Протираковий злитий протеїн

Реферат: (72) Винахідник(и): Пєчиколан Єжи Щепан (PL), Павлак Себастьян Домінік (PL), Жерек Бартломєй Мацєй (PL), Лемке Кжиштоф Казімєж (PL) (73) Власник(и): АДАМЕД СП. З О.О., Pieńków 149, PL-05-152 Czosnów k/Warszawy, Poland (PL) (74) Представник: Маслова Тетяна Михайлiвна, реєстр. №61 (56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою: DONG FENG ET AL: "Degradation of the proapoptotic proteins Bik, Puma, and Bim with Bcl-2 domain 3 homology in Chlamydia trachomatis-infected cells", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 73, no. 3, March 2005 (200503), pages 1861-1864 REED J C: "Proapoptotic multidomain Bcl2/Bax-family proteins: mechanisms, physiological roles, and therapeutic opportunities", CELL DEATH AND DIFFERENTIATION, vol. 13, no. 8, August 2006 (2006-08), pages 1378-1386 EP 0835305 B1, 23.11.2005 KRUYT ET AL: "TRAIL and cancer therapy", CANCER LETTERS, NEW YORK, NY, US, vol. 263, no. 1, 10 March 2008 (2008-03-10), pages 14-25 FULDA S ET AL: "Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer chemotherapy", ONCOGENE, vol. 25, no. 34, August 2006 (2006-08), pages 4798-4811 ZHANG H-Y ET AL: "Tumor-targeted delivery of biologically active TRAIL protein", CANCER GENE THERAPY, vol. 17, no. 5, May 2010 (2010-05), pages 334-343 ZHANG H M ET AL: "BNips: A group of proapoptotic proteins in the Bcl-2 family.", APOPTOSIS, vol. 8, no. 3, June 2003 (200306), pages 229-236 UA 111722 C2 (12) UA 111722 C2 Винахід належить до злитого протеїну, зокрема рекомбінантного, що включає домен (а), який є функціональним фрагментом послідовності розчинного протеїну hTRAIL, причому даний фрагмент починається амінокислотою в позиції не нижче, ніж hTRAIL95, або послідовності, яка має, принаймні, 70 % гомологію до названого вище, і домен (b), який є послідовністю проапоптотичного ефекторного пептиду, при цьому послідовність домену (b) приєднана в точці С-кінця і/або точці N-кінця домену (а). Злитий протеїн має протиракову активність. Розкрита фармацевтична композиція, що містить як активний інгредієнт злитий протеїн. UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід відноситься до області терапевтичних злитих протеїнів, зокрема, рекомбінантних злитих протеїнів. Більш конкретно, винахід відноситься до злитих протеїнів, що містять фрагмент послідовності розчинного людського TRAIL протеїну в поєднанні з послідовністю короткого проапоптотичного пептиду, до фармацевтичних композицій, що їх містять, до їх застосування в терапії, зокрема, в якості протиракових речовин, і до полінуклеотидних послідовностей, що кодують злиті протеїни, до векторів експресії, що містять полінуклеотидні послідовності, і до клітин-господарів, що містять зазначені вектори експресії. Апоптоз (запрограмована загибель клітини) являє собою процес, який відіграє важливу роль в запобіганні раку і в лікуванні ракового захворювання за допомогою речовин, які індукують апоптоз аномальних ракових клітин. Сигнал до апоптозу може бути ініційований ззовні клітини (зовнішній шлях або шлях рецептора загибелі) або зсередини клітини (внутрішній або мітохондріальний шлях). Активація зовнішніх шляхів апоптозу в ракових клітинах людини вимагає зв'язування ліганду рецепторами загибелі клітини, щоб активізувати рецептори. При зв'язуванні ліганду активовані рецептори індукують сигнали апоптозу. Ініціювання власного (внутрішнього) апоптозу всередині клітини по мітохондріальному шляху може бути розпочато на різних рівнях апоптотичного каскаду, щоб, нарешті, привести до індукування або відновлення функцій проапоптогенних протеїнів (цитохроми С, SmacDiablo, AIF, p53, сімейство Bcl2 протеїнів, включаючи сімейство домену BH3), деградації нуклеїнових кислот або активації каспаз. Протеїн TRAIL, що належить до сімейства цитокінів (ліганд, що спричинює апоптоз, який має відношення до фактору некрозу пухлини), також відомий як Apo2L (Apo2-ліганд), є потужним активатором апоптозу в пухлинних клітинах і в клітинах, інфікованих вірусами. TRAIL є лігандом, що природно виникає в організмі. Протеїн TRAIL, його амінокислотна послідовність, що кодує послідовності ДНК, і системи експресії протеїну, були вперше розкриті в EP0835305A1. Протеїн TRAIL проявляє свою протиракову активність, зв'язуючись з проапоптотичними поверхневими TRAIL рецепторами 1 і 2 (TRAIL-R1/R2) і забезпечуючи наступну активацію цих рецепторів. Дані рецептори, відомі також як DR4 і DR5 (рецептор загибелі 4 і рецептор загибелі 5), належать до сімейства рецептора TNF (фактора некрозу пухлини) і піддаються надекспресіі з боку різних типів ракових клітин. Активація цих рецепторів може індукувати зовнішній сигнальний шлях апоптозу, незалежно від гена-супресора р53, який активованою каспазою-8 призводить до активації виконавчих каспаз і тим самим - до деградації нуклеїнових кислот. Каспаза-8, вивільнена після активації TRAIL, може також спричинювати вивільнення Bid протеїну і тим самим - непряму активацію мітохондріального шляху, при цьому Bid протеїн, транслокований до мітохондрії, де він стимулює вивільнення цитохрому С, таким чином, опосередковано посилює апоптотичний сигнал від рецепторів загибелі . TRAIL вибірково впливає на пухлинні клітини, по суті, не спричинюючи апоптозу в здорових клітинах, які стійкі до цього протеїну. Таким чином, TRAIL, володіючий величезним потенціалом, був визнаний протираковим засобом, що впливає на широкий діапазон різних типів пухлинних клітин, в тому числі гематологічних злоякісних новоутворень і щільних пухлин, але, в той же час, не впливає на нормальні клітини і має відносно невеликі побічні ефекти . Протеїн TRAIL представляє собою протеїн мембранного типу II, що має довжину із 281 амінокислот, при цьому його позаклітинна область, що включає 114-281 амінокислотних залишків, після розщеплення протеазами утворює розчинну молекулу sTRAIL розміром 20 кДа, яка також є біологічно активною. Обидві форми TRAIL і sTRAIL здатні запустити механізм апоптозу через взаємодію з рецепторами TRAIL, присутніми на клітинах-мішенях. Сильна протипухлинна активність і дуже низька системна токсичність розчинної частини молекули TRAIL була продемонстрована із застосуванням тестування клітинних ліній. Крім того, клінічні дослідження людини на рекомбінантний людський розчинний TRAIL (rhTRAIL), що має амінокислотну послідовність, відповідну амінокислотам 114-281 з hTRAIL, відомий під назвою INN dulanermin (дуланермін), показали його хорошу переносимість та відсутність токсичності, що обмежує дозування. Останні дослідження показали, що протеїн TRAIL може мати форму коротшу, ніж амінокислоти 114 - 281, а також те, що в такій формі він здатний зв'язуватися з мембранними рецепторами сімейства DR (рецепторами загибелі клітини DR1, DR2, DcR1, DcR2 і OPG (Osteoprotegerin)) і індукувати апоптоз через ці рецептори [F., FANG, A., WANG, S., F., YANG, Antitumor activity of a novel recombinant mutant human tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand (Протипухлинна активність нового рекомбінантного мутантного людського апоптоз-індукуючого ліганду, що має відношення до фактору некрозу пухлини), Acta Pharmacologica Sinica 2005 Nov; 26 (11): 1373-1381]. 1 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дана інформація про токсичний вплив рекомбінаногого протеїну TRAIL на клітини печінки, ймовірно, пов'язана з наявністю модифікації, тобто маркувань полігістидину, немарковані TRAIL не демонструють системної токсичності Однак у ході подальших наукових досліджень і розробок, виявилося, що багато ракових клітин також демонструють первинну або придбану стійкість до TRAIL (див., наприклад, WO2007/022214). Хоча механізм стійкості відносно TRAIL до кінця не вивчений, вважається, що вона може проявлятися на різних рівнях TRAIL-індукованого шляху апоптозу, починаючи від рівня рецепторів на поверхні клітини до виконавчих каспаз в межах сигнального шляху. Така стійкість обмежує корисність застосування TRAIL в якості протиракового засобу. Крім того, в клінічних дослідженнях пацієнтів дійсна ефективність TRAIL в якості монотерапевтичного засобу виявилася низькою. Щоб подолати таку низьку ефективність і стійкість пухлин до TRAIL, були розроблені різні комбіновані лікувальні методики із застосуванням радіо-і хіміотерапевтичних засобів, у результаті яких досягався синергічний апоптотичний ефект. [WO2009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews (Про цитокіни, фактори росту) 14 (2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis (Неоплазії), Vol 3, No 6, 2001, 535 - 546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology (Клінічна онкологія), Vol 28, No 9 (2010), p. 1527-1533]. Використання rhTRAIL для лікування раку в поєднанні з вибраними звичайними хіміотерапевтичними препаратами (паклітаксель, карбоплатин) і моноклональними анти-VEGF антитілами описано в документі WO2009/140469. Тим не менш, таке поєднання обов'язково пов’язане з добре відомими недоліками, властивими традиційній хіміотерапії або променевій терапії. Сконструйований злитий протеїн, що містить послідовності вазостатину інгібітора ангіогенезу і TRAIL, зв'язаного з лінкером (компонувальником) сайту розщеплення металопротеази, був описаний у вигляді речовини, що демонструє апоптоз-індукуючий ефект в пухлинних клітинах, авторами AI Guo et al in Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology (в китайському журналі "Біохімія та молекулярна біологія") 2008, vol. 24 (10), 925-930. Сконструйований злитий протеїн, що містить послідовності тумстатину (Tumstatin183-230) інгібітора ангіогенезу і TRAIL114-281, був описаний у вигляді речовини, що демонструє індукцію апоптозу клітин раку підшлункової залози, авторами N.Ren et al in Academic Journal of Second Military Medical University ( в академічному журналі Другого військового медичного університету) 2008, vol. 28 (5), 676-478. Документ US2005/244370 і відповідна публікація WO2004/035794 розкривають конструкцію TRAIL95-281 в якості ефекторного домену, зв'язаного пептидним лінкером з позаклітинною частиною іншого члена CD40 лігандів сімейства TNF в якості клітинна поверхня – зв’язуючогодомену. Встановлено, що активація конструкції здійснюється через зв’язування її CD40 частини. Крім того, TRAIL терапія не була позбавлена проблеми, яка полягала в низькій стабільності TRAIL і його швидкому виведенні з організму після прийому. Незважаючи на те, що в даний час існує велика кількість клінічних методик лікування раку, вони часто недостатньо ефективні і мають безліч добре відомих недоліків, серед яких одними з найбільш неприємних і таких, що обмежують лікування, є відсутність вибірковості по відношенню до ракових клітин, серйозні побічні ефекти і резистентність, яка є первинною або набута під час лікування. В даний момент відома обмежена кількість протиракових засобів, які є ефективними і вибірковими відносно ракових клітин. Таким чином, залишається нагальною та актуальною потреба в нових протиракових препаратах, які дозволили б не тільки розширити спектр доступних засобів, але і знайти засоби, які є більш ефективними (цитотоксичними) і одночасно – вибірковими (селективними). Існує також потреба в нових селективних речовинах з підвищеною стабільністю і поліпшеною фармакокінетикою. Даний винахід пропонує рішення поставленої технічної задачі за допомогою нових злитих протеїнів, які містять домен, похідний від TRAIL, і короткий ефекторний пептидний домен, без фрагментів TRAIL, що мають власну (внутрішньоклітинну) або зовнішню (позаклітинну) проапоптотичну активність, яка посилює або доповнює дію TRAIL. Крім того, з'ясувалося, що у багатьох випадках злиті протеїни за даним винаходом демонструють більш високу активність, ніж розчинний TRAIL і його варіанти, в тому числі і фрагмент послідовності, а в багатьох випадках також долають резистентність до TRAIL. Крім того, додавання єфекторного пептиду призводить до більш тривалого періоду напіврозпаду і збільшення проміжку часу утримання протеїну в пухлині і, нарешті, до підвищення його ефективності. Опис ілюстрацій. Далі наводиться докладний опис винаходу з посиланнями на ілюстративний матеріал, де: На фіг. 1 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 1, 2, 3, 4, 5. 2 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На фіг. 2 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 6, 7, 8, 9, 10. На фіг. 3 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 11, 12, 13, 14, 15. На фіг. 4 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 16, 17, 18, 19, 20. На фіг. 5 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 21, 22 і 23, а також для порівняння - злитих протеїнів відповідно до прикладів 24, 25 і 26. На фіг. 6 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 27, 28, 29, 30 і 31. На фіг. 7 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 32, 33, 34, 35 і 36. На фіг. 8 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 37, 38, 39, 40 і 41. На фіг. 9 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 42, 43, 44, 45 і 46. На фіг. 10 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 47, 48, 49, 50 і 51. На фіг. 11 дано схематичне зображення структури злитих протеїнів за даним винаходом відповідно до прикладів 52, 53, 54, і 55. На фіг. 12 представлено зміну обсягу пухлини в часі у мишей SCID / NOD, хворих на рак товстої кишки Colo205, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом, в порівнянні з hTRAIL114-281. На фіг. 13 представлені значення показників уповільнення росту пухлини у мишей, хворих на рак товстої кишки Colo205, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом на 29-й день експерименту, у порівнянні з hTRAIL114-281. На фіг. 14 представлено зміну обсягу пухлини в часі у мишей Crl: SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на людський рак легені NCI-H460, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом, в порівнянні з hTRAIL114-281. На фіг. 15 представлено уповільнення росту пухлини у мишей, хворих на людський рак легені NCI-H460, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом на 29-й день експерименту, у порівнянні з hTRAIL114-281. На фіг. 16 представлено зміну об’єму пухлини в часі у мишей Crl: SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на людський дрібноклітинний рак легенів А549, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом, в порівнянні з hTRAIL114-281. На фіг. 17 представлено уповільнення росту пухлини у мишей, хворих на людський дрібноклітинний рак легенів А549, що отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом на 34-й день експерименту, у порівнянні з hTRAIL114-281. На фіг. 18 представлено зміну об’єму пухлини в часі у мишей Crl: SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на людську карциному підшлункової залози, що є подібною епітеліальній клітинній лінії PANC-1, які отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом, в порівнянні з hTRAIL114-281. На фіг. 19 представлено уповільнення росту пухлини у мишей, хворих на людську карциному підшлункової залози, що є подібною епітеліальній клітинній лінії PANC-1, які отримали лікування злитими протеїнами за даним винаходом на 43-й день експерименту, у порівнянні з hTRAIL114-281. На фіг. 20 показані спектри циркулярного (кругового) дихроїзму для злитих протеїнів за прикладами 1, 2, 14, 24, 51 і 42 та для rhTRAI114-281, експресованих у специфічній еліптичності. Детальний опис винаходу Винахід відноситься до злитого протеїну, що містить: домен (а), який є функціональним фрагментом послідовності розчинного протеїну hTRAIL, при цьому даний фрагмент починається амінокислотою в позиції не нижче, ніж hTRAIL95, і домен (b), який є послідовністю проапоптотичного ефекторного пептиду, який здійснює свою проапоптотичну дію через властивий йому внутрішній шлях апоптозу, при цьому послідовність домену (b) приєднана в точці C кінця і / або точці N кінця домену (а). Термін "функціональний розчинний фрагмент послідовності розчинного hTRAIL" слід розуміти як назву, що позначає будь-який такий фрагмент розчинного hTRAIL, який здатний індукувати апоптотичний сигнал. 