Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин

1. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин, що включає джерело клітин, яке подає клітини для аналізу вказаним поточним цитометром, джерело рідини оболонки, що створює для вказаних клітин рідке середовище оболонки, яке містить приблизно 2,9 % цитрату натрію, патрубок, крізь який проходять вказані клітини під час подачі до них рідинного середовища оболонки, осцилятор, який діє на вказану рідинну оболонку, коли вона проходить крізь вказаний патрубок, систему аналізу клітин, яка реагує на вказані клітини, систему поділяючого сортування, яка здійснює сортування клітин, що мають бажані характеристики, і збірник, до якого поміщаються клітини, що мають бажані 2. Система протокового цитометра для ізоляції характеристики. бажаних клітин за п. 1, яка відрізняється тим, що джерелом згаданих клітин є клітини бичачих сперматозоїдів. 3. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 2, яка відрізняється тим, що 2 (19) 1 3 77641 4 ливими до хімічної композиції в навколишньому до них рідинного середовища оболонки, осцилярідинному середовищі. тор, який діє на вказану рідину оболонки, коли 10. Система протокового цитометра для ізоляції вона проходить крізь вказаний патрубок, систему бажаних клітин за п. 7, яка відрізняється тим, що аналізу клітин, яка реагує на вказані клітини, сисвказаний збірник використовують для забезпечентему поділяючого сортування, яка здійснює сортуня низької дози сперматозоїдів. вання вказаних видів клітин, що мають бажані ха11. Система протокового цитометра для ізоляції рактеристики, і збірник, до якого поміщаються бажаних клітин за п. 10, яка відрізняється тим, клітини, що мають бажані характеристики. що вказаний патрубок, осцилятор, система аналізу 19. Система протокового цитометра для ізоляції клітин та система поділяючого сортування є часбажаних клітин за п. 18, яка відрізняється тим, тиною системи протокового цитометра, а вказана що вказане рідинне середовище клітин як перед, система протокового цитометра містить протокотак і після сортування містить хоча б одну надчутвий цитометр для сортування вказаних сперматоливу хімічну композицію, до якої вказані клітини є зоїдів зі швидкістю принаймні 500 подій сортуванособливо чутливими і в якій джерело хімічно моня за секунду. дифікованої рідини оболонки зводить до мінімуму 12. Система протокового цитометра для ізоляції зміни вказаної надчутливої хімічної композиції. бажаних клітин, яка включає джерело клітин, яке 20. Система протокового цитометра для ізоляції подає клітини для аналізу протоковим цитометбажаних клітин за п. 19, яка відрізняється тим, ром, джерело рідини оболонки, яке створює рідинщо вказана надчутлива хімічна композиція містить не середовище оболонки для вказаних клітин, паметаболічну хімічну композицію. трубок, крізь який проходять вказані клітини під 21. Система протокового цитометра для ізоляції час подачі до них рідинного середовища оболонки, бажаних клітин за п. 19, яка відрізняється тим, осцилятор, який діє на вказану рідину оболонки, що вказана надчутлива хімічна композиція містить коли вона проходить крізь вказаний патрубок, сисцитрат. тему аналізу клітин, яка реагує на вказані клітини, 22. Система протокового цитометра для ізоляції систему поділяючого сортування, яка здійснює бажаних клітин за п. 21, яка відрізняється тим, сортування вказаних сперматозоїдів, що мають що вказане джерело хімічно модифікованої рідини бажані характеристики, і збірник, до якого поміщамістить розчин приблизно 2,9 % цитрату натрію. ються клітини, що мають бажані характеристики, 23. Система протокового цитометра для ізоляції що включає цитратну рідину для збирання, яка бажаних клітин за п. 22, яка відрізняється тим, містить приблизно шість відсотків яєчного жовтка. що джерелом вказаних клітин є клітини бичачих 13. Система протокового цитометра для ізоляції сперматозоїдів. бажаних клітин за п. 12, яка відрізняється тим, 24. Система протокового цитометра для ізоляції що джерело рідини оболонки містить розчин прибажаних клітин за п. 23, яка відрізняється тим, близно 2,9 % цитрату натрію. що вказаний збірник застосовують для забезпе14. Система протокового цитометра для ізоляції чення штучного осіменіння сперматозоїдами. бажаних клітин за будь-яким з пп. 12 або 13, яка 25. Система протокового цитометра для ізоляції відрізняє ться тим, що джерелом вказаних клітин бажаних клітин за п. 23, яка відрізняється тим, є клітини бичачих сперматозоїдів. що вказаний збірник використовують для забезпе15. Система протокового цитометра для ізоляції чення низької дози сперматозоїдів для штучного бажаних клітин за п. 12, яка відрізняється тим, осіменіння. що джерелом вказаних клітин є клітини, які є над26. Система протокового цитометра для ізоляції чутливими до хімічної композиції в навколишньому бажаних клітин за п. 19, яка відрізняється тим, рідинному середовищі. що вказане джерело клітин містить невідновлюва16. Система протокового цитометра для ізоляції ні клітини. бажаних клітин за п. 12, яка відрізняється тим, 27. Система протокового цитометра для ізоляції що вказаний збірник використовують для забезпебажаних клітин за п. 26, яка відрізняється тим, чення низької дози сперматозоїдів. що вказане джерело клітин містить клітини з не17. Система протокового цитометра для ізоляції здатною до транскрипції ДНК. бажаних клітин за п. 16, яка відрізняється тим, 28. Система протокового цитометра для ізоляції що вказаний патрубок, осцилятор, система аналізу бажаних клітин за п. 26, яка відрізняється тим, клітин та система поділяючого сортування є часщо вказане джерело клітин містить клітини з нетиною системи протокового цитометра, а вказана здатною до реплікації ДНК. система протокового цитометра містить протоко29. Система протокового цитометра для ізоляції вий цитометр для сортування вказаних сперматобажаних клітин за п. 26, яка відрізняється тим, зоїдів зі швидкістю принаймні 500 подій сортуванщо джерелом вказаних клітин є клітини сперматоня за секунду. зоїдів. 18. Система протокового цитометра для ізоляції 30. Система протокового цитометра для ізоляції клітин, яка включає джерело клітин, яке подає клібажаних клітин за п. 29, яка відрізняється тим, тини для аналізу вказаним протоковим цитометщо вказаний збірник використовують для забезпером, джерело хімічно модифікованої рідини обочення низької дози сперматозоїдів. лонки, що створює рідинне середовище оболонки 31. Система протокового цитометра для ізоляції для вказаних клітин, яке вибирають таким чином, бажаних клітин за п. 30, яка відрізняється тим, щоб воно узгоджувалось з рідинним середовищем що вказана низька доза сперматозоїдів містить не клітин як перед, так і після сортування, патрубок, більш ніж приблизно десять відсотків від дозуванкрізь який проходять вказані клітини під час подачі ня, вибраного з групи, що містить один мільйон 5 77641 6 бичачих сперматозоїдів, десять мільйонів бичачих 35. Система протокового цитометра для ізоляції сперматозоїдів та сто мільйонів кінських спермабажаних клітин за будь-яким з пп. 19 або 31, яка тозоїдів. відрізняє ться тим, що вказане джерело клітин 32. Система протокового цитометра для ізоляції містить бичачі сперматозоїди. бажаних клітин за п. 30, яка відрізняється тим, 36. Система протокового цитометра для ізоляції що вказані сперматозоїди містять бичачі спермабажаних клітин за п. 19, яка відрізняється тим, тозоїди, і вказана низька доза сперматозоїдів місщо вказане джерело клітин містить кінські сперматить дозу менш ніж приблизно п'ятсот тисяч бичатозоїди. чих сперматозоїдів. 37. Система протокового цитометра для ізоляції 33. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 18, яка відрізняється тим, бажаних клітин за п. 30, яка відрізняється тим, що вказане джерело створює вказане рідинне сещо вказані сперматозоїди містять бичачі спермаредовище перед сортуванням клітин та що вказатозоїди, і вказана низька доза сперматозоїдів місний приймач створює вказане середовище після тить дозу менш ніж приблизно триста тисяч бичасортування клітин. чих сперматозоїдів. 38. Система протокового цитометра для ізоляції 34. Система протокового цитометра для ізоляції бажаних клітин за п. 18, яка відрізняється тим, бажаних клітин за п. 30, яка відрізняється тим, що вказане джерело клітин містить клітини, які є що вказані сперматозоїди містять кінські сперманадчутливими до хімічної композиції в рідині оботозоїди, і вказана низька доза сперматозоїдів міслонки. тить дозу менш ніж приблизно десять мільйонів сперматозоїдів. Даний винахід загалом стосується області статевого добору потомства ссавців. Він особливо стосується аспектів штучного осіменіння низькими дозами та підвищення продукування яйцеклітин для одержання потрібної статі потомства. Зокрема, винахід стосується забезпечення штучного осіменіння з контролем статі низькими дозами незалежно від методів сортування, систем сортування сперми за способом проточної цитометрії для штучного осіменіння з контролем статі при низьких дозах та методів підвищення результатів овуляції, або аналогічної тематики. Протягом віків було бажаним обрання статі конкретного потомства. Крім очевидних психологічних аспектів, дійсний контроль статі потомства ссавців має значні економічні наслідки, якщо розглянути його застосування до тварин, що продукують продукти харчування, таких як велика рогата худоба, а також уславлених нагородних тварин, таких як коні і т.