Нематоцидна композиція, яка містить bacillus subtilis і bacillus licheniformis

Реферат: Винахід стосується композиції, яка містить Bacillus subtilis DSM 17231 і Bacillus licheniformis DSM 17236 з нематоцидним ефектом проти фітонематод на рослинах і/або в їх природному середовищі, використання і процесу її отримання, використовуючи Bacillus subtilis DSM 17231 і UA 112846 C2 (12) UA 112846 C2 Bacillus licheniformis DSM 17236, способу боротьби і надання специфічної стійкості до фітонематод і набору. UA 112846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується композиції, яка містить Bacillus subtilis і Bacillus licheniformis, з нематоцидним ефектом проти фітонематод на рослинах і/або в їх природному середовищі, її використання, способу її отримання, використання Bacillus subtilis і Bacillus licheniformis, способів контролю, боротьби і/або надавання специфічної стійкості фітонематодам і набору. Зокрема, винахід стосується Bacillus subtilis (DSM 17231) і Bacillus licheniformis (DSM 17236). ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Посилення сільськогосподарської активності є причиною порушення екологічного балансу, роблячи необхідним використання селективних продуктів, які не чинять впливу на баланс між сільськогосподарськими шкідниками і їх хижаками, паразитоїдами і патогенуми, які відповідають за значну частину природного біологічного контролю, оскільки вони зберігають прийнятні рівні популяцій сільськогосподарських шкідників (DENT, D., Insect pest management. Cambridge: Cabi Bioscience 2000). Для того, щоб змінити цю ситуацію, рекомендується розробляти програми для інтегрованої боротьби з сільськогосподарськими шкідниками, які розглядаються як система прийняття рішень використання як окремо тактичних засобів контролю, так і гармонійно комбінованих в рамках стратегії боротьби, засновуючись на ціні/користі, при розрахунку якої береться до уваги їх значення і/або вплив на фермерів, суспільство і навколишнє середовище. Серед способів контролю, доступних для цих систем боротьби, мають місце ентомопатогенні нематоди і комахи паразитоїди, які покривають різні області біологічного контролю сільськогосподарських шкідників. У поточному контексті сучасного і екологічного суспільства, яке піклується про збереження навколишнього середовища, біологічний контроль вважається привабливою альтернативою і/або доповненням для стандартних способів контролю. Біологічний контроль являє собою використання одного організму (хижака, паразита або патогену), який атакує інший організм, який є причиною економічного збитку для сільськогосподарських культур. Це є самою звичайною стратегією в агроекологічних системах, а також в стандартному землеробстві, яке основане на Інтегрованому управлінні сільськогосподарськими шкідниками (IPM). Незважаючи на те, що біологічний контроль приносить позитивну реакцію стосовно зниження або скасування використання пестицидів і підвищує прибутки фермерів, аналіз групи експериментів по всьому світу показує, що результати все ще зосереджені тільки на декількох сільськогосподарських культурах. У галузях контролю сільськогосподарських шкідників і захворювань все ще достатньо проблем для розробок. Існує великий упор на дослідження біологічного контролю з використанням бактерій, які колонізують коріння рослин, що називаються ризобактеріями. Корисні ризобактерії для прискорення росту і/або які діють в біологічному контролі патогенних бактерій рослин називають прискорюючими ріст ризобактеріями або PGPR. PGPR збільшують доступність поживних речовин рослині і можуть створювати комбінації і концентрації речовин, які прискорюють ріст. Однак, основний ефект цих ризобактерій полягає в придушенні патогенів рослин, шкідливих для росту цих рослин. Інгібування цих шкідливих бактерій відбувається через утворення сидерофорів, речовин, які діють в умовах низької доступності фосфору за допомогою додаткового зниження фосфору, доступного іншим ризосферним мікроорганізмам, або утворення антибіотиків. ВІДОМИЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Вимоги суспільства на заміну нематоцидів на прийнятні для навколишнього середовища продукти або екологічні способи сприяють дослідженням альтернативних способів для контролю нематод. У цьому контексті біологічний контроль розглядають як одну з альтернатив в рамках інтегрованого підходу, в якому прагнуть забезпечити тривалий розвиток землеробства. Використання природних ворогів стало галуззю досліджень, яка може діяти для зниження популяцій нижче порогового рівня економічного збитку. Ризики для людини і навколишнього середовища, які складає використання синтетичних пестицидів, підкреслюють необхідність інструментів, таких як біологічний контроль, в оптимізації невиснажувальних сільськогосподарських систем. Європейська патентна заявка EP 0705807A1 пов'язана з бактеріальним препаратом для кондиціонування ґрунту, який містить бактерії, які належать до роду Bacillus, такі як Bacillus subtilis і Bacillus licheniformis. Препарат може запобігати пошкодженням коріння сільськогосподарських культур, зумовлених нематодами. Бразильська патентна заявка BR PI 0604602-9A стосується використання Bacillus subtilis в поєднанні з Bacillus licheniformes для контролю фітонематод. 1 UA 112846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Siddiqui і Mahmood (1999) описують роль бактерій при боротьбі з паразитичними нематодами рослин, показуючи, що Bacillus subtilis і Bacillus licheniformis можуть бути ефективні проти фітонематод, таких як Meloidogyne spp., Heterodera spp. і Rotylenchulus. Автори даного винаходу приступили до екстенсивного скринінгу і дослідженням для того, щоб вирішити задачу надавання біологічних способів боротьби з нематодами, основуючись на ідентифікації двох штамів дикого типу Bacillus subtilis і Bacillus licheniformis, які зокрема здатні знижувати пошкодження коріння сільськогосподарських культур, зумовлені нематодами. КОРОТКИЙ ОПИС МАЛЮНКІВ Фіг. 1 - послідовність умов роботи для виробничих процесів змішування. Фіг. 2 - процентна частка інгібування переміщення молодих особин після впливу біологічних продуктів. А: Meloidogyne incognita; У: M. javanica, С: M. paranaensis. Фіг. 3 - процентна частка інгібування вилуплення після впливу біологічних продуктів. А: Meloidogyne incognita; У: M. javanica, С: M. paranaensis. Фіг. 4 - середнє число молодих особин, які проникли другої фази Meloidogyne exigua, процентні частки проникнення і інгібування проникнення в коріння томата. "Santa Cruz Kada Gigante", через три тижні після інокуляції. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Ризобактерії Ґрунти являють собою житло складного біологічного співтовариства, серед яких мікроорганізми, прокаріоти і еукаріоти формують більшість, як за чисельністю, так і за різноманітністю. Деякі прокаріоти мають екологічні ніші, такі як ризосфера і/або ризоплана рослин, де вони розмножуються, живуть і захищають себе від іншої антагоністичної дії мікрофлори ґрунту. Ці організми мають родову назву ризобактерії. У поєднанні з рослинами ризобактерії можуть мати шкідливий, нейтральний або корисний ефект. Тих, хто виконує позитивний ефект - сприяння росту і біологічний контроль захворювання - називають PGPR ("сприяючі росту рослин ризобактерії). За оцінками, тільки 0,6 % ризобактерій мають деякий позитивний ефект для рослини, з якою вони асоційовані. PGPR як засоби біологічного контролю PGPR використали для біологічного контролю захворювань рослин і тим самим збільшували продуктивність сільськогосподарських культур. Як і чому відбувається здійснення цього біологічного контролю, досі є темою, яка вимагає додаткових досліджень. У деяких ситуаціях можливо, що біологічний контроль відбувається за допомогою безпосереднього антагонізму, який виявляється за допомогою PGPR проти патогену, із залученням відомих механізмів антибіозу: утворення протимікробних речовин, безпосереднє паразитування, конкуренція за поживні речовини і екологічні ніші. Дослідження показало, що визначені PGPR схоже діють як засіб, який викликає ISR (індуковану системну стійкість), в тому значенні, що рослина стає системно захищеною від більше ніж одного патогену, на відміну від класичного біологічного контролю, який націлений на реалізацію більш специфічного контролю. Коли PGPR колонізує кореневу систему, складові молекули бактеріальної клітини або синтезовані нею діють як засіб, який викликає біохімічний сигнал. Відбувається транслокація цього сигналу в сайти, віддалені від сайту його походження. Відбувається вимкнення і експресія генів, які кодують синтез компонентів динамічної стійкості, в індукованій системній стійкості. Деякі ризобактерії створюють токсичні метаболіти, які впливають на переміщення нематод in vitro, тоді як інші інгібують вилуплення молодих особин і процес, за допомогою якого вони проникають в коріння. Ефект ризобактерій, який надається на паразитуючі на рослинах нематоди Контроль, який ризобактерії надають на нематоди, може бути реалізований різними способами і може впливати на різні фази життєвого циклу нематод: - яйце: антибіотики і токсини, які утворюються бактеріями, в ризосфері дифундують всередину ґрунту і можуть бути абсорбовані яйцями нематод, вбиваючи клітини і запобігаючи їх ембріональному розвитку. - Вилуплення: ризобактерії руйнують виділення коріння, які діють як чинник вилуплення для багатьох видів нематод і тоді має місце можливість, що сполуки, абсорбовані яйцем нематоди, інактивують або викликають деформацію під час розвитку, які запобігають вилупленню. - Спрямованість і рухливість: перетворення виділень коріння в метаболічні побічні продукти ризобактерій може вести до того, що нематоди просто не розпізнають хемотропний стимул, так що вони будуть продовжувати рухатися випадковим чином, і в кінцевому результаті вичерпають свої запаси енергії і помруть, так і не попавши в коріння. Якщо нематода розпізнає виділення коріння і рухається в напрямку коріння, деякі бактеріальні продукти можуть представляти 2 UA 112846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нематостатичні характеристики і знижувати рухливість нематоди, щоб перешкоджати досягненню коріння нею. - Розпізнавання організму-хазяїна: коріння абсорбує речовини, які утворюються ризобактеріями, які можуть змінювати їх хімічну композицію, будучи причиною того, що нематоди не розпізнають свій організм-хазяїн. Також вважають, що ризобактерії зв'язуються з лектинами на поверхні коріння, які характеризуються тим, що є сайтом скріплення між нематодою і її рослиною-хазяїном, тим самим запобігаючи розпізнаванню. - Проникнення в коріння: токсин або репелент, який утворюється ризобактеріями у високій концентрації в області ризоплани або в клітинному вмісті епідерми коріння, може запобігати проникненню нематоди в рослину-хазяїн. - Поживні речовини: ризобактерії, або продукти їх метаболізму, можуть абсорбувати рослину, і останнє, щоб зрозуміти присутність нематоди, запускає реакцію гіперчутливості в гігантоцитах, яка являє собою основний механізм стійкості організму-хазяїна до нематод роду Meloidogyne. Ця стійкість, що називається системною стійкістю, не властива рослинам, тобто реакція, яку індукують в ній за рахунок присутності PGPR. - Відтворення: деякі ризобактерії надають більш виражений ефект на зменшення яєць, ніж на зменшення числа цецидій, це може бути одним з механізмів дії. Навколишнє середовище ризосфери Один з найбільш зручних способів введення ризобактерій в кореневу область відбувається через нанесення на насіння перед посівом. Процес проростання насіння вивільняє вуглеводи і амінокислоти у великій кількість в формі виділень насіння. Таким чином, ці організми, які вводяться з насінням в ґрунт, використовують виділення як джерело поживних речовин і колонізують коріння по мірі їх появи. Ізоляти ризобактерій, які мають вищу здатність використовувати виділення коріння насіння, можуть мати селективну перевагу при колонізації коріння. Ризобактерії роду Bacillus асоційовані з контролем нематод. Sikora, R.A. (Interrelationship between plant health promoting rhizobacteria, plant parasitic nematodes and soil microorganisms. Medicine Faculty Landbouww Rijksuniv Gent, Landbouww, v.53, n.2b, р. 867-878, 1988) спостерігав зменшення інфекції Meloidogyne arenaria, M. incognita і Rotylenchulus reniformis приблизно 6065 % при обробці насіння різних