3 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "пептид" в контексті даного винаходу слід розуміти як молекулу, сконструйовану з безлічі амінокислот, зв'язаних разом за допомогою пептидного зв'язку. Таким чином, термін "пептид" в контексті даного винаходу включає в себе поняття олігопептидів, поліпептидів і протеїнів. Слід розуміти, що домен (b) ефекторного пептиду в злитому протеїні за даним винаходом не є ні самим протеїном hTRAIL, ні частиною протеїну hTRAIL. У даному винаході амінокислотні послідовності пептидів будуть представлені звичайним способом, прийнятим у рівні техніки, в напрямку від точки N закінчення (N-кінця) пептиду в бік точки С його закінчення (C-кінця). Будь-яка послідовність, таким чином, має свою точку N закінчення з лівого боку і точку С закінчення з правого боку. Злитий протеїн за винаходом може містити один домен (b) ефекторного пептиду, приєднаний в точці С закінчення або в точці N закінчення домену (а). Злитий протеїн за винаходом може також містити два домени (b) ефекторного пептиду, в цьому випадку один з доменів (b) приєднаний в точці С закінчення домену (а), а інший приєднаний в точці N закінчення домену (а). Якщо злитий протеїн за винаходом містить два домени (b) ефекторного пептиду, зазначені домени можуть бути однаковими або відмінними один від одного. В даному випадку перевага віддається доменам (b), відмінним один від одного. В одному з конкретних прикладів здійснення винаходу домен (а) являє собою фрагмент послідовності hTRAIL, що починається амінокислотою з діапазону від hTRAIL114 до hTRAIL121, включно, і закінчується на амінокислоті hTRAIL 281 або інших функціональних фрагментах послідовності hTRAIL поміщеної (депонованої) в ГенБанк (GenBank) з реєстраційним номером P50591. Зокрема, домен (а) може бути вибраний з групи, що складається з послідовностей, відповідних hTRAIL114-281 (SEQ № 27), hTRAIL119-281 (SEQ № 28) та hTRAIL121-281 (SEQ № 29), hTRAIL116- 281 і hTRAIL120-281. В іншому прикладі здійснення домен (а) може бути послідовністю hTRAIL95-281. Проапоптотичний ефекторний пептид домену (b), який здійснює свою апоптотичну активність через внутрішній (притаманний йому) шлях апоптозу (внутрішньоклітинно), може індукувати апоптоз безпосередньо шляхом активації сигнальних каскадних компонентів мітохондріального шляху апоптозу, або за допомогою прямого індукування мітохондріального апоптозу в клітинах. В одному з прикладів здійснення злитого протеїну за даним винаходом ефекторним пептидом є пептид, який діє через внутрішній шлях апоптотозу, вибраний з групи, що складається з SEQ. No. 30, No. 31, SEQ. No. 32, SEQ. No. 33, SEQ. No. 34, SEQ. No. 35, SEQ. No. 36, SEQ. No. 37, SEQ. No. 38, SEQ. No. 39, No. 40, SEQ. No. 41, SEQ. No. 42, SEQ. No. 43, SEQ. No. 44, SEQ. No. 45, SEQ. No. 46, и SEQ. No 47, або SEQ. No. 151, SEQ. No. 152, SEQ. No. 153, SEQ. No. 154, SEQ. No. 155, SEQ. No. 156, SEQ. No. 157, SEQ. No. 158 SEQ. No. 159, SEQ. No. 160, No. 161, SEQ. No. 162, SEQ. No. 163, SEQ. No. 164, SEQ. No. 165 и SEQ. No. 166. Ефекторний пептид послідовності SEQ. № 30 зазначеної вище групи є пептидом, похідним з домену BH3 протеїну Bax, який інгібує антиапоптотичні фактори, і зокрема, 16-амінокислотним пептидом, представленим: KKLSECLKRI GDELDS SEQ. № 30 Вважається, що пептиди, засновані на послідовностях доменів BH3 протеїну Bax, здатні ефективно зв'язуватися з антиапоптотичними протеїнами Bcl-2 та Bcl-XL. Антиапоптотична активність протеїну Bcl-2 та Bcl-XL заснована на їх взаємодії з доменами BH3, присутніми в факторах, відповідальних за ініціювання апоптозу (Bax, Bak, Bad). Зв'язування домену BH3 забезпечує попередження взаємодії протеїнів Bcl-2 та Bcl-XL з їх природними лігандами та інгібування їх активності, і тим самим сприяє ініціюванню розвитку апоптозу. Ефекторний пептид послідовності SEQ. № 31 зазначеної вище групи є 15-амінокислотним пептидом, що включає домен BH3 протеїну Bid, який представлений: RNIARHLAQV GDSMD (SEQ. № 31). Протеїн Bid відноситься до сімейства Bcl-2 і відповідає, зокрема, за активацію проапоптотичного фактора Bax. Вважається, що 16-амінокислотний пептид, що містить домен BH3 протеїну Bid, включений у злитий протеїн за даним винаходом, буде ефективно індукувати апоптоз. Ефекторний пептид послідовності SEQ. № 32 з вказаної вище групи являє собою пептидну гомологію рибонуклеази А (РНКази), представлену: KETA AKFERQHMDS STSAASSSNY CNQMMKSRNL TKDRCKPVNT FVHESLADVQ AVCSQKNVAC KNGQTNCYQS YSTMSITDCR ETGSSKYPNC AYKTTQANKH 4 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 IIVACEGNPY VPVHFDASV (SEQ. No. 32). Рибонуклеази являють собою малі протеїни з потенційними протипухлинними властивостями, які при зв'язуванні з негативно зарядженими клітинними мембранами проникають всередину клітини за допомогою ендоцитозу, а потім потрапляють в цитозоль, де вони діють як фермент, що викликає деградацію РНК. Починаючи з концентрації 10 нМ, вони припиняють клітинний цикл і спричинюють апоптоз. Ефекторний пептид послідовності SEQ. No.33 описаної вище групи являє собою цитохром C молекули, представленої за допомогою: GDVEK GKKIFIMKCS QCHTVEKGGK HKTGPNLHGL FGRKTGQAPG YSYTAANKNK GIIWGEDTLM EYLENPKKYI PGTKMIFVGI KKKEERADLI AYLKKATNE (SEQ. No. 33). Випуск цитохрому С з мітохондрії в цитоплазму є одним з основних сигналів, індукуючих апоптоз через так званий мітохондріальний шлях. Протеїн є частиною комплексу апоптосоми, який активує каспазу 9. Ефекторний пептид послідовності SEQ. No. 34 описаної вище групи являє собою гранзім B, представлений за допомогою: IIGGHVAKPH SRPYMAYLMI WDQKSLKRCG GFLIRDDFVL TAAHCWGSSINVTLGAHNIK EQEPTQQFIP VKRAIPHPAY NPKNFSNDIM LLQLERKAKR TRAVQPLRLP SNKAQVKPGQ TCSVAGWGQT APLGKHSHTL QEVKMTVQED RKCESDLRHY YDSTIELCVG DPEIKKTSFK GDSGGPLVCN KVAQGIVSYG RNNGMPPRAC TKVSSFVHWI KKTMKRY (SEQ. No. 34). Гранзіми, які в літературі також називаються фрагментінами, є сироватковими (сериновими) протеазами, типовими для клітинної зернистості Тс-лімфоцитів і NK-клітин. У людському організмі в даний час ідентифіковано 5 різних гранзімів: A, B, H, K (тріптаза) і M (метіоніназа). Дослідження підтвердили, що дані ферменти є елементами цитотоксичної реакції, в яку вступають лімфоцити, впливаючи на клітини-мішені (цільові клітини). Було наочно продемонстровано, що дані ферменти активізували перфорин, тобто протеїн, що генерує пори в клітинних мембранах і тим самим виконує роль посередника при генеруванні цитотоксичної відповіді (цитотоксичної реакції). Крім того, наявним є висновок, що дані ферменти безпосередньо залучаються до процесу індукування апоптозу в клітинах-мішенях. Гранзім В активізує відібрані прокаспази в їх активних формах (наприклад, каспазу 3), а також вивільняє за допомогою протеолізу активну форму протеїну Bid (протеїну, що належить до сімейства протеїну Bcl-2), який ініціює внутрішньоклітинний шлях апоптозу методом інкорпорування в мітохондріальні мембрани і формування пор у мембранах, після чого настає вивільнення факторів, які індукують апоптоз (цитохром С, каспазу 9, апаф (Apaf)). Зв'язуючись з гістонами, гранзім В також може брати участь в релаксації структури хроматину, що спричинює її ослаблення і полегшує доступ до ДНК для ендонуклеаз. Ефекторний пептид послідовності SEQ. № 35 зазначеної вище групи є фрагментом протеїну Nur77, представленого за допомогою: FSRSLHSLL (SEQ No. 35). Ядерний рецептор Nur77 є дуже потужним індуктором апоптозу. Одним з механізмів його дії є здатність зв'язуватися з протеїном Bcl-2, важливим антиапоптотичним фактором. Така взаємодія викликає конформаційні зміни в структурі Bcl-2, які перетворюють його в індуктора апоптозу. Фрагментом, представленим вище, є 9-амінокислотна область з послідовності Nur77, ідентифікована як відповідальна за зв'язування і перетворення Bcl-2, а також індукування апоптозу в клітинах. [Kolluri и др., Cancer Cell (Ракова клітина) 14: 285-298, 2008]. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No. 36 зазначеної вище групи є 15амінокислотний пептид, що містить домен BH3 протеїну Bak, представлений за допомогою: GQVGRQLAII GDDIN (SEQ. No. 36). Вважають, що даний короткий пептид, включений у злитий протеїн за винаходом буде ефективно індукувати апоптотичний сигнал. Ефекторний пептид послідовності SEQ. No. 37 вищевказаної групи являє собою домен BH3 протеїну PUMA/BBC3, представлений за допомогою EEQWAREIGA QLRRMADDLN AQYE SEQ. No. 37. PUMA/BBC3 (p53 - активований модулятор апоптозу / Bcl-2-зв’язувальний компонент 3) є членом сімейства протеїнів Bcl-2 (BH3 тільки для підсімейства). Він виступає посередником апоптозу в порядку, як залежному, так і незалежному від р53. Пряма взаємодія PUMA/BBC3 з усіма відомими протеїнами Bcl-2 про-виживаності викликає їх інактивації, мітохондріальну дисфункцію, і отже, активацію каспаз і загибель клітин. PUMA також опосередковано впливає на відновлення проапоптотичної активності молекул, наприклад, таких як Bak та Bax. Домен BH3 відповідальний за зв'язування PUMA з протеїнами про-виживаності. 5 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ефекторний пептид послідовності SEQ. No. 38 вищевказаної групи являє собою протеїн PUMA/BBC3, представлений у вигляді: ARAR QEGSSPEPVE GLARDGPRPF PLGRLVPSAV SCGLCEPGLA AAPAAPTLLP AAYLCAPTAP PAVTAALGGS RWPGGPRSRP RGPRPDGPQP SLSLAEQHLE SPVPSAPGAL AGGPTQAAPG VRGEEEQWAR EIGAQLRRMA DDLNAQYERR RQEEQQRHRP SPWRVLYNLI MGLLPLPRGH RAPEMEPN (SEQ. No. 38). Вважається, що і протеїн PUMA/BBC3, і його домен BH3 при введенні в злитий протеїн за винаходом буде ефективно індукувати апоптотичні сигнали. Ефекторний пептид послідовності SEQ. No. 39 з вищевказаної групи являє собою 8амінокислотний фрагмент протеїну SMAC / Diablo, представлений за допомогою: AVPIAQKP (SEQ. No. 39). SMAC / DIABLO (другий мітохондрія - вироблений активатор каспаз / безпосередньо IAP зв'язувальний протеїн з низьким показником PI) є активатором каспаз, вивільненим з мітохондрій. Його мотив в точці N закінчення (N-кінця) має перевагу при зв'язуванні з протеїнами IAP, запобігаючи їх домени BIR 2 і BIR 3 від інактивації каспаз. Вважається, що даний короткий пептид, будучи інкорпорованим в злитий протеїн за винаходом, буде ефективно індукувати апоптотичний сигнал. Ефекторний пептид послідовності SEQ. No 40 з вищевказаної групи являє собою пептид буфорін (buforin) IIb, представлений у вигляді: RAGLQFPVGR LLRRLLRRLL (SEQ. № 40). Buforin IIb являє собою пептид, отриманий з гистону H2A, який здатний до незалежного проникнення через клітинні мембрани і наділений антибактеріальними властивостями (Park та ін, Biochem Biophys Res Commun, 244 ... 253-257, 1998). Дослідження його корисності в якості протиракового засобу показали, що він здатний селективно зв'язуватися з численними раковими клітинами, проникати в клітини і накопичуватись в ядрах, індукуючи апоптоз через мітохондріальний шлях (Lee і ін, Cancer Letters, 271:47-55, 2008). Ефекторний пептид послідовності SEQ. No 41 з вищевказаної групи являє собою пептид онконази, представлений за допомогою: QDWLT FQKKHITNTR DVDCDNIMST NLFHCKDKNT FIYSRPEPVK AICKGIIASK NVLTTSEFYL SDCNVTSRPC KYKLKKSTNK FCVTCENQAP VHFVGVGSC (SEQ. No. 41). Онконаза або P-30 є протеїном, спочатку отриманим з лізатів жаби Rana pipiens oocytes Це одноланцюговий протеїн масою 12 кДа, структурний гомолог РНКази А. Дослідження даного протеїну показали, що він має чудову цитотоксичну активність щодо пухлинних клітин (Y Wu, SM Mikulski, W Ardelt, SM Rybak and RJ Youle, The Journal of Biological Chemistry 268, 1068610693). Дослідження механізму дії онконази показали, що під час процесу інтерналізації вона проникає в клітину, де здійснює процес деградації рибосомних rRNA 28S і 18S, що призводить до гальмування синтезу протеїну і загибелі клітини. Ефекторний пептид послідовності SEQ. No. 42 з вказаної вище групи являє собою 20амінокислотний фрагмент протеїну p14ARF з точкою N закінчення, який є інгібітором протеїну про-виживаності Mdm2, представлений як: VRRFLVTLRI RRACGPPRV (SEQ. No. 42). P14ARF є протеїном, який регулює активність протеїну Mdm2, що зв'язується з р53 супресором пухлини, несе відповідальність за її деградацію і тим самим забезпечує можливість виживання трансформованих клітин. Протеїн p14ARF, зв'язуючись з Mdm2, запобігає його взаємодію з р53. Відомо, що короткий пептид, отриманий з p14ARF, в достатній мірі здатний блокувати взаємодію між Mdm2 і р53 і запобігає деградацію останнього (Midgley et al, Oncogene 19: 2312-2323, 2000). Ефекторний пептид послідовності SEQ. No. 43 з вказаної вище групи є 11-амінокислотним пептидом, що зв'язуються з Mdm2, представленим через: PRFMDTWEGL N (SEQ. No. 43). Даний пептид демонструє гомологію послідовності у відношенні до послідовності р53 і значну ефективність гальмування взаємодії Mdm2-p53 (Böttger et al, Oncogene 13:2141-2147, 1996), тим самим запобігаючи деградації р53. Ефекторний пептид послідовності SEQ. No. 44 зазначеної вище групи являє собою 17амінокислотний фрагмент пептиду луназіну (lunasin), представлений через: CEKHIMEKIQ GRGDDDD (SEQ. No. 44). Луназін є 43-амінокислотним пептидом, отриманим із сої (Гліцин макс.), з доведеним антикарциногенним потенціалом. Основний механізм дії даної молекули полягає в інгібуванні процесу ацетилювання гистону. Відомо, що молекули, які мають активність дезацетілази, діють також в якості Со-супресорів процесу транскрипції (Leong та ін, Cancer Lett, 18: 42 - 48, 2007). 6 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ефекторний пептид послідовності SEQ. No. 45 з вищезгаданої групи є доменом BH3 протеїну Bik, представлений через: LALRLAC IGDEMDVS (SEQ. No. 45). Протеїн Bik взаємодіє з клітинними і вірусними факторами, що ініціюють сигнали виживаності (наприклад, Bcl-2), тим самим стимулюючи апоптоз. Як і багато інших проапоптотичних протеїнів, вона містить домен BH3, необхідний для взаємодії з Bcl-2. Пептид, отриманий з цього протеїну, що містить домен BH3, може ініціювати апоптоз шляхом активації інших проапоптотичних протеїнів або шляхом інгібування антиапоптотичних протеїнів (Del Gaizo Moore, V, et al, Blond, 111: 2300-2309, 2008). Ефекторний пептид послідовності SEQ. No. 46 з вищезгаданої групи являє собою синтетичний пептид - інгібітор протеасоми, представлений за допомогою: AGAGGGAGG AGAGGGAGGA G (SEQ. No. 46). Цей пептид складається з ряду повторень Gly - і Ала - залишків і є інгібітором протеасом, здатним до здійснення потенціювання TRAIL-індукованого апоптозу шляхом індукції над експресії (надлишкової експресії) TRAIL рецептора DR5. Ефекторний пептид послідовності SEQ. No. 47 з вищезгаданої групи являє собою домен Скінцевого фрагмента протеасоми S5a, представлений у вигляді MTISQQEFG RTGLPDLSSM TEEEQIAYAM QMSLQGAEFG QAESADIDAS SAMDTSEPAK EEDDYDVMQD PEFLQSVLEN LPGVDPNNEA IRNAMGSLAS QATKDGKKDK KEEDK (SEQ. No. 47). Цей домен з фрагмента протеасоми S5a містить мотиви Uims, які беруть безпосередню участь у убіквітин - зв'язуванні і, отже, здатні індукувати апоптоз. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.151 з вищезгаданої групи є пептид, отриманий з азуріну. Азурін – це протеїн окисно-відновного потенціалу, що містить мідь, випущений патогенною бактерією синьогнійної палички (Pseudomonas aeruginosa). Він є у високому ступені цитотоксичним по відношенню до багатьох ракових клітинних ліній. Азурін входить в цитозоль і переміщується у напрямку до ядра. Його активність чітко залежить від наявності активної форми p53 в ракових клітинах. Було виявлено, що азурін зв'язується з p53 і посттрансляційно збільшує р53 і Bax рівень. Така явна антагоністична активність по відношенню до функціональної взаємодії Mdm2-p53 дає можливість припустити, що зв'язування азуріну з p53 може перешкодити виникненню об'єднання Mdm2-p53 і тим самим запобігти деградації р53. Після зв'язування, це спричинює вихід мітохондріального цитохрому С в цитозоль. Даний процес активує каскад каспаз (в тому числі, каспази-9 і каспази-7), ініціюючи тим самим процес апоптозу (Punj V, et al Oncogene. 2004 Mar 25;23(13):2367-78, Funari G et al. J Mol Recognit. 2010 Jul Aug; 23(4):343-51). Докладний аналіз активності пептидів, отриманих з послідовності азуріну, виявив область з 28 амінокислот, що відповідають за ефективну клітинну пенетрацію і запуск механізму апоптозу (Yamada i wsp., Cell Microbiol, 7:1418–1431, 2005). Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.152 з вищевказаної групи є азуріновий пептид повної довжини. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.153 з вищевказаної групи є пептид, сконструйований з протеїну аРР і домену BH3 протеїну Bax. Химери протеїну аРР і переробленого проапоптотичного протеїну Bak були розкриті в EP1309680 в якості сильнодіючих і специфічних лігандів для людських Bcl-2 та Bcl-X. (Див. також Chin JW, Schepartz A. Design and evolution of a miniature Bcl-2 binding protein (Конструкція та еволюція мініатюрного Bcl-2 - зв’язуючого протеїну) Angew Chem Int Ed Engl. 2001 Oct 15;40(20):3806-3809 Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.154 з вищевказаної групи є інший пептид, сконструйований з протеїну аРР і домену BH3 протеїну Bax. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.155 з описаної вище групи є пептид, отриманий з Reticulon RTN1-C. Протеїн RTN1-C являє собою мембранний протеїн, локалізований в ER (ендоплазматичному ретикулумі) і експресований в нервовій системі, причому його біологічна роль ще не повністю вияснена. C-кінцева область RTN1-C, відповідна фрагменту із залишків від 186 до 208, здатна зв'язуватися з нуклеїновими кислотами та взаємодіяти з ферментами гістондеацетілази (HDAC), знижуючи їх активність. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No. 156 з описаної вище групи є людський ретікулон (Reticulon 3/ізоформа а) повної довжини. Ретікулони (RTNs) утворюють групу інтегральних мембранних протеїнів, які не мають гомології з іншими відомими доменами, що відносяться до апоптозу. Ізоформа а ретікулону (Reticulon 3) піддається надмірному 7 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 експресуванню в пухлинних клітинних лініях, перетворюючи їх на лінії, чутливі до TRAILопосередкованого апоптозу. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.157 з описаної вище групи є вдосконалена, конститутивно (постійно) активна каспаза-3 (одноланцюгова каспаза) [Srinivasula SM, Ahmad M, MacFarlane M, Luo Z, Huang Z, Fernandes-Alnemri T, Alnemri ES. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits (Генерування конститутивно активної рекомбінантної каспази-3 та каспази-6 шляхом перерозподілу їх підодиниць). J Biol Chem. 1998 Apr 24; 273(17):10107-11]. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.158 з описаної вище групи є домен SAC протеїну Par-4 (протеїну Par-4 апоптозної відповіді простати). Par-4 є супресорним протеїном пухлини, що має проапоптотичну функцію. Канцер-специфічна проапоптотична активність Par-4 зосереджується в його центрально розташованому домені SAC. Функція молекули забезпечується двома специфічними засобами: активацією молекулярних компонентів механізму загибелі клітини (транслокація Fas і FasL в плазматичну мембрану), і інгібуванням фактора про-выживаності (NF-Кб шлях). [(Zhao Y, Rangnekar VM. Apoptosis and tumor resistance conferred by Par-4. (Апоптоз і пухлинна резистентність, забезпечувана Par-4) Cancer Biol Ther. 2008 Dec;7(12):1867-74. Epub 2008 Dec 8. Review)]. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.159 з вказаної вище групи є протеїн Noxa. Noxa кодує Bcl-2 гомологію 3 (BH3) - єдиного члена Bcl-2 сімейства протеїнів; цей елемент містить область BH3, але не інші домени BH. Noxa є посередником р53-залежного апоптозу і піддається BH3 мотив - залежній локалізації в мітохондріях, а також взаємодіє з антиапоптотичними членами сімейства Bcl-2, що призводить до активації каспаз-9. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.160, описаної вище групи є 10-AA (KLLNLISKLF) фрагмент протеїну Noxa, необхідного для мітохондріальної локації (MTD мітохондріальний цільовий домен або CKP - пептид загибелі клітин). Він був описаний в патентній публікації WO2006/001582 і в роботі Young-Woo Seo et al. in The Journal of Biological Chemistry Vol. 278, No. 48, Issue of November 28, pp. 48292–48299, 2003 (у науковому журналі Біологічна хімія. Том 278. №48, випущено 28 листопада, стор. 48292–48299, 2003 р.) Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.161 з вищевказаної групи є короткий гібридний пептид Antp-TPR, описаний в патентній публікації WO2010055929. Antp-TPR є продуктом генної інженерії - гібридним пептидом Hsp90-орієнтації, який має селективну цитотоксичну активність у відношенні до ракових клітин за рахунок гальмування взаємодії Hsp90 з доменом TPR2A Hop -протеїну. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.162 з описаної вище групи є пептидний інгібітор домену SH2 протеїну Stat3. Домен SH2 протеїнів Stat несе відповідальність за серію подій, які призводять до активізації клітинного росту та диференціювання клітин через звичайну STAT сигналізацію у відповідь на фактори росту і цитокіни. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.163 з вищезгаданої групи є пептид GQVGRQLAIIGDDINR, отриманий з домену BH3 протеїну Bak (сімейства Bcl-2) (Castelli M, Reiners JJ, Kessel D. A mechanism for the proapoptotic activity of ursodeoxycholic acid: effects on Bcl-2 conformation. Cell Death Differ. (Механізм проапоптотичної активності урсодезоксихолевої кислоти: вплив на Bcl-2 конформацію. Різні види загибелі клітини). 2004 Aug;11(8):906-14). Протеїн Bak є проапоптотичним представником сімейства Bcl-2, який залучається до ініціювання апоптозу. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. No.164 з вищезгаданої групи є пептид KNLWAAQRYGRELRRMSDEFEGSFKGL, отриманий з домену BH3 протеїну Bad (сімейства Bcl2) (Wang JL, Zhang ZJ, Choksi S, Shan S, Lu Z, Croce CM, Alnemri ES, Korngold R, Huang Z. Cell permeable Bcl-2 binding peptides: a chemical approach to apoptosis induction in tumor cells. (Клітина-проникні Bcl-2 - зв'язувальні пептиди: хімічний підхід до індукування апоптозу в пухлинних клітинах)Cancer Res. 2000 Mar 15;60(6):1498-502). Ефекторним пептидом SEQ. No. 165 з вищезгаданої групи є пептид ATAP з протеїну Bfl1. ATAP (амфіпатичний пептид з хвостовою "якірною" функцією) (залишки 147-175 з Bfl1; біфункціональний протеїн сімейства Bcl2), призначений спеціально для мітохондрій і індукує каспаза-залежний апоптоз, який не потребує Bax або Bak. Ефекторним пептидом послідовності SEQ. № 166 вищеназваної групи є інший ATAP пептид з протеїну Bfl1. Протеїн ATAP зливається з МТС - доменом з HCCS1 [Ko JK, Choi KH, Pan Z, Lin P, Weisleder N, Kim CW, Ma J. The tail-anchoring domain of Bfl1 and HCCS1 targets mitochondrial membrane permeability to induce apoptosis. (Домен з хвостовою "якірною" функцією протеїну Bfl1 8 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 і HCCS1 націлений на мітохондріальну проникність мембрани для індукування апоптозу) J Cell Sci. 2007 Aug 15;120(Pt 16):2912-23. Epub 2007 Jul 31]. Як описано вище, першим варіантом проапоптотичного ефекторного пептиду домену (b) може бути пептид, який здійснює свою апоптотичну активності через внутрішній (притаманний йому) шлях апоптозу (внутрішньоклітинно), що викликає апоптоз безпосередньо шляхом активації компонентів сигнального каскаду мітохондріального шляху апоптозу, або шляхом прямого індукування мітохондріального апоптозу в клітинах. В одному з прикладів здійснення першого варіанту однієї з груп проапоптотичних ефекторних пептидів домену (б), що здійснюють свою активність через внутрішній шлях, можуть бути пептиди, які гальмують і / або модулюють внутрішньоклітинні антиапоптотичні фактори або фактори про-виживаності, наприклад, такі як антиапоптотичні протеїни Bcl-2 та Bcl-XL, при їх зв'язуванні. Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи є пептиди, представлені послідовністю SEQ. No. 30, присутньою в злитих протеїнах прикладів 1, послідовністю SEQ. No. 37, присутньої в злитих протеїнах прикладів 11 і 47, послідовністю SEQ. No.45, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 21, послідовністю SEQ. No. 158, присутньою в злитих протеїнах прикладів 42 і 43, і послідовністю SEQ. No. 159, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 44. В іншому прикладі здійснення даного першого варіанту група проапоптотичних ефекторних пептидів домену (b), що проявляють свою активність через внутрішній шлях, може бути представлена пептидами, які здійснюють руйнівну активність безпосередньо всередині клітини, забезпечуючи арешт клітинного циклу. Зазначена вище руйнівна активність безпосередньо всередині клітини в мітохондріальному внутрішньому шляху може бути ініційована ефекторним пептидом на різних рівнях каскаду каспаз, що призводить до загибелі клітини. Прикладами зазначеної вище прямої руйнівної активності ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є деградація нуклеїнових кислот, зокрема, клітинної РНК або ДНК в цілому, і індукування деградаційних нуклеаз. Такий вплив можуть чинити, наприклад, рибонуклеази, такі як рибонуклеази надсімейства підшлункової залози RNAse A, в тому числі підшлункової залози людини RNAse, людського ангіогеніну (рибонуклеази 5, hAng), людського еозінофіл-похідного нейротоксину (EDN), і бичачою рибонуклеазою, а також їх гомологами і варіантами. Прикладами гомологів RNAse є онконаза, рибонуклеази, виділені з Rana catesbiana (жаба-бик) і Rana japonica (коричнева японська жаба). Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, які проявляють активність, в результаті якої забезпечується деградація нуклеїнових кислот, є пептиди, представлені послідовністю SEQ. No.32, присутньою в злитих протеїнах прикладів 3, 4 і 27, послідовністю SEQ. No. 41, присутньою в злитих протеїнах прикладів 16, 17 і 46, і послідовністю SEQ. No.157, присутньою в злитому протеїні прикладу 41. Іншим прикладом зазначеного прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є активація каспаз. Така дія може бути здійснена, наприклад, цитохромом С (SEQ. No. 33), присутнім в злитих протеїнах прикладів 5 і 6, гранзімом B (SEQ. No. 34), присутнім в злитих протеїнах прикладів 7 і 8, або пептидом, отриманим з протеїну Smac / DIABLO (SEQ. No. 39), присутнім в злитих протеїнах прикладів 14, 21, 33, 34 і 35. Іншим прикладом згаданої вище прямої руйнівної дії ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є інгібування протеасоми, завдяки впливу стабілізації проапоптотичних протеїнів на відновлення функцій p53. Типовими ефекторними пептидами вищевказаної групи, дія яких здійснюється за рахунок інгібування протеасоми, є пептиди, представлені SEQ No. 46, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 22, і SEQ. No 47, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 23. Ще одним прикладом згаданого прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є модуляція протеїнів гістонів, завдяки посиленню впливу експресії проапоптотичних протеїнів на відновлення функцій p53 Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, що діють за рахунок модуляції протеїнів гістонів, є буфорін (buforin Iib), представлений SEQ. No 40, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 15, і луназін, представлений SEQ No 44, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 20. Іншим прикладом згаданого прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є відновлення функцій P-53, наприклад, шляхом інгібування деградації P-53. Попередження деградаціі P-53 може бути досягнуто шляхом інгібування негативного регулятора Р-53, такого як murine double minute 2 (MDM2), щоб зірвати 9 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 процес негативного регулювання P-53. Це може бути досягнуто за рахунок MDM2 - зв'язуючих пептидів, які конкурують з MDM2 за зв'язування з P-53, наприклад, азуріну, окислювальновідновного протеїну, що містить мідь, регулятора клітинного циклу p14ARF, або SuperTIP (ThioredoxinInsert Protein - протеїну, що вміщує тіоредоксин), mdm-2-зв'язуючого пептиду в межах петлі активної зони бактеріального тіоредоксин - протеїну), або їх фрагментів. Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, що діють за рахунок відновлення P-53 - функцій, є пептиди, представлені SEQ. No, 42, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 18, SEQ No, 43, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 19, SEQ. No. 151, присутньою в злитих протеїнах прикладів 29, 30 і 31, і SEQ No. 152, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 32. Ще одним прикладом згаданої прямої руйнівної дії ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є забезпечення впливу, тобто активації, інгібування або модуляції сімейства протеїнів Bcl-2, таких як протеїни Bax, Bak, Bok, Bid, Bim, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma, Bik, BNIP3 і Spike, більш конкретно, тільки BH3 - сімейства протеїнів, що включає Bid, Bim, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma, Bik, BNIP3 і Spike. Зокрема, фрагменти доменів BH3 членів сімейства Bcl-2 будуть представлені в якості бажаних ефекторних пептидів. Інша група ефекторних пептидів представлена фрагментами сімейства ядерних рецепторів RXR (ретіноідних X-рецепторів), таких як, наприклад, ядерний рецептор Nur77. Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, чия дія полягала у впливі на сімейство протеїнів Bcl-2, є пептиди, представлені SEQ No 30, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 1, SEQ. No 31, присутньою в злитих протеїнах прикладів 2, 4 і 8, SEQ. No 32, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 3, SEQ. No 35, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 9, SEQ. No 36, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 10, SEQ. No 37, присутньою в злитих протеїнах прикладів 11 і 47, SEQ. No 38, присутньою в злитих протеїнах прикладів 12 і 13, SEQ. No 159, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 44, SEQ. No 160, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 45, SEQ. No 163, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 51, SEQ. No 164, присутньою в злитих протеїнах прикладів 52 і 53, SEQ. No 165, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 54 і SEQ. No 166, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 55. Ще одним прикладом згаданого прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є забезпечення зосередження апоптотичного сигналу, індукованого за допомогою TRAIL - зв'язування з TRAIL - рецепторами, зокрема, шляхом активації каспаз. Іншим прикладом згаданого прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є забезпечення сприяння формуванню апоптосоми. Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, чия дія полягає в сприянні формуванню апоптосоми, є пептиди, представлені SEQ. No. 30, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 1, SEQ. No. 31, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 2, SEQ. No.33, присутньою в злитих протеїнах прикладів 5 і 6, SEQ. No.35, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 9, SEQ. No. 36, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 10, SEQ. No. 37, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 47, SEQ. No. 39, присутньою в злитих протеїнах прикладів 33, 34 і 35, SEQ. No. 40, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 14, SEQ. No. 45, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 21, SEQ. No. 153, присутньою в злитих протеїнах прикладів 36 і 37, SEQ No. 154, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 38, SEQ No. 157, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 41, SEQ. No. 158, присутньою в злитих протеїнах прикладів 42 і 43, SEQ No. 159, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 44, SEQ. No. 160, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 45, SEQ. No. 163, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 51 і SEQ. No. 164, присутньою в злитих протеїнах прикладів 52 і 53. Ще одним прикладом згаданого прямого руйнівного впливу ефекторного пептиду в мітохондріальному внутрішньому шляху є сприяння забезпеченню проникності мітохондріальної зовнішньої мембрани (MOMP), завдяки чому протеїни, що вивільняються з мітохондрій, можуть впливати на рівень активації каспази. Типовими ефекторними пептидами зазначеної вище групи, чия дія полягає в сприянні забезпеченню проникності, мітохондріальної зовнішньої мембрани (MOMP), є пептиди, представлені SEQ. No.30, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 1, SEQ. No. 31, присутньою в злитих протеїнах прикладів 2 і 48, SEQ. No.33, присутньою в злитих протеїнах прикладів 5 і 6, SEQ. No. 39, присутньою в злитих протеїнах прикладів 14, 33, 34 і 35, SEQ. No. 40, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 15, SEQ. No. 41, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 46 і SEQ. No. 45, інкорпорованою в злитий протеїн прикладу 21. Як описано вище, другий варіант проапоптотичного ефекторного пептиду домену (b) за винаходом являє собою групу проапоптотичних ефекторних пептидів, що діють через зовнішній 10 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шлях (позаклітинно), причому їх ефективність можлива у випадку зв'язування з рецепторами, присутніми на поверхні ракової клітини. Нижче наведені наступні TNF-ліганди (TNF - фактор некрозу пухлини) або TNF-аналоги, як позаклітинно діючі пептиди, що були використані в якості порівняльних ефекторних пептидів: - VANPQAEGQL декапептид (SEQ. No. 48); - LANGVE гексапептид (SEQ. No. 49) або - Септапептид CPSEGLC (SEQ. No. 50). Декапептид, представлений послідовністю SEQ. No. 48, був описаний в якості аналога / агоніста TNF в патентному документі JP 60226816. Гексапептид, представлений послідовністю SEQ. No. 49, походить від TNF і був описаний у патентному документі DE 3,841,768. Септапептид, представлений SEQ. No.50, являє собою п'яти-амінокислотний пептид, який є частиною цитокіну TNF, отриманого з поверхні взаємодії даного цитокіну з його клітинними рецепторами: TNFR55 і TNFR75, яка примикає (межує) на С-кінці і N-кінці до двох залишків цистеїну. Залишки цистеїну стабілізують циклізацію пептиду за рахунок утворення сульфідної перемички між амінокислотами. Метою циклізації є стабілізація пептиду та підвищення його активності. Після зв'язування з рецепторами TRAIL, присутніми на поверхні ракових клітин, злитий протеїн здатний надавати подвійної дії. Домен (а), яким є функціональний фрагмент TRAIL, проявить свою відому антагоністичну активність - тобто, зв'яжеться з рецепторами загибелі клітини на поверхні клітини і здійснить активацію зовнішнього шляху апоптозу. Після інтерналізації за допомогою ендоцитозу злитого протеїну, що містить проапоптотичний пептид, що діє внутрішньоклітинно, домен (b) буде в змозі цілком відчутно здійснювати свою внутрішньоклітинну дію паралельно з активністю домену TRAIL. Таким чином, протиракова активність TRAIL може бути посилена шляхом активації інших елементів і механізмів апоптозу. Порівняльний злитий протеїн, що інкорпорує проапоптотичний пептид, діючий позаклітинно, повинен потенційно додатково ініціювати апоптотичний шлях через зв'язування ш активацію проапоптотичних рецепторів, інших, ніж TRAIL рецептори В одному з прикладів здійснення винаходу, домени (а) і (b) злитого протеїну можуть бути безпосередньо зв'язані один з одним. В іншому прикладі здійснення домен (а) і домен (b) зв'язані доменом (с), що містить послідовність ділянки розщеплення, розпізнану протеазами, присутніми в клітинному середовищі, особливо в середовищі пухлинної клітини. Ділянка протезного розщеплення може бути вибрана з наступного переліку: - послідовність, розпізнана металопротеїназою MMP, зокрема послідовності PLGLAG (SEQ. No. 51), PLGIAGE (SEQ. No. 171) або PLGLAGQ (SEQ. No. 173); - послідовність, розпізнана урокіназою uPA, зокрема, послідовність RVVR (SEQ. No. 52), і - послідовність, розпізнана фурином, зокрема, послідовність RKKR (SEQ. No. 53), або послідовність RKKRVKR (SEQ. No. 172), та їх комбінації. Зокрема, ділянка протеазного розщеплення являє собою комбінацію послідовності, розпізнаної металопротеїназою MMP, і послідовністю, розпізнаною урокіназою uPA, розташованих поруч одна з одною в будь-якому порядку. В одному з прикладів здійснення домен (с) являє собою комбінацію MMP/uPA SEQ. No 51/Sekw. No. 52, тобто послідовність PLGLAGRVVR, або комбінацію uPA/MMP SEQ. No 52/SEQ. No. 51, тобто послідовність RVVRPLGLAG. Такі протеази, як металопротеїназа MMP, урокіназа і / або фурин піддаються гіперекспресії в пухлинному середовищі. Наявність послідовності, розпізнаної протеазою, забезпечує відщеплення домену (а) з домену (b) після інтерналізації конструкції, тобто секретування функціонального домену (b) і, отже, його активацію. Наявність ділянки протеазного розщеплення, завдяки забезпеченню швидкого випуску ефекторного пептиду, підвищує можливості переносу пептиду до місця його дії ще до того моменту, коли може відбутися випадкова деградація злитого протеїну через протеази, присутні в клітині. Крім того, до домену (b) ефекторного пептиду злитого протеїну за винаходом може бути приєднаний транспортуючий домен (d), вибраний з групи, яка складається з переліку, що включає: (d1) послідовність, направляючу в ендоплазматичний ретикулум; (d2) послідовність поліаргініну, транспортуючу через клітинні мембрани, що складається з 6, 7, 8 або 9 Arg залишків; (d3) домен транслокації Pseudomonas aeruginosa (синьогнійної палички) (SEQ. No. 54); 11 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (d4) домен мембранного транспортування (мембрану, транспортуючу домен); (d5) домен ядерної локалізації та (d6) мітохондріальний націлюючий домен та їх комбінації. Комбінація доменів (d1) (d2) і (d3) може включати в себе, зокрема, комбінацію (d1) / (d2), (d1) / (d3) або (d1) / (d2) / (d3). Комбінація доменів (d1), (d2), (d3), (d4), і (d5) може включати, зокрема, також і комбінацію (d1) / (d2), (d1) / (d3), (d1) / (d4), (d1) / (d5) і (d1) / (d2) / (d3), (d3) / (d5), (d2) / (d5), (d1) / (d3) / ( d5), (d2) / (d3) / (d6). Крім того, комбінація доменів (d1), (d2), (d3), (d4) і (d5) може включати домени, розташовані поруч один з одним і зв'язані з одним кінцем домену (b), і / або домени, зв'язані з різними кінцями домену (b). Слід розуміти, що у випадку, коли у злитого протеїну є як транспортуючий домен (d), приєднаний до домену (b), так і домен (с) ділянки розщеплення між доменами (а) і (b), тоді домен (с) розташований таким чином, що після розщеплення структури транспортуючий домен (d) залишається приєднаним до домену (b). Іншими словами, якщо злитий протеїн містить і транспортуючий домен (d), і домен ділянки розщеплення (с), то домен (d) розташований між доменом (b) і доменом (с), або він розташований на кітці домену (b) навпроти точки приєднання домену (d) Винахід не містить такого варіанту, при якому домен (d) розташований між доменом (с) і доменом (а), тобто такого прикладу здійснення, при якому після розщеплення структури транспортуючий домен залишається приєднаним до домену TRAIL. Транспортуюча послідовність може бути приєднана в точці N-закінчення або в точці Сзакінчення домену (b). У деяких прикладах здійснення транспортуюча послідовність може бути також частиною закінчення всієї структури, наприклад, такою, як частина C-закінчення або частина N-закінчення, залежно від способу приєднання доменів (а) і (b). Домен транслокації Pseudomonas aeruginosa (синьогнійної палички) здатний забезпечити транслокацію через лізосомальну мембрану в цитоплазму і може бути застосований для введення ефекторного пептиду в окремі ділянки (компартменти) пухлинної клітини. Послідовність домену транслокації Pseudomonas aeruginosa (синьогнійної палички)- добре відома з рівня техніки і представлена наступним: PEGGSLA ALTAHQACHL PLETFTRHRQ PRGWEQLEQC GYPVQRLVAL YLAARLSWNQ VDQVIANALA SPGSGGDLGE AIRESPEQAR LALTLAAAES ERFVRQGTGN DEAGAANGPA D (SEQ. No. 54) Послідовністю (d1), направляючою у ендоплазматичний ретикулум, може бути будь-яка сигнальна послідовність, направляюча в ендоплазматичний ретикулум, відома з рівня техніки, не обмежувальними прикладами якої є KDEL, HDEL, RDEL, DDEL, ADEL, SDEL, KEDL. Послідовність (d1), переважно, вибирають з переліку послідовностей KDEL KDEL (SEQ. No. 55) і KEDL (SEQ. No. 56). Переважно, направляюча послідовність (d1) розташована в точці C-закінчення злитого протеїну за винаходом і формує частину його С-закінчення. Доменом мембранного транспортування (d4), може бути будь-яка сигнальна послідовність, транспортуюча через плазмову мембрану, відома з рівня техніки, необмежувальним прикладом якої є KPRRPY або K PRRPYR. Послідовністю ядерної локалізації (d5) може бути будь-яка відома з рівня техніки сигнальна послідовність, направляюча в ядро, необмежувальним прикладом якої є EEEAAGRKRKKRT (SEQ. No. 168), FFFAAGRKRKKRT, NNNAAGRKRKKRT, YYYAAGRKRKKRT, AAKKK, або GR KRKKRT. Мітохондріальним націлюючим доменом (d6) може бути будь-яка відома з рівня техніки сигнальна послідовність, направляюча в мітохондрію, необмежувальним прикладом якої є RVSFCRPGWSAMARSRLTATSVSQVQENGFVK (SEQ. No. 166), фрагмент MLATRVFSLVGKRAISTSVCVR підгрупи IV (hCOXIV1), людської оксидази цитохрому, або лідерний пептид орнітин -транскарбамілази. Крім основних функціональних елементів злитого протеїну, що транспортують домени і ділянки розщеплення доменів, злиті протеїни за даним винаходом можуть містити домен (е), а саме, мотив поліцистеїну, що сприяє тримеру стабілізації, як, наприклад, і не тільки, послідовність CAACAAAC (SEQ. No. 177) або CAAECAAAC (SEQ. No. 178). Крім того, домен (е) поліцистеїну може бути приєднаний до одного кінця домену (b) і / або зв'язаний з різними кінцями домену (b). Слід розумітися на тому, що у випадку, коли злитий протеїн має як домен (е) поліцистеїну, приєднаний до домену (b), так і домен (с) ділянки розщеплення між доменами (а) і (b), то домен 12 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (с) розташований таким чином, що після розщеплення структури домен (е) поліцистеїну залишається приєднаним до домену (а). Іншими словами, якщо злитий протеїн містить як домен (е) поліцистеїну, так і домену (с) ділянки розщеплення, то домен (е) розташований між доменом (а) і доменом (с), або знаходиться на кінці домену (а) напроти місця прикріплення домену (d). Винахід не містить варіанту, при якому домен (е) був би розташований між доменом (с) і доменом (b), тобто відсутня ситуація, коли після розщеплення структури домен поліцистеїну залишався б прикріпленим до домену ефекторного пептиду. Окрім основних функціональних елементів злитого протеїну, що транспортують домени і домен (домени) ділянки розщеплення, злиті протеїни за даним винаходом можуть містити нейтральну послідовність / послідовності гнучкого стеричного лінкера (спейсера), що складається з аланіну, гліцину, глютаміну, цистеїну, гістидину і серину залишків. Такі лінкери / спейсери добре відомі і описані в літературі. Їх включення в послідовність злитого протеїну призначене для забезпечення правильного згортання протеїнів, які продукуються в процесі гіперекспресії в клітинах-господарях. Зокрема, гнучкий стеричних лінкер може бути вибраний з групи, що складається з: GGSG (SEQ. No. 57), GGGS (SEQ. No. 58), GGGGS (SEQ. No. 59), GGSGG (SEQ. No. 60), GGGSGG (SEQ. No. 61), GGGSGGG (SEQ. No. 62), GGGSGGGS (SEQ. No. 63), GGGSGGGGS (SEQ. No. 64), ASGG (SEQ. No. 65), GGGSASGG (SEQ. No. 66) SGCGS (SEQ. No. 169), GGGGSGGGG (SEQ. No. 180),GGSHG (SEQ. No. 182), SGGCGGS(SEQ. No. 183) и AACAA (SEQ. No. 184). В одному з прикладів здійснення, між доменом (а) і доменом (b) додатково присутній домен (f) послідовності, прийнятної для приєднання до злитого протеїну за винаходом, PEG (поліетиленгліколь)- молекули (PEG - лінкера). Таким лінкер може бути будь-яка відома послідовність AlaSerGlyCysGlyProGlu (ASGCGPE в однолітерному зображенні), зазначена у доданому переліку послідовностей, наприклад, SEQ. No.170. PEG-лінкер також може бути вибраний з переліку, що включає AlaAlaCysAlaAla (AACAA), SerGlyGlyCysGlyGlySer (SGGCGGS) I (SGCGS), зазначені в доданому переліку послідовностей, відповідно, SEQ. No. 178, SEQ. No. 177 та SEQ. No. 179. В іншому прикладі здійснення домени a) (b) (c) (d) (e) і (f) можуть бути додатково відділені з використанням до трьох амінокислотних залишків, сформованих амінокислотними залишками, зокрема, вибраними з групи, що складається з гліцину і глютаміну. Крім того, в деяких прикладах здійснення злитий протеїн може містити в якості частини Сзакінчення цілої структури не функціональний фрагмент hTRAIL, такий як послідовність hTRAIL95-121, якій передує послідовність, що забезпечує його відщеплення від структури, переважно, протеїназної ділянки розщеплення , переважно послідовність, розпізнана тромбіном. Включення такого невеликого не функціонального фрагменту hTRAIL надає всій структурі більш високого ступеню гідрофільності, що покращує розчинність протеїну в процесі експресії. Після операцій очищення hTRAIL95-121 може бути відщеплений тромбіном. У цьому випадку, hTRAIL95-121 не буде присутній в злитім протеїні, який застосовується для отримання фармацевтичної композиції. Може бути використана будь-яка відома з рівня техніки послідовність, розпізнана тромбіном, зокрема, послідовність LVPRGS (SEQ. No. 174). Така додаткова послідовність hTRAIL95-121 особливо доцільна у випадку застосування ліпофільних ефекторних пептидів, а також, коли домен (а) починається амінокислотою 114 і вище в послідовності всієї TRAIL. Конкретні приклади здійснення злитого протеїну за винаходом являють собою злиті протеїни, що містять внутрішньоклітинно діючий проапоптотичний пептид, вибраний з групи, що складається з протеїнів, представлених:SEQ. No. 1, SEQ. No. 2, SEQ. No. 3, SEQ. No. 4, SEQ., No. 5, SEQ. No. 6, SEQ. No. 7, SEQ. No. 8, SEQ. No. 9, SEQ. No. 10, SEQ. No. 11, SEQ. No. 12, SEQ. No. 13, SEQ. No. 14, SEQ. No. 15, SEQ. No. 16, SEQ. No. 17, SEQ. No. 18, SEQ. No. 19, SEQ. No. 20, SEQ. No. 21, SEQ. No. 22, SEQ. No 23, SEQ. No. 93, SEQ. No. 94, SEQ. No. 95, SEQ. No. 96, SEQ., No. 97, SEQ. No. 98, SEQ. No. 99, SEQ. No. 100, SEQ. No. 101, SEQ. No. 102, SEQ. No. 103, SEQ. No. 104, SEQ. No. 105, SEQ. No. 106, SEQ. No. 107, SEQ. No. 108, SEQ. No. 109, SEQ. No. 110, SEQ. No. 111, SEQ. No. 112, SEQ. No. 113, SEQ. No. 114, SEQ. No 115, SEQ. No. 116, SEQ. No. 117, SEQ. No. 118, SEQ. No. 119, SEQ. No. 120 и SEQ. No. 121. Іншими специфічними прикладами здійснення злитого протеїну за винаходом є злиті протеїни, що містять позаклітинно діючий проапоптотичний пептид, вибраний з групи, що складається з протеїнів, представлених SEQ. No. 24, SEQ. No. 25 і SEQ. No. 26. Детальне розкриття структури згаданих вище репрезентативних злитих протеїнів, представлено на фіг. 1 - 5 і 9 - 13, а також в описаних нижче прикладах. 