Рання діагностика конформаційних захворювань

1. Спосіб діагностики або виявлення конформаційного захворювання, яке характеризується конформаційним перетворенням білка, що лежить в його основі, з непатогенного у патогенний конформер, шляхом аналізу зразка на маркер вказаного захворювання; зазначений спосіб включає в себе: (і) контактування вказаного зразка з певною кількістю непатогенного конформера; (іі) дезагрегацію будь-яких агрегатів, що утворюються в кінцевому результаті під час стадії (і); і (ііі) визначення наявності і/або кількості у зразку вказаного патогенного конформера, де патогенний конформер є маркером наявності вказаного захворювання, причому стадія (і) включає в себе стадію (іа) інкубування вказаного зразка/непатогенного конформера, а стадії (іа) та (іі) утворюють цикл, який повторюється щонайменше двічі до виконання стадії (ііі). 2. Спосіб за п. 1, де цикл повторюється від 5 до 40 разів до виконання стадії (ііі). 2 (19) 1 3 76115 4 ком, що лежить в основі захворювання, є пріонний ком, що лежить в основі захворювання, є пріонний білок. білок. 13. Спосіб виявлення наявності патогенної форми 22. Спосіб діагностики хвороби Альцгеймера у пріонного білка у зразку, що включає в себе: пацієнта, що включає в себе взяття зразка у паціє(і) контактування вказаного зразка з певною кількінта: стю непатогенного пріонного білка; (і) контактування зразка з певною кількістю непато(іа) інкубування зразка/непатогенного пріонного генного β-амілоїдного білка; білка; (іа) інкубування зразка/непатогенного β(іі) дезагрегацію будь-яких агрегатів, що утворюамілоїдного білка; ються під час стадії (іа); (іі) дезагрегацію будь-яких агрегатів, що утворюповторення стадій (іа)-(іі) два або більше разів; а ються під час стадії (іа); потім повторення стадій (іа)-(іі) два або більше разів; і (ііі) визначення наявності і/або кількості у зразку потім патогенного пріонного білка. (ііі) визначення наявності і/або кількості у зразку 14. Спосіб за п. 13, де цикл, який утворюється стапатогенного β-амілоїдного білка. діями (іа) та (іі), повторюється від 5 до 40 разів до 23. Спосіб за п. 22, де цикл, який утворюється ставиконання стадії (ііі). діями (іа) та (іі), повторюється від 5 до 40 разів до 15. Спосіб за п. 13, де патогенним конформером є виконання стадії (ііі). PrPSc, непатогенним конформером є PrPС, а біл24. Спосіб за пп. 22, 23, де патогенним конформеком, що лежить в основі захворювання, є пріонний ром є PrPSc, непатогенним конформером є PrPС, а білок. білком, що лежить в основі захворювання, є пріон16. Спосіб діагностики хвороби Крейтцфельданий білок. Якоба у пацієнта, що включає в себе взяття зразка 25. Спосіб аналізу на виявлення маркера конфору пацієнта: маційного захворювання, яке характеризується (і) контактування зразка з певною кількістю білка конформаційним перетворенням білка, що лежить PrPC; в його основі, з непатогенного у патогенний кон(іа) інкубування зразка/білка PrPC; формер у зразку, де вказаний аналіз включає в (іі) дезагрегацію будь-яких агрегатів, що утворюсебе наступні стадії: ються під час стадії (іа); (і) контактування вказаного зразка з певною кількіповторення стадій (іа)-(іі) два або більше разів; і стю непатогенного конформера; потім (іі) дезагрегацію будь-яких агрегатів, що утворю(ііі) визначення наявності і/або кількості PrPSc у ються в кінцевому результаті під час стадії (і); і зразку. (ііі) визначення наявності і/або кількості у зразку 17. Спосіб за п. 16, де цикл, який утворюється ставказаного патогенного конформера, причому патодіями (іа) та (іі), повторюється від 5 до 40 разів до генний конформер є маркером наявності вказановиконання стадії (ііі). го захворювання, причому стадія (і) включає в се18. Спосіб за п. 16, де патогенним конформером є бе стадію (іа) інкубування вказаного PrPSc, непатогенним конформером є PrPС, а білзразка/непатогенного конформера, а стадії (іа) та ком, що лежить в основі захворювання, є пріонний (іі) утворюють цикл, який повторюється щонаймебілок. нше двічі до виконання стадії (ііі). 