Біотехнологічне продукування хондроїтину

Реферат: Винахід належить до рекомбінантного мікроорганізму, модифікованого для продукування хондроїтину, в якому інактивовано ген, що відповідає за додавання залишків фруктози до лінійного полісахариду хондроїтину; а також до способу біотехнологічного продукування хондроїтину з використанням вказаного мікроорганізму. UA 111723 C2 (12) UA 111723 C2 UA 111723 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід відноситься до медицини, мікробіологічної та хіміко-фармацевтичної промисловості, зокрема, до створення нового рекомбінантного мікроорганізму, що продукує хондроїтин, та до способу біотехнологічного продукування хондроїтину. У цьому винаході термін "хондроїтин" означає лінійний полісахарид, визначений як лінійний глікозамінглікан, утворений переміжними залишками D-глюкуронової кислоти (GlcUA) та Nацетил-О-галактозаміну (GalNAc), зв'язаними глікозидними зв'язками 1-3 (GlcUA → GalNAc) та 1-4 (GalNAc → GlcUA). Хондроїтинсульфат - це глікозамінглікан, в якому глюкуронова кислота (GlcUA) і N-ацетил-Dгалактозамін (GalNAc) лінійно і переміжно зв'язані глікозидним зв'язком 1-3 та глікозидним зв'язком 1-4 відповідно від ланцюга лінійного полісахариду, сульфатованого у різних ступенях в залишках GalNAc. Хондроїтинсульфат присутній у тварин у хрящах та сполучній тканині, відіграючи важливу роль у клітинній адгезії, регенерації тканин, збудження нервових закінчень тощо. Продукування хондроїтину з нетваринних джерел є важливим та необхідним кроком до продукування хондроїтинсульфату нетваринного походження. У патентній літературі описані кілька способів продукування хондроїтину нетваринного походження. Крім того, клоновані та секвеновані декілька генів хондроїтин-синтази, які одержані як з тварин, так і з мікроорганізмів. Створений спосіб продукування хондроїтину з використанням рекомбінантної грампозитивної бактерії роду Bacillus, до якої введений ген хондроїтин-синтази, одержаний з Pasteurella multocido (US 2007/0281342 Al). У ще одному винаході описується спосіб продукування хондроїтину шляхом інтродукції генів kfoC і кfоА, які одержані з Escherichia coli О5:К4:Н4, до бактерії, що продукує UDP-глюкуронову кислоту (WO2008/133350). У ще одному винаході описується синтез in vitro хондроїтину у ферментативній системі, що містить хондроїтин-синтазу Escherichia coli О5:К4:H4 та прекурсори реакції (US2009/0263867 А1). Відомо, що Escherichia coli O5:K4:H4 здатна продукувати капсулярний полісахарид (полісахарид К4), який має таку ж саму структуру остова, як і полісахарид хондроїтину, в якому залишки фруктози зв'язані із залишками GlcUA (див., наприклад, N. Volpi, Glycoconj. J. (2008) 25:451-457). Отже, полісахарид К4 складається з одиниці трисахариди, що повторюється, яка містить частку D-глюкуронової кислоти (GlcUA) та частку N-ацетил-D-галактозаміну (GalNAc), зв'язані глікозидним зв'язком 1-3 (GlcUA → GalNAc), та залишок фруктози, зв'язаний з С3гідроксильною групою залишку GlcUA. Таким чином, залишки фруктози представляють собою відгалуження результуючого лінійного полісахариду. Видалення залишків фруктози досягнуте гідролітичною обробкою у кислотному середовищі (N. Volpi, Electrophoresis 25, 692-696 (2004)). Попри те, що капсульний антиген кластера генов Escherichia coli O5:K4:Н4 та метаболічні шляхи, що ведуть до цукрів, утворюючих лінійний полісахарид К4, широко досліджені, активність глікозилтранферази, яка відповідає за додавання часток фруктози до лінійного полісахариду і отримати полісахарид К4, ще й досі не ідентифікована. Новітня ознака цього винаходу - це безпосереднє продукування хондроїтину з високою молекулярною масою рекомбінантним мікроорганізмом, який одержаний за допомогою інактивації гена, що кодує фермент, відповідальний за додавання часток фруктози до остова хондроїтину, таким чином усуваючи потребу у піддаванні полісахариду К4 гідролітичному