сільськогосподарських культур штамом Bacillus. Переваги ризобактерій для комерційного застосування Ризобактерії мають множину переваг над нематоцидами або навіть над іншими засобами біологічного контролю: легко здійснювати їх масове виробництво, їх легко зберігати, їх можна адаптувати до технології отримання складів і вони не вимагають генетичних маніпуляцій. Ризобактерії можна застосовувати за допомогою обробки субстрату, занурення кореневої системи сходів в бактеріальні суспензії, поливання рослини бактеріальною суспензією за допомогою занурення насіння в суспензію ризобактерій або за допомогою застосування PGPR з використанням дражування насіння в альгінаті. Бактерії роду Bacillus Види Bacillus являють собою грампозитивні бактерії, які характеризуються наявністю товстих клітинних стінок і відсутністю зовнішніх мембран, які відрізняються від грамнегативних бактерій. Значна частина стінок грампозитивних бактерій складається з пептидоглікану. Грампозитивні види поділені на групи згідно з їх морфологічними і біохімічними характеристиками. Рід Bacillus стосується групи споротвірних бактерій. Види зі споротвірними структурами, які стійкі до змін навколишнього середовища, витримують сухий жар і певні хімічні дезинфікуючі засоби протягом помірних періодів часу. На суші вони зберігаються протягом років. Використання Bacillus spp. в контролі нематод Нематоди відповідальні за великі збитки в сільськогосподарському виробництві. Збитки, які оцінюються, становлять приблизно 100 мільярдів доларів США в рік по всьому світу в економічно важливих сільськогосподарських культурах. Використання культурних сортів, стійких до нематод не завжди можливо в зв'язку з відсутністю джерел стійкості для схрещування, відсутністю адаптованості культурних сортів, стійких до визначених областей і сезонів посадки або порушенням стійкості в польових умовах. Хімічний контроль нематод загалом не рекомендований, оскільки він не є дуже ефективним; він є таким, який дорого коштує, внаслідок відходів, які він залишає в продуктах живлення, і забруднення навколишнього середовища, яке він викликає. Внаслідок цих недоліків має місце вимога суспільства обмежити використання хімічних засобів, результатом чого є потреба фермерів в продуктах, які одночасно є нетоксичними для людини і тварин, які недорого коштують і дуже ефективно контролюють нематод. 3 UA 112846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Багато які ґрунтові мікроорганізми відомі як паразити або хижаки нематод. Дія цих мікроорганізмів може бути результатом прямого або опосередкованого впливу через втручання в стадії в життєвому циклі патогену. Bacillus subtilis Позитивний ефект В. subtilis, коли застосовують поруч з насінням або ґрунтом, пов'язаний не тільки з антагонізмом, передбаченим для патогенів. Бактерія має позитивний вплив на проростання, розвиток і врожай сільськогосподарської культури також завдяки утворенню речовин, які сприяють росту і поліпшенню живлення рослини за допомогою солюбілізації фосфору. Рід Meloidogyne Велика різноманітність нематод роду Meloidogyne (бульбові нематоди) присутня на рослинах-хазяїнах і зустрічаються в різних регіонах земної кулі, викликаючи збитки в різних культурах. Основним симптомом є присутність цецидій на корінні рослин. Ці цецидії являють собою потворність або потовщення кореневої системи. Уражені рослини виявляють слабкість, мають низьку продуктивність, раннє опадання листя і передчасне в'янення, і іноді може мати місце загибель рослини, з симптомами, які посилюються в умовах поживного стресу і засухи. Спочатку, молоді особні другої фази (J2) Meloidogyne проникають в коріння і створюють місце годування в області центрального циліндра коріння. Шляхом розвитку нематод, J2 диференціюються у дорослих самців або самиць. Дорослі самці покидають кореневу систему, а самиці залишаються в корінні. Під час розвитку самиця Meloidogyne відкладає приблизно 500 яєць. Вони розташовані в гелеподібній матриці за межами коріння, з яких вилуплюються J2, і тим самим вони повторно інфікують кореневу систему. Життєвий цикл бульбових нематод становить приблизно чотири тижні і може збільшуватися при менш сприятливих температурних умовах. Температури нижчі ніж 20 °C або вищі ніж 35 °C і умови засухи або заболочування ґрунту знижують розвиток і виживаність нематод. Боротьбу з Meloidogyne incognita і M. javanica можна здійснювати з використанням хімічних засобів, які містять певні активні інгредієнти, такі як карбофуран, етопрофос, алдикарб, метамнатрій або фенаміфос, серед інших, залежно від культури, яка розглядається. Практика ротації сільськогосподарських культур також важлива для контролю завдяки розміщенню сільськогосподарських культур, які не є організмами-хазяїнами, таких як арахіс, ананас, рис, або використанню як ґрунтовий покрив видів рослин, також які не є організмами-хазяїнами, таких як овес. Нематода Meloidogyne exigua є дуже агресивною і дуже широко поширеною на насадженнях. Різні способи хімічної боротьби в областях, інфікованих M. exigua, включають використання хімічних засобів, які містять які-небудь з активних інгредієнтів тербуфос або карбофуран, залежно від типу культури. Серед сільськогосподарських культур, які не є організмами-хазяїнами, виділяються бавовна, арахіс, рис і овес. Подібно M. exigua, вигляд M. paranaensis широко поширений в культурі кави, але не складає значної проблеми в інших культурах. Відносно боротьби з ним позитивні результати отримані за допомогою гриба Paecilomyces lilacinus, і він знижував популяції нематод в корінні томата "Santa Clara" в теплиці. Використання ризобактерій як біологічних засобів боротьби вже відоме. Однак заявник в наш час розробив композицію, яка містить два види Bacillus, а саме: Bacillus subtilis DSM 17231 (також відомий як DSM 5750) або його мутант і Bacillus licheniformis DSM 17236 (також відомий як DSM 5749) або його мутант з нематоцидним ефектом проти фітонематод в рослинній культурі. Таким чином, перший аспект за винаходом стосується описаних в цьому документі нових штамів або їх мутантів. Фахівцеві зрозуміло, що використовуючи депоновані штами як початковий матеріал, за допомогою способів стандартного мутагенезу