1-10 або 1-15 амінокислот) зліва і прамістить імуноглобуліновий домен Сн2 або його воруч від SEQ ID NO:22. Або можуть бути викорифрагмент. Наприклад, поліпептид RAGE може стані фрагменти SEQ ID NO:22 з делецією, напримістити амінокислоти 23-251 RAGE людини (SEQ клад, 1-3, 1-5 або 1-10 або 1-15 амінокислот з ID NO:19) або послідовність, на 90% ідентичну їй, будь-якого кінця цього лінкера. Наприклад, в одабо амінокислоти 24-251 RAGE людини (SEQ ID ному варіанті здійснення, міждоменний лінкер NO:20) або послідовність, на 90% ідентичну їй, RAGE може містити SEQ ID NO:24, відповідну амівідповідну V-домену, C1-домену, міждоменному нокислотам 222-226. Або міждоменний лінкер молінкеру, який зв'язує ці два домени, і другому міжже містити SEQ ID NO:44, відповідну амінокислодоменному лінкеру, праворуч від C1. В одному там 318-342 RAGE. варіанті здійснення, конструкція нуклеїнової кислоВ одному варіанті здійснення, злитий білок дати, яка містить SEQ ID NO:30, або її фрагмент моного винаходу може вводитись різними способами. же кодувати RAGE-злитий білок з чотирьох домеВведення RAGE-злитого білка даного винаходу нів. може використати внутрішньочеревинну (IP) ін'єкАльтернативно, злитий білок з трьох доменів цію. Альтернативно, RAGE-злитий білок може може містити один імуноглобуліновий домен, одевводитись перорально, інтраназально або у виржаний з RAGE, і два імуноглобулінових домени, гляді аерозолю. В іншому варіанті здійснення, одержаних з Fc-поліпептиду людини. Наприклад, введення є внутрішньовенним (IV). RAGE-злитий цей злитий білок може містити єдиний імуноглобубілок може також ін'єктуватись підшкірно. В іншому ліновий домен RAGE, пов'язаний через міждоменваріанті здійснення, введення цього злитого білка ний лінкер RAGE з N-кінцевою амінокислотою поє внутрішньоартеріальним. В іншому варіанті здійліпептиду, що містить імуноглобуліновий домен снення, введення є сублінгвальним. Введення Сн2 або його фрагмент. Наприклад, цей поліпепможе також використати капсулу з пролонгованим тид RAGE може містити амінокислоти 23-136 вивільненням. Ще в одному варіанті здійснення, RAGE людини (SEQ ID NO:15) або послідовність, введення може бути трансректальним, наприклад, на 90% ідентичну їй, або амінокислоти 24-136 з використанням супозиторію або т.п. Наприклад, RAGE людини (SEQ ID NO:16) або послідовність, підшкірне введення може бути застосовне для на 90% ідентичну їй, відповідну V-домену RAGE і лікування хронічних порушень, коли бажаним є міждоменному лінкеру праворуч. В одному варіансамостійне введення. ті здійснення, конструкція нуклеїнової кислоти, яка Для валідизації застосування сполук, які момістить SEQ ID NO:31 або її фрагмент, може кодудулюють RAGE, як терапевтичні засоби викорисвати RAGE-злитий білок з трьох доменів. тали різні моделі тварин. Прикладами цих модеМіждоменний линкерний фрагмент RAGE молей є наступні моделі: же містити пептидну послідовність, яка знаходитьa) Утворення нової інтими, яке інгібується ся природно праворуч від імуноглобулінового доsRAGE, (внутрішньої оболонки судин) в щурячій мену RAGE і, отже, пов'язана з ним. Наприклад, моделі рестенозу після артеріального пошкоджендля V-домену RAGE, цей міждоменний лінкер моня як у діабетичних, так і у нормальних щурів інгіже містити амінокислотні послідовності, які знахобуванням активації ендотеліальних клітин, клітин дяться природно праворуч від V-домену. В одному гладких м'язів і макрофагів за допомогою RAGE варіанті здійснення, цей лінкер може містити SEQ (Zhou et al., Circulation 107:2238-2243 (2003)); ID NO:21, відповідну амінокислотам 117-123 повb) Інгібування взаємодій RAGE/ліганд з виконорозмірного RAGE. Або цей лінкер може містити ристанням або sRAGE, або анти-RAGE-антитіла, пептид, що має додаткові частини природної посзменшене утворення амілоїдних бляшок в мишачій лідовності RAGE. Наприклад, може бути викорисмоделі системного амілоїдозу (Yan et al., Nat. таний міждоменний лінкер, що містить декілька Med., 6:643-651 (2000)). Зменшення числа амілоїамінокислот (наприклад, 1-3, 1-5 або 1-10 або 1-15 дних бляшок супроводжувалось зменшенням заамінокислот) зліва і праворуч від SEQ ID NO:21. пальних цитокінів, інтерлейкіну-6 (IL-6) і макрофа 39 92154 40 гального колонієстимулюючого фактора (M-CSF), Було показано також, що глікоокислення макромолекул, що зрештою приводить до утворення а також зменшеною активацією NF- Β у тварин, просунутих кінцевих продуктів глікозилування що одержували лікування; (AGE), посилюється в місцях запалення, при нирc) RAGE-трансгенні миші (понадекспресуючі і ковій недостатності, у присутності гіперглікемії та RAGE-домінантно-негативні) виявляють утворення інших станів, асоційованих з системним або локабляшок і порушення пізнавальної здатності (когнільним окислювальним стресом (Dyer et al., J. Clin тивні порушення) в