Спосіб одержання антигену для діагностики дифтерії

ь 61 К 39/05 СПО СІБ О ДЕР ЖА ННЯ А НТИ ГЕ НУ ДЛ Я Д ІА ГНО СТ ИКИ Д ИФТ ЕР ІЇ Винахід відноситься до медицини, а саме, до мікробіології, зокрема, до одержання препаратів для визначення стану антиди фтерійного імунітету. Незважаючи на спад епідемії дифтерії який спостерігається в , 1997 - 1998 роках, проблема цієї інфекції запишається актуальною в зв'язку з широко розповсюдженим носійством збудника що стримує , подолання інфекційного процесу При цьому важливого значення набу . ває слідкування за станом антидифтерійного імунітету населення і носійства. На даному етапі в практичних лабораторіях викор истовується в основному РИГА з діагностикумами / єритроцитарними та лактесовими / - носіями антитоксина, які дають можливість визначити наявність в сироватці крові антитоксичних антитіл / Фаворова та інші, 1988 /. Однак ці препарати не забезпечують визначення імунітету до компонентів клітини який характеризує , стійкість до зараження дифтерією /Фаворова та інші,1988 / і здатність до завершеного фагоцитозу збудника / Горисюк 1974 /. Використання антидифтерійних діагностичних препаратів доцільне та кой при псшуці доноріЕ які мають природний захисний титр антидиф , терійних антитіл,сироватка яких мо*е бути використана для лікування хвсрих на дифтерію і одержання антидифтерійного імуноглобуліну . Бикладене стало передумовою розробки способу виділення сомат ичного антигена для одержання антибактеріального антидифтерійного еритроцитарного діагностикума для визначення антидифтерійних ант ибактеріальних антитіл в сироватці крові. На даному етапі різними авторами запропоновано численні методи виділення соматичних антигенів С diphtherias. Із них для одержання сенситинів для діагностикумів рекомендовані слідуючі : — О _ екстракція висушеної біомаси 0,85£ розчином хлористого натрію /Филипова Л.И., 1972, Шмелева, Биргер, 1971/, х лороформно - сольо ва екстракція /Костюкова , 1971/, механічне струшення з скляними бусами на холоду /Каральник, 1976/, обробка детергентами /Гренкова, 1972/. Загальним недоліком перелічених методів є можливість виділення із клітини корінебактерії дифтерії в основному поверхневого розташова них структур, які містять типові антигени і антигени які перехресно , реагують з іншими грампозитивними бактеріями В результаті титри ан . титіл., які визначаються даними діагностикумами не відображають іс, тиного стану антидифтеріиного імунітету /Каральник, 1976/. Найближчим прототипом запропонованого методу є метод Філіпової і інших, в якому рекомендується виділення препарату з високою гемо сенситивною активністю із клітини С diphtheriase методом сольової екстракції /Филипова Л.И., 1972/ Для цього бактерії, які вирощені на цільному середовищі, ретельно відмивали фізіологічним розчином висушували ацетоном та ефі , ром і екстрагували 0,85% NaCl при рН 7,0-7,8 з чергуванням заморожу ванням і відтанення Потім суміш центригували діалізували і висушу. , вали ліофільно Одержаний матеріал використовували як сенситин для виготовлення еритроцитарних діагностикумів . Недоліком даного методу є значна антигенна гетерогенність продукта/до 10 антигенів/ та великий зміст баластних речовин. В основу винаходу який пропонується, поставлено задачу , розробити спосіб одержання із клітинної маси дифтерійного мік роба гомо генн ого сома тичн ого анти гену для ви явле ння анти тіл . -зПоставлена