або повторного виділення звичайним способом можна отримати додаткові мутанти або їх похідні, які зберігають описані в цьому документі відповідні ознаки і переваги. Відповідно, термін "його мутант" за першим аспектом стосується мутантних штамів, які отримуються за допомогою використання депонованого штаму як початкового матеріалу. Під фітонематодою загалом розглядають будь-яку нематоду, яка впливає негативним чином на комерційні сільськогосподарські культури. Нематоди, з якими можна боротися з використанням композиції за даним винаходом, включають нематоди родів: Meloidogyne, Pratylenchus, Heterodera, Globodera, Ditylenchus, Tylenchulus, Xiphinema, Radopholus, Rotylenchulus, Helicotylenchus і Belonolaimus. Види роду Meloidogyne вважають особливо важливими, оскільки вони відповідальні приблизно за 95 % всіх заражень паразитами в 4 UA 112846 C2 5 10 15 20 25 30 сільськогосподарських культурах, які викликають приблизно 5 % всіх збитків в сільськогосподарських культурах по всьому світу. Композиція за даним винаходом, крім активних компонентів, може містити їх агрохімічні прийнятні ексципієнти і/або наповнювачі. Композиція за винаходом додатково містить агрохімічно прийнятні носії, наповнювачі і/або ад'юванти. Композиція за даним винаходом зокрема служить для боротьби з нематодами в сільськогосподарських культурах. Основні сільськогосподарські культури рослин включають цукрову тростину, каву, соєві боби, бавовну, кукурудзу, картоплю, томати, тютюн, банан, рис, пшеницю, авокадо, ананас, гарбуз, какао, кокос, овес, цибулю, латук, буряк, моркву, маніоку, квасолю, соняшник, перець, ріпу, яблуко, полуниці, окру, редиску і цибулю. Стосовно фруктових культур: цитрусові, виноград, гуава, папайя, інжир, персик, слива і неспейра мають особливе значення, і стосовно садових культур: баклажан і хрестоцвіті. Стосовно квіткових культур: троянда, хризантема, лізіантус, гербера, амариліс, бегонія і целозія. Даний винахід стосується композиції, яка містить Bacillus subtilis DSM 17231 або його мутант і Bacillus licheniformis DSM 17236 або його мутант, і набору, який містить композицію, або отриману за допомогою процесу отримання композиції, а також інструкцій і відповідного реципієнта. Також розкритий спосіб отримання композиції, який містить Bacillus subtilis DSM 17231 або його мутант і Bacillus licheniformis DSM 17236 або його мутант разом з агрохімічно прийнятними носіями, наповнювачами і/або ад'ювантами, і використання вказаної композиції для контролю, боротьби і/або надання специфічної стійкості до фітонематод. Додатково, винахід стосується використання ефективних кількостей Bacillus subtilis DSM 17231 або його мутанта і Bacillus licheniformis DSM 17236 або його мутанта у виготовленні агрохімічної композиції з нематоцидним ефектом проти фітонематод в рослинній культурі, а також способу контролю, боротьби і/або надавання специфічної стійкості до фітонематод. Ілюстративні приклади, представлені нижче, служать для того, щоб краще описати даний винахід. Однак, описані склади лише стосуються деяких засобів деяких варіантів здійснення даного винаходу і їх не треба приймати як обмеження його об'єму. ПРИКЛАДИ Композиція за винаходом 10 Bacillus subtilis (DSM 17231):1,6×10 КУО/г 10 Bacillus licheniformis (DSM 17236):1,6×10 КУО/г 35 Інгредієнти Bacillus subtilis (DSM 17231) Bacillus licheniformis (DSM 17236) Мальтодекстрин Діоксид кремнію 40 45 50 Мінімальний процентний вміст 2,4 2,4 94,2 1,0 Максимальний процентний вміст 3,0 3,0 93,0 1,0 Композицію можна використовувати як змочуваний порошок. Однак, композицію також можна надавати в якій-небудь іншій прийнятній формі, наприклад, у вигляді порошку, розчину, суспензії, гранул і т. д. Умови роботи для виробничих процесів змішування Основні інгредієнти/матеріали: рецептуру здійснює персонал, навчений для верифікації і перевірки отриманих товарів. Згідно з виробничими задачами, видають список інгредієнтів і їх кількості і інформацію посилають на фабрику. Зважування інгредієнтів/матеріалів: інгредієнти отримують на фабриці, зважують і розміщують в змішувач з нержавіючої сталі. Суміш: інгредієнти змішують після обробки, описаної в SOP (стандартна технологічна процедура). Аналіз: зразки збирають для підрахунку числа колоній в КУО/г. Бутилування: продукт упаковують в мішки з внутрішнім захисним крафт-папером, які містять 20 кг, або поліетиленові пластмасові посудини, які містять 1,0 або 5,0 кг. Закривання: мішки герметизують і зашивають. Посудини герметизують кришкою і пропускають через магнітну індукцію. Укладання: ще на фабриці упаковку розміщують на дерев'яні піддони, які чекають контролю якості (QC). 5 UA 112846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Складування: кінцевий продукт зберігають, герметизують і належно проводять ідентифікацію. Кожну партію реєструють в електронній програмі, доступній всім операторам в кожному секторі який цікавить. Відвантаження: коли його випускає контроль якості, продукт залишається на зберіганні на складі для відвантаження до моменту продажу. Ця послідовність представлена на фіг. 1. Тести in vitro: Тест 1 Мета: оцінити ефект in vitro біологічних продуктів на основі бактерій Bacillus в контролі фітонематод, а саме, Meloidogyne incognita, M. Javanica і M. paranaensis. Матеріал і способи: досліджували три види фітонематод роду Meloidogyne: M. incognita, M. javanica, M. paranaensis і два біологічних продукти в двох різних дозах: японський продукт на основі видів Bacillus і продукт Nemixо, який складається з Bacillus subtilis і Bacillus licheniformis 97,8 % лактози і діоксиду кремнію. Нематоцидом, який використовується як стандарт ефективності, був 150G TEMIK® (алдикарб), який має наступні характеристики: - торгова марка: TEMIK® 150; - власник реєстрації: Bayer CropScience Ltda; - марка(и): майтицид - інсектицид нематоцид; - склад: GR гранульований; - активний інгредієнт (серед іншого) алдикарб; - концентрація серед іншого: 150 г/кг; - спосіб застосування: земний; - режим застосування: ґрунт; - токсикологічна класифікація: I - надзвичайно токсичний. Експеримент включає шість обробок: - вода: абсолютний контроль; -1 - P1 D2: японський продукт в дозі 2 кг×га ; -1 - P1 D4: японський продукт в дозі 4 кг×га ; -1 - продукт Nemix в дозі 2 кг×га ; -1 - продукт Nemix в дозі 4 кг×га ; -1 - нематоцид алдикарб (TEMIK® 150G) в дозі 15 кг×га . Тест для оцінки продуктів по активності нематод Отримання молодих особин 2-ї фази Meloidogyne Коріння кави і томатів, інфіковане видами Meloidogyne, промивали для того, щоб видалити надлишок ґрунту, прилиплого до них, різали і обробляли способом змішувача (BONETI, J. I. S. & FERRAZ, S.: Modificagao de metodo de Hussey е Barker para extragao de ovos de Meloidogyne exigua de raizes de cafeeiro. Fitopatologia Brasileira, Brasilia, DF, v.6, n.3, 553p, 1981). Коріння різали на фрагменти приблизно 1 см в довжину, вміщували в змішувач, заповнювали розчином гіпохлориту натрію 0,5 % активного хлору, щоб покрити матеріал. Змішувач включали на його самій низькій швидкості в середньому на 40 секунд. Потім суспензію, яка отримується пропускали через сито 100 меш, накладене на 500 меш. Відходи збирали з сита 500 меш за допомогою струменів води при стисненні кухля Becker, обережно, щоб кінцевий об'єм був настільки концентрованим, наскільки можливо. Суспензії центрифугували протягом 5 хвилин на швидкості 650 гравітацій. Обережно видаляли супернатант і внутрішню стінку пробірки для центрифуги очищали для того, щоб усунути органічні забруднення. У залишок в кожній трубці додавали розчин сахарози (концентрація 454 г цукру на один літр води), добре перемішували і центрифугу включали на тій же швидкості протягом 1 хв., як описано раніше. Супернатант виливали через сито 500 меш, промивали водою для того, щоб видалити надлишок сахарози, і збирали за допомогою струменів води з piseta в чашку Becker. Чашки Петрі діаметром 5 см були всередині нейлонвмісного шару тонкого гігієнічного паперу. Суспензії яєць додавали поверх шару тонкого паперу і чашки Петрі вміщували в інкубатор при 30 °C протягом 24 годин. Після 24 г екран з тканиною суспендували за допомогою пінцета і рідину всередині чашки Петрі видаляли в тарілку Becker і промивали водою. Екран замінювали паперовою пластиною і додавали воду. Пластини залишали в інкубаторі на 48 г. Через 48 г екрани видаляли і рідину збирали за допомогою струменів води з piseta в чашку Becker. Суспензію калібрували так, щоб вона в 1 мл містила 250, 50, 20 і 100 молодих особин 6 UA 112846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Meloidogyne incognita, M. javanica, і M. paranaensis 2-ї фази, щоб зібрати групу тесту in vitro, відповідно. Постановка і оцінка in vitro Чашки Петрі діаметром 11 см, які містять шар водного агару 2 %, отримували 1 мл суспензії молодих особин 2-ї фази і 1 мл кожної обробки, яка підлягає тестуванню: розчин TEMIK® 150G в дистильованій воді (нематоцид); розчин японського продукту на основі Bacillus в двох концентраціях; розчин продукту Nemix в двох концентраціях. При обертанні, ці два ретельно змішували мл. Чашки тримали в інкубаторі при 30 °C протягом 7 діб. Через 7 діб кожну чашку досліджували під збільшувальним склом для того, щоб верифікувати і підрахувати запаси нематод. Тестування для оцінки інгібування вилуплення молодих особин 2-ї фази Meloidogyne Коріння томатів і кави отримували для змішувача (BONETI, J. I. S.; FERRAZ, S.: Modificagao de metodo de Hussey е Barker para extragao de ovos de Meloidogyne exigua de raizes de cafeeiro. Fitopatologia Brasileira, Brasilia, DF, v.6, n.3, 553p., 1981), заздалегідь описаного в розділі "Отримання молодих особин 2-ї фази Meloidogyne". Суспензії калібрували так, щоб вони містили 1500 яєць/мл, 100 яєць/мл, 500 яєць/мл і 200 яєць/мл M. incognita, M. javanica і M. paranaensis, відповідно. Постановка і оцінка in vitro Чашки Петрі діаметром 5 см, які містять всередині нейлонову матерію з шаром зволоженого тонкого паперу, отримували по 1 мл кожного впливу, який тестується, і 1 мл суспензії яєць. Чашки тримали в інкубаторі при 30 °C протягом 7 діб. Через 7 діб екрани видаляли і рідину з кожної чашки збирали, використовуючи струмені води з piseta в склянку. Кожну суспензію досліджували під мікроскопом за допомогою рахункової камери для верифікації і підрахунку J2 Meloidogyne. Дизайн і статистичний аналіз Експеримент являв собою повністю рандомізований дизайн з шістьма обробками і п'ятьма повтореннями для кожної нематоди. Кожна чашка Петрі являла собою експериментальну одиницю. Дані піддавали програмі статистичних процедур Sisvar (FERREIRA, Analises estatisticas por meio do Sisvar para Windows versao 4,0. In: REUNIAO ANUAL DA REGIAO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA., 45, 2000, Sao Carlos: UFSCar, 2000, р. 255-258, 2000). У статистичному аналізі дані піддавали аналізу дисперсії і середнього, які порівнюються за допомогою критерію Скотта-Нота при імовірності 5 %. (Результати, які показують відсутність статистично значимої різниці, помічені на фігурах ідентичними буквами в нижньому регістрі). При оцінці ефекту пестицидів при контролі нематод, обчислювали процентну частку інгібування переміщення і процентну частку інгібування вилуплення молодих особин. При обчисленні цих процентних часток використовували наступну формулу: (B-A)/В × 100, де: А = число активних нематод або які вилупилися в кожному повторенні кожної обробки. В = число нематод, використаних в аналізі для оцінки інгібування переміщення або інгібування вилуплення. Результати і обговорення На фіг. 2 і 3 проілюстрований інгібуючий ефект різних нематод на переміщення (фіг. 2) і вилуплення (фіг. 3) нематод M. incognita (А), M. javanica (В) і M. paranaensis (С). Дані, представлені на фіг. 2A, ілюструють, що тільки нематоцид TEMIK® значно відрізнявся від інших обробок, характеризуючись кращим результатом за смертністю і інгібуванню вилуплення молодих особин M. incognita. Відносно інгібування вилуплення молодих особин спостерігали, що обробки не відрізнялися від контролю і тільки хімічна обробка з використанням TEMIK® знижувала вилуплення. Для інгібування Meloidogyne javanica не спостерігали значної різниці між тестованими біологічними продуктами і TEMIK®, яке показує, що біологічні продукти мали задовільний ефект, який надається на інгібування руху нематод (фіг. 2B). Ефект, який надається на вилуплення, не