19. Спосіб виявлення наявності патогенної форми 26. Спосіб аналізу за п. 25, де цикл, який утворюβ-амілоїдного білка у зразку, що включає в себе: ється стадіями (іа) та (іі), повторюється від 5 до 40 (і) контактування зразка з певною кількістю непаторазів до виконання стадії (ііі). генного β-амілоїдного білка; 27. Спосіб аналізу за будь-яким з пп. 25, 26, де (іа) інкубування зразка/непатогенного βпатогенним конформером є PrPSc, непатогенним амілоїдного білка; конформером є PrPС, а білком, що лежить в основі (іі) дезагрегацію будь-яких агрегатів, що утворюзахворювання, є пріонний білок. ються під час стадії (іа); 28. Діагностичний набір для застосування в аналізі повторення стадій (іа)-(іі) два або більше разів; і за будь-яким з пп. 25-27, який включає в себе певпотім ну кількість непатогенного конформера, багатоям(ііі) визначення наявності і/або кількості у зразку ковий мікротитраційний планшет і багатоямковий патогенного β-амілоїдного білка. ультразвуковий пристрій. 20. Спосіб за п. 19, де цикл, який утворюється ста29. Апарат для застосування при діагностиці кондіями (іа) та (іі), повторюється від 5 до 40 разів до фірмаційного захворювання за будь-яким з пп. 1виконання стадії (ііі). 27, що включає в себе мікротитраційний планшет, 21. Спосіб за п. 19, де патогенним конформером є багатоямковий ультразвуковий пристрій і надлишPrPSc, непатогенним конформером є PrPС, а білкову кількість непатогенного конформера. Даний винахід відноситься до способу діагностики або виявлення конформаційних захворювань шляхом аналізу зразка на наявність маркера (тобто, патогенного конформера) вказаних захворювань; зазначений спосіб включає в себе використання циклічної ампліфікаційної системи для підвищення рівнів патогенного конформера. Зокрема, вказані конформаційні захворювання можуть являти собою пріонні енцефалопатії. Конформаційні захворювання являють собою групу розладів, що не мають очевидного зв'язку один з одним, але мають виражену подібність у 5 76115 6 клінічних виявах, яка відображає їх спільні молевань ускладнюються очевидною відсутністю імункулярні механізми стимуляції та самоасоціації, з ної відповіді на PrPSc. Клінічний діагноз CJD на подальшим депонуванням і пошкодженням тканин. сьогоднішній день базується на поєднанні підгостІнтерес до структури виникає завдяки тому рої прогресуючої деменції (менш ніж за 2 роки), факту, що вказані різні захворювання викликаютьміоклонусу та мультифокальної неврологічної дися конформаційним перетворенням білка, який сфункції, пов'язаних з характерною періодичною лежить в їх основі, що звичайно приводить до його електроенцефалограмою (ЕЕГ) [доповідь ВООЗ, агрегації та депонування у тканинах. З медичної 1998p., Weber et al., 1997]. Однак варіант CJD точки зору, проявлення вказаних конформаційних (vCJD), більшість ятрогенних форм CJD і до 40% захворювань відображає даний молекулярний спорадичних випадків не показують відхилень ЕЕГ механізм, звичайно з повільним початком, що не[Steinhoff et al., 1996]. У середньому точність клініпомітно наступає, коли перетворення спостерігачної діагностики складає близько 60% для CJD і є ється у нормальному білку, але з більш раптовим високою мірою мінливою для інших зв'язаних з початком, коли воно спостерігається у нестабільпріонами захворювань. Клінічна діагностика є ному варіанті