13 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно до даного винаходу, поняття злитого протеїну означає одиночну молекулу протеїну, що містить два або більше протеїнів або їх фрагментів, ковалентно зв'язаних за допомогою пептидного зв'язку в межах їх відповідних пептидних ланцюгів без додаткових хімічних лінкерів. В якості альтернативи, злитий протеїн може бути описаний як узагальнений образ структури протеїну або химерний протеїн. Відповідно до даного винаходу, терміни "узагальнений образ структури протеїну" або "химерний протеїн", якщо вони використовується, слід розуміти як такі, що відносяться до злитого протеїну, згідно з визначення, наданим вище. Для фахівця, кваліфікованого в даній області техніки, є очевидним, що злитий протеїн, визначений таким чином, може бути синтезований відомими методами хімічного синтезу пептидів та протеїнів. Злитий протеїн може бути синтезований з використанням методів хімічного синтезу пептидів, зокрема, із застосуванням методів синтезу пептидів в твердій фазі, використовуючи відповідні смоли в якості носіїв. Такі методи є традиційними і відомими з рівня техніки, зокрема, вони описані в таких монографіях як, наприклад, [Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Застосування пептидного синтезу на практиці), 1984, Springer-Verlag, New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (Твердофазний пептидний синтез), 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company.] Злитий протеїн може бути синтезований із застосуванням методів хімічного синтезу пептидів як безперервний протеїн. Крім того, окремі фрагменти (домени) протеїну можуть бути синтезовані окремо, а потім об'єднані разом в один безперервний пептид через пептидний зв'язок шляхом конденсації аміно - закінчення одного пептидного фрагменту із карбоксильного закінчення другого пептиду. Такі методи є традиційними і добре відомі з рівня техніки. Для перевірки структури отриманого пептиду можуть бути використані відомі методи аналізу амінокислотного складу пептидів, наприклад, метод мас-спектрометрії високого дозволу для визначення молекулярної маси пептидів. Для підтвердження пептидної послідовності можуть бути також використані секвенсори протеїну, які послідовно руйнують пептид і ідентифікують послідовність амінокислот. Однак, переважно, злитий протеїн за винаходом є рекомбінантним протеїном, генерованим методами генної експресії полінуклеотидної послідовності, що кодує злитий протеїн у клітинахгосподарях. Ще одним аспектом винаходу є полінуклеотидна послідовність, зокрема, послідовність ДНК, що кодує злитий протеїн, як зазначено вище. Переважно, полінуклеотидною послідовністю, зокрема ДНК, що, відповідно до винаходу, кодує злитої протеїн, як зазначено вище, є послідовність, яка оптимізована для експресії в E. coli. Іншим аспектом винаходу є також вектор експресії, що містить полінуклеотидну послідовність, зокрема, послідовність ДНК за винаходом, як визначено вище. Ще одним аспектом винаходу є також клітина - господар, що містить вектор експресії, як описано вище. Переважною клітиною-господарем для експресії злитих протеїнів за винаходом є клітина E. coli (клітина кишкової палички). Способи генерування рекомбінантних протеїнів, у тому числі злитих протеїнів, добре відомі. Якщо говорити коротко, даний спосіб полягає в генеруванні полінуклеотидної молекули, наприклад молекули ДНК, що кодує амінокислотну послідовність цільового протеїну і спрямовує експресію цільового протеїну в клітині-хазяїні. Далі цільовий протеїн, що кодує полінуклеотидну молекулу, інкорпорують у відповідний вектор експресії, який забезпечує ефективну експресію поліпептиду. Далі рекомбінантний вектор експресії вводять в клітини-господарі для трансфекції / трансформації, і, як наслідок, виробляють трансформовану клітину-господаря. Після цього культурою трансформованих клітин піддають гіперекспресії цільовий протеїн, забезпечують очистку отриманих протеїнів, і, за вибором, відділяють шляхом відщеплення марковані послідовності, застосовані для експресії або очищення протеїну. Придатні способи експресії і очищення описані, наприклад, в монографії Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology (Технологія генної експресії, методи ензимології) 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995. В якості векторів експресії для впровадження і тиражування послідовностей ДНК в клітинахгосподарях можуть бути використані косміди, плазміди або модифіковані віруси. Зазвичай, в якості векторів експресії використовують плазміди. Відповідні для цієї мети плазміди добре відомі і комерційно доступні. 14 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вектор експресії за винаходом включає полінуклеотидну молекулу, що кодує злитий протеїн за винаходом і необхідні регуляторні послідовності для транскрипції і трансляції кодуючої послідовності, інкорпорованої в підходящу клітину-господаря. Вибір регуляторних послідовностей залежить від типу клітин-господарів і може бути легко здійснений кваліфікованим фахівцем в даній області. Прикладами таких регуляторних послідовностей є транскрипційний промотор і енхансер (підсилювач) або РНК - полімераза - звязувальна послідовність, рибосома - зв’язувальна послідовність, що містить сигнал ініціації транскрипції, вбудований перед кодуючою послідовністю і послідовність закінчення транскрипції, вбудовану після кодуючої послідовності . Крім того, в залежності від клітини-хазяїна і застосованого вектора, в вектор експресії можуть бути введені інші послідовності, такі як джерело реплікації, додаткові ділянки рестрикції ДНК, підсилювачі (енхансери) і послідовності, що забезпечують індукування транскрипції. Вектор експресії також буде містити послідовність маркерного гена, який надає визначеного фенотипу трансформованій клітині і створює можливість для специфічної селекції трансформованих клітин. Крім того, вектор може також містити іншу маркерну послідовність, яка дозволяє відрізняти клітини, трансформовані рекомбінантною плазмідою, що містить вбудовану кодуючу послідовність цільового протеїну, від тих, які прийняли плазміду без інсерту (вставки). Найчастіше використовуються типові маркери стійкі до антибіотиків, однак, можуть бути використані будь-які інші репортерні гени, відомі з рівня техніки, чия присутність в клітині (в природних умовах) може бути легко визначена з використанням методів авторадіографіі, спектрофотометрії або біо-та хемілюмінесценції. Наприклад, в залежності від клітини-хазяїна, можуть бути використані такі репортерні гени, як β-галактозидаза, β-глюкуронідаза, люціферази, хлорамфенікол ацетилтрансфераза або зелений флуоресцентний протеїн. Крім того, вектор експресії може містити сигнальну послідовність, транспортуючу протеїни у відповідний клітинний компартмент, наприклад, періплазму, де полегшується утворення складчастості. При цьому, може бути присутньою послідовність, яка кодує мітку / тег, така як HisTag, прикріплена до точки N закінчення, або GST, прикріплена до точки C закінчення, що полегшує подальше очищення протеїну, яке відбувається з використанням принципу афінності, за допомогою афінної хроматографії на нікелевій колонці Також можуть бути присутніми додаткові послідовності, які захищають протеїни від протеолітичної деградації в клітинахгосподарях, а також послідовності, які підвищують його розчинність. Допоміжний елемент, приєднаний до послідовності цільового протеїну, може блокувати її діяльність, або чинити несприятливий вплив з іншої причини, наприклад, через токсичність. Такий елемент повинен бути вилучений, що може бути досягнуто шляхом ферментативного або хімічного розщеплення. Зокрема, шестигістидиновий маркер HisTag або інші маркери зазначеного типу, приєднані для забезпечення очищення протеїну за допомогою афінної хроматографії, повинні бути видалені, через уже описаний вплив на печінкову токсичність розчинного протеїну TRAIL. Можуть бути використані гетерологічні системи експресії на основі різних відомих клітингосподарів, в тому числі прокаріотичних клітин, бактеріальних клітин, таких як кишкова паличка (Escherichia coli) або сінна паличка (Bacillus subtilis), дріжджі, такі як Saccharomyces cervisiae або Pichia pastoris (пекарські дріжджі), і еукаріотичні клітинні лінії (комах, ссавців, рослин). Переважно, у зв'язку з простотою культивування та генетичних маніпуляцій, а також великою кількістю отриманого продукту, використовується система експресії E. coli (кишкової палички). Відповідно, полінуклеотидна послідовність, що містить цільову послідовність, яка кодує злитий протеїн за винаходом, буде оптимізована для експресії в E. coli, тобто в кодуючій послідовності вона буде містити кодони, оптимальні для експресії в E. coli, вибрані з можливих варіантів послідовностей, відомих з рівня техніки. Крім того, вектор експресії буде містити описані вище елементи, що підходять для E. coli, приєднані до кодуючої послідовності. Таким чином, у переважному прикладі здійснення винаходу полінуклеотидна послідовність, що містить послідовність, яка кодує злитий протеїн за винаходом, оптимізований для експресії в E. coli, вибрана з групи полінуклеотидних послідовностей, що складається з: SEQ. No. 67, SEQ. No. 68, SEQ. No. 69, SEQ. No. 70, SEQ. No. 71, SEQ. No. 72, SEQ. No. 73, SEQ. No. 74, SEQ. No. 75, SEQ. No. 76, SEQ. No. 77, SEQ. No. 78, SEQ. No. 79, SEQ. No. 80, SEQ. No. 81, SEQ. No. 82, SEQ. No. 83, SEQ. No. 84, SEQ. No. 85, SEQ. No. 86, SEQ. No. 87, SEQ. No. 88), SEQ. No. 89, SEQ. No. 90, SEQ. No. 91, SEQ. No. 92, SEQ. No. 122, SEQ. No. 123, SEQ. No. 124, SEQ. No. 125, SEQ. No. 126, SEQ. No. 127, SEQ. No. 128, SEQ. No. 129, SEQ. No. 130, SEQ. No. 131, SEQ. No. 132, SEQ. No. 133, SEQ. No. 134, SEQ. No. 135, SEQ. No. 136, SEQ. No. 137, SEQ. No. 138, SEQ. 15 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 No. 139, SEQ. No. 140, SEQ. No. 141, SEQ. No. 142, SEQ. No. 143), SEQ. No. 144, SEQ. No. 145, SEQ. No. 146, SEQ. No. 147; SEQ. No. 148, SEQ. No. 149 і SEQ. No. 150, які кодують злитий протеїн, що має амінокислотну послідовність, відповідну до амінокислотної послідовності, вибраної з группи, яка складається з амінокислотних послідовностей: SEQ. No. 1, SEQ. No. 2, SEQ. No. 3, SEQ. No. 4, SEQ. No. 5, SEQ. No. 6, SEQ. No. 7, SEQ. No. 8, SEQ. No. 9, SEQ. No. 10, SEQ. No. 11, SEQ. No. 12, SEQ. No. 13, SEQ. No. 14, SEQ. No. 15, SEQ. No. 16, SEQ. No. 17, SEQ. No. 18, SEQ. No. 19, SEQ. No. 20, SEQ. No. 21, SEQ. No. 22), SEQ. No. 23, SEQ. No. 24, SEQ. No. 25, SEQ. No. 26, SEQ No. 93, SEQ. No. 94, SEQ. No. 95, SEQ. No. 96, SEQ. No. 97, SEQ. No. 98, SEQ. No. 99, SEQ. No. 100, SEQ. No. 101, SEQ. No. 102, SEQ. No. 103, SEQ. No. 104, SEQ. No. 105, SEQ. No. 106, SEQ. No. 107, SEQ. No. 108, SEQ. No. 109, SEQ. No. 110, SEQ. No. 111, SEQ. No. 112, SEQ. No. 113, SEQ. No. 114, SEQ. No. 115, SEQ. No. 116, SEQ. No. 117 и SEQ. No. 118, SEQ. No. 119, SEQ. No. 120 и SEQ. No. 121. У переважному прикладі здійснення винахід також забезпечує вектор експресії, придатний для трансформації E. coli, що містить полінуклеотидну послідовність, обрану з групи полінуклеотидних послідовностей від SEQ. No. 67 до SEQ. No. 92 і от SEQ. No. 122 до SEQ. No. 150, зазначених вище, а також клітини E. coli, трансформовані таким вектором експресії. Трансформація, тобто введення послідовності ДНК в бактеріальні клітини-хазяїни, зокрема, E. coli (кишкову паличку), як правило, здійснюється на компетентних клітинах, приготованих для сприйняття ДНК, наприклад, шляхом обробки іонами кальцію при низькій температурі (4 °С), з подальшою дією із застосуванням теплового шоку (при 37-42 °С), або методом електропорації. Такі способи добре відомі і, як правило, визначаються виробником системи експресії. Процедура гіперекспресії злитих протеїнів за даним винаходом у системі експресії E. coli, буде описана нижче. Винахід також відноситься до фармацевтичної композиції, що містить злитий протеїн за винаходом, як визначено вище, в якості активного інгредієнта, а також відповідного фармацевтично прийнятного носія, розріджувача та звичайні допоміжні компоненти. Фармацевтична композиція має містити ефективну кількість злитого протеїну за винаходом і фармацевтично прийнятні допоміжні компоненти, розчинені або дисперговані у носії або розріджувачі, і бажано, фармацевтична композиція має бути представлена виконаною в стандартній лікарській формі з дозувальною одиницею або у вигляді препарату, що містить безліч доз. Фармацевтичні форми і методи їх приготування, а також інші компоненти, носії та розріджувачі відомі кваліфікованим фахівцям і описані в літературі. Наприклад, вони описані в монографії Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA. Термін "фармацевтично прийнятний носій, розріджувач та допоміжний інгредієнт" включає будь-які розчинники, дисперсійні середовища, поверхнево-активні речовини, антиоксиданти, стабілізатори, консерванти (наприклад, антибактеріальні засоби, протигрибкові препарати), ізотонічні агенти, відомі з рівня техніки. Фармацевтична композиція за винаходом може містити різні типи носіїв, розріджувачів та наповнювачів, в залежності від обраного способу введення і бажаних лікарських форм, таких як