задача вирішується, шляхом втлрощування дифтерійної культури на щільному живильному середовищі з подальшою відмивкою фізіологічним розчином, екстракцією активного начала 0,85$ 0,5 0,8 8, 9 + 1, 7 51,9 + 16,0 27,0 0,58 + 0,30 70,5 10, 2 + 1, 9 62,6 + 18,0 62,5 0,60 + 0,19 70,5 2,0 9 , 4 + 2,1 х - середня арифметична; 49,0 + 14,0 0,52 + 0,17 5зГ- середнє квадратичне відхилення : 98,0 ьДля визначення оптимального рН екстракції клітинного антигена використовували екстрагенти з різнім значенням рН» Діапазон рН ство I рювала за рахунок внесення в 0 , 5 ? розчин E^TA-J^U невеликих кількостей сухого трісоксиметлламінометану /трлсу/ до досягнення необхідного рН. Дану процедуру здійснювали під контролем рН-метру на магнітній мішалці. Одержані таким чином екстрагенти з різним значенням рН використовувала для одержання антлгену. Після проведення екстракці. та діалізу одержані прл різних значеннях рН препарати порівнювали за такими показниками: вихід продукта /за сухОіО вагою /, вигляд препарата, стійкість при зберіганні в холодильнику /табл. і* / ТаоллцяЗ Вихід антигена при різних $Н екстракції, вигляд розчину та стійкість при зберіганні рН екстрагента Вихід продукта, мг з І г клітин 7, 3 15,2 7,5 7,8 8*0 8,1 16,4 20,9 21,7 22, 5 8,3 24,С ЭЙ 7 Вигляд проду к? а ковтувата прозора рідича прозора з опалесц. жовта рід-ша з значною опалесценцією мутна непрозора рідина Стійкість при зберіганні в холодильнику стійклЛ 2-3 тижня тенденція до випадення ъ осад яскраво виражена тенденція до випадення в осад Як видно із таблЛ , оптимальним в даному випадку є рН в діапазоні 7 ,8 - Р , І . При цих значеннях рН досягається середній кількісний вихід продукта / 2, С - 2,25 % І і одержаним препарат харак ТерЛЗуЄГЬСЯ ПрОЗОрІСТКЗ Та СТІЙКІСТЮ При ЗберЄ^8ННІ. ПрЛ бІЛЬШ високих зн ачення х рН, яоча і підв ищується кількісній в лхід продукта, одержуються непрозорі зразка з тенденцією до влпаду в осад. Параметри центрифугування одержаного продукта визначали слідую чим чином: для відділення піску, клітин та клітинних уламків викорис товували центрифугування при З, б, 8 тис.0 • Центрифугування при З тле. не забезпечує осадження всіх твердих субстанцій, ^к правило, одержується надосадова рідина значної мутностї. Центрифугування при 6 - 8 тле. о забезпечує освітлення надосадової р.ідлш, але при змлві її частина легкого осаду змучується і потрапляє до освітленої частини. В зв"язку з викладенім більш раціонально перше центрифугува ння здійсните при 6 тле.й , а потім одержану рідку #азу відцентригугувати ще раз прл 18 тле, й ЗС хв, що забезпечує вої рі длнл , з вільнен ої від кліти н та ї х уламкі в. одержання надосадо f СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ КЛІТИННОГО АНТИГЕНУ С. diphthriae Мікробну масу С. diphtheriae, одержану як відхід виробництва дифтерійного анатоксину у вигляді білої пасти заливають етиловим , , спиртом і ресуспендують. Для знезараження культури досить 2 - 3 об'ємів спирту. Суспензію витримують 24 години при кімнатній температурі. Кдітини відділяють від спиртової фази центрифугуван ням на протязі ЗО хв при 600 0g в пластмас ових центри фужних склянках з відомою вагою Етанол зливають, а склянки з знезараженим . осадом дифтерійних клітин зважують на технічних терезах після , чого визначають сиру вагу осаду в етанолі . Осад промивають фізіологічним розчином і розтирають в охолодженому 0,3 - 0,8% розчині ЕДГА - Na2 