був значним і тільки хімічний продукт TEMIK інгібував вилуплення (фіг. 3B). -1 Для інгібування Meloidogyne paranaensis доза Nemix 4 кг×га давала результат, що значно -1 дорівнює нематоциду (фіг. 2C). Після, японські продукти в дозах 2 і 4 кг×га і Nemix в дозі 2 -1 кг×га і всі органічні продукти мали сильніший ефект, ніж контрольна обробка. Відносно інгібування вилуплення молодих особин, продукт Nemix з двома дозами мав схожі ефекти, які показують кращі результати серед тестованих біологічних продуктів (фіг. 3C). Всі тестовані 7 UA 112846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 продукти відрізнялися від абсолютного контролю і нематоцидний ефект перевершував всі інші обробки. -1 Продукти TEMIK® і Nemix в дозі 4 кг×га були найефективнішими і не розрізнялися значно відносно смертності M. paranaensis. Відносно інгібування вилуплення TEMIK® значно відрізнявся від всіх інших обробок, перевершуючи їх. Однак, продукт Nemix був ефективнішим, ніж японський продукт (фіг. 3C). Таким чином, композиція Nemix демонструвала значне інгібування нематод M. javanica і M. paranaensis, порівняне з хімічним продуктом TEMIK. Тест 2 Мета: оцінити проникнення Meloidogyne javanica в коріння томатів відносно різних доз біологічного продукту Nemix, який містить Bacillus subtilis і Bacillus licheniformis, в умовах теплиці. Отримання інокуляту Отримання інокуляту здійснювали з обробки зразка коріння кави, інфікованого M. javanica. Зразки брали в Agricultural Nematology Laboratory в Institute of Agricultural Sciences і для обробки коріння рубали на фрагменти по 2 см і вміщували в чашу побутового змішувача, яка містить розчин гіпохлориту натрію (1 частину відбілювача:4 частини води). Розчин центрифугували протягом 20 секунд. Після цього періоду суспензію пропускали через набір сит 200, які перекриваються, і 500 меш, відповідно. Залишок з сита 500 меш збирали за допомогою стиснення з використанням води в склянку. Отриману суспензію калібрували так, щоб вона містила 800 яєць нематод/мл. Постановка і проведення тесту Дизайн експерименту являв собою повністю рандомізований дизайн з п'ятьма обробками і п'ятьма повтореннями. Використали культурний сорт томатів "Santa Cruz Kada Gigante" і використали дози -1 -1 біологічного продукту NEMIX 4, 6 і 8 кг×га . Нематоцид алдикарб (TEMIK® 20 G 150 кг×га ) використали як стандартну перевірку і контроль без якого-небудь томатного продукту і паразитуючу на рослинах нематоду M. javanica для стандартного проникнення. Насіння культурного сорту томатів "Santa Cruz Kada Gigante" висівали в лотки з пінополістиролу на 128 ямок, заповнених субстратом Plantmax®. Для інокуляції відкривали три отвори глибиною 2 см і на відстані 2 см від стебла сходів. У цих трьох отворах розподіляли 5 мл суспензійного каліброваного інокуляту (4000 нематод/пластмасова чашка). Незабаром після цього дози продуктів додавали в маленькі пластмасові чашки у відкриту ямку біля кожного зі сходів. Оцінка проникнення молодих особин другої фази M. javanica в коріння томатів Оцінку виконували після 3 тижнів від інокуляції, де коріння, після відрізання пагонів і відділення ґрунту, отримували для фарбування нематод в тканинах рослини (Byrd Jr. et al., An improved technique for clearing and staining plant tissues for detection of nematodes. Journal of Nematology, Lakeland, v. 5, n. 1, р. 142-143, 1983). Коріння ламали на шматки 1-2 см і переносили в чашку Becker 50 мл води, в яку додавали 20 мл комерційного відбілювача (5,25 % NaOCl), що вело до кінцевої концентрації 1,5 % NaOCl. Сегменти коріння залишали протягом 6 хв. в цьому розчині, допомагаючи струшуванням руками протягом 10 с з інтервалами в 1 хв. Коріння промивали під проточною водою протягом від 30 до 45 с і залишали в стані спокою протягом 15 с у воді для того, щоб видалити залишковий гіпохлорит натрію. Потім проводили повне осушення і додавали 30 мл дистильованої води плюс 1 мл розчину барвника (3,35 г кислого фуксину + 25 мл крижаної оцтової кислоти + 75 мл води). Коріння в цьому розчині нагрівали до точки кипіння, залишали їх на 30 секунд кипіти і незабаром після цього контейнер вміщували на стіл, щоб досягнути кімнатної температури. Згодом видаляли розчин барвника, який залишився і матеріал промивали у водопровідній воді і вміщували в 2030 мл гліцерину, підкисленого декількома краплями 5Н HCl. Сегменти коріння затискали між предметним склом і спостерігали в оптичний мікроскоп. Рахували молоді особні другої фази, які проникли в коріння. Статистичний аналіз Дані піддавали програмі статистичних процедур SISVAR (FERREIRA, D. F. Analises estatisticas por meio do Sisvar para Windows versao 4,0. In: REUNIAO ANUAL DA REGIAO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA., 45, 2000, Sao Carlos: UFSCar, 2000, р. 255-258, 2000). У статистичному аналізі середні порівнювали за допомогою критерію Т'юкі з імовірністю 5 %. Результати і обговорення 8 UA 112846 C2 5 З даних, представлених в таблиці 3, видно, що на проникнення молодих особин другої фази M. javanica був наданий вплив у всіх обробках в порівнянні з контролем без використання якого-1 небудь продукту. Обробка продуктом алдикарб до 20 кг×га показала найнижче проникнення. -1 Серед різних доз NEMIX, краща становила 8 кг×га , яка забезпечувала сильніше інгібування, ніж інші тестовані дози. Таблиця 3 Число прониклих молодих особин другої фази Meloidogyne javanica і процентна частка проникнення в коріння культурного сорту томатів "Santa Cruz Kada Gigante" через 3 тижні після інокуляції. Uberlandia, UFU, 2007 Продукти Прониклі -1 Алдикарб (TEMIK 150 G® 20 кг×га ) -1 Bacillus spp. (NEMIX 8 кг×га ) -1 Bacillus spp. (NEMIX 6 кг×га ) -1 Bacillus spp. (NEMIX 4 кг×га ) Контроль (без застосування продукту) Проникнення, % 10,20* а** 28,80 b 50,40 с 62,20 d 85,00 е 0,26*** а 0,72 с 1,26 с 1,57 d 2,13 е Інгібування проникнення, % 88,00 66,12 40,70 26,82 C.V (%)= 12,5 * Середнє для п'яти повторень ** Середні, за якими йдуть однакові букви в колонці, не відрізняється один від одного по критерію Т'юкі з імовірністю 5 % ***% Проникнення = N° J2/4000 яєць 10 15 20 25 30 35 40 Виявлено, що процентна частка проникнення нематод варіювала від 0,26 для дози