п. Це велике бажання викликало різноманітні спроби забезпечення потомства бажаної статі. Можливо, спробами, що здаються найближчими до досягнення бажаних результатів, були спроби сортування та добору сперматозоїдів X та Υ перед осіменінням. Однією з проблем, з якими зіштовхнулися спроби сортування X та Υ сперматозоїдів, була велика кількість сперматозоїдів. При натуральному осіменінні у деяких видів продукуються мільярди сперматозоїдів; при штучному осіменінні використовується менша, але все ще значна кількість сперматозоїдів. Наприклад, методи штучного осіменіння звичайно використовують від десяти мільйонів до п'ятисот мільйонів сперматозоїдів (в залежності від виду). Таким чином, навіть за умов штучного осіменіння потрібна значна кількість сперматозоїдів. Робилися спроби використання багатьох методів для забезпечення розділення сперматозоїдів, які несуть X- та Y-хромосому. Ці методи вклю чали використання різних методик розділення, від магнітних, таких як описані в [патенті США №4276139, до методик розділення на колонці, як описано в патенті США №5514537], гравіметричних методик, як описано в [патентах США №3894529, повторно опублікованому патенті №32350, патентах США №№ 4092229, 4067965 та 4155831]. Робилися спроби використання електричних властивостей, як описано в [патенті США №4083957], а також комбінації електричних та гравіметричних властивостей, як описано в [патентах США №№ 4225405, 4698142 та 4749458]. Робилися також спроби використання рухомості як описано в [патентах США №№ 4009260 та 4339434], Хімічні методики, такі як [описані в патентах США №№ 4511661 та 4999283] (з використанням моноклональних антитіл) та [патентах США №№ 5021244, 5346990, 5439362 та 5660997 (з використанням мембранних протеїнів), і патентах США №№ 3687803, 4191749, 4448767 та 4680258 (з використанням антитіл), а також додання компонентів сироватки, як описано в патенті США №4085205]. Хоч кожну з цих методик було описано як таку, що має високу ефективність фактично жодна з цих методик зараз не забезпечує бажаного рівня попереднього визначення статі. Однак, незалежно від використаної зрештою методики розділення, конкуруюче поєднання великої кількості сперматозоїдів за природних умов та підходу до розділення сперматозоїдів, які несуть Xта Y-хромосому, зробило бажаним розробку методів забезпечення осіменіння з меншою кількістю сперматозоїдів. На даний час єдиною кількісною методикою, що використовується для забезпечення розділення сперматозоїдів, які несуть X- та Y-хромосоми, є така, що включає індивідуальне розрізнення та розділення сперматозоїдів методом поточної цитометрії. Ця методика стала можливою завдяки досягненням та відкриттям, пов'язанням з дифе 7 77641 8 ренційованою абсорбцією барвника сперматозоїДійсно, як описано в даному винаході, обробка дами, що несуть X- та Y-хромосоми. Вона була шляхом використання методики звичайної поточспочатку описана в [патенті США №4362246] і знаної цитометрії може бути неприйнятною у певних чно розширена за допомогою прийомів, описаних випадках для цитометричного сортування спермаLawrence Johnson в [патенті США №5135759]. Затозоїдів. Різні види чутливості, починаючи з чутлипропонована Johnson методика використання повості до розрідження та властивої поточній цитоточної цитометрії для розділення сперматозоїдів, метрії необхідності ізолювати та розрізнити кожну що несуть X-та Y-хромосоми, була надзвичайно клітину індивідуально, а також тиск та інші стреси, значним досягненням, яке уперше зробило можпритаманні типовій поточній цитометрії, чинили, ливим комерційне розділення таких сперматозоїдо даного винаходу, сильний вплив на клітини чи дів. Залишаючись ще на експериментальній стадії, інші речовини, що піддавались сортуванню. У вирозділення було значно поліпшено з використанпадку сперматозоїдів цей фактор може мати особням високошвидкісних поточних цитометрів, таких ливе значення, оскільки навіть якщо здається, що сперматозоїди були піддані поточній цитометрії та як поточних цитометр MoFloÒ , що виробляється сортуванню без будь-яких візуально помітних поCytomation, Inc., як описано в різних інши х [патенбічних ефектів, в дійсності самі клітини могли затах, включаючи патенти США №№ 5150313, знати такого стресу, що в процесі осіменіння їх 5602039, 5602349 та 5643796, а також у міжнародній патентній публікації РСТ WO 96/12171]. Хоч показники будуть нижче оптимальних. Отже, напевно, з точки зору сортування сперматозоїдів та їх використання цитометрів MoFloÒ фірми Cytomation кінцевого використання для штучного осіменіння дозволило значно підвищити швидкість, і хоч таке відбувається взаємодія факторів, що приводить до збільшення швидкості є дуже доречним з урахувиникнення незвичних проблем. ванням великої кількості сперматозоїдів, що часто Іншою проблемою, що залишилась - незважавикористовується, певні проблеми ще залишаютьючи на великі успіхи, яких було досягнуто завдяки ся. Всупереч майже десятикратному підвищенню патенту Johnson та спорідненим технологіям - є швидкості, яке є можливим при використанні пототой факт, що до даного винаходу було надзвичайчного цитометра MoFloÒ , з кількох причин бажанино важко забезпечити осіменіння меншими дозами ми є ще коротші часи сортування. По-перше, було виділених за статевими ознаками сперматозоїдів, виявлено, що з практичної точки зору сперматозонезалежно від використаної технології розділення. їди є клітинами, для яких фактор часу є критичним. Хоч історично було досягнуто певного успіху в Чим довше вони залишаються невикористаними, області осіменіння низькими дозами, він стосуєтьтим більше вони втрачають свою ефективність. ся переважно теорії чи лабораторних умов, а не По-друге, графік проведення збирання, сортувантих умов, що можуть ймовірно існувати при комерня та осіменіння робить швидкість фактором, який ційному використанні чи бути застосовними до має високе комерційне значення. Отже, залежність нього. У цьому відношенні існує бажання не просвластивостей клітин сперматозоїдів та результатів то забезпечити осіменіння низькими дозами, а процесу від часу робить швидкість суттєвим елезабезпечити осіменіння низькими дозами з такими ментом у забезпеченні високої ефективності та показниками запліднюваності, що є порівняними з долі успішних спроб. наявними спробами штучного осіменіння високими Існують також інші проблеми, від практичних дозами без відбору за статевими ознаками. Таким до теоретичних. З практичної точки зору було бачином, успіхи, досягнуті авторами даного винахожаним одержання зразків сортованої за статевими ду, є значними досягненнями, які можуть уперше ознаками сперми з використанням недорогих визробити можливим комерційне застосування. тратних компонентів та речовин. Також, з урахуІншою проблемою, з якою зустрічаються фахіванням витрат, було бажаним здійснити сортуванвці в цій області - також незважаючи на великі усня (а також збирання та осіменіння) з якомога піхи, яких було досягнуто завдяки патенту Johnson меншою трудомісткістю. Отже, для комерційного та спорідненим технологіям - є той факт, що сама виробництва та успіху за практичних умов будь-які проблема, а саме штучне осіменіння з високими поліпшення, що можуть привести до підвищення показниками запліднюваності, має статистичний ефективності, можуть бути значними. З практичхарактер і пов'язане з взаємодією множини фактоним аспектом витрат пов'язаний практичний асрів. Отже, запропоновані рішення можуть у певній пект делікатності та чутливості усього процесу. У мірі включати комбінації різних факторів, необхідцьому відношенні було б бажаним спростити проність яких окремо чи у поєднанні з іншими фактоцес та зробити його процедурно якомога надійнірами буде показана при ретельному статистичношим, щоб зменшити роль помилки чи кваліфікації му аналізі. Таке визначення додатково оператора. Разом вони також роблять осіменіння ускладнюється тим фактом, що самі результати низькими дозами ще більш бажаним. також відрізняються для різних видів і їх важко На додаток до делікатності процесу завжди оцінити внаслідок того, що випробування та статибуло відомо, що самі сперматозоїди є надзвичайстичне вибирання на достатньо великій базі даних но ніжними клітинами. Хоч на перший погляд цей навряд чи виправдають зусилля на початкових фактор здається легко зрозумілим, фактично у стадіях. З ци х причин винахід може також включаповній мірі чутливість клітин ще не було досліджети комбінацію факторів, які можуть, окремо чи у но. Загалом, в контексті поточної цитометрії, більпоєднанні, забезпечувати відповідне рішення для