видаленню залишків фруктози, зв'язаних з частками GlcUA, щоб одержати хондроїтин. Докладний опис винаходу Технічною задачею винаходу є створення рекомбінантного мікроорганізму, що продукує хондроїтин, визначений як лінійний глікозамінглікан, що складається з переміжних залишків Dглюкуронової кислоти (GlcUA) і N-ацетил-D-галактозаміну (GalNAc), зв'язаних глікозидним зв'язком 1-3 і глікозидним зв'язком 1-4 відповідно, який характеризується тим, що в ньому інактивований ген, який кодує фермент, відповідальний за додавання залишків фруктози до остова хондроїтину. Отже, відповідно до одного аспекту цього винаходу, пропонується рекомбінантний мікроорганізм, що продукує хондроїтин, який одержується шляхом піддавання первісно присутнього у ньому гена, який кодує білок, відповідальний за додавання залишків фруктози до остова лінійного хондроїтину, інактивації, причому зазначена інактивація включає делецію або заміну повністю або частково зазначеного гена або руйнування шляхом інсерції додаткової нуклеотидної послідовності. 1 UA 111723 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно до одного переважного аспекту цього винаходу, пропонований рекомбінантний мікроорганізм, який одержаний шляхом інактивації гена, що кодує білок, який має фруктосилтранферазну активність, одержують з мікроорганізму, що належить до виду Escherichia coli і переважно належить до групи 2 антиіену К, що включає добре відомі серотипи, такі, як К1, К5, К7, К12. Хоча, відповідно до одного показового варіанту здійснення цього винаходу, рекомбінантний мікроорганізм, який має здатність продукувати хондроїтин, одержують з Escherichia coli O5:K4:H4, але може використовуватися будь-який з мікроорганізмів, що належать до групи антигену К, незалежно від того, чи поділяють вони будь-яку гомологію генів з Escherichia coli O5:K4:H4. Приклади зазначених мікроорганізмів включають бактерії, що належать до родів Haemophilus, такі, як Н. influenzae (Branefors-Helander P., Carbohydr. Res., Vol. 88, Jan 15, 1981), Campylobacter, такі, як C.jejuni (McNally DJ, Jarrell HC, Li J, Khieu NH, Vinogradov E, Szymanski CM, Brisson JR., FEBS J. Vol. 272, No. 17, 4407-4422, Sept. 2005), Gloeocapsa, такі, як G. gelatinosa (Raungsomboon S, Chidthaisong A, Bunnag B, Inthorn D, Harvey NW., Water Res. Vol., 40, No. 20, 3759-3766, Dec. 2006), і Vibrio, такі, як V.cholerae (Knirel YA, Widmalm G, Senchenkova SN, Jansson PE, Weintraub A Eur. J. Biochem., Vol. 247, 402-410, July 1997). Переважніше, мікроорганізмом, з якого одержують пропонований рекомбінантний мікроорганізм, що продукує хондроїтин, є Escherichia coli серотип О5:К4:Н4, який містить ген кfоЕ, що кодує білок, маючий фруктосилтранферазну активність. Відомо, що ген kfoE знаходиться у кластері генів антигену К4 Е. coli (GenBank (база даних, що містить послідовності ДНК, розміщена на сервері Національного центру біотехнологічної інформації США) АВ079602), який містить гени, які, як встановили винахідники, в значній мірі гомологічні з генами з інших мікроорганізмів, які вірогідно залучені до продукування бактеріальної капсули (T. Ninomiya, N.Sugiura, A. Tawada, K.Sugimoto, H. Watanabe і K. Kimata J. BioI. Chem.Vol. 277, No. 24, 21567-75, June 14, 2002). Мікроорганізмом, який найпереважніше використовувати для одержання пропонованого рекомбінантного мікроорганізму, є Escherichia coli O5:K4:H4, штам U1-41, який можна одержати з АТСС (Американської колекції типових культур, м. Манасас, штат Вірджинія, США), каталожний номер АТСС 23502. Відповідно до одного показового варіанту здійснення цього винаходу, рекомбінантний мікроорганізм представляє собою мікроорганізм, який продукує хондроїтин, причому геном, що піддається інактивації, є ген, що кодує білок, вибраний з групи, що складається з наступного: (A) білок, що містить послідовність амінокислот SEQ ID N2; (B) білок, що містить послідовність