з рН 7,8 - 8,1 з кварцевим піском. Кількість мл розчину ЕДТА беруть з розрахунку 2 - 3 мл на 1 г сирої ваги клітин Квар. цевий ПІСОК і розчин екстрагенту добавляють поступово клітини , розтирають до білої липкої маси на льодовій бані. Розтерту білу масу поміпрють в побутовий холодильник на 17 - 18 годин. Далі масу центрифугують при 6000g, ЗО хв, осад відкидають, центрифугат центрифугують при 18000g. Одержаний екстрат діалізують 48 годин проти надлишку дистильованої води з частою зміною діалізаційних вод . Ph дистильованої води установлюють рівним 8,0 добавкою невеликої кількості 10н NaOH. Діалізований екстрат згущають ПЕГом з м.м." 15 - 20 тис., або сефадексом g 200 superfine до об'єму чисельно рівного потрійній кількості грам сирої ваги клітин взятих в , роботу.. Одержаний матеріал контролюють за складом та преципітаці йною активністю проти антидифтерійної сироватки. Антиген зберігають в холодильнику в замороженому вигляді . В раз і появи осаду п і длужнюютьNaOH. Антиген використовують як сенситин при виготовленні дифтерійного диагностикума за методом Stawzki /цит. за Каральник Б. В. ,1976/. Активність диагностикума оцінювали в РИГА проти антитоксичної і аглютинуточо антидифтерійЇ йних сироваток а також проти дифтерійного антитоксина . Приклад N 1 13 г, знезараженої мікробної маси С . dіphtherіае,одержаної як вихід виробництва анатоксину,промили одноразово фізіолог ічним розчином і перенесли в охолоджену ступку охолодженим0,3£ розчином ЕДТА - Na2 / 15 шь/. Стерильний кварцевий пісок добавили до робочої в'язкості і проводили розтирання на льодовій бані до утворення білої липкої маси. Решту роачину ЕДТА - Na2 / 17 мл /і кварцевий пісок добавляли по мірі розтирання . Розтерту масу разом зі ступкою поміпрли в холодильник на 16 годин. Наступного дня розтерту масу добре перемішали скляною паличкою , дали відстоятися / 2 0 - 3 0 хв. /.Рідку фазу перенесли в центрифужні пластмасові склянки. Пісок промили невеликою КІЛЬКІСТЮ фізіологічного розчину, промивні води об'єднали з рідкою фазою і ценрифугували ЗО хвилин при 6GQQg э охолодженням . Центрифугат злили і центрифугували пов торно при IBOOQg з охолодженням . Одержану жовту опалесцюючу рідину діалізували 48 годин проти надлишку дистильованої води, рК якої встановлювали рівним 7,8 Юн NaOH. Діалізований матеріал згустили до об'єму 39 мл зануренням в нього целафанових мішечків з сефадексом g 200 superfine на холоду. Характеристика препарату: 1 ЛІНІЯ преципітації з антитоксичною сироватк ою, суха вага 15,4 мг/мл; білок за біуретовою рекцією 8,2 мг/мл; вуглеводи 1,72 мг/мл; ліпіди 0,09 мг/мл. Препарат використано для виготовлення еритроцитарного діагностикума за методом Statfitzki/ / при навантаженні антигена 1,5 мг/мл /.Одержаний діагностикум було використано для визначення тит рі в а нт ит іл у а глю ти ну юч ій ди фт ер ійн ій не ад со рб ов ан ій сороватці та дифтерійному антитоксині . Для порівняння було взято -їйтакож діагностикум з сенситином,виготовленим по прописам прототипу / табл 3 /. Таблиця З Титри антитіл , виявлені діагностикумами з сенситинами , одержаними запропонованим методом та методом - прототипом Сироватки Титри антитіл з діагностикумами - носіями ЕДГА - антигену антигену - прототипу Дифтерійний анти ТОКСИН 1 : 64 1 ; 64 рбована дифтерійна сироватка 1 : 64 1 : 32 Донорська сироватка сумарна і: 8 1:2 Аглютинуюча неадсо Як видно is приведених даних, діагнос