шість сортованих клітин чи частинок часто є сфеконкретного завдання. Таким чином, цей опис моричними або здатними за іншими фізичними же вважатись досить широким для того, щоб захарактеристиками протистояти різним шкідливим безпечувати різні комбінації та поєднання описафакторам. У випадку сперматозоїдів це не так. 9 77641 10 них методик. Можуть існувати невиявлені синергії характеристиках чи спрощених процедурах, що з іншими факторами. Такі фактори можуть існуваможуть виявитись необхідними для комерційного ти в діапазоні від факторів, що стосуються стадій впровадження. Крім осіменіння низькими дозами з сортування чи, можливо, поточної цитометрії, до контролем статі, як би воно не було досягнуто, факторів, що стосуються стадії збирання, а також даний винахід розкриває також методики, які заосіменіння. На даний час дослідження були пробезпечують підвищення ефективності, і тим самим ведені переважно на тваринах роду бичачих, але сприяють досягненню бажаного кінцевого резульвважається, що ці методи не обмежені цими витату, а саме штучному осіменінню низькими дозадами, або, у цьому відношенні, лише сперматозоїми з контролем статі на комерційній основі. дами. Вважається, що використані методики моЗгідно з вищезгаданим, даний винахід претенжуть знайти застосування не лише для дує на досягнення, на комерційному рівні, осімесперматозоїдів в областях, пов'язаних з сортуванніння низькими дозами та результатів, що стосуням чутливи х об'єктів або просто із зведенням до ються попереднього визначення статі ссавця. Він мінімуму впливу стресів при поточній цитометрії на пропонує також удосконалені оболонку та систему об'єкти, що сортуються. збирання для сортування сперматозоїдів для виЦікаво, що в той час, як даний винахід спрязначення їх статі з використанням розділення за мований на зменшення впливу сортування чи методом поточної цитометрії. У цій методиці розстресів на сперматозоїди, інші віддалялися від ділення рідину оболонки, яку типово використовуцього напрямку, збільшуючи тиск та вимоги до ють у поточному цитометрі, замінюють на рідину, швидкості та інших показників продуктивності. По яка зводить до мінімуму стрес сперматозоїдів при суті, прагнення до осіменіння низькими дозами та їх сортуванні. Крім того, удосконалено систему високої швидкості обробки можуть, окремо чи, мозбирання для зведення до мінімуму фізичного та жливо, у взаємозв'язаний спосіб, висувати прохімічного стресів, яких зазнають сперматозоїди. блеми, що обмежують одна одну. Отже, хоч поОписані різні методики та речовини, але фахівці в треба у високошвидкісному осіменінні низькими цій області легко зрозуміють, що можуть бути видозами з контролем статі відчувалась вже давно, і користані різні комбінації та зміни таким чином, хоч потрібні для його втілення способи та елеменщоб оптимізувати експлуатаційні показники в зати були наявними вже давно, до даного винаходу лежності від виду тварин, методик розділення, фа хівці не помічали досягнень чи, можливо, комцілей та інших параметрів конкретних умов викобінацій досягнень. Можливо, у певній мірі вони не ристання. змогли зрозуміти, що ця проблема пов'язана з Таким чином, об'єктом даного винаходу є провзаємодією факторів, а також з особливими вимосто забезпечення осіменіння з контролем статі гами до типів клітин (сперматозоїди чи, можливо, нижчими дозами у такий спосіб, який працює за видоспецифічні сперматозоїди), що використовуреальних промислових умов. Об'єктом є також ються в цій області. Цікаво, що, як показує навезабезпечення кращого сортування таких речовин, дений вище перелік робіт, були зроблені значні як сперматозоїди. Спорідненою метою є зведення зусилля, але вони, очевидно, не змогли зробити до мінімуму впливу самої функції сортування на зрозумілою проблему, притаманну такій області, клітини чи інші чутливі речовини, які можуть бути як осіменіння низькими дозами з контролем статі і, піддані сортуванню. Для сортування методом поможливо, зроблено припущення, що оскільки у точної цитометрії метою є, зокрема, зведення до природному акті осіменіння беруть участь, можлимінімуму впливу, який рідина оболонки чинить на во, мільярди сперматозоїдів, то можуть існувати клітини і, потенційно, впровадження рідини оболофізичні обмеження на забезпечення штучного осінки, яка чинить позитивний вплив, допомагаючи меніння з використанням кількостей, що є меншиклітинам перенести різні стреси. Паралельною ми на чотири порядки величини. Отже, немає нічометою є створення методик та речовин, які є осого несподіваного в тому, що існувала думка, яка бливо придатними для сперматозоїдів загалом, відрізнялась від технічного напряму даного винадля бичачих сперматозоїдів, для кінських спермаходу. Можливо, результати можуть навіть вважатозоїдів, і для розділення таких сперматозоїдів на тись у певній мірі несподіваними, оскільки вони компоненти, що несуть X- та Y-хромосоми. Аналопоказали, що може бути забезпечене штучне осігічно, метою є зведення до мінімуму впливу, який меніння низькими дозами з контролем статі при чинить на клітини стадія збирання (наприклад, показниках запліднювання, порівнянних з показнипісля сортування) і зведення до мінімуму фізичноками для штучного осіменіння високими дозами го впливу, а також хімічних впливів на такі сортобез контролю статі. Для декого може навіть бути вані за статевою ознакою сперматозоїди. Отже, несподіваним, що методики та нові прийоми данометою є одержання в результаті сортованого маго винаходу фактично поєднуються для досягнентеріалу, ушкодженого якнайменше. ня описаних значних результатів. В той час як коІншим об'єктом винаходу є забезпечення осіжна методика окремо може деким вважатись меніння низькими дозами сортованого матеріалу незначною, фактично непомітні зміни, які розгляна рівні та з показниками запліднення, порівняндаються окремо чи у комбінації з іншими непомітними з типовим штучним осіменінням високими ними змінами, приводять до суттєвих поліпшень дозами без контролю статі. Згідно з цією метою, кінцевого результату. пропонується загальна система штучного осімеТаким чином, до даного винаходу забезпеченніння, яка може досягти цієї мети у комерційно ня показників запліднювання при штучному осімепрактичний спосіб. Отже, важливими є описані нінні низькими дозами з контролем статі було невище цілі із зведення до мінімуму стресу чи потенможливим при потрібних те хніко-економічних ційного ушкодження сперматозоїдів. Важливою 11 77641 12 метою є також спосіб сортування, який забезпечує чи подає клітини чи якийсь інший тип матеріалу високу швидкість та низький рівень стресів при для аналізу за допомогою поточного цитометра. сортуванні, і який є особливо адаптованим для Клітини вводять до патрубка (2) таким чином, щоб сортування сперматозоїдів в контексті низької довони були оточені рідиною оболонки (3). Рідина зи. Важливими є також цілі зі створення рідин обооболонки (3) звичайно подається якимсь джерелонки та інших, що не чинять негативного впливу лом рідини оболонки (4) таким чином, щоб при на здатність сперми до запліднення і які є сумісподачі клітин джерелом клітин (1) рідина оболонки ними зі штучним осіменінням. (3) подавалась спільно з ними крізь патрубок (2). Звичайно, інші об'єкти винаходу є розкритими Таким чином, легко зрозуміти, що рідина оболонки в інших частинах опису та формулі винаходу. утворює для клітин рідке середовище оболонки. Фігура 1 є принциповою схемою системи сорОскільки різні рідини подаються до поточного цитування з використанням методики розділення за тометра під тиском, вони залишають патрубок (2) допомогою поточного цитометра за даним вината витікають з нього крізь отвір патрубка (5). За ходом. допомогою якогось типу осцилятора (6), який можФігура 2 є схемою, що зображує захоплені кліна дуже точно контролювати пристроєм керування тини на ділянці вільного падіння типового поточноосцилятором (19), можна створити в патрубку (2) го цитометра. хвилі тиску, що передаються до рідин, які виходять Фігура 3 є принциповою схемою, яка орієнтовз патрубку (2) крізь отвір патрубку (5). Оскільки но зображує відмінності, що виникають в резульосцилятор (6) чинить вплив на рідину оболонки (3), таті даного винаходу. потік (7), що виходить з отвор у патр убка (5), в реФігура 4 є схемою потоку сортованих клітин, зультаті регулярно утворює краплини (8). Оскільки що збирається у приймальній ділянці. клітини оточені рідким середовищем оболонки, Як буде видно далі, основні принципи даного краплини (8) можуть містити у собі окремі ізольовинаходу можуть бути скомбіновані та втілені різвані клітини чи інші матеріали. ними шляхами. Даний винахід включає просто Оскільки краплини (8) загалом містять ізольокомерційно практичне осіменіння низькими дозами вані клітини, поточний цитометр може розрізняти з контролем статі та результати. З точки зору мета розділяти краплини на основі того, містить кратодики розділення з використанням способу потоплина чи ні відповідну клітину чи клітини. Це здійсчної цитометрії винахід також включає