білка. Двома прикладами особливої більш точною тільки на пізніх стадіях захворюванважливості вказаних конформаційних захворювань ня, коли розвиваються чіткі симптоми [Weber et al., є трансмісивні спонгіформні енцефалопатії і деме1997]. нція Альцгеймера - захворювання, яке загрожує Генетичний аналіз є придатним для діагностистати руйнівним для систем охорони здоров'я у ки спадкових пріонних захворювань, але останні розвинутих країнах [див. огляд Carrell et al., 1997]. представляють лише 15% всіх випадків. Методики Трансмісивні спонгіформні енцефалопатії візуалізації ЦНС є придатними тільки для виклю(TSE), відомі також як пріонні захворювання, явчення інших станів швидко прогресуючої деменції, ляють собою групу нейродегенеративних захвозавдяки структурним пошкодженням головного рювань, які уражають людину і тварин. Хвороба мозку [Weber et al., 1997]. Знахідки, зроблені за Крейтцфельда-Якоба (CJD), куру, хвороба Герстдопомогою методик, що візуалізують головний манна-Штраусслера-Шейкера (GSS) і фатальне мозок, шляхом комп'ютерної томографії (КТ) і месімейне безсоння (FFI) у людини, а також scrapie тодики ядерного магнітного резонансу (ЯМР), за(свербець) і спонгіформна енцефалопатія великої лежать, головним чином, від стадії захворювання. рогатої худоби (BSE) у тварин являють собою деКТ є значно менш чутливою методикою, і на ранній які з захворювань TSE (Prusiner, 1991). стадії у 80% випадків атрофія не виявляється Незважаючи на те, що дані захворювання лю[Galvez and Cartier, 1983]. Крім атрофії, виявлядини є відносно рідкісними, ризик можливої переються надінтенсивні сигнали ЯМР на базальних дачі BSE людині по харчовому ланцюгу береться гангліях [Onofrji et al., 1993]. Як і зміни, що спостедо уваги органами управління охороною здоров'я і рігаються за допомогою КТ, дані зміни жодним науковим співтовариством [Cousens et al., 1997, чином не є специфічними. Bruce et al., 1997]. Нещодавні дослідження дали можливість ідеДані захворювання відрізняються надто тринтифікувати декілька білків нейронів, астроцитів і валим інкубаційним періодом, за яким слідує короглії, вміст яких підвищується при CJD [Jimi et al., тка і неминуче смертельна клінічна стадія хвороби 1992]. Рівні білка S-100, нейрон-специфічного ізо[Roos et al., 1973]. На сьогоднішній день лікування ферменту і убіквітину значно підвищуються у цене розроблене. реброспінальній рідині (CSF) на ранній стадії заКлючовою характеристикою даного захворюхворювання, з підвищенням концентрацій у ході вання є утворення білка патологічної конфігурації, захворювання [Jimi et al., 1992]. Маркер загибелі що називається PrPSc, який являє собою посттраннейронів, білок 14-3-3, був запропонований як сляційно модифіковану версію нормального білка, специфічний і чутливий тест на спорадичну CJD що називається РrРC [Cohen and Prusiner, 1998]. [Hsich et al., 1996]. Однак він не підходить для діаДля розрізнення ізоформ РrР не було виявлено гностики vCJD і є значно менш специфічним при хімічних відмінностей [Stahl et al., 1993], і конвергенетичних формах. Оскільки білок 14-3-3 може сія, як представляється, являє собою конформабути присутнім у CSF пацієнтів з іншими станами, ційну зміну, в той час як α-спіральний вміст норданий тест не рекомендується ВООЗ як загальний мального білка зменшується, а кількість βскринінг на CJD і залишається у резерві для підтскладчастої структури збільшується [Pan et al., вердження клінічного діагнозу [доповідь ВООЗ, 1993]. За структурними змінами слідують зміни 1998p.]