алдикарбу і 2,13 для контролю без застосування продукту. Відносно біологічного продукту, він міг діяти на орієнтацію молодих особин другої фази M. javanica, спричиняючи розсіювання молодих особин, ускладнення їх проникнення, або таке зниження могло бути зумовлене втручанням в процес появи молодих особин M. javanica. Все ще має місце можливість того, що сполуки, абсорбовані яйцем, інактивують нематоду або викликають деформацію під час розвитку, яка запобігає вилупленню. -1 Серед трьох доз біологічного продукту, які оцінюються на основі Bacillus spp., доза 8 кг×га показала найкращі результати в зниженні проникнення молодих особин другої фази M. javanica в коріння культурного сорту томатів "Santa Cruz Kada Gigante" при проникненні 0,72 процента. Тест 3 Мета: оцінити проникнення Melodogyne exigua в коріння томатів, піддане впливу різних доз біологічного продукту на основі Bacillus spp. в тепличних умовах. Отримання інокуляту Отримання інокуляту виконували з обробки зразка коріння кави, інфікованого M. exigua. Зразки брали в Agricultural Nematology Laboratory в Institute of Agricultural Sciences і для обробки коріння рубали на фрагменти по 2 см і вміщували в чашу побутового змішувача, яка містить розчин гіпохлориту натрію (1 частина відбілювача:4 частини води). Перемелювали на низькій швидкості протягом 20 секунд. Після цього періоду суспензію пропускали через набір сит 200, які перекриваються і 500 меш, відповідно. Залишок з сита 500 меш збирали за допомогою стиснення з використанням води в склянку (BONETI, J. I. S.; FERRAZ, S. Modificagao de metodo de Hussey е Barker para extragao de ovos de Meloidogyne exigua de raizes de cafeeiro. Fitopatologia Brasileira, Brasilia, DF, v.6, n.3, 553p., 1981). Отриману суспензію калібрували так, щоб вона містила 800 яєць нематод/мл. Постановка і проведення тесту Дизайн експерименту являв собою повністю рандомізований дизайн з п'ятьма обробками і п'ятьма повтореннями. Використані томати мали генотип "Santa Cruz Kada Gigante", використані -1 дози продукту на основі Bacillus (NEMIX®) становили 4, 6 і 8 кг×га , нематоцид алдикарб (Temik® 150 G) в дозі 20 кг комерційного продукту на гектар як стандартна перевірка і контролю рослин томатів без якого-небудь продукту для стандартного проникнення. Насіння культурного сорту томатів "Santa Cruz Kada Gigante" висівали в лотки з пінополістиролу на 128 ямок і через 8 діб сходи пересаджували в пластмасові чашки об'ємом 500 мл, заповнені субстратом Plantmax®. Для інокуляції відкривали три отвори глибиною 2 см і на відстані 2 см від стебел сходів. У ці три отвори розподіляли 5 мл суспензійного каліброваного 9 UA 112846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 інокулята (4000 нематод/пластмасова чашка). Незабаром після цього дози продукту на основі Bacillus spp. додавали в пластмасові чашки при стисненні. Нематоцид алдикарб також додавали безпосередньо після інокуляції, відкрита борозенка навколо кожного сходу. Оцінка проникнення молодих особин другої фази M. exigua в коріння Оцінку виконували після 3 тижнів інокуляції, коли коріння після зрізання пагонів і відділення ґрунту, отримували для фарбування нематод в тканинах рослин (Byrd Jr., et. al., An improved technique for clearing and staining plant tissues for detection of nematodes. Journal of Nematology, Lakeland, v. 5, n. 1, р. 142-143, 1983). Коріння ламали на шматки по 1-2 см і переносили в чашку Becker, яка містить 50 мл води, в яку додавали 20 мл комерційного відбілювача (5,25 % NaOCl), що призводило до кінцевої концентрації 1,5 % NaOCl. Сегменти коріння залишали на 6 хв. в цьому розчині, допомагаючи струшуванням руками протягом 10 с з інтервалами в 1 хв. Коріння промивали під проточною водою протягом від 30 до 45 с, залишали в спокої протягом 15 с у воді для того, щоб видалити залишковий гіпохлорит натрію. Потім проводили повне осушення і додавали 30 мл дистильованої води плюс 1 мл розчину барвника (3,35 г кислого фуксину + 25 мл крижаної оцтової кислоти + 75 мл води). Коріння в цьому розчині нагрівали до точки кипіння, залишали їх на 30 секунд кипіти і незабаром після цього контейнер вміщували на стіл, щоб досягнути кімнатної температури. Згодом видаляли барвник, який залишився і матеріал промивали у водопровідній воді і вміщували в 20-30 мл гліцерину, підкисленого декількома краплями 5Н HCl. Сегменти коріння затискали між предметним склом і спостерігали в оптичний мікроскоп. Спостерігали фрагменти коріння і визначали число молодих особин другої фази, які проникали в коріння томатів. Максимальні і мінімальні температури повітря всередині теплиці Добові максимальні і мінімальні температури повітря всередині теплиці реєстрували в цілях обчислення середніх значень протягом періоду проведення експерименту. Середні максимальна і мінімальна температури повітря становили 35,9 °C і 15,3 °C, відповідно. Статистичний аналіз Дані піддавали програмі статистичних процедур SISVAR (FERREIRA, D. F. Analises estatisticas por meio do Sisvar para Windows versao 4,0. In: REUNIAO ANUAL DA REGIAO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA., 45, 2000, Sao Carlos: UFSCar, 2000, р. 255-258, 2000), яка верифікує однорідність дисперсії і нормальність помилок. У статистичному аналізі середні порівнювали за допомогою критерію Т'юкі при рівні імовірності 5 %. Результати і обговорення З даних, представлених в таблиці 4 і проілюстрованих на фіг. 3, видно, що на проникнення молодих особин другої фази M. exigua впливали значним чином всі обробки в порівнянні з контролем без використання якого-небудь продукту. Обробка продуктом алдикарб (TEMIK) до -1 20 кг×га впливала найбільшим чином на проникнення. Серед доз продукту NEMIX найкраща -1 становила 8 кг×га , яка демонструвала вищу процентну частку інгібування 54,13 % в порівнянні з нематоцидом алдикарб, який показував значне інгібування 81,95 %. 