удосконанюється за допомогою системи виявлення клітин лені системи поточного цитометра, а також (9). Система виявлення клітин включає принаймні системи для створення стать-специфічних зразків якийсь тип датчика (10), який реагує на клітини, що сперми, які можуть бути використані для штучного знаходяться усередині кожної краплини (8), як осіменіння, та тварин, продукованих з використанописано детально у зародковій роботі (без жартів) ням таких методик. Винахід включає загальні проLarry Johnson, а саме, в патенті США №5135759. цеси, завдяки яким високі швидкості є можливими Як пояснено в патенті Johnson для сперматозоїдів, навіть в промислових умовах. Крім того, описані система виявлення клітин (9) може спричинювати загальні методики, які можуть бути застосовані до дію в залежності від відносної наявності чи відносконкретних систем та областей застосування при ної відсутності конкретного барвника, який може розумінні загальних принципів. При описі удоскобути збуджений якимось стимулюючим засобом, налень приладів слід розуміти, що ці удосконатаким як лазерний збудник (11). Хоч барвник забалення не лише забезпечують втілення певних мервлює кожен тип сперматозоїдів, різна довжина Хтодів, але й можуть також бути змінені та хромосоми та Y-хромосоми спричинює різні рівні скомбіновані різними способами. Важливо, що для забарвлення. Таким чином, аналізуючи ступінь всього вищесказаного кожну з цих ознак слід роприсутності барвника в сперматозоїдах, можна зуміти як таку, що є охопленою даним винаходом. розрізнити Х-несучі сперматозоїди та Y-несучі Як згадувалось, основною метою є відокремсперматозоїди за їх різними рівнями емісії. лення сперматозоїдів, що несуть Х-хромосоми, від Для забезпечення кінцевого розділення та ізосперматозоїдів, що несуть Y-хромосоми. Це роляції відповідних клітин за методом розділення з биться у такий спосіб, при якому виділяються два використанням поточної цитометрії, сигнали, одетипи сперматозоїдів, так що кожен з них можна ржані датчиком (10), поступають до якогось типу окремо спакувати та використати. На даний час системи поділяючого сортування (12), яка дуже виділення краще здійснюється за допомогою пошвидко приймає рішення і може диференційовано точної цитометрії. Загалом поточна цитометрія є заряджати кожну краплину (8) на основі її рішення методикою, що є добре зрозумілою. Наприклад, її про те, є чи ні усередині цієї краплини (8) потрібна основні аспекти описані та обговорені у різноманіклітина. Таке функціонування системи поділяючотних патентах Cytomation, Inc., таких як патенти го сортування (12) дає змогу пластинам електроСША та інші раніше згадані публікації. Кожен з цих статичного відхилення (13) відхиляти краплини (8) патентів та зроблені в них посилання включені до за ознакою наявності чи відсутності в них відповідданого опису шляхом посилання; отже, фахівці в ної клітини чи іншого матеріалу. В результаті поданій області легко зрозуміють основні принципи . точний цитометр виконує функцію сортування кліПо суті, поточна цитометрія включає сортутин, примушуючи їх попадати до одного чи кількох вання речовин, таких як клітини, які подаються до збірників (14). Таким чином, аналізуючи якусь влаінструмента поточного цитометра за допомогою стивість клітин чи інших матеріалів, поточний циякогось джерела клітин. Схематично інструмент тометр може розрізняти клітини за якоюсь конкрезображено на Фігурі 1. Інструмент поточного цитотною характеристикою та поміщати їх до метра включає джерело клітин (1), яке виробляє відповідного збірника (14). В системі, що зараз 13 77641 14 використовується для сортування сперматозоїдів, новими досягненнями у поточній цитометрії та краплини, що містять Х-несучі сперматозоїди, законкретних варіантів її застосування той аспект, ряджаються позитивно, і тому відхиляються в одщо вважається «високим», може змінюватись або ному напрямку, краплини, що містять Y-несучі залишатись абсолютним. У будь-якому визначенні, сперматозоїди, заряджаються негативно, і тому загальний принцип полягає в тому, що сортування відхиляються в іншому напряму, а холостий потік може відбуватись на швидкості, при якій парамет(тобто клітини, що не сортуються) є незарядженим ри та фізичні характеристики поточного цитометра і тому збирається невідхиленим потоком до всмокє суттєвими для самих клітин при сортуванні певтуючого патрубка чи подібного пристрою. них клітин, таких як сперматозоїди. За допомогою Фігури 2 процес можна зрозуміОдним з аспектів високошвидкісного сортути ще краще. Як зображено на цій фігурі, патрубок вання, який відіграє певну роль при сортуванні (2) емітує потік (7), який завдяки осцилятору (6) (на сперматозоїдів за методом розділення з викорисФігурі 2 не зображений) утворює краплини (8). танням поточного цитометра, є тиск та інші стреси, Оскільки джерело клітин (1) (на Фігурі 2 не зобраяким піддано сперматозоїди у поточному цитометжене) може подавати сперматозоїди (15), які були рі. Наприклад, при експлуатації на високій швидзабарвлені за методикою Johnson, світлове збукості (та як альтернативне визначення «високої дження лазерним збудником (11) диференційно швидкості») поточні цитометри можуть працювати визначається датчиком (10) таким чином, що напри тиску в 345кПа (50фунтів/кв.дюйм) і навіть явність чи відсутність заряду на кожній краплині (8) 414кПа (60фунтів/кв.дюйм). Такий тиск може ввапри її відокремленні від потоку (7) може контролюжатись високим, оскільки він може чинити вплив ватись поточним цитометром. Цей контроль дона клітини, що піддані сортуванню. Ключовим факзволяє розрізняти позитивно заряджені, негативно тором для цього аспекту даного винаходу є той заряджені та незаряджені краплини (8) за їх вмісфакт, що визначальним фактором є порогові ветом. Як зображено на Фігурі 2, певні краплини поличини стресу для конкретних клітин. Крім того, з казані як відхилені краплини (16). Ці відхилені краподальшим накопиченням знань може бути покаплини (16) є тими, що містять сперматозоїди (15) зано, що порогові величини стресу є функцією однієї чи іншої статі. Потім вони осаджуються у поєднаних ефектів, таких як належність сперми до відповідному збірнику (14) для подальшого викоконкретного виду або вид попередньої чи подальристання. шої обробки клітин. Ключовим фактором у цьому Одним з аспектів поточної цитометрії, що є відношенні є те, що стрес, якого зазнають клітини, особливо важливим для її застосування у сортуможе фактично змінити їх життєздатність та їх ванні сперми, є висока швидкість роботи поточноздатність до досягнення бажаного результату. У го цитометра. Особливо удосконаленими є поточні випадку тиску можливо, що просте піддавання цитометри, що виробляються фірмою Cytomation, сперматозоїдів високому тиску в результаті проведення операції на поточному цитометрі при Inc. під товарним знаком MoFloÒ . Ці поточні цитоцьому тиску може призвести до зниження показниметри надзвичайно підвищили швидкість сортуків клітин. В одному з аспектів даний винахід звовання і тим самим зробили поточну цитометрію методикою, яка ймовірно може стати придатною дить до мінімуму ці стреси і. таким чином, забезпечує підвищення ефективності, а також менші до застосування у промисловому сортуванні спердози, як описано далі. ми (поряд з іншими варіантами промислового заПри розгляді в аспекті стресу клітин, даний стосування). Вони функціонують таким чином, щоб винахід працює таким чином, щоб звести до мінізабезпечити високошвидкісне сортування, тобто зі швидкістю, значно вищою, ніж та, що може бути муму стреси. Ці стреси можуть бути зменшені на будь-якій стадії всього циклу чи процесу збирання, досягнута в інших випадках. Зокрема, поточні цисортування, або навіть осіменіння тварини. Важтометри MoFloÒ виробництва Cytomation працюливо, що стрес, який створюється при обробці кліють з частотами осциляції вище приблизно п'яти тин у поточному цитометрі, є суттєвим для цього кілогерц, ще точніше, вони можуть працювати в варіанта застосування. В одному з варіантів втідіапазоні частот від 10 до 30, або навіть до 50 кілення винаходу рідину оболонки спеціально обилогерц. Таким чином, краплини утворюються на рають таким чином, щоб вона могла використовудуже високих частотах, і клітини, які знаходяться в ватись узгоджено з обома (або з будь-яким) з середовищі рідкої оболонки, можуть дуже швидко передсортувального рідкого середовища клітин емітуватись з патрубка (2). В результаті кожен з або післясортувального рідкого середовища клікомпонентів, що складають систему поточного тин. Хоч, звісно, можливо модифікувати будь-яку з цитометра та входять до її складу, таких як патрупередсортувальної та післясортувальної рідин, бок (2), осцилятор (6) і т.