Спосіб експрес-діагностики токсигенності збудника дифтерії

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням. Известен биологический способ определения токсигенности возбудителя дифтерии, основанный на изучении реакции организма морских свинок или кроликов на внутри кожное введение вирулентной культуры Corinebacterium diphtheriae. На 2 - 3 день после введения вирулентной культуры наблюдают воспалительный инфильтрат с последующим некрозом кожи. У животных, защищенных антитоксической сывороткой, указанные явления отсутствуют (Крылова М.Д. Ди фтерийная инфекция. - М., 1976). Недостатками указанного способа являются длительность его выполнения (не менее 4 суток), а также возможность получения ложных отрицательных результатов из-за гибели клеток C.diphtheriae в коже в результате фагоцитоза. Известен также способ-прототип определения токсигенности возбудителей дифтерии на чашках in vitro, в основе которого лежит взаимодействие между токсином и антитоксином, которое происходит в плотных питательных средах в места х оптимальных количественных соотношений токсина, продуцируемого коринебактериями, диффундирующего в агар, и антитоксина, содержащегося в антитоксической противодифтерийной сыворотке. В тех участках, где токсин встречается с антитоксином, выпадает преципитат в виде белых линий, "стрел" или "усов" (Методические рекомендации к Приказу №45 МЗ СССР от 02.04.86г.; Дифтерийная инфекция / Т.Г. Философова, П.С. Мо щич, М.Н. Мельник, С.А. Богатырева. - К., 1984). Определение токсигенности возбудителей дифтерии указанным методом производится следующим образом. 1. Забор материала от пациента производится сухим стерильным ватным тампоном раздельно со слизистой зева и миндалин и из носа. 2. Производится посев материала на одну из рекомендуемых питательных сред, например, на кровянотеллуритовый агар. 3. Через 24 часа производится учет результатов посева. При наличии подозрительных колоний проводится посев одной половины каждой колонии на чашку для определения токсигенности (см. операцию 4) и на среду Пизу (тест на цистиназу), а другой половины - на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры. Чашки с первичным посевом помещаются в термостат и выдерживаются еще сутки для дальнейшего выявления роста подозрительных колоний. 4. Для определения токсигенности на чашку со средой симметрично помещают 4 диска, пропитанных дифтерийным антитоксином. Посев испытуемых культур, и контрольных штаммов производится бляшками. Вокруг каждого диска засевается 5 бляшек диаметром 6 - 7мм на расстоянии от диска 6 - 7мм: 2 контрольные из токсигенного контрольного штамма 24 - 48 часового роста и 3 испытуемые. Чашки с посевами помещаются в термостат. 5. Учет результатов определения токсигенности производится через 24 часа. Культура считается токсигенной, если отчетливо видны белесоватые линии преципитации, сливающиеся под углом с линиями преципитации контрольных штаммов. Если все исследуемые культуры токсигенны, то сливающиеся линии преципитации образуют правильный пятиугольник. Культура считается нетоксигенной, если у испытуемой культуры отсутствуют линии преципитации при их наличии у контрольного штамма. Недостатками указанного способа являются: 1. Невысокая точность определения токсигенности, связанная с плохим ростом и недостаточно массивным засевом исследуемых штаммов, отклонений в составе питательных сред, подсыхания поверхности агара, применения поливалентных сывороток, обуславливающих образование ложных линий преципитации, появлением атипических штаммов (Турьянов М.Х. Особенности клиники и эпидемиологии дифтерии на современном этапе // Сов. медицина. -1991. - №1. - С.75 - 77; Шестакова И.В., Мазепа Ю.А. Случай тяжелого течения дифтерии // Врачебное дело. - 1994. - №1. - С.112 - 114). 