10 UA 112846 C2 Таблиця 4 Число прониклих молодих особин другої фази Meloidogyne exigua, процентна частка проникнення і процентна частка інгібування в корінні томатів "Santa Cruz Kada Gigante" через три тижні після інокуляції. Uberlandia, UFU, 2007 Продукти Алдикарб (TEMIK 150 G® 20 -1 кг×га ) -1 Bacillus spp. (NEMIX 8 кг×га ) -1 Bacillus spp. (NEMIX 6 кг×га ) -1 Bacillus spp. (NEMIX 4 кг×га ) Контроль (без застосування) Число прониклих J2 M. exigua Процентна частка Інгібування Проникнення проникнення 19,40* a** 0,48*** 81,95*** 49,00 b 66,20 c 81,00 c 106,60 d 1,22 1,65 2,02 2,66 54,13 37,97 24,06 C.V (%) 13,04 * Середнє для п'яти повторень ** Середні, за якими йдуть однакові літери в колонці, не відрізняється один від одного за критерієм Т'юкі з імовірністю 5 % ***% Проникнення = число J2/4000 яєць *** Значення за порівнянням з початковою популяцією 4000 яєць M. exigua -1 5 10 15 20 25 30 35 Також спостерігали, що була відсутня різниця в ефекті між дозами 4 і 6 кг×га продукту NEMIX з процентними частками проникнення 1,65 і 2,02 % відповідно. Процентна частка проникнення нематод варіювала між 0,48 і 2,66 % в контролі і контрольному патерні проникнення, відповідно, для початкової популяції. Ефект пестицидів, який надається на міграцію M. exigua, показує, що має місце порушення в напрямку, який обумовлює розсіювання молодих особин. Зниження присутності молодих особин, які проникли в коріння томата, відносно контролю, також може мати зв'язок з втручанням в процеси вилуплення і орієнтації молодих особин M. exigua. Гіпотезу про зниження проникнення нематод в коріння можна уточнити, оскільки здатність бактерії, яку містить продукт, займати або сполучатися з поверхневими лектинами, які в цьому випадку можуть бути мінімальними завдяки грампозитивним бактеріям. Температури всередині теплиці також можуть впливати на проникнення молодих особин в коріння. Деякі автори повідомляють, що антагоністична дія деяких мікроорганізмів на популяції Meloidogyne spp. вище при температурах в діапазоні 23-25 °C, ніж 18-32 °C (AL-HAZMI, SCHIMITT, SASSER, J. N. The effect of Arthrobotrys conoides on Meloidogyne incognita populations densities in corn as influenced by temperature, fungus inoculum density and of fungus introduction in the soil. Journal of Nematology, DeLeon Springs, v. 14, n. 2, р. 168-174, Apr., 1982). -1 Серед трьох протестованих доз продукту на основі Bacillus spp. доза 8 кг×га забезпечувала більш ефективне зниження проникнення молодих особин другої фази M. exigua в коріння культурного сорту томатів "Santa Cruz Kada Gigante" при процентній частці проникнення 1,22 % і інгібування 54,13 %. Висновок Конкретна комбінація штаму Bacillus subtilis з штамами Bacillus licheniformis, така як, наприклад, Bacillus subtilis (DSM 17231) і Bacillus licheniformis (DSM 17236), довела, що є сильною альтернативою хімічним нематоцидним продуктам, а також поліпшеною композицією в порівнянні з доступними біологічними продуктами. Комбінований ефект двох штамів корисний для інгібування нематод, які викликають збитки в сільськогосподарських культурах. ДЕПОЗИТИ І ЕКСПЕРТНЕ РІШЕННЯ Заявник просить, щоб зразок депонованих мікроорганізмів, встановлених нижче, міг бути доступний тільки експерту до тієї дати, до якої виданий патент. Штам Bacillus subtilis депонували 2005-04-07 в Німецьку Колекцію Мікроорганізмів і Клітинних Культур(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig (DSMZ)), і він отримав номер доступу DSM 17231. Штам Bacillus licheniformis депонували 2005-04-07 в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig (DSMZ), і він отримав номер доступу DSM 17236. 11 UA 112846 C2 5 Депозити створені згідно з Будапештським договором на міжнародне визнання депозиту мікроорганізмів для цілей процедури патентування. ПОСИЛАННЯ EP 0705807 BR PI 0604602-9 Siddiqui and Mahmood (1999). Bioresource Technology 69; 167-179. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 20 25 30 35 40 1. Композиція, яка надає рослині специфічну стійкість до фітонематод, яка містить як активні інгредієнти штам Bacillus subtilis, депонований в Німецькій Колекції Мікроорганізмів і Клітинних Культур під номером доступу DSM 17231, і штам Bacillus licheniformis, депонований в Німецькій Колекції Мікроорганізмів і Клітинних Культур під номером доступу DSM 17236, і агрохімічно прийнятні ексципієнти і/або носії. 2. Композиція за п. 1, яка містить вказані Bacillus subtilis і Bacillus licheniformis в суміші мальтодекстрину і діоксиду кремнію, де вказані компоненти присутні в мінімальній кількості 2,4(%), 2,4(%), 94,2(%) і 1,0(%), відповідно, і в максимальній кількості 3,0(%), 3,0(%), 93,0(%) і 1,0(%), відповідно. 3. Композиція за будь-яким з пп. 1 і 2 в формі змочуваного порошку. 4. Спосіб отримання композиції за будь-яким одним з пп. 1-3, який включає змішування, в бажаних відношеннях, ефективних кількостей вказаних штамів Bacillus subtilis і Bacillus licheniformis з агрохімічно прийнятними носіями, наповнювачами і/або ад′ювантами. 5. Застосування композиції за будь-яким одним з пп. 1-3 або отримуваної в способі, як визначено в п. 4, для контролю, боротьби і/або надання рослині специфічної стійкості до фітонематод. 6. Застосування за п. 5, де фітонематоди вибрані з групи, яка складається з Meloidogyne, Pratylenchus, Heterodera, Globodera, Ditylenchus, Tylenchulus, Xiphinema, Radopholus, Rotylenchulus, Helicotylenchus і Belonolaimus. 7. Застосування за п. 6, де фітонематоди вибрані з групи, яка складається з Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Meloidogyne exigua, Meloidogyne paranaensis, Heterordera glycines і Pratylenchus zeae. 8. Застосування за будь-яким з пп. 5-7, де рослина вибрана з групи, яка складається з цукрової тростини, соєвих бобів, картоплі, моркви, кави і банана. 9. Спосіб контролю і/або боротьби з фітонематодами на рослинах і/або в їх природному середовищі, де композиція за будь-яким одним з пп. 1-3, взаємодіє з фітонематодами і/або їх природним середовищем. 10. Спосіб надання рослині специфічної стійкості до фітонематод, який включає застосування ефективної кількості композиції за будь-яким одним з пп. 1-3, на рослини і/або на їх природне середовище. 11. Набір для надання рослині специфічної стійкості до фітонематод, який містить композицію за будь-яким одним з пп. 1-3 або отримувану способом за п. 4, інструкції і відповідний реципієнт. 12 UA 112846 C2 13 UA 112846 C2 14 UA 112846 C2 15 UA 112846 C2 Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 16