. біохімічних властивостей: РrРC є розчинним у деБільш успішна діагностика досягається за дотергентах, що не денатурують, РrР є нерозчинним; помогою комбінації клінічних даних з біохімічними РrР легко розщеплюється протеазами, в той час як маркерами. Однак відповідно до оперативної діагPrPSc є частково резистентним, що приводить до ностики, прийнятої на сьогоднішній день в Євроутворення N-термінально зрізаного фрагмента, пейській системі спостереження за CJD, остаточвідомого як форма "PrPres" [Baldwin et al., 1995; ний діагноз встановлюється тільки за Cohen and Prusiner, 1998], "Prp 27-30" (27-30кДа) результатами нейропатологічних досліджень і виабо "PK-резистентна" (резистентна до протеїнаявленням PrPSc за допомогою імуногістохімічних зи K). методик, гістоблотингу або вестерн-блотингу На сьогоднішній день точної діагностики TSE [Weber et al., 1997, Budka et al., 1995]. не існує [доповідь ВООЗ, 1998p., Budka et al., Утворення PrPSc являє собою не тільки най1995, Weber et al., 1997]. Спроби розробити діагбільш вірогідну причину захворювання, але також і ностичний тест для виявлення пріонних захворюнайбільш добре відомий маркер. Виявлення PrPSc 7 76115 8 у тканинах і клітинах широко корелює з захворюційним перетворенням білка, що лежить в його ванням і з наявністю інфективності TSE, а способи основі між непатогенним і патогенним конформелікування, які інактивують або елімінують інфектиром, шляхом аналізу зразка на наявність маркера вність TSE, також елімінують PrPSc [Prusiner, 1991]. вказаного захворювання; зазначений спосіб вклюІдентифікація PrPSc у тканинах людини або тваричає в себе: ни вважається ключовою для діагностики TSE [до(і) контактування вказаного зразка з деякою кіповідь ВООЗ, 1998p.]. Важливим обмеженням далькістю непатогенного конформера; ного підходу є чутливість, оскільки кількості PrPSc є (іі) дезагрегацію будь-яких агрегатів, що утвовисокими (достатніми для виявлення звичайними рюються в кінцевому результаті під час стадії (і), і способами) тільки у ЦНС на пізніх стадіях захво(ііі) визначення наявності і/або кількості у зразрювання. Однак було показано, що на ранніх стаку вказаного патогенного конформера. діях захворювання має місце генералізований роЗагалом, патогенний конформер буде маркезподіл PrPSc (у низьких кількостях), особливо у ром наявності вказаного захворювання. лімфоретикулярній системі (Aguzzi, 1997). Дійсно, Переважно стадія (і) включає в себе стадію повідомляється про наявність PrPSc у тканині під(іа) інкубування вказаного зразка/непатогенного небінних мигдалин і апендиксі, одержаних у пацієконформера. нтів з vCJD [Hill et al., 1997]. Незважаючи на те, що Відповідно до переважного варіанту втілення невідомо, наскільки рано у ході захворювання моданого винаходу, стадії (іа) і (іі) утворюють цикл, жна використовувати біопсію мигдалин або апенякий повторюється щонайменше двічі до виконандиксу для діагностики vCJD, було показано, що у ня стадії (ііі). Більш переважно, цикли повторюовець, генетично схильних до захворювання ються від 5 до 40 разів, і найбільш переважно - 5scrapie (свербець), PrPSc можна виявити у тонзи20 разів. лярній тканині ще до появи симптомів і на ранніх Конформаційні захворювання, що підлягають стадіях інкубаційного періоду. Однак до цього часу виявленню або діагностиці, являють собою такі PrPSc не був виявлений у вказаних тканинах у жозахворювання, які характеризуються конформадному випадку спорадичної CJD або GSS ційним перетворенням білка, що лежить в їх осно[Kawashima et al., 1997]. ві. Даний "білок, що лежить в основі" являє собою Нормальний білок експресується білими кробілок, який здатний сприйняти непатогенне перетв'яними клітинами і тромбоцитами, і, отже, можливорення і патогенне перетворення. Прикладом во, що в уражених хворобою індивідуумів деякі подібного білка є пріонний білок, РrР. Ще