мишачій моделі AD (Arancio et Invest., 91:2463-2469 (1992); Reddy et al., Biochem., al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004)); 34:10872-10878 (1995); Dyer et al., J. Biol. Chem, d) Лікування діабетичних щурів з використан266:11654-11660 (1991); Degenhardt et al., Cell Mol. ням sRAGE зменшувало проникність судин Biol., 44:1139-1145 (1998)). Накопичення AGE в (Bonnardel-Phu et al., Diabetes, 48:2052-2058 судинній мережі може відбуватись локалізовано (у (1999)); вигляді осередків), як у випадку амілоїду суглобів, e) Лікування sRAGE зменшувало атеросклеротичні пошкодження у діабетичних аполіпопротеїн що складається з АОЕ- 2-мікроглобуліну, що виЕ-нуль-мишей і запобігало виникненню функціонаявляється у пацієнтів з пов'язаним з діалізом амільних і морфологічних показників діабетичної нелоїдозом (Miyata et al., J. Clin Invest., 92:1243-1252 фропатії у мишей db/db (Hudson et al., Arch. (1993); Miyata et al., J. Clin Invest., 98:1088-1094 Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)); і (1996)), або генералізовано, як наприклад, в суf) sRAGE атенуював тяжкість запалення в мидинній мережі і тканинах пацієнтів з діабетом шачій моделі індукованого колагеном артриту (Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995)). (Hofmann et al., Genes Immunol., 3:123-135 (2002)), Прогресуюче накопичення AGE у часі у пацієнтів з мишачій моделі експериментального алергічного діабетом передбачає, що ендогенні механізми енцефаломієліту (Yan et al., Nat. Med. 9:28-293 кліренсу не здатні ефективно функціонувати в міс(2003)) і мишачій моделі запального захворювання цях відкладення AGE. Такі AGE, що накопичуютькишечнику (Hofmann et al., Cell, 97:889-901(1999)). ся, здатні змінювати клітинні властивості за допоТаким чином, в одному варіанті здійснення, бімогою ряду механізмів. Хоча RAGE експресується лки даного винаходу можуть бути використані для при низьких рівнях в нормальних тканинах і судинлікування симптому діабету і/або ускладнень, що ній мережі, було показано, що в середовищі, в походять від діабету, опосередковуваних RAGE. В якому нагромаджуються ліганди рецептора, RAGE альтернативних варіантах здійснення, симптом стає позитивно регульованим (Li et al., J. Biol. діабету або пізні діабетичні ускладнення можуть Chem., 272:16498-16506 (1997); Li et al., J. Biol. включати в себе діабетичну нефропатію, діабетиChem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al., J. чну ретинопатію, діабетичну виразку стопи, серцеBiol. Chem., 275:25781-25790 (2000)). Експресія во-судинне ускладнення діабету або діабетичну RAGE збільшується в ендотелії, клітинах гладких нефропатію. м'язів та інфільтруючих мононуклеарних фагоциСпочатку ідентифікований як рецептор для тах в судинній мережі діабетиків. Дослідження в молекул, експресія яких асоційована з патологією клітинній культурі також продемонстрували, що діабету, RAGE, сам, є важливим для патофізіології взаємодія AGE RAGE викликає зміни в клітинних діабетичних ускладнень. Було показано, що in vivo властивостях, важливих в гомеостазі судин. інгібування взаємодії RAGE з його лігандом (ліганЗастосування RAGE-злитих білків в лікуванні дами) є терапевтичним у множинних моделях діапов'язаної з діабетом патології ілюструється на бетичних ускладнень і запалення (Hudson et al., Фіг. 13. RAGE-злитий білок ТТР-4000 оцінювали в Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)). Напримоделі рестенозу діабетичних щурів, яка включала клад, двомісячне лікування анти-RAGE-антитілами в себе вимірювання проліферації гладких м'язів і нормалізувало функцію нирок і зменшувало анорозвитку інтими після васкулярного пошкодження. мальну гістопатологію нирок у діабетичних мишей Як показано на Фіг. 13, лікування ТТР-4000 може (Flyvbjerg et al., Diabetes 53:166-172 (2004)). Крім значуще зменшувати відношення інтима-медіа того, лікування розчинною формою RAGE (внутрішня оболонка судин - середня оболонка (sRAGE), яка зв'язується з лігандами RAGE та судин) (І/М) (Фіг. 13А; таблиця 1) в асоційованому інгібує взаємодії RAGE/ліганд, зменшувало атероз діабетом рестенозі залежним від дози чином. склеротичні пошкодження у діабетичних аполіпопЛікування з використанням ТТР-4000 може також ротеїн Е-нуль-мишей і атенуювало функціональну значуще зменшувати пов'язану з рестенозом проі морфологічну патологію діабетичної нефропатії у ліферацію клітин гладких м'язів судин залежним мишей db/db (Bucciarelli et al., Circulation 106:2827від дози чином. 2835 (2002)). 41 92154 42 Таблиця 1 Дія ТТР-4000 в щурячій моделі рестенозу IgG (n=9) Площа просвіту (мм2) Площа медії (мм2) Відношення І/М 0,2±0,03 0,12±0,01 1,71±0,27 ТТР-4000 (n=9) Низька доза** (0,3 мг/тварина qodx4)) 0,18±0,04 0.11±0,02 1,61±0,26 ТТР-4000 (n=9) Висока доза** (1,0 мг/тварина qodx4)) 0,16±0,02 0,11±0,01 1,44*±0,15 *Р