амінокислот SEQ ID N2, модифіковану делецією, заміною або інсерцією однієї або кількох амінокислот, і має фруктосилтранферазну активність; (C) білок, що містить послідовність амінокислот, яка має гомологію принаймні 50 % з послідовністю амінокислот SEQ ID N2, і має фруктосилтранферазну активність. Пропонованим мікроорганізм є мікроорганізм, у якого інактивоаний ген, є ген kfoE або ДНК, вибрана з групи, що складається з наступного: (a) ДНК, що містить нуклеотидну послідовність SEQ ID N1; (b) ДНК, що гібридизує з ДНК, яка містить нуклеотидну послідовність, комплементарну до SEQ ID N1, і кодує білок, який має фруктосилтранферазну активність; (c) ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, яка має гомологію принаймні 50 % з нуклеотидною послідовністю SEQ ID N1 і кодує білок, що має фруктосилтранферазну активність. Метою цього винаходу є мікроорганізм, продукуючий хондроїтин, причому інактивацію кfоЕ одержують шляхом модифікації її нуклеотидної послідовності, наприклад, делецією або заміною, повністю або частково, нуклеотидної послідовності, описаною вище у підпунктах (а), (b) або (с). Ще однією метою цього винаходу є мікроорганізм, в якому інактивацію кfоЕ одержують шляхом інсерції одного або кількох нуклеотидів в нуклеотидну послідовність, описану вище у підпунктах (а), (b) або (с). Відповідно до одного найпереважнішого аспекту цього винаходу, рекомбінантну похідну Escherichia coli О5:К4:Н4, штам U1-41 (далі за текстом іменовану як Е. coli К4), одержують інактивацією гена кfоЕ, що кодує передбачувану фруктосилтранферазу, за допомогою делеції нуклеотиду. У цьому описі розкривається, як руйнування гену kfoE призводить до безпосереднього продукування полісахариду К4, що не містить залишків фруктози, тобто хондроїтину. Відповідно до ще одного аспекту цього винаходу, пропоновану рекомбінантну похідну Е. coli K4 одержують за допомогою руйнування хромосомних генів,в якому праймери для ПЛР 2 UA 111723 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (полімеразної ланцюгової реакції) забезпечують гомологію гену-мішені (Datsenko and Wanner, PNAS, Vol. 97, No. 12, 6640-6645, June 06, 2000). Для запропонованого рекомбінантного штаму Е. coli K4 було проведено інактивацію хромосомного гена kfoE спочатку шляхом заміни більшої частини його нуклеотидної послідовності геном стійкості до екзогенного канаміцину ("перша генетична модифікація"), а потім через делецію інсерцьованого гена за допомогою векюра експресії FLP-рекомбінази ("друга генетична модифікація"). Рекомбінантний штам Е. coli K4, одержаний після першої генетичної модифікації, R іменований як Е. coli K4 (kfoE/kan ), було депоновано відповідно до Будапештської угоди під інвентарним номером DSM23578 30 квітня 2010 року в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Німеччина, 38124, м. Брауншвейг, Інхофенштрасе, 7В). Рекомбінанший штам Е. coli K4, одержаний після другої генетичної модифікації, Е. coli K4 (kfoE), було депоновано відповідно до Будапештської угоди під інвентарним номером DSM23644 26 травня 2010 року в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Німеччина, 38124, м. Брауншвейг, Інхофенштрасе, 7В). Інактивація гена kfoE була досягнута за допомогою 3 послідовних бактеріальних трансформацій, по-перше, плазмідою експресії Red-рекомбінази (pKD46), по-друге, фрагментом ДНК, яка одержана з темплатної плазміди (pDK4), відповідно модифікована для забезпечення гомології з геном kfoE, і пo-тpeтє, плазмідою-помічником, що експресує фермент FLPрекомбіназу (рСР20). Для того щоб одержати першу генетичну модифікацію Е. coli K4, були використані як плазміда pKD46 (GenBank: AY048746), так і фрагмент лінійної ДНК. Плазміда pKD46, що використовується на першій стадії трансформації Е. coli K4, складається з 2154 нуклеотидів з фага лямбда і гена, що кодує резистентність до ампіциліну. Ця плазміда сприяє підвищенню швидкості рекомбінації