п., може бути скомпоноодин з варіантів втілення винаходу модифікує ріваний чи обраний таким чином, щоб створити видину оболонки (3) таким чином, щоб вона спричисокошвидкісний прилад для сортування клітин. нювала значно менший стрес клітин, ніж це було При застосуванні приладу для високошвидкісного досягнуто раніше. У певному відношенні винахід є сортування клітин до сортування сперматозоїдів примітним тим, що він переносить загальний фобуло досягнуте сортування зі швидкостями більше кус з функціонування поточного цитометра на споприблизно 500 елементарних подій сортування за соби поводження та зняття стресу з самих клітин. секунду. Фактично, при використанні приладів виНаприклад, хоч було відомим використання рідин сокошвидкісного сортування клітин були вже досяз належним показником рН чи осмотичністю, дагнуті швидкості сортування до тисячі та тисячі ний винахід визнає, що можуть існувати певні хімідвохсот подій. Важливо розуміти, що термін «вичні композиції, у яких клітини можуть мати підвисока швидкість» є відносним терміном, так що з 15 77641 16 щену чутливість. Ці хімічні композиції, що спричивість по відношенню до цієї хімічної композиції. нюють підвищену чутливість, можуть, звісно, зміВиявляється, що внаслідок добору певної метабонюватись в залежності від виду клітин чи навіть лічної хімічної композиції, найкраще цитратів чи попередньої обробки клітин. В цьому випадку важхімікатів, що входять до циклу лимонної кислоти, ливим є те, що для сперматозоїдів виявляйся, що можуть бути досягнуті значні поліпшення. Таким певні метаболічні хімічні композиції, такі як цитрат, чином, для використання з бичачою спермою ріпопереджають надзвичайно високий рівень стресу дину оболонки (3) обирають та компонують таким клітин. Таким чином, хімічні композиції, що викличином, щоб вона мала в складі приблизно 2,9 відкають підвищену чутливість, можуть бути визначесотка цитрату натрію. Зокрема, розчин цитрату ні як такі, до яких клітини є особливо чутливими в натрію з концентрацією 2,9 відсотка може бути контексті їх функціональності та методик обробки, одержаний таким чином: що існували на той час. У випадку сперматозоїдів 1. Поміщають 29,0г дигідрату цитрату натрію виявляється, що дуже важливими можуть бути (Nа3С6Н5О7·2Н2О) до мірної колби на 1000мл метаболічні композиції, а саме постійність цитрата. Розчиняють цитрат натрію у 3/4 об'єму води, ного складу для бичачих сперматозоїдів та постійа потім додають воду до потрібної кількості. ність буфера hepes для кінських сперматозоїдів. 2. Додають деіонізовану воду чи воду, одерТаким чином, даний винахід намагається звести жану на установці Nanopure, до кінцевого об'єму до мінімуму зміни шляхом вибору типу операції 1000мл. або речовин, які можуть діяти як засіб зведення до 3. Переміщають до склянок та автоклавують мінімуму тих змін, яких зазнають клітини. при тиску 15 фунтів сили (118°С (245°F)) протягом За одним з варіантів втілення винаходу, речопринаймні 30 хвилин вина для рідини оболонки обирається таким чиа. Автоклавують розчин за умов, які забезпеном, щоб її можна було з хімічної точки зору узгочують знижене випаровування (вільно прилягаюча дити з вимогою мінімальних змін. Таким чином, кришка) шляхом добору відповідної рідини оболонки не б. Стежать за тим, щоб вода не википіла. лише в контексті параметрів поточної цитометрії, а 4. Повільно охолоджують до кімнатної темпетакож в контексті параметрів самих клітин, можна ратури. поліпшити зміни, яких зазнають клітини і, над усе, 5. Зберігають закритою в холодній кімнаті при результат сортування. Це зображено схематично 5°С. на Фігурі 3. Фігура 3 зображує деякий тип хімічного Надалі при виготовленні рідини оболонки розфактора (такого як цитратний чи інший фактори), чин цитрату натрію може бути профільтрований. який може існувати на різних стадіях процесу. На6. Фільтрують на фільтрі 0,22 мікрон за метоприклад, чотири фази, що зображені, можуть для дикою асептичного фільтрування. методики розділення з використанням способу Цікаво, що для кінських сперматозоїдів така поточної цитометрії позначати наступне, але не композиція є придатною в меншій мірі. Замість обмежені цим: фаза І може позначати існування цього було знайдено, що для кінських сперматозоклітин у джерелі клітин (1), фаза II може показуваїдів кращим є середовище з буфером hepes, таке ти існування клітин під час їх сортування у рідкому як hepes-буферизоване середовище для бичачих середовищі оболонки, фаза III може показувати гамет, зокрема, HBGM3, яке було створено клітини під час їх збирання після сортування, і фаJ.J.Parrish для роботи з бичачими матеріалами. Це за IV може зображувати відновлені клітини у сересередовище [описано у статті «Capacitation of довищі для зберігання після сортування. Ці чотири Bovine Sperm by Heparin», 38, Biology of фази, як зображено для відомого рівня техніки, Reproduction, 1171 (1988), яку включено сюди за можуть зазнавати дії дуже різних за хімічними фапосиланням]. Це є несподіваним не лише тому, що кторами середовищ. Однак, як зображено схематип речовини відрізняється від того, що використично, за даним винаходом клітини можуть зазнатовується для бичачої сперми, але й тому, що сам вати дуже малих змін, причому найсуттєвішим є цей буфер був оригінально розроблений для роте, що занурення чи утворення краплин, яке відбуботи з бичачими матеріалами. Отже, для кінського вається між фазами І та II, може бути по суті відсуматеріалу обирається рідина оболонки, яка містнім. Це є результатом добору відповідної рідини тить буфер hepes. Цей розчин може мати при кімоболонки, як було вказано вище. Таким чином, в натній температурі значення рН приблизно 7,54 результаті того, що за даним винаходом клітини (рН при 39°С = 7,4), при такому складі: піддані дії відповідної рідини оболонки, вони моРеагент Суха вага (г/500мл) жуть зазнавати значно нижчого рівня стресу. СаСІ2 0,145 Одним з потенційних узагальнень, які можуть КСІ 0,115 виникнути у зв'язку з цим явищем, є той факт, що МgСІ2·6Н2 О 0,004 певні хімічні композиції можуть бути хімічними NaH2PO4·H2O 0,018 композиціями, які спричинюють більш підвищену NaCI 2,525 чутливість, ніж інші. Хоч, звичайно, це може зміПіруват Na 0,011 нюватись в залежності від виду сперми, обробки, Молочна кислота (60%) 1,84мл або навіть типу клітин, яких це стосується, виявляHEPES 4,765 ється, що життєздатність клітин, потрібна для їх NaHCO3 0,420 призначення (в цьому випадку - штучного осімеBSA (фракція V) 3,0 ніння) може сильно змінюватись з природних приОдним з інших аспектів, що можуть відігравати чин чи внаслідок сортування, або з обох причин, свою роль у даному винаході, є той факт, що клітак що клітини будуть виявляти підвищену чутлитини, про які йде мова, можуть виявляти незви 17 77641 18 чайну чутливість. В одному відношенні це може використанні для цієї мети тестової пробірки Фалбути спричинено тим фактом, що сперматозоїди кона на 14мл. належать до класу клітин, які є невідновлюваними Слід відзначити, що навіть тестова пробірка клітинами. Тобто, вони не мають здатності відновФалкона на 14мл може бути не оптимальним варілювати себе і тому можуть вимагати набагато антом. Зокрема, вважається, що найоптимальніобережнішого ставлення, ніж звичайні для поточшим варіантом може бути використання контейнених цитометрів чи іншого обладнання для обробра збірника, який відповідає геометрії потоку ки. Отже, може виявитись, що це удосконалення є (тобто, « узгоджений з геометрією потоку контейособливо застосовним у тих випадках, коли як нер»). Цей узгоджений з геометрією потоку конджерело сперматозоїдів використовується поточтейнер може мати будь-яку або всі з таких харакний цитометр чи інший пристрій для розділення. теристик: відносно широкий отвір, отвір еліптичної Іншим потенційно спорідненим аспектом, що може форми, меншу величину співвідношення висоти до бути унікальним для такого класу клітин, як сперширини, ніж це використовується в даний час, наматозоїди, є той факт, що їх ДНК є нездатним до вскісну чи іншим чином визначену форму, так щоб відновлення, реплікації та транскрипції. Будь-який вона могла мати бокові стінки, що розташовані з цих факторів може відігравати певну роль, так паралельно падаючому потоку, і т.п. Може бути що вони можуть мати певне значення окремо чи у також бажаним передбачити елемент кріплення, поєднанні. Отже, може виявитись, що опис даного такий як рухомий елемент чи засіб, типу шарикопівинаходу стосується всіх гаметних клітин, або надшипників і т.п., для забезпечення змінної орієнтавіть вірусів і т.п., які є клітинами, нездатними до ції пробірки в залежності від форми падаючого відновлення, трансляції та транскрипції. потоку, який бажано зібрати. Крім того, фізичні Окремим аспектом обробки за допомогою похарактеристики класу контейнерів, таких як існуюточного цитометра, що також може бути важлича пробірка (яку названо тестовою пробіркою «тивим, є те, що обробка клітин після їх сортування пу Фалкона») можуть включати не лише ширину має проводитись належним чином як з хімічної, так пробірки, але також матеріал (такий як полістирол, і з фізичної точки зору. Як зображено на Фігурі 4, до якого клітини не прилипають), з якого вона коли клітини усередині краплин (8) потрапляють зроблена і т.