одним клітини крові можуть містити PrPSc [Aguzzi, 1997]. прикладом подібного білка є білок, який має відЦе дає можливість розроблення аналізу крові на ношення до хвороби Альцгеймера, тобто, βСJD, але вимагає дослідження з набагато більш амілоїдний білок. високою чутливістю, ніж чутливість методів досліКонформаційні захворювання, що підлягають дження, що існують на сьогоднішній день. діагностиці або виявленню, являють собою переПрипускають, що реплікація пріонів спостеріважно трансмісивні конформаційні захворювання, гається, коли PrPSc в інокулюмі, що інфектує, спетакі як TSE (як визначено у розділі "Передумови"). цифічним чином взаємодіє з РrРC хазяїна, каталіУ випадку діагностики TSE і відповідно до пезуючи його перетворення у патогенну форму білка реважного варіанту втілення даного винаходу, (Cohen et al., 1994). Для того, щоб досягти конценмаркером даного захворювання, а також патогентрації PrPSc, достатньої для появи клінічних симпним конформером є PrPSc, в той час як непатогентомів, вказаний процес продовжується протягом ним конформером білка, що представляє інтерес, періоду часу від багатьох місяців до багатьох роє РrРC. ків. Кількість непатогенного конформера, яка виІнфективна одиниця PrPSc, як вважають, являє користовується на стадії (і) (і, необов'язково, на собою олігомерну структуру з високим вмістом βстадії (ib)), це звичайно відома кількість, хоча це і складчастої структури, яка конвертує нормальний необов'язково у випадку, якщо треба просто встабілок шляхом включення його у зростаючий агреновити наявність або відсутність патогенного конгат (Фіг.1). Дану конверсію імітують in vitro за доформера. помогою змішування очищеного РrРC з 50-кратним Переважно, щоб кількість непатогенного конмолярним надлишком заздалегідь денатурованого формера, яка використовується на стадії (і) (і, неPrPSc (Kocisko et al., 1994). обов'язково, на стадії (ib)), була надмірною кількісОписані до цього часу системи конверсії in тю. Загалом, вихідне співвідношення vitro мають низьку ефективність, оскільки вони непатогенного конформера і патогенного конфорвимагають надлишку PrPSc і, отже, не придатні для мера (якщо він присутній у зразку) буде більше діагностичних цілей, оскільки вони не можуть ви100:1, переважно, більше 1000:1, і найбільш переявити кількості маркера, що не виявляються. Приважно, більше 1000000:1. чиною низької ефективності є те, що кількість оліЩе в одному переважному варіанті втілення гомерів PrPSc (одиниць, що конвертують) даного винаходу непатогенний конформер на стазалишається фіксованою у ході дослідження. Одидії (і) присутній у гомогенаті головного мозку здониці, що конвертують, ростуть послідовно по кінрового суб'єкта і/або може бути доданий до нього, цях, і в результаті вони стають більшими, але кільперед здійсненням стадії (і); у цьому випадку, откість їх не збільшується (Фіг.1). же, гомогенат головного мозку, який містить (пеЗаявники розробили спосіб діагностики або реважно, відомий) надлишок непатогенного конвиявлення конформаційного захворювання, при формера, додають на стадії (і). Переважно, щоб якому захворювання характеризується конформагомогенат головного мозку здорового суб'єкта мав 9 76115 10 таке ж видове походження, як і у зразка, що аналіність) [Jarrett and Lansbury, Jr., 1993, Caughey et зується (наприклад, гомогенат головного мозку al., 1997]. Після інкубування двох форм РrР, оліголюдини для людського зразка, гомогенат головномерні види збільшують свій розмір за рахунок заго мозку щура для щурячого зразка, який підлягає лучення і трансформування молекул РrРC. Даний аналізу). Більш переважно, щоб непатогенний процес має низьку ефективність, оскільки він