при використанні фрагментів лінійної ДНК. Фрагмент лінійної ДНК, який використовували при послідовній трансформації Е. coli К4, був одержаний методом ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) з використанням кількох пар праймерів, що включають подовження гомології як на ген kfoE, так і на темплатну плазміду pKD4, що несе касету стійкості до канаміцину (GenBank: AY 048743). Ця процедура виявилася спроможною створити фрагмент лінійної ДНК, що має гомологічні кінці kfoE 5' та 3' й несе касету стійкості до канаміцину. В одному варіанті здійснення цього винаходу бактеріальна трансформація була здійснена електропорацією, яку було вибрано через її здатність легко створювати подвійні трансформанти, які можна було вилучати з планшетів, що містили як ампіцилін, так і канаміцин. Однак хоча електропорація є переважним способом, цього результату можна було б досягти й будь-яким відомим способом трансформації, наприклад, таким, як трансформація хлористим кальцієм або трансформація діетиламіноетил-декстраном (DEAE-декстраном). З метою перевірки правильності локації заміни первинної послідовності ДНК касетою R стійкості до канаміцину у трансформантів Е. coli K4 (kfoE/kаn ), було виконано кілька ПЛРампліфікацій з використанням 2 пар сусідніх локус-специфічних праймерів: перша пара праймерів була здатна продемонструвати утворення нового з'єднання між кінцем 5' kfoE, що залишився, та інсерцьованим геном kаn, друга пара праймерів була здатна продемонструвати утворення нового з'єднання між інсерцьованим геном kаn та кінцем 3' kfoE, що залишився. Плазмідою-помічником, що використовувалася для видалення касети стійкості до канаміцину ("друга генетична модифікація"), була плазміда рСР20, що несла ген FLPрекомбінази дріжджів та ген резистентності до ампіциліну. Обидві плазміди pKD46 та рСР20 є чутливими до температури векторами, які у подальшому були видалені зі штамів трансформантів Е. coli K4 після інкубації при температурі 43 °C. R На Е. coli K4 {kfoE/kan ) було проведено аналіз секвенування для підтвердження заміни гена kfoE, повністю або частково, касетою стійкості до канаміцину. Так само, аналіз секвенування було проведено на Е. coli K4 (кfoЕ) підтвердження наступної делеції касети стійкості до канаміцину, яка призвела до кінцевою продукування штаму бактерії зі зруйнованим геном kfoE. Спосіб, який використовують для успішної побудови рекомбінантного штаму Е. coli K4, здатного продукувати негліколізований варіант природного глікозаміноглікану, має широку застосовність та може переважно застосовуватися до інших гліколізованих продуктів, якщо необхідно запобігти цій гліколізації. На закінчення, було розроблено загальний спосіб 3 UA 111723 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержання мікроорганізмів, здатних продукувати негліколізовані варіанти природних глікозаміногліканів. Ще однією метою цього винаходу є створення способу біотехнологічного продукування хондроїтину, який включає наступні стадії: 1) стадію, на якій культивують рекомбінантний мікроорганізм у підхожому середовищі, 2) стадію, на якій продукований хондроїтин вилучають з його бульйонної культури. На стадії культивування можуть використовувати будь-який рекомбінантний мікроорганізм, здатний продукувати хондроїтин, одержаний відповідно до способу, описаного вище, через інактивацію гена, що кодує фермент, відповідальний за додавання залишків фруктози до хондроїтину. Відповідно до одного переважного варіанту здійснення цього винаходу, як рекомбінантний мікроорганізм, який має здатність безпосередньо продукувати хондроїтин, використовують рекомбінантний штам Е. coli DSM23644, який одержаний з Е. соlі К4. Спосіб, прийнятий для культивування бактерії Е. coli DSM23644 - це загальний спосіб, який застосовують до культивування бактерій роду Escherichia. Зазначений спосіб ґрунтується на переважному, але не виключному використанні