п. (Ці можливі матеріали для тестових до збірника (14), може бути важливим, щоб конпробірок Фалкона на 14мл є добре відомими). Татейнер, який є збірником, мав належний розмір, ким чином, контейнер та його рідина для збирання так щоб він забезпечував певні засоби запобігання можуть також виконувати роль амортизуючого зіткненню між клітинами та самим контейнером. елемента для зведення до мінімуму фізичного Хоч був відомим прийом поміщення на дно конпошкодження клітин. За своїми розмірами він татейнера початкової рідини збірника (17) для збикож може сприяти збиранню достатньої кількості рання клітин таким чином, щоб вони не ударялись сперматозоїдів без суттєвого ефекту розрідження. у дно контейнера, виявляється, що для поліпшенІншим аспектом рідини збірника (17) може буня результату може бути використане просте збіти той факт, що вона також може бути використальшення ширини контейнера для урахування варіна для зменшення хімічних стресів клітин. В одноацій форми потоку, а також неминучого му відношенні, оскільки може бути важливим розбризкування внаслідок зіткнення клітин з конзабезпечення живильних речовин для клітин як тейнером. В одному відношенні це може виконуперед, так і після сортування, рідина збірника (17) вати функцію амортизуючого елемента, так щоб може бути обрана таким чином, щоб забезпечити забезпечити відповідне ставлення для клітин, які узгоджений рівень живильних речовин, щоб рівні можуть бути механічно неміцними, тобто можуть перед та після сортування були збалансованими. бути зруйновані чи пошкоджені зіткненням. Таким Було знайдено, що для бичачої сперми, в якій як чином, коли джерелом клітин цитометра для сорживильна речовина використовується цитрат з тування є клітини, які є фізично ніжними клітинами, двома відсотками яєчного жовтка, добрі результаможе бути важливим використання деякого типу ти забезпечує використання цитрату з рівнем яєчамортизуючого елемента, такого як широка пробіного жовтка шість відсотків (тобто цитратного розрка для збирання, для якої ширина отвору (18) чину з вмістом яєчного жовтка шість відсотків). Це дозволяє розмістити стінки контейнера таким чиє наслідком різниці об'ємів перед та після сортуном, щоб уникнути контакту з клітинами. Отже, вання. Рідина збірника може починати (перед сорбокові стінки пробірки розташовані не настільки туванням) з об'єму приблизно 2мл. В результаті близько, щоб існувала будь-яка значна вірогідність сортування може бути доданий приблизно подвійконтакту між клітинами, які піддано сортуванню, та ний об'єм (кінцевий об'єм в три рази перевищує стінками пробірки. У цьому способі може бути бапочатковий) при дуже низькому рівні цитрату з жаним, на додаток до рідини збірника (17), викорияєчним жовтком у розчині (внаслідок злипання та з стовувати широку пробірку для збирання матеріаурахуванням інших особливостей поточного цитолу. Можливо, достатньо буде самого лише метра). Таким чином, кінцевий результат за показвикористання широкого отвору контейнера, який є никами кількісного рівня наявного цитрату з яєччастиною збірника (14). Для варіантів використанним жовтком може бути еквівалентним вихідним ня, які застосовують високу швидкість сортування даним, тобто вмісту яєчного жовтка в цитратному сперматозоїдів, було знайдено, що достатнім вварозчині в два відсотки завдяки використаним об'жається використання контейнера, який має внутємам рідини. Таким чином, рідина збірника (17) рішній діаметр отвору принаймні 15мм. Зокрема, може бути обрана таким чином, щоб створити кінбуло знайдено, що фізичні пошкодження клітин, цеве рідке середовище збірника, яке є збалансопов'язані зі збірником (14), були мінімальними при ваним з вихідним рівнем живильної речовини чи 19 77641 20 іншим рідким середовищем. У цей спосіб, вона 2. Α-фракція (безгліцеринова фракція) може бути використана для того, щоб скоротити а. Поміщають 800мл 2,9% розчину цитрату начас дії на клітини композиції із зміненим рівнем трію до градуйованого циліндра на 1000мл. компонентів. Звісно, ці рідкі середовища можуть б. Рівні антибіотиків в безгліцериновій фракції використовува тись в поточному цитометрі або (А-фракції розріджувача) можуть бути такими: можуть існувати в будь-який інший час у минулоI. Тілозин = 100мкг/мл му, а важливим є просто зведення до мінімуму II. Гентаміцин = 500мг/мл стресу, якого зазнають клітини в будь-який період III. Лінко-спектин = 300/600мкг/мл їх життєвого циклу. Крім того, оскільки вихідний в. Додають 200мл свіжого яєчного жовтка, як вміст хімічної речовини може змінюватись (наприописано нижче (Розділ Г). клад, вміст яєчного жовтка у відсотках в цитраті І. Дуже ретельно перемішують. може бути змінений в більший чи меншій бік), то і г. В результаті цього одержують Α-фракцію початковий склад рідкого середовища для збиранрозріджувача на основі 2,9% цитрату натрію з 20% ня чи різні об'єми також можуть бути змінені таким яєчного жовтка та концентрацією антибіотиків, що чином, щоб кінцевий результат був таким самим. напевно є нетоксичною для бичачої сперми. Таким чином, перед початком процесу сортування д. Розріджувач може зберігатись протягом ночі є рідина для збирання з шістьма відсотками яєчнопри 5°С.го жовтка в цитратному розчині, а після закінчення e. Наступного дня декантують надосадну рідисортування рідина для збирання - зі статьну (вер хні 800мл). специфічною спермою - може мати вміст яєчного є. Наступного дня перед використанням підіжовтка в цитратному розчині, який дорівнює двом грівають до 37°С. відсоткам, аналогічно до початкового вмісту живиГ. Для додання яєчного жовтка до буферизольних речовин. ваного розчину добре спрацьовує така процедура. Зверніть увагу на те, що при подальшому ви1. Промивають та очищають яйця (дивись Б користанні ці сперматозоїди можуть бути обробвище). лені цитратною рідиною з вмістом яєчного жовтка 2. Розкривають яйце і відокремлюють жовток до 20% з інших причин, але вважається, що ці змівід альбуміну за допомогою сепаратора для жони не створюють стресу для клітин, оскільки вони є втка. лише відомою частиною загального процесу осіЗа іншим варіантом, переливають жовток впеменіння. Хоч, звісно, рівні можуть змінюватись, ред-назад між двома половинками шкаралупи. Не фа хівці в цій області легко зрозуміють, що цитратпошкоджуйте мембрану навколо жовтка. ний буфер з 20% яєчного жовтка може мати такий 3. Поміщають жовток на стерильний шмат фісклад: льтрувального паперу розміром 15см. I. Кінцева композиція: 4. Тримають фільтрувальний папір над граду80% розчину цитрату натрію (72мМ) йованим циліндром з буфером і розчавлюють жов20% (об./об.) яєчного жовтка ток (розриваючи мембрану), даючи жовтку стекти з II. Рецептура на 1 літр: фільтрувального паперу до циліндру. Типово з А. Розчин цитрату натрію одного яйця може бути одержано приблизно 121. Поміщають 29,0г дигідрату цитрату натрію 15мл жовтка. (Na3C6H5O7·2H2O) до мірної колби на 1000мл Іншим аспектом, який може відігравати роль у 2. Додають деіонізовану воду чи воду, одеррізних факторах даного винаходу, є той, що стосужану на установці Nanopure, до кінцевого об'єму ється використання для штучного осіменіння і т.п. 1000мл. низьких доз сперми. Додатковий опис відомого 3. Переносять до склянок та автоклавують при рівня техніки з штучного осіменіння з контролем тиску 15 фунтів сили (118°С (245°F)) протягом статі може бути знайдений у [книзі Rupert P. принаймні 30 хвилин Amman and George E. Seidel, Jr., «Prospects for а. Автоклавують розчин за умов, які забезпеSorting Mammalian Sperm», Collorado Associated чують знижене випаровування (вільно прилягаюча University Press (1982), яку включено сюди за покришка) силанням]. Як згадувалось, при природному осіб. Стежать за тим, щоб вода не википіла. менінні використовується кількість сперми, яка 4. Повільно охолоджують до кімнатної темпемістить порядку мільярдів сперматозоїдів. Типове ратури. штучне осіменіння зараз здійснюється з викорис5. Зберігають закритою в холодній кімнаті при танням мільйонів сперматозоїдів для тварин роду 5°С. бичачих та сотень мільйонів сперматозоїдів для Б. Приготування яйця тварин роду коней. Термін «низька доза» позна1. Одержують свіжі курячі яйця з надійного кочає, що доза сперми, використаної для проведенмерційного джерела. ня осіменіння, становить менш ніж половину, або, 2. Відмивають яйця від бруду (не використокраще, навіть менш ніж приблизно 10% від типової вуючи забагато миючого засобу) та споліскують. кількості сперматозоїдів, що типово використову3. Занурюють яйця до 70% етанолу на 2-5 ється для проведення штучного осіменіння. Отже, хвилин. термін «низька доза» слід розглядати в контексті 4. Дістають яйця і залишають сохнути (або витипових доз для штучного осіменіння або як абсотирають насухо) і складають на чистий рушник. лютну кількість. Для бичачої сперми, де зараз виВ. Приготування розріджувача користовується від 1 до 10 мільйонів сперматозої1. Використовують стерильний, чистий склядів, процес може вважатись таким з низькою ний посуд. дозою при абсолютній кількості в приблизно 21 77641 22 500000 сперматозоїдів, або