рідкі, тверді і аерозольні форми для орального, парентерального, інгаляційного, місцевого (зовнішнього) застосування, при цьому, обрана форма повинна бути стерильною при її введенні методом ін'єкції. Кращим шляхом введення фармацевтичної композиції за винаходом є парентеральний шлях, в тому числі із застосуванням маршрутів ін'єкції, таких як внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, підшкірний, внутрішньочеревний, внутрішньопухлинний, також шлях або одноразового, або безперервного внутрішньовенного вливання. В одному з прикладів здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена шляхом ін'єкції безпосередньо в пухлину. В іншому прикладі здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена внутрішньовенно. У ще в одному прикладі здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена підшкірно або інтраперитонеально (внутрішньочеревно). Фармацевтичною композицією для парентерального введення може бути розчин або дисперсія в фармацевтично прийнятному водному або неводному середовищі, що містить буферний розчин для забезпечення відповідного показника рН та є ізоосмотичним щодо внутрішніх рідин організму, в разі необхідності, а також може містити антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні агенти і розчинні речовини, які роблять композицію сумісною з тканинами чи кров'ю реципієнта. Іншими компонентами, які можуть бути включені в композицію, є, наприклад, вода, спирти, такі як етанол, поліоли, такі як гліцерин, пропіленгліколь, рідкий 16 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліетиленгліколь, ліпіди, такі як тригліцериди, рослинні олії, ліпосоми. Відповідна плинність і розмір часток вказаної речовини може бути забезпечена за рахунок покривних речовини, таких як лецитин і поверхнево-активні речовини, наприклад, гідроксипропілцелюлози полісорбат, і інших подібних речовин. Підходящими ізотонічними (isotoning) засобами для парентеральних рідких композицій, є, наприклад, цукри, такі як глюкоза, і хлорид натрію, а також їх комбінації. Крім того, фармацевтична композиція для введення шляхом ін'єкції або інфузії, може бути приготована у вигляді порошку, наприклад, у вигляді ліофілізованого порошку, що розводиться безпосередньо перед використанням у відповідному носії, такому як, наприклад, стерильна апірогенна вода. Фармацевтична композиція за винаходом для парентерального введення в організм може також мати форму, придатну для інтраназального введення, в тому числі, вона може бути приготована у вигляді розчинів, спреїв або аерозолів. Переважно, форма для інтраназального введення представлена у вигляді водного розчину і є ізотонічною або містить буферний розчин для підтримання показника рН від приблизно 5,5 до приблизно 6,5, щоб забезпечувати характеристики композиції аналогічними за своїми ознаками виділенням з носа. Крім того, композиція містить консерванти і стабілізатори, наприклад, такі як у відомих інтраназальних препаратах. Композиція може містити різні антиоксиданти, які уповільнюють окислення одного або декількох компонентів. Крім того, з метою запобігання дії мікроорганізмів, композиція може містити різні антибактеріальні і протигрибкові засоби, в тому числі, наприклад, і не обмежуючись названим, парабени, хлорбутанол, тімеросал, сорбінова кислота, і подібні відомі речовини зазначеного типу. Загалом, фармацевтична композиція за винаходом може включати, наприклад, щонайменше, близько 0,01% по вазі активного інгредієнта. Зокрема, композиція може містити активний інгредієнт у кількості від 1% до 75% за вагою одиниці композиції або, наприклад, від 25% до 60% за вагою, але не обмежуючись зазначеними значеннями. Фактична кількість дози композиції за даним винаходом, введена пацієнтам, включаючи людину, має визначатися фізичними і фізіологічними факторами, наприклад, такими як вага тіла, тяжкість стану хворого, вид захворювання, яке лікують, попередні або супутні терапевтичні втручання і спосіб введення композиції. Підходяща одинична доза, загальна доза та концентрація активного інгредієнта в композиції повинна визначатися лікарем. Композиція може, наприклад, вводитися при дозуванні від близько 1 мкг / кг маси тіла до, приблизно, 1000 мг / кг маси тіла пацієнта, наприклад, в діапазоні від 5 мг / кг маси тіла до 100 мг / кг маси тіла або в діапазоні від 5 мг / кг маси тіла до 500 мг / кг маси тіла. Злитий протеїн і композиції, що його включають, проявляють протиракову або протипухлинну активність і можуть бути використані для лікування ракових захворювань. Винахід також відноситься до застосування злитого протеїну за винаходом, як визначено вище, для лікування онкологічних захворювань у ссавців, включаючи людину. Винахід також відноситься до способу лікування онкологічних захворювань у ссавців, у тому числі людини, що включає введення пацієнту, потребуючому такого лікування, протиракової ефективної кількості злитого протеїну за винаходом, як визначено вище, опційно, у вигляді відповідної фармацевтичної композиції. Злитий протеїн за винаходом може бути використаний для лікування гематологічних злоякісних новоутворень, таких як лейкемія, гранулематоз, мієлома та інших гематологічних злоякісних новоутворень. Злитий протеїн також може бути використаний для лікування щільних пухлин, таких як рак молочної залози, рак легені, в тому числі недрібноклітинний рак легені, рак товстої кишки, рак підшлункової залози, рак яєчників, рак сечового міхура, рак простати, рак нирки, рак мозку тощо. Відповідні шляхи введення злитого протеїну при лікуванні раку, зокрема, включають парентеральний шлях, який полягає у введенні злитого протеїну за винаходом у вигляді ін'єкцій або інфузій (вливань), застосовуючи композицію і форму, прийнятну для такого шляху введення. Винахід більш детально розкрито в описі наступних загальних процедур і прикладів специфічних злитих протеїнів. Загальна процедура гіперекспресії злитого протеїну Приготування плазміди Амінокислотна послідовність цільового злитого протеїну була використана в якості шаблону для генерування кодуючої його послідовності ДНК, що містить кодони, оптимізовані для експресії в Escherichia coli (кишковій паличці). Така процедура дозволяє збільшити ефективність наступної операції синтезу цільового протеїну в Escherichia coli (кишковій паличці). Далі була 17 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 автоматично синтезована результуюча нуклеотидна послідовність. Крім того, ділянки розщеплення ферментів рестрикції NdeI (на 5'-кінці ведучої нитки) і XhoI (на 3'-кінці ведучої нитки) були додані до результуючого гену, що кодує цільовий протеїн. Вони були використані для клонування гену у векторі pET28a (Novagen). Вони також можуть бути використані для клонування гену, що кодує протеїн для інших векторів. Цільовий протеїн, експресований з даної структури, був забезпечений на N-кінці полігістидиновим тегом (шість гістидинів), якому передує ділянка, розпізнана (активізована) тромбіном, що згодом застосовується для його очищення за допомогою афінної хроматографії. Коректність отриманої структури була підтверджена, поперше, дослідженням рестрикції виділених плазмід із застосуванням ферментів NdeI і XhoI, а потім автоматичним секвенуванням усієї рамки зчитування цільового протеїну. Праймери, використані для секвенування, стали доповненням до послідовностей промотора T7 (5'TAATACGACTCACTATAGG-3 ') і термінатора T7 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'), присутніх у векторі. Результуюча плазміда була використана для гіперекспресії цільового злитого протеїну в комерційному штамі E. coli, який був трансформований у відповідності до рекомендацій виробника. Колонії, отримані на селективному середовищі (LB агар, канаміцин (50 мкг / мл), 1% розчин глюкози), були використані для підготовки нічної культури в рідкому середовищі LB, доповнені канаміцином (50 мкг / мл) і 1% глюкозою. Через 15 годин росту культури, отримані в перемішувальному інкубаторі, були застосовані для інокуляції відповідної заданої культури. Гіперекспресія і очищення злитих протеїнів - загальна процедура А LB середовище з канаміцином (30 мкг / мл) і 100 мкМ (UM) сульфату цинку інокулювали нічною культурою. Культуру інкубували при 37 °С до тих пір, поки оптична щільність (OD) при 600 нм не досягала 0,60-0,80. Потім додавали IPTG до отримання кінцевої концентрації в діапазоні 0,25-1мМ. Після перемішувальної інкубації (3,5 – 20год.) при 25 °C культуру центрифугували протягом 25 хв при 6000g). Бактеріальні гранули повторно суспендували в буфері, що містить 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 10 мМ імідазолу, рН 7,4. Суспензію обробляли ультразвуком на льоду протягом 8 хвилин (40% - амплітуда, 15-секундний імпульс, інтервал 10с) Отриманий екстракт освітлювали центрифугуванням протягом 40 хвилин при 20000 g, 4 °С. Смолу Ni-Sepharose (Ni-. сефароза) (GE Healthcare) попередньо обробляли методом урівноваження буфером, який використовували для приготування екстракту бактеріальних клітин. Далі смолу інкубували протягом ночі при 4 °С з супернатантом, отриманим після центрифугування екстракту. Далі її завантажували в хроматографічну колонку і промивали від 15 до 50 об'ємами буфера 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 20 мМ імідазолу, рН 7,4. Отриманий протеїн елюїрували з колонки з використанням градієнту імідазолу в буфері 50 мМ KH2PO4 з 0,5 М NaCl, рН 7,4. Одержані фракції досліджували (аналізували) за допомогою SDS-PAGE. Відповідні фракції об'єднували і діалізували протягом ночі при 4 °С проти 50 мМ Тріс-буфера, рН 7,2, 150 мМ NaCl, 500 мМ Lаргініну, 0,1 мМ ZnSO4, 0,01% Твін (Твін) 20, і в той же час Histag розщеплювали тромбіном (1:50). Після розщеплення тромбін був відділений від цільового злитого протеїну, завдяки TM використанню смоли Benzamidine Sepharose . Чистоту продукту досліджували із застосуванням SDS-PAGE - електрофорезу [Maniatis et al, Molecular Cloning. (Молекулярне клонування) Cold Spring Harbor, NY, 1982]. Гіперекспресія і очищення злитих протеїнів – загальна процедура В LB середовище з канаміцином (30 мкг / мл) і 100 мкМ сульфату цинку було інокульоване нічною культурою. Культуру інкубували при 37 °С до тих пір, поки оптична щільність (OD) при 600 нм не досягала 0,60-0,80. Далі додавали IPTG до отримання кінцевої концентрації в діапазоні 0,5-1мм. Після 20 - годинної перемішувальної інкубації при 25 °C культуру центрифугували протягом 25 хв при 6000 g. Після гіперекспресії бактеріальні клітини були зруйновані у френч-пресі у буфері, що містить 50 мМ KH2PO4, 0.5 M NaCl, 10 мM імідазолу, 5мM бета-меркаптоетанолу, 0,5 мкм PMSF (фенілметілсульфоніл флуориду (фториду), рН 7,8. Отриманий екстракт освітлювали центрифугуванням протягом 50 хвилин при 80000 g. Смолу Ni-Sepharose (Ni-сефарозу) інкубували протягом ночі з отриманим супернатантом. Після цього смолу зі зв'язаним протеїном упаковували в хроматографічну колонку. Для вимивання фракцій, що містять незв'язувальні протеїни, колонку промивали від 15 до 50 об'ємами буферу 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 10 мМ імідазолу, 5 мМ бета-меркаптоетанолу, 0,5 мМ PMSF (фенілметілсульфоніл флуориду (фториду), рН 7,8. Далі, щоб вимити більшість протеїнів, специфічно зв'язуючих із шаром (постіллю), колонку промивали буфером, що містить 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 500 мМ імідазолу, 10% гліцерину, 0,5 мм PMSF, рН 7, 5. 18 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 Отримані фракції досліджували із застосуванням SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning (Молекулярне клонування). Cold Spring Harbor, NY, 1982). Фракції, що містять цільовий протеїн, об'єднували і розщеплювали тромбіном (1U на 4 мг протеїну, 8 годин при 16 º C), щоб видалити полігістидиновий тег (мітку). Потім фракції піддавали діалізу проти буфера (500 мМ L-аргініну, 50 мМ Тріс (Tris), 2,5 мМ ZnSO4, рН 7,4). Кваліфікація злитих протеїнів з використанням 2-D електрофорезу З метою подальшого вивчення отриманих протеїнів і підбору точних хроматографічних режимів, були визначені ізоелектричні точки протеїнів. Для цього був застосований спосіб двовимірного електрофорезу (2-D), виконаний в два етапи у відповідності з наступним графіком. Етап 1. Ізоелектричне фокусування протеїнів в умовах градієнту рН і в умовах денатурації. Протеїнові препарати при концентрації 1 - 2 мг / мл осаджувалися шляхом змішування в співвідношенні 1:01 з розчином осаду, що містить 10% трихлоруксусної кислоти і 0,07% бетамеркаптоетанолу в ацетоні. Суміш інкубували протягом 30 хв. при температурі -20 °С, а потім центрифугували протягом 25 хв. при 15000 g і 4 °C. Супернатант видаляли, а осад двічі промивали холодним ацетоном з 0,07% бета-меркаптоетанолом. Потім залишки ацетону випарювали до зникнення запаху. Осад протеїну суспендували в 250 мл буфера регідратації 8 М сечовини, 1% CHAPS, 15 мМ DTT, 0,5% амфоліту (GE Healthcare) з профілем рН 3-11 або 611, в залежності від використовуваної в подальшому смуги. Розчин протеїну поміщали в керамічну камеру для ізоелектричного фокусування, а потім досліджували за допомогою пристрою 13 см DryStrip (GE Healthcare) з відповідним профілем рН (3-11 або 6-11). Весь вміст було покрито шаром мінерального масла. Камери були розміщені в Ettan IPGphor III апараті, де ізоелектричне фокусування було проведено відповідно до наступної програми, призначеної для обраних розмірів смуги і рН профілю: 16 годин дегідратації при 20 °C. Фокусування в електричному полі при фіксованому градієнті рН Час 1година 1 година 2 години 30хвилин 30 хвилин 30 35 40 45 50 Напруга 500 В градієнт 500-1000 В градієнт 1000-8000 В 8000 В Далі смугу, що містить сфокусовані протеїни промивали протягом 1 хвилини у деіонізованій воді, фарбували кумасі діамантовим (Coomassie Brilliant), а потім знебарвлювали і архівували в якості зображення, щоб відзначити розташування протеїнів. Знебарвлену смугу врівноважували 2 х 15 хв. буфером, що має наступний склад: 50 мМ Tris-HCl, рН 8,8, 6М сечовини, 1% DTT, 2% SDS, 30% гліцерину. Етап 2. Відділення (розділення) в другому напрямку за допомогою SDS-PAGE. Смуга була поміщена на 12,5% поліакриламідний гель, що містить єдину лунку на стандартний розмір, після чого проводили відділення в апараті для здійснення електрофорезу SDS-PAGE при напрузі 200 В протягом 3 годин. Гель фарбували кумасі діамантовим, а потім архівували з нанесеною шкалою. Протеїн ідентифікували шляхом визначення ваги на основі стандарту розміру, при цьому його IPI був прочитаний для шкали 6-11 на основі кривих, наданих виробником (GE Healthcare) (відношення рН% до% довжини смуги з кінця, поміченого як анод), або для шкали 3-11 на основі кривої, визначеної експериментально за допомогою ізоелектричного фокусуючого калібрувального комплекту (GE Healthcare). Типові приклади злитих протеїнів за винаходом, описані нижче. Приклад 1. Злитий протеїн SEQ. No. 1 Протеїн послідовності SEQ. No. 1 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 194 амінокислот, і масу 22,7 кДа, в якому на N-кінці послідовності TRAIL121-281 16амінокислотний пептид, отриманий з домену BH3 протеїну Bax (SEQ. No. 30), приєднаний в якості ефекторного пептиду. На С-кінці 16-амінокислотної послідовності ефекторниого пептиду приєднана поліаргінінова послідовність з 7 Arg / R залишків. Поліаргінінова послідовність сприяє забезпеченню проникності клітинної мембрани і створює умови для транспортування злитого протеїну в клітину. Між поліаргініновою послідовністю і доменом TRAIL існують інкорпоровані послідовно один за одним послідовності, розпізнані урокіназою uPA (SEQ. No. 52) і металопротеїназою MMP (SEQ. No. 51), завдяки чому ефекторний пептид після інтерналізації злитого протеїну буде розщеплений в середовищі пухлинної клітини. 