середовища для культивування, що містить на літр: калія дигідрофосфат тригідрат - 9,7 г, калія дигідрофосфат - 8.0 г, натрія цитрат пентагідрат - 0,5 г, магнія хлорид септагідрат - 0,2 г, казамінові кислоти - 20 г, амонію сульфат 20 г, глюкоза - 2.0 г, дріжджовий екстракт - 10,0 г. Посилення здатності мікроорганізмів к продукуванню хондроїтину можна досягти шляхом підхожої модифікації складу основного середовища та/або забезпечення додаткових живильних речовин в бульйонній культурі. Умови культивації культури визначають таким чином, щоб максимізувати ріст бактерій та продукування хондроїтину. Зазвичай культивування здійснюють при температурах 25 °C та 40 °C на протязі від 8 до 72 годин. Надосадкову рідину збирають переважно центрифугуванням та використовують для наступної очистки і характеризації продукованого хондроїтину. Очистка хондроїтину досягається відповідно до методів, що адаптовані, які описані Родрігес і Джанн (Rodriguez and Jann) (Eur.J.Biochem. 117, 117-124, FEBS 1988). Стисло: прийнятий спосіб очистки хондроїтину ґрунтується на кількох стадіях преципітації (осадження), починаючи з надосадкової рідини культури та закінчуючи сушкою у вакуумі. Ідентичність вилученого продукту можна встановити низкою способів, переважно, сполученням способів, що надають доказ структури ланцюга полісахариду та відсутності залишків фруктози. Відсутність фруктози в очищеному продукті можна переважно перевірити за допомогою кислотного гідролізу продукту в умовах, відомих як такі, що вивільняють фруктозу з нативного полісахариду К4, з подальшим специфічним кількісним визначенням будь-якої фруктози, що вивільнилася як наслідок. Цей контроль відповідно показував, що полісахарид, вилучений з культури Е. соlі DSM23644, не містить фруктози на відміну від нативного полісахариду К4, одержаного з Escherichia coli О5:К4:Н4, штам U1-41, який узгоджено продукував полісахарид, що містив фруктозу у кількостях, очікуваних зі структурної формули полісахариду К4. Подальше підтвердження ідентичності продукту, вилученого з культури Е. соlі DSM23644, було одержане крізь піддавання продукту зброджуванню ферментом хондроїтиназа ABC, яка, як відомо, повністю руйнує до дисахаридів полісахарид хондроїтин, що не містить фруктозу, але не нативний полісахарид К4. Інакше кажучи, хондроїтиназа ABC не здатна ферментувати нативний полісахарид К4. Досліди з ферментуванням хондроїтиназою ABC продукту, вилученого з культури Е. соlі DSM23644, дали кількості продукту-дисахариду, очікувані від повного зброджування, таким чином підтверджуючи природу остова полісахариду і, зокрема, відсутність залишків фруктози. Відповідно до одного варіанту здійснення цього винаходу, для підтвердження функції kfoE як гена, що кодує фруктосилтранферазну активність К4, була побудована та введена в штам Е. соlі К4 (кfoЕ) рекомбінантна плазміда, що несла нуклеотидну послідовність дикого (не мутантного) типу kfoE, щоб опосередковувати комплементацію втраченої функції. Стисло: ген kfoE було ампліфіковано і клоновано в плазміду pTrcНis (виробник - корпорація Invitrogen Corporation, штат Каліфорнія, м. Карлсбад, поштова а/с 6482, Ван-Ален-Уей, 5791) в сайтах рестрикції Ncol і ВаmНІ. Генно-інженерна конструкція pTrcHis-kfoE була використана для трансформації електропорацією рекомбінантного Е. соlі(kfoE), трансформанти були вибрані при температурі 37 °C на планшетах, що містили 100 мкг/мл ампіциліну. Трансформанти Е. соlі (kfoE). що несли конструкцію pTrcHis-kfoE, були культивовані, і полісахарид К4 був очищений відповідно до Родрігес та Джанн (Eur.J.Biochem. 