навіть 300000 спермації розріджувача для створення відповідного житозоїдів чи менше. Фактично, завдяки використанвильного середовища. Для бичачого матеріалу це ню методів даного винаходу, штучне осіменіння з може включати додання приблизно 20% яєчного добрими відсотковими показниками запліднюванжовтка до цитратного розчину негайно після забаня було проведене при кількості сперматозоїдів рвлення. Крім того, було знайдено, що при забарпри осіменінні, що становила 100000 та 250000 влюванні сперматозоїдів можна очікувати досягсперматозоїдів (відповідні показники запліднюваннення кращих у певному ступеню результатів при ня 41% та 50%), як описано у [статті «Uterine Horn використанні більших кількостей барвника. Ці виInsemination of Heifers With Very Low Numbers of сокі концентрації при забарвлюванні можуть вклюNon-frozen and Sexed Spermatozoa», опублікованій чати використання барвника з концентрацією в в 48, Theriogenology, 1255 (1997), яку включено десятки мкМ (мікромоль), так як описано нижче у сюди за посиланням]. Оскільки сперматозоїди, прикладах, де було використано барвник Hoechst виявляється, проявляють чутливість до розрі33342 з концентрацією 38мкМ. дження, ці результати можуть відображати особПісля додання барвника може бути використаливу взаємозалежність використання вибірок маний інкубаційний період, такий як інкубування протеріалу з низькими дозами сперматозоїдів з тягом однієї години при 34°С для прискорення різними методиками за даним винаходом. Абсопоглинання барвника при концентрації приблизно лютні величини можуть бути залежними від виду 100 мільйонів сперматозоїдів на мл. Після цього тварини. Для тварин роду коней процесом з низьможе бути проведена фільтрація для видалення кою дозою може вважатись процес з менш ніж згустків сперматозоїдів, а потім може бути провеприблизно двадцятьма п'ятьма, десятьма, п'ятьма, дено розріджування чи розведення для одержання або навіть одним мільйоном сперматозоїдів. бажаної концентрації в приблизно 100 мільйонів Іншим аспектом, який може бути важливим, є сперматозоїдів на мл. Після цього може бути протой факт, що в системі штучного осіменіння виковедене сортування згідно з різними методиками, ристовується сперма, розділена методами даного описаними раніше, при якому сперматозоїди збивинаходу за статевими ознаками, або навпаки. рають у фазі збірника. Як згадувалось раніше, в Отже, коли, для методики з використанням поточрезультаті збирання можуть бути одержані вибірки ного цитометра, використовується збірник (14) для матеріалу з концентрацією яєчного жовтка в цитзбирання сперми для штучного осіменіння, метораті приблизно 2% (для бичачого матеріалу). Подики даного винаходу можуть бути особливо дотім зразок може бути сконцентрований до приблиречними. Крім того, можливо, що комбінація викозно 3-5 мільйонів сперматозоїдів на мл шляхом ристання штучного осіменіння та його проведення використання центрифугування, після якого рідина з низькою дозою може створити синергічні ефекти, оболонки та консервувальна рідина можуть бути які роблять різні методики даного винаходу особвидалені. Після цього може бути проведене кінцеливо доречними. Звісно, розділена за статевими ве розріджування з використанням цитрату з 20% ознаками сперма може бути використана не лише яєчного жовтка або розріджувача Cornell Universal в режимі штучного осіменіння, але й іншими споExtender і т.п. Розріджувач Cornell Universal собами, такими як запліднювання in vitro і т.п. Extender може мати таку рецептуру на 1000мл: Процес збирання, сортування, і згодом осіме14,5г дигідрату цитрату натрію ніння тварини з використанням поточної цитомет2,1г NaHCO3 рії, або іншої методики розділення, включає різні 0,4г КСІ стадії. В контексті осіменіння корів, спочатку зби3,0г глюкози рають сім'я бика за допомогою штучної вагіни. При 9,37г гліцину цьому рівні становлять приблизно 1,5 мільярдів 0,87г лимонної кислоти сперматозоїдів на мл. Це нерозріджене сім'я можДля композиції з 20% яєчного жовтка може буна перевірити за допомогою спектрофотометра ти використано 800 мл вказаного вище препарату для оцінки концентрації і можна проаналізувати та приблизно 200мл яєчного жовтка. мікроскопічно для визначення відповідності станПісля цього останнього розріджування може дартам рухомості та життєздатності. Після цього бути одержана концентрація від 3 до 5 мільйонів можуть бути додані антибіотики. В результаті вихісперматозоїдів на мл (для бичачого матеріалу). дний зразок може мати приблизно від 60 до 70 Цей зразок може бути охолоджений для уповільвідсотків послідовно рухомих сперматозоїдів в нення метаболізму сперматозоїдів та забезпеченеякуляті. Для проведення обробки може бути виня можливості використання протягом довших користане розрідження за допомогою якогось типу періодів часу. У коней вибірка матеріалу може TALP (тірод альбумін лактат піруват) для довебути потім використана з використанням яйцепродення кількості сперматозоїдів до придатного (для відного чи інших способів осіменіння, як добре поточного аналізу) рівня в приблизно 100 мільйозрозуміло фахівцям в цій області. Для бичачої нів на мл. TALP не лише підживлює сперматозоїсперми вибірка матеріалу може бути розведена ди, але й підвищує їх активність на стадії забарвще раз до бажаного рівня дозування. Було знайлення. Перед забарвленням для деяких видів дено, що розрідження може вплинути на життєтварин, таких як коні, може бути проведене здатність сперми, і тому може бути зручно уникати центрифугування. Забарвлення здійснюють за надто високого рівня розрідження шляхом викорипротоколом багатократного чи однократного забастання меншої вибірки матеріалу. На даний час, рвлювання, причому останній є об'єктом патенту незалежно від використаної методики розділення, Johnson та споріднених технологій. Забарвлюванможуть бути досягнуті низькі дози в 300000 сперня може бути здійснено при одночасній модифікаматозоїдів на 0,184мл. Крім того, може бути бажа 23 77641 24 ним підтримувати вміст сім'яної плазми на рівні Наприклад, у дванадцяти метизованих телиць приблизно п'яти відсотків, хоч результати дотриабердин-ангуської породи викликали суперовулямання цієї вимоги на даний час є невизначеними. цію з використанням стандартних методик: з інПотім зразок сперматозоїдів може бути поміщений тервалами в півдня вводили внутрішньом'язово 6, до соломини, призначеної для використання при 6, 4, 4, 2, 2, 2 та 2мг FSH, починаючи між 9 та 12 штучному осіменінні і може бути доставлений до днями циклу тічки; з 6-ю та 7-ю ін'єкціями FSH внукорів чи телиць, яких треба осіменити. трішньом'язовою ін'єкцією вводили 25 та 12,5мг Для забезпечення зручного графіку штучного простагландину F-2 альфа. Сперму від биків з неосіменіння тічка у корів чи телиць може бути синвідомою здатністю до запліднення забарвлювали хронізована з використанням відомих методів, Hoechst 33342, а потім сортували за допомогою поточного цитометра/приладу для сортування клітаких як застосування простагландину F2a згідно з відомими в техніці методами. Остання речовина тин MoFlo Ò , одержуючи 700-800 живих сперматоможе бути особливо цінною, оскільки було повідзоїдів кожної статі/сек. Середня чистота сортуваномлено про те, що вона потенційно забезпечує ня становила 89% бажаної статі. Сортовану підвищення здатності телиць до зачаття, як описперму концентрували до 3,36x106 сперматозоїдів/мл центрифугуванням при 650д протягом 10 сано у [статті «Prostaglandin F2a - A Fertility Drug in хвилин, охолоджували до 5°С і зберігали протягом Dairy Cattle?», 18, Theriogenology, 245 (1982), яку 4год. Потім 184мкл поміщали до пластикових совключено сюди за посиланням]. Хоч останні реломинок на 0,25мл; половину кожної дози вводили зультати не підтримують це припущення, можлидля осіменіння до кожного рога матки протягом во, що даний винахід демонструє його особливу періоду з 20 до 24год. з початку тічки за допоможиттєздатність у випадку осіменіння низькими догою автоматичних капсул для перенесення ембрізами з контролем статі. Для тварин роду бичачих онів з бічним отвором. Ембріони збирали за станпісля цього може бути проведене штучне осімедартними нехірургічними методиками на 7 чи 16 ніння шляхом використання обладнання для передень після тічки. Були одержані аналогічні резульнесення ембріонів з введенням сперматозоїдів в тати для матеріалу, зібраного на 7 та 16 дні, та глибину рогів матки. Це може бути здійснено не в для сперми, сортованої за X- та Y-хромосомами. піковий момент, який зазвичай використовується Були одержані ембріони від 9 телиць. Було 52 емпри штучному осіменінні, а в дещо пізніший мобріони (середнє -4,3±5,3/донора) на нормальних мент часу, такий як через 12 годин після нього, стадіях розвитку, 13 із затримкою розвитку та 31 оскільки існує деяка вірогідність того, що запліднезапліднена яйцеклітина. Для 46 ембріонів була нення при штучному осіменінні з контролем статі визначена стать методом PCR з використанням може відбуватись трохи пізніше. Може бути викопраймерів на специфічну до Y-хромосоми ДНК ристане обладнання для перенесення ембріону, послідовності; з них 43 (93%) мали передбачувану оскільки може існувати висока чутливість стінки стать. Хоч ці дослідження охоплювали лише кільматки до такого осіменіння низькими дозами з конкох тварин, несподівано осіменіння телиць з супетролем статі. ровуляцією загальною кількістю в усього лише Крім того, ці методики можуть бути поєднані 600000 (живих) сортованих за статтю незамородля досягнення вищої ефективності продукування. жених сперматозоїдів дало результати, аналогічні Зокрема, будь-який з винайдених процесів, що до звичайних процедур. Можуть бути здійснені дозволяють проведення високошвидкісного сортуваріації описаної вище процедури, включаючи совання та осіменіння низькими дозами відібраних ртування іншими засобами, ніж поточна цитометза статевими ознаками ембріонів, може бути викорія, інші способи досягнення суперовуляції, інші ристаний у тварини з суперовуляцією. Суперовуспособи підвищення запліднюваності і т.