тикум - носій ЕДГА антигена має в 2 - 4 рази більшу чутливість, ніж прототип у РПГА з аглютинуючою і з донорською сироватками , шр вказує на його перевагу перед прототипом. Приклад N 2 25 г знезараженої мікробної маси С diphtherias, одержаної як . відход виробництва дифтерійного анатоксина, промили одноразово фізіологічним розчином і перенесли в ступку, поміщену в льодову баню, охолодженим 0,5%" ЕДТА - Na2 / 27 мл /. Решта операцій були проведені як і в прикладі N 1,об'єм одержаного матеріалу після . -Hдіалізу і згущення дорівнював 70 мл. В реакції преципітації утворював 1 лінію. Хімічна характеристика : суха вага 10,8 мг/мл; J білок за біуретовою реакцією - 8,3 мг/мл; вуглеводи 0,440 мг/мл; ЛІП ІД И - 0,10 5 м г/мл. Препарат використано для виготовлення діагностику му за методом StaWitzki. Чутливість одержаного діагностикума контролювали в РПГА проти дифтерійного антитоксина та лікувальної дифтерійної антисироватки виробництва Ставропольського заводу біологічних пр епаратів в порівнянні з діагностикумом - прототипом / Табл 4 /. Таблиця 4 Чутливість діагностикума - носія ЕДТА - антигену в РПГА в порівнянні з прототипом Сироватки Титри антитіл Діагностикуми - носії ЕДТА - антигену антигена - прототипу Дифтерійний антитоксин 1 : 64 1 : 64 1 : 64 1 : 32 Антидифтерійна лікувальна сиро ватка Як в идн о і з п рив еде них в таб лиц і 4 да них, д іаг нос тик ум носій ЕДТА - антигена виявися в 2 рази більш чутливим в реакції РПГА з антидифтерійною лікувальною сироваткою ніж прототип. , - і f Приклад N 3 18 г знезараженої мікробної маси С. diphtheriae, одержаної як ВІДХОДИ виробництва дифтерійного анатоксину, промили одноразово фізіологічним розчином,перенесли в охолоджену ступку на льодовій бані охолодженим 0,8% водним розчином ЕДГА - Na2 pH 8,0. Далі обробку проводили як в попередніх прикладах . Об'єм матеріалу піся згущення дорівнював 57 мл. В реакції преципітації матеріал утворю вав одну ЛІНІЮ преципітації. Хімічні показники : суха вага 12,8 мг/мл; білок за біуретовою реакцією 8,55 мг/мл вуглеводи 0,620 мг/мл; ЛІПІДИ - 0,082 мг/мл. Препарат використано для виготовлення діагностикума за методом Stawytzki/ /,титри антитіл визначали в дифтерійній сироватці виробництва підприємства " Біолек " / 500 Lf / та в дифтерійній аглютинуючій неадсорбованій сироватці / таблиця 5 /. Таблиця 5 Титри антитіл, визначувані в РПГА за допомогою діагностикума носія ЕДГА - антигена в порівнянні з антигеном - прототипом Сироватки : : Титри антит іл Діагностикуми - носії : ЕДТА - антигена : антигена - прототипу Антидифтерійна кін ська сироватка 500 f1 Аглютинуюча неадсор бована дифтерійна сироватка 1 ; 64 1 ; 32 1 : 64 1 : 32 -isЯк видно із. приведених даних, діагностикум - носій ЕДТА виявився в 2 рази більш чутливим в РИГА, НІЖ прототип з антидифте рійною кінською та аглютинуючою неадсорбованою дифтерійною сирова ткою. Розроблений диагностикум було випробувано з метою визначення титрів антидифтерійних антитіл у сироватках донорів,одержаних э Харківської станції переливання крові / табл 6 / Таблиця 6 Титри антитіл,визначувані в сироватках донорів за допомогою діагностикума - носія ЕДГА - антигену в порівнянні з діагностикумом - прототипом Сироватки : Титри антитіл, визначувані діагностикумами - носіями ЕДГА - антигену Антигена - прототипу Донорські сироватки, вилучені 19 лютого 1996р. 1 1 ' 1 1 68 : 1 . 8 1 . 