2. Длительность определения токсигенности - до 48 и более часов от момента получения материала от пациента. В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа диагностики токсигенности возбудителя дифтерии, в котором за счет применения полимеразной цепной реакции возможно повышение точности и специфичности определения токсигенности, что позволит значительно сократить затраты времени и труда, устранить вредные факторы и повысить качество диагностики и терапии дифтерии. Поставленная задача решается тем, что в способе экспресс-диагностики токсигенности возбудителя дифтерии путем забора ротоглоточного смыва пациента, согласно изобретению, в пробу добавляют этиловый спирт с дальнейшим лизированием пробы, осаждением бактериальной ДНК и амплификацией фрагмента ДНК методом геноспецифической полимеразной цепной реакции с применением прямого и обратного праймеров и термостабильной ДНК-полимеразы Tth, после чего осуществляется электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле. Заявляемый способ экспресс-диагностики токсигенности возбудителя дифтерии основан на применении полимеразной цепной реакции с парой специфических праймеров, фланкирующих участок гена токсигенности C.diphtheriae длиной 260 пар нуклеотидов, что позволяет с большой точностью определить токсигенность возбудителя дифтерии при сокращении затрат времени и труда и устранить вредные факторы. Сущность изобретения заключается в следующем. Забор материала от пациента производится сухим стерильным ватным тампоном со слизистой зева и миндалин. Материал с тампона смывают стерильной водой в стерильную пробирку и добавляют этиловый спирт до концентрации 50%. Пробирки с материалом центрифугир уют в течение 15мин при 8000об/мин, после чего сливают супернатант, а осадок суспендируют в 200мкл стерильной воды. Производят щелочной лизис пробы, добавляя в пробирку 2,8мкл 16,5М раствора NaOH, после чего нейтрализуют раствор добавлением 40мкл 2М раствора трис-HCl pH = 8,0. После этого центрифугируют пробирки в течение 3мин при 8000об/мин, отбирают супернатант и производят депротеинизацию пробы добавлением равного объема фенола. Центрифугируют пробирку, отбирают верхнюю фазу и добавляют к ней равный объем хлороформа. Повторно центрифугируют пробирку, отбирают верхнюю фазу и осаждают выделенную ДНК двумя объемами холодного этилового спирта, после чего пробирку выдерживают при температуре +4 в течение 2 - х часов. ДНК осаждают центрифугированием в течение 30мин при 8000об/мин, растворяют осадок в 20мкл буфера ТЕ (трис-ЕДТА) и производят амплификацию с применением прямого и обратного олигонуклеотидов (праймеров), термостабильной полимеразы в течение 35 циклов. Продукты амплификации исследуют путем электрофореза в 1,8% агарозном геле. Наличие фрагмента ДНК длиной 260п.н. свидетельствует о наличии гена токсигенности в исследуемом штамме и позволяет сделать вывод о токсигенности данного возбудителя. Таким образом, за счет введения добавления к пробе этилового спирта мы определяем возможность безопасной работы с образцами, а за счет применения щелочного лизиса пробы, выделения и осаждения бактериальной ДНК с последующим применением амплификации (полимеразной цепной реакции) с парой специфических праймеров и электрофореза продуктов амплификации добиваемся большей быстроты точности и специфичности определения токсигенности. Результаты исследований по способу-прототипу и заявляемому способу занесены в табл.1 и 2 соответственно. Приводим пример конкретного выполнения способа. Больная К., 32 лет, поступила в ин ф. больницу с жалобами на общую слабость, высокую температуру, головокружение, боль в горле на 2 - й день заболевания. Состояние при поступлении тяжелое, отек и гиперемия слизистой ротоглотки, миндалины резко отечны, на них налеты серого цвета, снять которые не удалось. Отек шеи до 1 - й шейной складки. Учитывая клинику дифтерии, больной было введено 120тыс. ПДС, назначен курс дезинтоксикационной терапии. После проведенной терапии состояние больной значительно улучшилось. Результаты лабораторно-инструментальных исследований. ЭКГ - умеренные изменения миокарда, нарушения проводимости ножек пучка Гиса. РПГА - 1 : 40. Бактериологическое исследование мазков на токсигенность по способу-прототипу дало отрицательный результат. Параллельно с традиционными методами лабораторной диагностики у больной при поступлении был взят смыв из ротоглотки для проведения исследования методом ПЦР по заявляемому способу. Геноспецифическая ПЦРдиагностика дала положительный результат, в смыве был обнаружен токсический штамм C.diphtheriae. Учитывая клинику заболевания и результаты исследования, больной был поставлен клинический диагноз: токсическая дифтерия ротоглотки 1 степени.