117, 117-124, FEBS 1988), для того щоб кількісно визначній фруктозу, присутню у вилученому продукті, вільну 4 UA 111723 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 фруктозу визначили до та після гідролізу 0,2М розчином трифтороцтової кислоти упродовж 1 години при температурі 99 °C. Вільну фруктозу, кількісно визначену до та після гідролізу, було взято як фруктозу, яка зв'язана з вихідною молекулою К4. Продукт, вилучений з культури Е. coli DSM23644, яка трансформована конструкцією pTrcHiskfoE, показав присутність зв'язаної фруктози, що підтвердило тим самим, що у цьому штамі втрата фруктосилтранферазної активності була комплементована плазмідою. Опис графічного матеріалу На фіг. 1 схематично показані генетичні модифікації, яким піддавався штам U1-41 R Escherichia coli О5:К4:Н4, в результаті чого були одержані структури Е. coli K4 (kfoE/kan ) і Е. coli K4 (кfоЕ): a) Фрагмент ДНК, що несе касету стійкості до канаміцину (канаміцин), франковану двома послідовностями FRT-рекомбінації (FRT - мішень розпізнавання фліпази); касета стійкості до канаміцину одержана з темплатної плазміди pKD4 за допомогою сайтів примірування Р1 і Р2. b) Детальна структура кластера генів антигену К Е. соlі О5:К4:Н4, штам U1-41, де kfoD і kfoFфланкуючі гени гена kfoE. R c) Хромосомна ДНК Е. coli K4 (kfoE/kan ), що показує руйнування гена kfoE шляхом заміни фрагмента первісної ДНК геном стійкості до канаміципу. d) Хромосомна ДНК Е. coli K4 (kfoE), що показує остаточну делецію більшої частини гена kfoE. На фіг. 2 показані результати ПЛР-ампліфікації, яка проведена на 3 трансформантах Е. coli R K4 (kfoE/kan ) для перевірки послідовності фланкуючих областей 3’ і 5’ kfoE, що залишилися: доріжки 1 і 10 показують маркер молекулярної маси (маркер довжин ДНК 1Kb ladder): доріжки 2-4: ПЛР-продукт залишкового кінця kfoE3’ 3 трансформантів: доріжки 6-8: ПЛР-продукт залишкового кінця KfoE 5' 3 трансформантів; доріжки 5 і 9: ПЛР-продукт Escherichia coli О5:К4:Н4, штам U1-41, одержаний з використанням пар 3’ 5’ праймерів відповідно. На фіг. 3 показана хроматограма полісахариду, продукованого Е. coli DSM23644, проаналізованого капілярним електрофорезом після зброджування хондроїтиназою ABC, на якій показаний ненасичений -дисахарид (di-0S), типовий для зброджування хондроїтину хондроїтиназою ABC (пік 8). 13 На фіг. 4 показаний спектр С-ЯМР хондроїтину, продукованого Е. coli DSM23644, одержаного відповідно до прикладу 3. Приклади Приклад 1 R Побудова штаму Е. coli K4 (kfoE/kan ) R Побудова фрагменту лінійної ДНК (фіг. 1а), що несе як ген kan , так і гомологічні кінці гена kfoE, була досягнута шляхом ПЛР з використанням вектора pKD4 як темплата і наступних праймерів ПЛР: OL151: atgcttctaataatgtctggttcctatgttcaacaagaatgtgtaggctggagctgcttc (SEQ ID N 3), OL152: tcatactgcagcctccttaaaaatttcatataatctaaatgcacatatgaatatcctcct ta (SEQ ID N 4). У кожній олігонуклеотидній послідовності перші 40 нуклеотидів забезпечують гомологію гена kfoE, а решта 20 нуклеотидів забезпечують гомологію темплатної плазміди pKD4 (сайти примірування Р1 і Р2). ПЛР проводили на 120 нг темплатної ДНК відповідно до наступних умов: 94 °C  3 хв., (94 °C  1 хв., 40 °C  1 хв., 68 °C  2 хв.)  5 циклів, (94 °C  1 хв., 59 °C  1 хв., 68 °C  2 хв.)  30 циклів, 68 °C  10 хв., 4 °C  10 хв. Продукт ПЛР було очищено гелем і бактерії трансформували. Escherichia coli O5:K4:H4, штам U1-41 (фіг. 1b) приготували і трансформували електропорацією плазмідою pKD46 відповідно до Даценко й Уоннер (Datsenko and Wanner) (PNAS, Vol. 97, No. 12, 6640-6645, June 06, 2000), потім висіяли на чашки на середовище, що містило ампіцилін. Резистентні до ампіциліну трансформанти ідентифікували й відділили. Два трансформанти перевірили екстракцією плазміди та ПЛР з використанням наступних праймерів й умов: OL149: ccactcataaatcctcatagag (SEQ ID N5), OL150: ccaacttacttctgacaacgat (SEQ ID N6) при 94 °C  3 хв., (94 °C  1 хв., 43 °C  1 хв., 68 °C  2,5 хв.)  30 циклів, 68°C  10 хв., 4°C  10 хв. 5 UA 111723 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Продукт ПЛР піддали аналізу 0,8 %-м агарозним гель-електрофорезом та ідентифікували продукт із розміром 1799 пар основ у повній відповідності з очікуваним