п., але не ляція може бути досягнута шля хом використання обмежуючись ними. лікарського засобу для викликання суперовуляції Крім того, поєднання способів сортування спеабо будь-яким іншим методом. Лікарський препарматозоїдів за статтю на основі вмісту ДНК, висорат для викликання суперовуляції може діяти безкошвидкісних поточних цитометрів/приладів для посередньо чи опосередковано, наприклад, через сортування клітин та процедур осіменіння телиць з послідовність реакцій, з метою забезпечення підвикористанням загалом менш ніж 500000 спермавищеного порівняно з нормальним продукування тозоїдів без погіршення показників запліднюваносяйцеклітин. Комбінація з суперовуляцією є неспоті призвело до виникнення протягом кількох років діваною, оскільки раніше вважалось, що супероефективної промисловості сортованого за статтю вуляція перешкоджає такій комбінації. Транспорт сім'я. Для сперми, сортованою за статтю з точніссперми у тварин з суперовуляцією є ризикованим, тю >85% знайдеться множина варіантів застосутому штучне осіменіння тварин часто проводили вання. Можливо, найбільш очевидним є осіменіння за кілька разів та/або кількома дозами сім'я. Крім одного з стад худоби (як молочного, так і м'ясного) того, відомі процедури розділення сім'я за статедля відновлення жіночої частини стада, і осіменінвими ознаками були відносно повільними; тому ня іншого стада (молочного чи м'ясного) від зовсім було цікаво визначити показники запліднення пісінших типів биків для продукування самців на м'я ля однократного осіменіння худоби, що одержала со. Дуже важливим варіантом вищесказаного є лікарський засіб для індукування суперовуляції, осіменіння телиць сперматозоїдами, що несуть Хтакий як FSH (фолікулостимулюючий гормон), захромосому, для продукування телят жіночої статі, гальною кількістю в усього лише 600000 незамоякі мають значно нижчі показники дистоції, ніж рожених відібраних за статевими ознаками спертелята чоловічої статі, в першу чергу через меншій матозоїдів з використанням цих нових комбінацій розмір. Крім того, оцінка молодих плідників молочметодів. 25 77641 26 ного стада стане набагато ефективнішою з переданого винаходу. Що стосується експериментів, важанням телиць. Одержання більш ніж 85% теодин з них був проведений з використанням сорлиць дасть змогу керувати молочними коровами тованих за статтю незаморожених сперматозоїдів таким чином, щоб вони мали в середньому протяз високими показниками успіху таким чином: гом життя менш ніж два теляти, що виживають, що Приклад 1 є привабливим внаслідок зменшення проблем, Телиць абердин-ангуської породи у віці 13-14 асоційованих з вагітністю та пологами. Здійсненмісяців, середньої кондиції, синхронізували (узгозними стануть також системи одностатевого продуджували процеси у часі) за допомогою 25мг проскування яловичини, в яких кожна самка репродутагландину F-2 альфа з інтервалами в 12 днів і кує саму себе і забивається у віці від 2 до 3 років, осіменяли через 6-26год. після появи безперервзавдяки чому значно більший відсоток живильних ної тічки. Щойно зібране сім'я від трьох бичків у речовин в системі витрачатиметься на ріст, і менвіці 14-26 місяців інкубували з 39мкМ Hoechst шій відсоток - на підтримку. Сортоване за статтю 33342 при 75x106 сперматозоїдів/мл в середовищі сім'я буде корисним для запліднення in vitro та TALP протягом 1 години при 34°С. Сперматозоїди осіменіння корів, підданих суперовуляції для пересортували за статевими хромосомами на основі несення ембріонів. Часто одна із статей телят є епіфлуоресценції від лазерного збудження на 351 значно більш цінною, ніж інша, і хоч існують точні та 364нм при потужності 150мВт за допомогою методи добору ембріонів за статтю, вони потрепоточного цитометра/приладу для сортування клібують часу, і половина продукованих ембріонів тин MoFloÒ , який працював при тиску 345кПа належить до менш цінної статі, а тому передбача(50psi) з використанням як рідини оболонки 2,9% ється, що точно розділене за статевими ознаками цитрату Na. Сперматозоїди, що несуть Хсім'я стане широко використовуватись для штучхромосому (чистота ~90% за результатами переного осіменіння худоби, якщо надбавка за сортувірки шляхом повторного сортування озвучених вання за статтю буде невеликою, а погіршення аліквот сперми), збирали зі швидкістю ~500 живих показників запліднюваності буде мінімальним. сперматозоїдів/сек до пробірок Епендорфа на Ймовірно, суттєво зросте доля м'ясної худоби, що 2мл, які містили 100мкл розріджувача Cornell штучно осіменяється сортованим за статтю сім'ям. Universal Extender (CUE) з 20% яєчного жовтка. Цікаво, що при осіменінні у глибину рога матки Зібрані сперматозоїди центрифугували при 600хg можуть бути одержані кращі результати, ніж при протягом 10 хвилин і повторно суспендували в осіменінні в тіло матки, як це звичайно робиться CUE з концентрацією 1,63x106 живих сперматозоїпри осіменінні. Можливо, несподіваним є також те, дів/мл. Для контролю використовували рідке сім'я що досі досліджені зразки не виявили ніякої різнибез сортування за статтю; сперму, забарвлену ці між іпсі- та контралатеральним осіменінням при Hoechst 33342, розводили рідиною оболонки до проведенні їх у глибині рога матки. Під глибоким 9x105 сперматозоїдів/мл і центрифугували та послід розуміти, що введення здійснюють далеко вторно суспендували в CUE до 1,63х106 стійко усередину рога матки з використанням обладнанрухомих сперматозоїдів/мл. Сортоване за статтю ня для перенесення ембріонів. Той факт, що ресім'я та рідке контрольне сім'я охолоджували до зультати при проведенні іпсі- та контралатераль5°С протягом 75хв. і завантажували до соломинок ного осіменіння суттєво не відрізняються, дав на 0,25мл (0,184мкл/соломинку). Соломинки змогу авторам даного винаходу запропонувати транспортували в о холоджувачі для напоїв з регувикористання обох варіантів осіменіння, так що льованою температурою при 3-5°С на 240км для процес ідентифікації відповідного рога матки може осіменіння через 5-9 годин після сортування. Пробути далі непотрібним. водили осіменіння сортованим за статтю сім'ям та Бажаним результатом осіменіння є, звичайно, рідким контрольним сім'ям за допомогою синіх продукування тварини бажаної статі. Ця тварина капсул з боковим отвором (IMV), по половині вмісможе бути продукована з використанням описаних ту кожної соломини до кожного з рогів матки (3x105 вище систем з використанням вибірок матеріалу живих сперматозоїдів/телицю). Як стандартний сортованої за статтю сперми. Слід також розуміти, контроль, сім'я від тих самих бичків заморожували що методики за даним винаходом можуть знайти у соломинах на 0,5см 3 за стандартними методизастосування в інших методах, таких як лапаросками (у середньому 15,6x106 рухомих сперматозокопічне осіменіння, яйцепровідне осіменіння, або їдів/дозу після відтаювання), відтаювали при 35°С подібних методах. протягом 30сек та проводили осіменіння в тіло Як приклади, були проведені описані далі ексматки. Процедури розподіляли між 3 бичками та 2 перименти. Хоч не всі з них використовують всі запліднювачами у співвідношенні 3:2:2 запліднюаспекти описаних тут винаходів, вони показують вань для сортованого за статтю сім'я та двох контможливі завдяки різним аспектам винаходу поліпролів. Вагітність визначали ультразвуковими мешення експлуатаційних показників. Крім того, ститодами через 31-34 дні після осіменіння і слий опис деяких експериментів наведений в підтверджували через 64-67 днів, коли визначали [статті «Uterine Horn Insemination of Heifers With також стать плода (всліпу). Дані наведені в табVery Low Numbers of Non-frozen and Sexed лиці. Spermatozoa», яка згадувалась раніше]. Ця стаття узагальнює деякі дані, що показують ефективність 27 Обробка Сортоване за статтю сім'я Рідкий контроль Заморожений контроль 77641 28 Кількість заплідне- Кількість вагітних, Кількість вагітних, Без плодів жіночої них телиць Дні 31-34 дні 64-67 статі 45 28 29 Співвідношення статей для величин з різними індексами відрізняються (Р