19 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No. 1 і SEQ. No. 67. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 1 1 KKLSECLKRI GDELDSRRRR RRRRVVRPLG LAGRVAAHIT GTRGRSNTLS 51 SPNSKNEKAL GRKINSWESS RSGHSFLSNL HLRNGELVIH EKGFYYIYSQ 101 TYFRFQEEIK ENTKNDKQMV QYIYKYTSYP DPILLMKSAR NSCWSKDAEY 151 GLYSIYQGGI FELKENDRIF VSVTNEHLID MDHEASFFGA FLVG ДНК послідовність: SEQ. No. 67 1 GCCCACCAGA AATGCACCAA AAAAGCTGGC TTCATGATCC ATATCAATCA GATGTTCATT GGTCACGCTC ACAAAAATGC GATCATTTTC TTTCAGTTCA 101 AAAATGCCAC CCTGATAAAT GCTATACAGG CCATATTCTG CATCTTTGCT CCAACAGCTA TTACGTGCGC TTTTCATCAG CAGAATCGGA TCCGGATAGC 201 TGGTATATTT ATAAATGTAC TGCACCATTT GTTTATCATT TTTGGTATTT TCTTTAATTT CTTCCTGAAA GCGAAAATAG GTCTGGCTAT AAATATAATA 301 AAAGCCTTTT TCATGAATCA CCAGTTCACC ATTACGCAGA TGCAGATTGC TCAGAAAGCT ATGACCGCTA CGGCTGCTTT CCCAGCTATT AATTTTGCGA 401 CCCAGGGCTT TTTCATTTTT GCTATTCGGG CTGCTCAGGG TATTGCTACG ACCACGGGTG CCGGTAATAT GTGCTGCAAC ACGACCTGCC AGACCCAGCG 501 GACGAACAAC ACGACGACGG CGACGACGAC GACGGCTATC CAGTTCATCA CCAATACGTT TCAGGCATTC GCTCAGTTTT TT Амінокислотна послідовність описаної вище структури була використана в якості шаблону для генерування її кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штами E. coli BL21 (DE3) і Tuner (DE3) pLysS, обидва з Novagen. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу у відповідності із загальною методикою (процедурою), описаною вище. Приклад 2. Злитий протеїн SEQ. No. 2 Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 2 являє собою протеїн, що має довжину, складену із 193 амінокислот, і масу 22, 5 кДа, в якому на N-кінці послідовності 121-281TRAIL 16амінокислотний пептид, отриманий з протеїну Bid (SEQ. No. 31), приєднаний в якості ефекторного пептиду. Крім того, до С-кінця ефекторного протеїну приєднана поліаргінінова послідовність, що складається з 7 Arg - залишків. Поліаргінінова послідовність сприяє забезпеченню проникності клітинної мембрани і створює умови для транспортування злитого протеїну в клітину. Між поліаргініновою послідовністю і послідовністю TRAIL існують інкорпоровані послідовно одна за одною послідовності, розпізнані урокіназою uPA (SEQ. No. 52) і металопротеїназою MMP (SEQ. No. 51) і урокіназою uPA (SEQ. No. 52), завдяки чому ефекторний пептид після інтерналізації злитого протеїну буде розщеплений в середовищі пухлинної клітини. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No. 2 і SEQ. No. 68. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 2 1 RNIARHLAQV GDSMDRRRRR RRRVVRPLGL AGRVAAHITG TRGRSNTLSS 51 PNSKNEKALG RKINSWESSR SGHSFLSNLH LRNGELVIHE KGFYYIYSQT 101 YFRFQEEIKE NTKNDKQMVQ YIYKYTSYPD PILLMKSARN SCWSKDAEYG 151 LYSIYQGGIF ELKENDRIFV SVTNEHLIDM DHEASFFGAF LVG ДНК послідовності: SEQ. No. 68 1 CGTAATATTG CACGTCATCT GGCACAGGTT GGTGATAGCA TGGACCGTCG TCGTCGTCGC CGTCGTCGTG TTGTTCGTCC GCTGGGTCTG GCAGGTCGTG 101 TTGCAGCACA TATTACCGGC ACCCGTGGTC GTAGCAATAC CCTGAGCAGC CCGAATAGCA AAAATGAAAA AGCCCTGGGT CGCAAAATTA ATAGCTGGGA 201 AAGCAGCCGT AGCGGTCATA GCTTTCTGAG CAATCTGCAT CTGCGTAATG GTGAACTGGT GATTCATGAA AAAGGCTTTT ATTATATTTA TAGCCAGACC 301 TATTTTCGCT TTCAGGAAGA AATTAAAGAA AATACCAAAA ATGATAAACA AATGGTGCAG TACATTTATA AATATACCAG CTATCCGGAT CCGATTCTGC 401 TGATGAAAAG CGCACGTAAT AGCTGTTGGA GCAAAGATGC AGAATATGGC CTGTATAGCA TTTATCAGGG TGGCATTTTT GAACTGAAAG AAAATGATCG 20 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 501 CATTTTTGTG AGCGTGACCA ATGAACATCT GATTGATATG GATCATGAAG CCAGCTTTTT TGGTGCATTT CTGGTGGGC Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам E. coli BL21 (DE3) з Novagen. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу у відповідності з загальною процедурою, описаною вище. Приклад 3. Злитий протеїн SEQ. No. 3 Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 3 являє собою протеїн, що має довжину, складену із 303 амінокислот, і масу 34,2 кДа, в якому на C-кінці послідовності 121-281TRAIL гомолог рибонуклеази RNase A (SEQ. No. 32) приєднаний в якості ефекторного пептиду. Між поліаргініновою послідовністю і послідовністю TRAIL інкорпоровані послідовно одна за одною послідовності, розпізнані металопротеїназою MMP (SEQ. No. 51) та урокіназою uPA (SEQ. No. 52), завдяки чому ефекторний пептид після інтерналізації злитого протеїну буде розщеплений в середовищі пухлинної клітини. Протеїн також містить між послідовністю домену TRAIL і послідовністю ділянок розщеплення гнучкий гліцин-сериновий лінкер GGSG (SEQ. No. 57). Крім того, на С-кінці ефекторного пептиду протеїн містить послідовність KEDL (SEQ. No. 56), направляючу в ендоплазматичний ретикулум, будучи також С-кінцевою частиною всієї конструкції. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No. 3 і SEQ. No. 69. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 3 1 RVAAHITGTR GRSNTLSSPN SKNEKALGRK INSWESSRSG HSFLSNLHLR 51 NGELVIHEKG FYYIYSQTYF RFQEEIKENT KNDKQMVQYI YKYTSYPDPI 101 LLMKSARNSC WSKDAEYGLY SIYQGGIFEL KENDRIFVSV TNEHLIDMDH 151 EASFFGAFLV GGGSGPLGLA GRVVRKETAA AKFERQHMDS STSAASSSNY 201 CNQMMKSRNL TKDRCKPVNT FVHESLADVQ AVCSQKNVAC KNGQTNCYQS 251 YSTMSITDCR ETGSSKYPNC AYKTTQANKH IIVACEGNPY VPVHFDASVK 301 EDL ДНК послідовність: SEQ. No. 69 1 CGTGTTGCAG CACATATTAC CGGCACCCGT GGTCGTAGCA ATACCCTGAG CAGCCCGAAT AGCAAAAATG AAAAAGCCCT GGGTCGCAAA ATTAATAGCT 101 GGGAAAGCAG CCGTAGCGGT CATAGCTTTC TGAGCAATCT GCATCTGCGT AATGGTGAAC TGGTGATTCA TGAAAAAGGC TTTTATTATA TTTATAGCCA 201 GACCTATTTT CGCTTTCAGG AAGAAATTAA AGAAAATACC AAAAATGACA AACAAATGGT GCAGTATATC TACAAATACA CCAGCTATCC GGATCCGATT 301 CTGCTGATGA AAAGCGCACG TAATAGCTGT TGGAGCAAAG ATGCAGAATA TGGCCTGTAT AGCATTTATC AGGGTGGCAT TTTTGAACTG AAAGAAAATG 401 ATCGCATTTT TGTGAGCGTG ACCAATGAAC ATCTGATTGA TATGGATCAT GAAGCCAGCT TTTTTGGTGC ATTTCTGGTT GGTGGTGGTA GCGGTCCGCT 501 GGGTCTGGCA GGTCGTGTTG TTCGTAAAGA AACCGCAGCA GCCAAATTTG AACGTCAGCA CATGGATAGC AGCACCAGCG CAGCAAGCAG CAGCAATTAT 601 TGCAATCAGA TGATGAAAAG CCGCAATCTG ACCAAAGATC GTTGTAAACC GGTGAATACC TTTGTTCATG AAAGCCTGGC AGATGTTCAG GCAGTTTGCA 701 GCCAGAAAAA TGTGGCCTGT AAAAATGGTC AGACCAATTG CTATCAGAGC TATAGCACCA TGAGCATTAC CGATTGTCGT GAAACCGGTA GCAGCAAATA 801 TCCGAATTGC GCCTATAAAA CCACCCAGGC CAATAAACAT ATTATTGTGG CCTGTGAAGG CAATCCGTAT GTTCCGGTTC ATTTTGATGC CAGCGTGAAA 901 GAAGATCTG Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штам E. coli BL21 (DE3) з Novagen. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. Приклад 4. Злитий протеїн SEQ. No. 4 21 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Протеїн послідовності SEQ. No. 4 представляє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 293 амінокислот, і масу 33,2 кДа, в якому на C-кінці послідовності 121-281TRAIL гомолог рибонуклеази RNase A (SEQ. No. 32) приєднаний в якості ефекторного пептиду. Між ефекторним пептидом і послідовністю TRAIL є гнучкий гліцин-сериновий лінкер GGGSGGGS (SEQ. No. 63). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No. 4 і SEQ. No. 70. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 4 1 RVAAHITGTR GRSNTLSSPN SKNEKALGRK INSWESSRSG HSFLSNLHLR 51 NGELVIHEKG FYYIYSQTYF RFQEEIKENT KNDKQMVQYI YKYTSYPDPI 101 LLMKSARNSC WSKDAEYGLY SIYQGGIFEL KENDRIFVSV TNEHLIDMDH 151 EASFFGAFLV GGGGSGGGSK ETAAAKFERQ HMDSSTSAAS SSNYCNQMMK 201 SRNLTKDRCK PVNTFVHESL ADVQAVCSQK NVACKNGQTN CYQSYSTMSI 251 TDCRETGSSK YPNCAYKTTQ ANKHIIVACE GNPYVPVHFD ASV ДНК послідовність SEQ. No. 70 1 CGTGTTGCAG CACATATTAC CGGCACCCGT GGTCGTAGCA ATACCCTGAG CAGCCCGAAT AGCAAAAATG AAAAAGCACT GGGTCGCAAA ATTAATAGCT 101 GGGAAAGCAG CCGTAGCGGT CATAGCTTTC TGAGCAATCT GCATCTGCGT AATGGTGAAC TGGTGATTCA TGAAAAAGGC TTTTATTATA TTTATAGCCA 201 GACCTATTTT CGCTTTCAAG AAGAAATTAA AGAAAATACC AAAAATGATA AGCAGATGGT GCAGTATATC TATAAATATA CCAGCTATCC GGATCCGATT 301 CTGCTGATGA AAAGCGCACG TAATAGCTGT TGGAGCAAAG ATGCAGAATA TGGTCTGTAT AGCATTTATC AGGGTGGCAT TTTTGAACTG AAAGAAAATG 401 ATCGCATTTT TGTGAGCGTG ACCAATGAAC ATCTGATTGA TATGGATCAT GAAGCCAGCT TTTTTGGTGC ATTTCTGGTT GGTGGTGGTG GTAGCGGTGG 501 TGGTAGTAAA GAAACCGCAG CAGCAAAATT TGAACGTCAG CACATGGATA GCAGCACCAG CGCAGCAAGC AGCAGCAATT ATTGTAATCA GATGATGAAA 601 AGCCGCAATC TGACCAAAGA TCGTTGTAAA CCGGTGAATA CCTTTGTTCA TGAAAGCCTG GCAGATGTTC AGGCAGTTTG TAGCCAGAAA AATGTTGCCT 701 GTAAAAATGG TCAGACCAAT TGCTATCAGA GCTATAGCAC CATGAGCATT ACCGATTGTC GTGAAACCGG TAGCAGCAAA TATCCGAATT GTGCATATAA 801 AACCACCCAG GCCAATAAAC ATATTATTGT TGCCTGTGAA GGCAATCCGT ATGTTCCGGT TCATTTTGAT GCAAGCGTT Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штами E. coli BL21DE3pLysSRIL из Stratagene и Tuner (DE3) з Novagen. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. Приклад 5.Злитий протеїн SEQ. No. 5 Протеїн послідовності SEQ. No. 5 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 283 амінокислот, і масу 31 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281TRAIL в якості ефекторного пептиду приєднана послідовність цитохрому C (SEQ. No. 33). Між послідовністю домену TRAIL і послідовністю ефекторного протеїну інкорпоровані послідовно одна за одною послідовності, розпізнані металопротеїназою MMP (SEQ. No. 51) та урокіназою uPA (SEQ. No. 52), завдяки чому ефекторний пептид після інтерналізації злитого протеїну буде розщеплений в середовищі пухлинної клітини . Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 1, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No. 5 і SEQ. No. 71. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 5 1 RVAAHITGTR GRSNTLSSPN SKNEKALGRK INSWESSRSG HSFLSNLHLR 51 NGELVIHEKG FYYIYSQTYF RFQEEIKENT KNDKQMVQYI YKYTSYPDPI 101 LLMKSARNSC WSKDAEYGLY SIYQGGIFEL KENDRIFVSV TNEHLIDMDH 151 EASFFGAFLV GGGSGPLGLA GRVVRGDVEK GKKIFIMKCS QCHTVEKGGK 201 HKTGPNLHGL FGRKTGQAPG YSYTAANKNK GIIWGEDTLM EYLENPKKYI 251 PGTKMIFVGI KKKEERADLI AYLKKATNEK EDL ДНК послідовність: SEQ. No. 71 22 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1 CAGATCTTCT TTTTCATTGG TGGCTTTTTT CAGATAGGCA ATCAGATCTG CGCGTTCTTC TTTTTTTTTA ATGCCCACAA AAATCATTTT CGTACCCGGA 101 ATATATTTTT TCGGATTTTC CAGATATTCC ATCAGGGTAT CTTCACCCCA AATAATGCCT TTGTTTTTAT TGGCTGCGGT ATAGCTATAA CCCGGTGCCT 201 GACCGGTTTT ACGACCAAAC AGACCATGCA GATTCGGACC GGTTTTATGT TTGCCACCTT TTTCAACGGT ATGACACTGG CTGCATTTCA TAATAAAAAT 301 TTTTTTGCCT TTTTCCACAT CACCACGAAC AACACGACCT GCCAGACCCA GCGGACCGCT ACCACCACCA ACCAGAAATG CACCAAAAAA GCTGGCTTCA 401 TGATCCATAT CAATCAGATG TTCATTGGTC ACGCTCACAA AAATGCGATC ATTTTCTTTC AGTTCAAAAA TGCCACCCTG ATAAATGCTA TACAGGCCAT 501 ATTCTGCATC TTTGCTCCAA CAGCTATTAC GTGCGCTTTT CATCAGCAGA ATCGGATCCG GATAGCTGGT ATATTTATAA ATGTACTGCA CCATTTGTTT 601 ATCGTTTTTG GTATTTTCTT TAATTTCTTC CTGAAAGCGA AAATAGGTCT GGCTATAAAT ATAATAAAAG CCTTTTTCAT GAATCACCAG TTCACCATTA 701 CGCAGATGCA GATTGCTCAG AAAGCTATGA CCGCTACGGC TGCTTTCCCA GCTATTAATT TTGCGACCCA GGGCTTTTTC ATTTTTGCTA TTCGGGCTGC 801 TCAGGGTATT GCTACGACCA CGGGTGCCGG TAATATGTGC TGCAACACGC AT Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам E. coli Tuner (DE3) з Novagen. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. Приклад 6. Злитий протеїн SEQ. No. 6 Протеїн послідовності SEQ. No. 6 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 407 амінокислот, і масу 45,2 кДа, в якому на C-кінці послідовності 121-281TRAIL послідовність цитохрому С (SEQ. No. 33) приєднана в якості ефекторного пептиду. Між послідовністю домену TRAIL і ефекторним пептидом розташована послідовність, розпізнана фурином (SEQ. No. 53), і домен транслокації Pseudomonas aeruginosa (SEQ. No. 54). Протеїн також містить гнучкі лінкери: між послідовністю TRAIL-послідовності і послідовністю ділянки розщеплення, розпізнаної фурином, є гнучкий гліцин-сериновий лінкер GGGS (SEQ. No. 58), між послідовністю ділянки розщеплення, розпізнаної фурином, і доменом транслокації з Pseudomonas aeruginosa є гнучкий гліцин-сериновий лінкер ASGG (SEQ. No. 65), а також між послідовністю домену транслокації і послідовністю цитохрому С є гнучкий гліцин-сериновий лінкер GGGSGGG (SEQ. No. 62). Крім того, на С-кінці домену ефекторного пептиду протеїн містить послідовність KEDL (SEQ. No. 56), направляючу в ендоплазматичний ретикулум, будучи також С-кінцевою частиною всієї конструкції. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 2, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No. 6 і SEQ. No. 72. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 6 1 RVAAHITGTR GRSNTLSSPN SKNEKALGRK INSWESSRSG HSFLSNLHLR 51 NGELVIHEKG FYYIYSQTYF RFQEEIKENT KNDKQMVQYI YKYTSYPDPI 101 LLMKSARNSC WSKDAEYGLY SIYQGGIFEL KENDRIFVSV TNEHLIDMDH 151 EASFFGAFLV GGGGSRKKRA SGGPEGGSLA ALTAHQACHL PLETFTRHRQ 201 PRGWEQLEQC GYPVQRLVAL YLAARLSWNQ VDQVIANALA SPGSGGDLGE 251 AIRESPEQAR LALTLAAAES ERFVRQGTGN DEAGAANGPA DGGGSGGGMG 301 DVEKGKKIFI MKCSQCHTVE KGGKHKTGPN LHGLFGRKTG QAPGYSYTAA 351 NKNKGIIWGE DTLMEYLENP KKYIPGTKMI FVGIKKKEER ADLIAYLKKA 401 TNEKDEL ДНК послідовність: SEQ. No. 72 1 CGTGTTGCAG CACATATTAC CGGCACCCGT GGTCGTAGCA ATACCCTGAG CAGCCCGAAT AGCAAAAATG AAAAAGCACT GGGTCGCAAA ATTAATAGCT 101 GGGAAAGCAG CCGTAGCGGT CATAGCTTTC TGAGCAATCT GCATCTGCGT AATGGTGAAC TGGTGATTCA TGAAAAAGGC TTTTATTATA TTTATAGCCA 201 GACCTATTTT CGCTTTCAAG AAGAAATTAA AGAAAATACC AAAAATGACA AACAAATGGT GCAGTATATC TATAAATATA CCAGCTATCC GGATCCGATT 301 CTGCTGATGA AAAGCGCACG TAATAGCTGT TGGAGCAAAG ATGCAGAATA TGGTCTGTAT AGCATTTATC AGGGTGGCAT TTTTGAACTG AAAGAAAATG 23 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 401 ATCGCATTTT TGTGAGCGTG ACCAATGAAC ATCTGATTGA TATGGATCAT GAAGCCAGCT TTTTTGGTGC ATTTCTGGTT GGTGGTGGTG GTAGCCGTAA 501 AAAACGTGCA AGCGGTGGTC CGGAAGGTGG TAGCCTGGCA GCACTGACCG CACATCAGGC ATGTCATCTG CCGCTGGAAA CCTTTACCCG TCATCGTCAG 601 CCTCGTGGTT GGGAACAGCT GGAACAGTGT GGTTATCCGG TTCAGCGTCT GGTTGCACTG TATCTGGCAG CACGTCTGAG CTGGAATCAG GTTGATCAGG 701 TTATTGCAAA TGCACTGGCA AGTCCGGGTA GCGGTGGTGA TCTGGGTGAA GCAATTCGTG AAAGTCCGGA ACAGGCACGT CTGGCACTGA CCCTGGCAGC Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам E. coli Tuner (DE3) з Novagen. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. Приклад 7.Злитий протеїн SEQ. No. 7 Протеїн послідовності SEQ. No. 7 представляє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 409 амінокислот, і масу 46,1 кДа, в якому на N-кінці послідовності 114-281TRAIL в якості ефекторного пептиду приєднана послідовність гранзіму В (SEQ. No. 34). Між послідовністю домену TRAIL і послідовністю гранзіму В ефекторного протеїну розташована послідовність ділянки розщеплення фурину (SEQ. No. 53), додатково оточена (що межує з) гнучкими гліцин-сериновими лінкерами GGGGS (SEQ. No. 59). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 2, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No. 7 і SEQ. No. 73. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 7 1 IIGGHVAKPH SRPYMAYLMI WDQKSLKRCG GFLIRDDFVL TAAHCWGSSI 51 NVTLGAHNIK EQEPTQQFIP VKRAIPHPAY NPKNFSNDIM LLQLERKAKR 101 TRAVQPLRLP SNKAQVKPGQ TCSVAGWGQT APLGKHSHTL QEVKMTVQED 151 RKCESDLRHY YDSTIELCVG DPEIKKTSFK GDSGGPLVCN KVAQGIVSYG 201 RNNGMPPRAC TKVSSFVHWI KKTMKRYGGG GSRKKRGGGG SVRERGPQRV 251 AAHITGTRGR SNTLSSPNSK NEKALGRKIN SWESSRSGHS FLSNLHLRNG 301 ELVIHEKGFY YIYSQTYFRF QEEIKENTKN DKQMVQYIYK YTSYPDPILL 351 MKSARNSCWS KDAEYGLYSI YQGGIFELKE NDRIFVSVTN EHLIDMDHEA 401 SFFGAFLVG ДНК послідовність: SEQ. No. 73 1 CGTGTTGCAG CACATATTAC CGGCACCCGT GGTCGTAGCA ATACCCTGAG CAGCCCGAAT AGCAAAAATG AAAAAGCCCT GGGTCGTAAA ATTAATAGCT 101 GGGAAAGCAG CCGTAGCGGT CATAGCTTTC TGAGCAATCT GCATCTGCGT AATGGCGAAC TGGTGATTCA TGAAAAAGGC TTTTATTATA TTTATAGCCA 201 GACCTATTTT CGCTTTCAGG AAGAAATTAA AGAAAATACC AAAAATGATA AACAAATGGT GCAGTATATC TATAAATATA CCAGCTATCC GGATCCGATT 301 CTGCTGATGA AAAGCGCACG TAATAGCTGT TGGAGCAAAG ATGCCGAATA TGGTCTGTAT AGCATTTATC AGGGTGGCAT TTTTGAACTG AAAGAAAATG 401 ATCGCATTTT TGTGAGCGTG ACCAATGAAC ATCTGATTGA TATGGATCAT GAAGCCAGCT TTTTTGGTGC ATTTCTGGTT GGTGGTGGTG GTAGCCGTAA 501 AAAACGTGGT GGTGGCGGTT CTATTATTGG TGGTCATGTT GCAAAACCGC ATAGCCGTCC GTATATGGCA TATCTGATGA TTTGGGATCA GAAAAGCCTG 601 AAACGTTGTG GTGGCTTTCT GATTCGTGAT GATTTTGTTC TGACCGCAGC ACATTGTTGG GGTAGCAGCA TTAATGTTAC CCTGGGTGCC CATAATATTA 701 AAGAACAGGA ACCGACCCAG CAGTTTATTC CGGTTAAACG TGCAATTCCG CATCCGGCAT ATAATCCGAA AAATTTTAGC AATGATATCA TGCTGCTGCA 801 GCTGGAACGT AAAGCAAAAC GTACCCGTGC AGTTCAGCCG CTGCGTCTGC CGAGCAATAA AGCACAGGTT AAACCGGGTC AGACCTGTAG CGTTGCAGGT 901 TGGGGTCAGA CCGCACCGCT GGGTAAACAT TCTCATACCC TGCAAGAGGT TAAAATGACC GTCCAAGAGG ATCGTAAATG CGAAAGCGAT CTGCGCCATT 1001 ATTATGATAG CACCATTGAA CTGTGTGTGG GCGATCCGGA AATCAAAAAA ACCAGCTTTA AAGGTGATAG CGGTGGTCCG CTGGTTTGTA ATAAAGTTGC 1101 CCAGGGTATT GTTAGCTATG GTCGTAATAA TGGTATGCCG CCGCGTGCAT GTACCAAAGT TAGCAGCTTT GTGCATTGGA TTAAAAAAAC GATGAAACGC 24 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1201 TATAAAGATG AACTG Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам E. coli Tuner (DE3) з Novagen. Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. Приклад 8. Злитий протеїн SEQ. No. 8 Протеїн послідовності SEQ. No. 8 є злитий протеїн, що має довжину, складену із 405 амінокислот, і масу 45,7 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281TRAIL в якості ефекторного пептиду приєднана послідовність гранзіму В (SEQ. No. 34). Між послідовністю домену TRAIL і послідовністю ефекторного пептиду є послідовність ділянки розщеплення фурину (SEQ. No. 53), додатково відокремлена від послідовностей як гранзіму В, так і TRAIL за допомогою гнучких гліцин-серинових линкерів GGGS (Sekw. Nr 58) і GGGGS (SEQ. No. 59), відповідно. Крім того, на С-кінці ефекторного пептиду протеїн містить послідовність KDEL, направляючу ендоплазматичний ретикулум, який є частиною С-закінчення всієї конструкції. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 2, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No. 8 і SEQ. No. 74. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 8 1 RVAAHITGTR GRSNTLSSPN SKNEKALGRK INSWESSRSG HSFLSNLHLR 51 NGELVIHEKG FYYIYSQTYF RFQEEIKENT KNDKQMVQYI YKYTSYPDPI 101 LLMKSARNSC WSKDAEYGLY SIYQGGIFEL KENDRIFVSV TNEHLIDMDH 151 EASFFGAFLV GGGGSRKKRG GGGSIIGGHV AKPHSRPYMA YLMIWDQKSL 201 KRCGGFLIRD DFVLTAAHCW GSSINVTLGA HNIKEQEPTQ QFIPVKRAIP 251 HPAYNPKNFS NDIMLLQLER KAKRTRAVQP LRLPSNKAQV KPGQTCSVAG 301 WGQTAPLGKH SHTLQEVKMT VQEDRKCESD LRHYYDSTIE LCVGDPEIKK 351 TSFKGDSGGP LVCNKVAQGI VSYGRNNGMP PRACTKVSSF VHWIKKTMKR 401 YKDEL ДНК послідовність SEQ. No. 74 1 CGTGTTGCAG CACATATTAC CGGCACCCGT GGTCGTAGCA ATACCCTGAG CAGCCCGAAT AGCAAAAATG AAAAAGCACT GGGTCGCAAA ATTAATAGCT 101 GGGAAAGCAG CCGTAGCGGT CATAGCTTTC TGAGCAATCT GCATCTGCGT AATGGTGAAC TGGTGATTCA TGAAAAAGGC TTTTATTATA TTTATAGCCA 201 GACCTATTTT CGCTTTCAAG AAGAAATTAA AGAAAACACC AAAAATGATA AACAAATGGT GCAGTATATT TACAAATATA CCAGCTATCC GGATCCGATT 301 CTGCTGATGA AAAGCGCACG TAATAGCTGT TGGAGCAAAG ATGCAGAATA TGGTCTGTAT AGCATTTATC AGGGTGGCAT TTTTGAACTG AAAGAAAATG 401 ATCGCATTTT TGTGAGCGTG ACCAATGAAC ATCTGATTGA TATGGATCAT GAAGCCAGCT TTTTTGGTGC ATTTCTGGTT GGTGGTGGTG GTAGCCGTAA 501 AAAACGTGGT GGTGGCGGTA GTATTATTGG TGGTCATGTT GCAAAACCGC ATAGCCGTCC GTATATGGCA TATCTGATGA TTTGGGATCA GAAAAGCCTG 601 AAACGTTGTG GTGGTTTTCT GATTCGTGAT GATTTTGTTC TGACCGCAGC ACATTGTTGG GGTAGCAGCA TTAATGTTAC CCTGGGTGCC CATAATATTA 701 AAGAACAAGA ACCGACCCAG CAGTTTATTC CGGTTAAACG TGCAATTCCG CATCCGGCAT ATAATCCGAA AAATTTTAGC AATGATATTA TGCTGCTGCA 801 GCTGGAACGC AAAGCAAAAC GTACCCGTGC AGTTCAGCCG CTGCGTCTGC CGAGCAATAA AGCACAGGTT AAACCGGGTC AGACCTGTAG CGTTGCAGGT 901 TGGGGTCAGA CCGCACCGCT GGGTAAACAT TCACATACCC TGCAAGAGGT GAAAATGACC GTTCAAGAGG ATCGTAAATG CGAAAGCGAT CTGCGCCATT 1001 ATTATGATAG CACCATTGAA CTGTGTGTTG GTGATCCGGA AATTAAAAAA ACCAGCTTTA AAGGCGATAG CGGTGGTCCG CTGGTTTGTA ATAAAGTTGC 1101 ACAGGGTATT GTGAGCTATG GTCGTAATAA TGGTATGCCT CCGCGTGCAT GTACCAAAGT TAGCAGCTTT GTGCATTGGA TTAAAAAAAC GATGAAACGC 1201 TATAAAGATG AACTG Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена 25 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам E. coli Tuner (DE3) pLysS з Novagen Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. Приклад 9. Злитий протеїн SEQ. No. 9 Протеїн послідовності SEQ. No. 9 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену із 187 амінокислот, і масу 21,9 кДа, в якому на N-кінці послідовності 121-281TRAIL в якості ефекторного пептиду приєднаний 9-амінокислотний пептид, отриманий з Nur77 протеїну (SEQ. No. 35), при цьому послідовність поліаргініну, що складається з семи Arg-залишків, додатково приєднана на С-кінці ефекторного пептиду. Між ефекторним пептидом і послідовністю TRAIL розташована послідовність ділянок розщеплення для металопротеїнази MMP (SEQ. No. 51) і урокінази uPA (SEQ. No. 52). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 2, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No. 9 і SEQ. No. 75. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 9 1 FSRSLHSLLR RRRRRRRVVR PLGLAGRVAA HITGTRGRSN TLSSPNSKNE 51 KALGRKINSW ESSRSGHSFL SNLHLRNGEL VIHEKGFYYI YSQTYFRFQE 101 EIKENTKNDK QMVQYIYKYT SYPDPILLMK SARNSCWSKD AEYGLYSIYQ 151 GGIFELKEND RIFVSVTNEH LIDMDHEASF FGAFLVG ДНК послідовність: SEQ. No. 75 1 TTTAGCCGTA GCCTGCATAG CCTGCTGCGT CGTCGTCGTC GCCGTCGTCG TGTTGTTCGT CCGCTGGGTC TGGCAGGTCG TGTTGCAGCA CATATTACCG 101 GCACCCGTGG TCGTAGCAAT ACCCTGAGCA GCCCGAATAG CAAAAATGAA AAAGCCCTGG GTCGCAAAAT TAATAGCTGG GAAAGCAGCC GTAGCGGTCA 201 TAGCTTTCTG AGCAATCTGC ATCTGCGTAA TGGTGAACTG GTGATTCATG AAAAAGGCTT TTATTATATT TATAGCCAGA CCTATTTTCG CTTTCAGGAA 301 GAAATTAAAG AAAATACCAA AAATGATAAA CAAATGGTGC AGTACATTTA TAAATATACC AGCTATCCGG ATCCGATTCT GCTGATGAAA AGCGCACGTA 401 ATAGCTGTTG GAGCAAAGAT GCAGAATATG GCCTGTATAG CATTTATCAG GGTGGCATTT TTGAACTGAA AGAAAATGAT CGCATTTTTG TGAGCGTGAC 501 CAATGAACAT CTGATTGATA TGGATCATGA AGCCAGCTTT TTTGGTGCAT TTCTGGTGGG C Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штам E. coli Rosetta (DE3 з Novagen Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. Приклад 10. Злитий протеїн SEQ. No. 10 Протеїном послідовності SEQ. No. 10 є злитий протеїн, що має довжину, складену з 193 амінокислот, і масу 22,4 кДа, в якому на N-кінці послідовності 121-281TRAIL в якості ефекторного пептиду приєднаний 16-амінокислотний пептид, що містить домен BH3 протеїну Bak (SEQ. No . 36), при цьому мембрана-проникаюча поліаргінінова послідовність, що складається з семи Arg-залишків, додатково приєднана до С-кінця ефекторного пептиду. Між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю TRAIL наявні послідовності ділянок розщеплення для металопротеїнази MMP (SEQ. No. 51) і урокінази uPA (SEQ. No. 52). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 2, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No.10 і SEQ. No. 76. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 10 1 GQVGRQLAII GDDINRRRRR RRRVVRPLGL AGRVAAHITG TRGRSNTLSS 51 PNSKNEKALG RKINSWESSR SGHSFLSNLH LRNGELVIHE KGFYYIYSQT 101 YFRFQEEIKE NTKNDKQMVQ YIYKYTSYPD PILLMKSARN SCWSKDAEYG 151 LYSIYQGGIF ELKENDRIFV SVTNEHLIDM DHEASFFGAF LVG ДНК послідовність: SEQ. No. 76 1 GGTCAGGTTG GTCGTCAGCT GGCAATTATT GGTGATGATA TTAACCGTCG TCGTCGTCGC CGTCGTCGTG TTGTTCGTCC GCTGGGTCTG GCAGGTCGTG 101 TTGCAGCACA TATTACCGGC ACCCGTGGTC GTAGCAATAC CCTGAGCAGC CCGAATAGCA AAAATGAAAA AGCCCTGGGT CGCAAAATTA ATAGCTGGGA 26 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 201 AAGCAGCCGT AGCGGTCATA GCTTTCTGAG CAATCTGCAT CTGCGTAATG GTGAACTGGT GATTCATGAA AAAGGCTTTT ATTATATTTA TAGCCAGACC 301 TATTTTCGCT TTCAGGAAGA AATTAAAGAA AATACCAAAA ATGATAAACA AATGGTGCAG TACATTTATA AATATACCAG CTATCCGGAT CCGATTCTGC 401 TGATGAAAAG CGCACGTAAT AGCTGTTGGA GCAAAGATGC AGAATATGGC CTGTATAGCA TTTATCAGGG TGGCATTTTT GAACTGAAAG AAAATGATCG 501 CATTTTTGTG AGCGTGACCA ATGAACATCT GATTGATATG GATCATGAAG CCAGCTTTTT TGGTGCATTT CTGGTGGGC Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штами E. coli BL21 (DE3) и Tuner (DE3) pLysS з Novagen Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. Приклад 11. Злитий протеїн SEQ. No. 11 Протеїн послідовності SEQ. No. 11 представляє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 204 амінокислот, і масу 24,3 кДа, в якому на N-кінці послідовності 121-281TRAIL в якості ефекторних пептиду приєднаний домен ВН3 молекули PUMA/BBC3 (SEQ. No. 37), при цьому поліаргінінова послідовність, що складається з 9 Arg-залишків, додатково приєднана до С-кінця ефекторного пептиду. Між послідовністю ефекторного пептиду і послідовністю TRAIL конструкція містить послідовності ділянок розщеплення, розпізнані протеазами uPA (SEQ. No. 52) і MMP (SEQ. No. 51). Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No.11 і SEQ. No. 77. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 11 1 EEQWAREIGA QLRRMADDLN AQYERRRRRR RRRRVVRPLG LAGRVAAHIT 51 GTRGRSNTLS SPNSKNEKAL GRKINSWESS RSGHSFLSNL HLRNGELVIH 101 EKGFYYIYSQ TYFRFQEEIK ENTKNDKQMV QYIYKYTSYP DPILLMKSAR 151 NSCWSKDAEY GLYSIYQGGI FELKENDRIF VSVTNEHLID MDHEASFFGA 201 FLVG ДНК послідовність: SEQ. No. 77 1 GAAGAACAGT GGGCACGTGA AATTGGTGCA CAGCTGCGTC GTATGGCAGA TGATCTGAAT GCACAGTATG AACGTCGTCG TCGTCGCCGT CGGCGTCGTC 101 GTGTTGTTCG TCCGCTGGGT CTGGCAGGTC GTGTTGCAGC ACATATTACC GGCACCCGTG GTCGTAGCAA TACCCTGAGC AGCCCGAATA GCAAAAATGA 201 AAAAGCACTG GGTCGCAAAA TCAATAGCTG GGAAAGCAGC CGTAGCGGTC ATAGCTTTCT GAGCAATCTG CATCTGCGTA ATGGTGAACT GGTGATTCAT 301 GAAAAAGGCT TTTATTATAT TTATAGCCAG ACCTATTTTC GCTTTCAAGA AGAGATTAAA GAAAATACCA AAAATGATAA ACAAATGGTG CAGTATATTT 401 ACAAATACAC CAGCTATCCG GACCCGATTC TGCTGATGAA AAGCGCACGT AATAGCTGTT GGAGCAAAGA TGCAGAATAT GGTCTGTATA GCATTTATCA 501 GGGTGGCATC TTTGAGCTGA AAGAAAATGA TCGCATCTTT GTTAGCGTGA CCAACGAACA TCTGATCGAT ATGGATCATG AAGCCAGCTT TTTTGGTGCA Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури А, використовуючи штами E. coli BL21 (DE3) и Tuner (DE3) pLysS з Novagen Протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. Приклад 12. Злитий протеїн SEQ. No. 12 Протеїн послідовності SEQ. No. 12 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 372 амінокислот, і масу 41 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281TRAIL в якості ефекторного пептиду приєднаний протеїн PUMA (SEQ. No. 38). Між послідовністю TRAIL і послідовністю ефекторного пептиду є послідовність ділянок розщеплення, розпізнана металопротеїназою MMP (SEQ. No. 51) та урокіназою uPA (SEQ. No. 52), яка додатково відділена від послідовності TRAIL за допомогою гнучкого гліцин-серинового лінкера GGSGG 27 UA 111722 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (SEQ. No. 60). Крім того, на С-кінці ефекторний пептид містить послідовність KEDL (SEQ. No. 56), направляючу в ендоплазматичний ретикулум і формуючу частину С-кінця всієї конструкції. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No.12 і SEQ. No. 78. Амінокислотна послідовність: SEQ. No. 12 1 RVAAHITGTR GRSNTLSSPN SKNEKALGRK INSWESSRSG HSFLSNLHLR 51 NGELVIHEKG FYYIYSQTYF RFQEEIKENT KNDKQMVQYI YKYTSYPDPI 101 LLMKSARNSC WSKDAEYGLY SIYQGGIFEL KENDRIFVSV TNEHLIDMDH 151 EASFFGAFLV GGGSGGPLGL AGRVVRARAR QEGSSPEPVE GLARDGPRPF 201 PLGRLVPSAV SCGLCEPGLA AAPAAPTLLP AAYLCAPTAP PAVTAALGGS 251 RWPGGPRSRP RGPRPDGPQP SLSLAEQHLE SPVPSAPGAL AGGPTQAAPG 301 VRGEEEQWAR EIGAQLRRMA DDLNAQYERR RQEEQQRHRP SPWRVLYNLI 351 MGLLPLPRGH RAPEMEPNKE DL ДНК послідовність No. 78 1 CGTGTTGCAG CACATATTAC CGGCACCCGT GGTCGTAGCA ATACCCTGAG CAGCCCGAAT AGCAAAAATG AAAAAGCACT GGGTCGCAAA ATCAATAGCT 101 GGGAAAGCAG CCGTAGCGGT CATAGCTTTC TGAGCAATCT GCATCTGCGT AATGGTGAAC TGGTGATTCA TGAAAAAGGC TTTTATTATA TTTATAGCCA 201 GACCTATTTT CGCTTTCAAG AAGAGATTAA AGAAAATACC AAAAATGATA AACAAATGGT GCAGTACATT TACAAATATA CCAGCTATCC GGACCCGATT 301 CTGCTGATGA AAAGCGCACG TAATAGCTGT TGGAGCAAAG ATGCAGAATA TGGTCTGTAT AGCATTTATC AGGGTGGCAT CTTTGAGCTG AAAGAAAATG 401 ATCGCATCTT TGTTAGCGTG ACCAACGAAC ATCTGATCGA TATGGATCAT GAAGCCAGCT TTTTTGGTGC ATTTCTGGTT GGTGGTGGTA GCGGTGGTCC 501 GCTGGGTCTG GCAGGTCGTG TTGTTCGTGC CCGTGCGCGT CAAGAAGGTA GCAGTCCGGA ACCGGTTGAA GGTCTGGCAC GTGATGGTCC GCGTCCGTTT 601 CCGCTGGGTC GTCTGGTTCC GAGCGCAGTT AGCTGTGGTC TGTGTGAACC GGGTCTGGCA GCCGCACCGG CAGCACCGAC ACTGCTGCCT GCAGCATATC 701 TGTGTGCACC GACCGCACCG CCTGCAGTTA CCGCAGCACT GGGTGGTAGC CGTTGGCCTG GTGGTCCGCG TAGTCGTCCG CGTGGTCCTC GTCCGGATGG 801 TCCGCAGCCG AGCCTGAGCC TGGCAGAACA GCATCTGGAA AGTCCGGTGC CGAGCGCACC GGGTGCACTG GCAGGCGGTC CTACACAGGC AGCACCGGGT 901 GTTCGTGGTG AAGAGGAACA GTGGGCACGT GAAATTGGTG CACAGCTGCG TCGTATGGCA GATGATCTGA ATGCACAGTA TGAACGTCGT CGTCAAGAAG 1001 AACAGCAGCG TCATCGTCCG AGCCCGTGGC GTGTTCTGTA TAATCTGATT ATGGGTCTGC TGCCGCTGCC TCGTGGTCAT CGTGCACCGG AAATGGAACC 1101 GAATAAAGAA GATCTG Представлена вище амінокислотна послідовність була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності, що вказана вище. Була генерована плазміда, що містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресія злитого протеїну була виконана у відповідності з загальними процедурами, описаними вище. Гіперекспресія була здійснена відповідно до загальної процедури В, використовуючи штами E. coli B.21 (DE3) от Novagen i BL21DE3pLysSRIL от Stratagene. Даний протеїн був відділений (розділений) за допомогою електрофорезу відповідно до загальної процедури, описаної вище. Приклад 13. Злитий протеїн SEQ. No. 13 Протеїн послідовності SEQ. No. 13 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 493 амінокислот, і масу 53,4 кДа, в якому на С-кінці послідовності 121-281TRAIL в якості ефекторного пептиду приєднана послідовність протеїну PUMA (SEQ. No. 38). Крім того між послідовністю TRAIL і послідовністю протеїну PUMA є послідовність домену транслокації з Pseudomonas aeruginosa (SEQ. No. 54), яка додатково відділена від послідовності TRAIL за допомогою послідовних послідовностей: гнучкого гліцин-серинового лінкера GGGGS (SEQ. No. 59), ділянки розщеплення фурину (SEQ. No. 53) і гнучкого аланін-гліцин-серинового лінкера ASGG (SEQ. No. 65), а від протеїну PUMA - за допомогою гнучкого гліцин-серинового лінкера GGSGG (SEQ. No. 60). Додатково, на С-кінці ефекторного пептиду злитий протеїн містить послідовність KEDL (SEQ. No. 56), направляючу в ендоплазматичний ретикулум, будучи частиною С-кінця всієї конструкції. Структура злитого протеїну схематично представлена на фіг. 3, а нижче показані його амінокислотна послідовність і ДНК, що кодує послідовність, яка містить кодони, оптимізовані для експресії в E. coli, відповідно, SEQ. No.13 і SEQ. No. 79. 28