8 2 З 1 32 1 16 1 - 4 1 2 1 > 8 1 2 1 * 1 • 2 1 2 4 5• 6 7 ч н вияв 8 не вияв 10 1: 2 1 4 ; 2 1 11 2 1: 2 4 2 1:2' не вияв 2 не вияв 2 2 не вияв не вияв 8 не вияв 9 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 23 29 ЗО : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 8 1 : 8 1 : 16 1 : 8 1 : не 1 : 1 вия в 2 4 : 1: 4 1: 2 41:4 не вияв не вияв не вияв не вияв не вияв не вияв не вияв не вияв 1 2 : не вияв В 33 34 :: 4 1 35 1:2 32 1:2 1 :21: 1 2 : ВИЯ не не вия 4 1 :в 1 4 : 8 1 31 не вияв не вияв не вияв не вияв 1:2 не вияв не вияв Донорські сироват ки,вилучені 11 Се резня 1938року 1 2 1: 8 1; 4 1 .8 1 2 З 1і 8 1 4 4 1: 2 ^ 2 5 1: 2 1 2 8 1: 8 7 1: 8 1 ї 8 9 1; 8 1: 4 10 1: 2 11 12 1: 8 1; 4 13 1: 4 1 14 1: 8 1 15 1: 4 1: 8 1: Z н е 1 18 аі4 19 і:8 20 і:4 21 і:4 22 і:8 23 і:8 24 і:8 25 1: 2 н вияв е 2 1 1 4 1 8 1 2 1 4 н ВИЯВ 16 17 1 ' 1 1 н е 1 . 1 a 4 4 2 ВИЯВ 8 2 2 4 вияв 2 н вияв е 2 1 26 27 28 ; 1 : 8 - . 29 30 31 32 1:2 1; 4 1 ; 4 , ,1:2 1:8 1:8 1:8 не вияв 1:4 не вияв Ч " 1 : 2 " 1:4 1:3 Забір сироваток проводився дворагово: 19 лютого 1996 року / період епідемії дифтерії / та 11 березня 1998 року / період відносного спаду епідемії /. Першого разу було взято сироватки 35 донорів - добровольців,другого - 32. Як видно із приведених даних, при першому заборі за допомогою діагностикума - носія ЕДТА - антигена антитіла було виявлено у 32 \в 35 донорів / 917* /. Діагностикум - носій антигену - прототипу засвідчив наявність антитіл у 13 донорів / 37% /. Титри антитіл, виявлені ЕДТА діагностикуюм, були в 2 - 4 рази вищими, ніж при використанні прототипа. В березні 1998 року було аасвідчено більш імунологічний прош арок у донорів - добровольців. ЕДТА - діагностикуюм виявлено наявність антитіл у всіх доноріЕ / ІООЯ /. При використанні діагностикуму - прототипу антитіла виявлено у 25 донорів / 78,1% /.Титри антитіл, виявлені ЕДТА -діагностикумом, були в 2 - 4 рази вищими,ніж при використанні діагностикуму - прототипу,шр є свідченням більшої ефективності запропонованого діагностикума . Таким чином представлені результати проведених досліджень свідчать про доцільність одержання сенситину запропонованим спос обом з метою використання його для виготовлення еритроцитарного діагностикума- носія соматичного антигену дифтерійного мікробу . СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1 Фаворова JL А., Астафьева R Б., Корженкова М. IL, Дифтерия 11; Медицина, 1988 - 208с. 2 Горисюк А. Ф., Изучение соматических антигенов дифтерийной палочки, полученних фенольним методом / Дисс. канд. мед. наук Харь ков, 1974. - 198с. 3 Филиппова Л. М., Мазурова И. К , Хзлчевй. В. Получение сомат ических антигенов дифтерийних бактерий для РПГА . / Тезиси доклад 3 Всесоюзного съезда епидемиологов М., 1972. с. 219 - 220. ., 4 Шэлева Е. А. , Биргер М. 0. Получение чистих препаратов кле точних стенок С. diphtherias и определение их антигенного состава // ЖШИ. / 1971. N 4. с. 73 78» 5 Костюкова Н. Е , Кадирова X Е ,Еэепчук Ю. В. Серологическое исследование соматического компонента , виделенного из С.diphtherias.// ШЗИ. 1970. N 4. с. 59 - 64, 6 Каральник Б. В., Эритроцитарние диагностикуми. - М.: Медицина, 1976 - с. 163. 7 Гренкова Е. IL , Биргер М. 0., Федосеева Т. М., Шмелева Е. А. Пол учение и иммунохимическое изучение антигенних фракций дифтерийних коринебактерий. Сообщ, IV. З&рактеристика екстрактов, полученних разними методами. // ЖЪШ. , 1972. N 11. с. 39 - 43.