законформер був присутнім у конкретній фракції лежить від фіксованої кількості олігомерів, які росгомогенату головного мозку, наприклад, у жирових туть по кінцях. Кількість одиниць, що конвертують, масах з гомогенату головного мозку. Одержання зростає у ході реакції, протягом якої вони тільки даних фракцій можна здійснювати, наприклад, як стають більші за розміром. Припускають, що да[описано у Sargiacomo Μ. et al., 1993]. ний процес являє собою те, що відбувається в Таким чином, даний винахід відноситься також організмі тварини або людини після інфікування; до способу або аналізу, як описано у даному допроцес, який, як відомо, займає місяці або навіть кументі, при якому тканину або фракцію тканини декілька років. У даному винаході заявники описудодають до непатогенного конформера на стадії ють процедуру руйнування олігомерів на більш (і). Переважно, щоб тканина являла собою тканину дрібні молекули, кожна з яких потім здатна конвеголовного мозку або одержаний з нього гомогенат ртувати РrРC. або фракцію від здорового суб'єкта (тобто від таТаким чином, дану систему безпосередньо викого суб'єкта, у якого немає патогенного конфоркористовують для діагностики конформаційних мера). захворювань, і, зокрема, трансмісивних конфорПовідомляється [Kocisko et al., 1994], що менш маційних захворювань, таких як TSE, шляхом амглікозиловані форми РrРC переважно перетворюпліфікації кількостей PrPSc у різних тканинах або Sc C ються у форму PrP . Зокрема, РrР , на який біологічних рідинах, які не виявляються іншими впливали специфічною фосфатидилінозитолметодами. Дана система може дозволити раннє фосфоліпазою С, звичайно більш ефективно певиявлення людей, що входять до групи ризику ретворювався у патогенну форму, ніж повний, розвитку TSE, і могла б бути також досить корисбільш інтенсивно глікозилований, РrРC. Таким чиною для біохімічного контролювання ефективності ном, ще один варіант втілення даного винаходу лікарських засобів для лікування TSE у ході клінічвідноситься до способу або аналізу, як описано у них випробувань. даному документі, при якому непатогенним конВідповідно до переважного варіанту втілення формером є РrРC, який має знижений рівень глікоданого винаходу, зразок, що підлягає аналізу, прозилування (зокрема, N-пов'язаного глікозилування) ходить стадію "попередньої обробки", метою якої є у порівнянні з РrРC дикого типу. Переважно, РrРC "вибірне концентрування" у зразку патогенного обробляють, щоб видалити деяку, всю або значну конформера, який необхідно виявити. У випадку кількість глікозилування перед його використанням TSE, як повідомляється, і РrРC, і PrPSc розташовуяк непатогенного конформера у способах і аналіються в особливій ділянці плазматичної мембрани, зах, описаних у даному документі; і, більш переяка є резистентною до обробки м'якими детергенважно, непатогенний конформер являє собою тами (такими як крижаний тритон Х-100), завдяки РrРC, який практично неглікозилований. відносно високому вмісту холестерину та глікосфіУ випадку діагностики TSE, якщо у зразку принголіпідів [М. Vey et al., 1996]. Вказані мембранні сутні агрегати патогенної форми, під час стадії (і) домени називають жировими масами або стійкими до детергентів мембранами (DRM) або кавеолавони будуть індукувати конверсію PrPC PrPSc, а подібними доменами (CLD), і вони мають високий під час стадії (іі) вказані агрегати будуть розпадавміст сигнальних білків, рецепторів і GPI-якірних тися на більш маленькі, але інфективні одиниці, білків. Заявники підтвердили, що 100% РrРC у гокожна з яких все ще здатна індукувати конверсію ловному мозку знаходяться у даній фракції, яка іншого РrРC. Дана методика у даному документі містить