розміром продукту. Один із двох трансформантів pKD46 піддали наступній електропорації, використовуючи фрагмент ДНК, що ніс касету стійкості до канаміцину та гомологічні кінці гена кfоЕ. Для відділення рекомбінантів, що несли заміну більшої частини нуклеотидної послідовності гена кfоЕ геном, резистентним до канаміцину, використали селекційний відбір на середовищі, що містило ампіцилін та канаміцин, в чашках Петри. Три подвійних трансформанти перевірили ПЛР-ампліфікацією обох фланкуючих областей kfoE3’ і 5’, використовуючи відповідні наступні праймери: OL153: aatccgacggggactgtagatt (SEQ ID N7), OL142: aactgttcgccaggctcaag (SEQ ID N8), OL143: gcgttttcccttgtccagat (SEQ ID N9), OL154: gctaatgtatatgattgccaggt (SEQ ID N10) при 95 °C 5 хв., (94 °C  1 хв., 47°C  1 хв., 68 °C  2 хв.)  30 циклів, 68°C  10 хв., 4°C  10 хв. Продукт ПЛР піддали аналізу 0,8 %-м агарозним гель-електрофорезом та ідентифікували два продукти із розміром 1773 пар основ для ампліфікації кінця 3' і 769 пар основ для ампліфікації кінця 5' гена kfoE відповідно основ у повній відповідності з очікуваним розміром продуктів (фіг. 2). Для того щоб перевірити орієнтацію гена стійкості до канаміцину та забезпечити правильний напрямок транскрипції гена, провели подальший аналіз трансформант шляхом аналізу R секвенування Е. coli K4 (kfoE/kan ) (фіг. 1с), використовуючи наступні олігонуклеотиди: OL153: aatccgacggggactgtagatt (SEQ ID N7); OL154: gctaatgtatatgattgccaggt (SEQ ID N10). Результуюча нуклеотидна послідовність ідентифікована як SEQ ID N14. Приклад 2 Побудова штаму Е. coli K4 (kfoE) Для того щоб одержати штам Е. coli K4 (kfоЕ), у якого відсутня касета стійкості до канаміцину та який несе делецію більшої частини гена кfоЕ із супутньою втратою функції, R виконали подальшу трансформацію штаму Е. coli K4 {kfoE/kan ) плазмідою рСР20. Після стадії електропорації на середовищі, що містило ампіцилін, при температурі 30 °C. вибрали трансформанти та потім колонію очистили. Передбачувані трансформанти вирощували на чашках Петри з елективним середовищем при температурі 43 °C, а потім перевіряли на втрату стійкості до усіх антибіотиків. Трансформанти штаму Е. coli K4 (kfoE) перевірили секвенуванням кінців фланкуючих областей 3' та 5' kfoE, що залишилися (фіг. 1d), використовуючи наступні олігонуклеотиди: OL169: tgaggtgattgttggtaaaccttggtg (SEQ ID N11) OL166: tactgtttctgcttgcccccgagtt (SEQ ID N12) Результуюча нуклеотидна послідовність ідентифікована як SEQ ID 13 Приклад 3 Культивування Е. coli DSM23644 й аналіз хондроїтину Культивування Е. coli DSM23644 проводили відповідно до Родрігес і Джанн (Eur. J. Biochem., Vol. 177, 117-124, October 1988). Стисло: 0,5 мл розмороженої вегетативної культури, засівали в колбу, що містила 20 мл рідкого середовища, яке містило на літр: дікалія фосфат тригідрат - 9,7 г, калія дигідрофосфат 8,0 г, натрію цитрат пентагідрат - 0,5 г, магнія хлорид гептагідрат - 0,2 г, казамінови кислоти 20,0 г, амонію сульфат - 20,0 г, глюкоза - 2,0 г, дріжджовий екстракт - 10,0 г; проводили -1 інкубацію при температурі 37 °C упродовж 16 годин з перемішуванням зі швидкістю 180 хв. та 2,5 см витіснення. Подальшу стадію культивування проводили у періодичній культурі у перегородчастій колбі ємністю 500 мл, що містила 85 мл рідкого середовища, описаного вище, засіяного 0,05 %-ю вегетативною культурою, приготовленою, як описано вище. Інкубацію проводили при -1 температурі 37 °C упродовж 48 годин з перемішуванням зі швидкістю 180 хв. та 25 см витіснення. Наприкінці інкубації культуру центрифугували і надосадкову рідину піддали очистці, щоб відділити та характеризувати продукований хондроїтин. Очистки хондроїтину досягли відповідно до адаптованих методів, описаних Родрігес та Джанн (Eur.J.Biochem. 117, 117-124, FEBS 1988). 6 UA 111723 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Стисло: полісахарид осадили з надосадкової рідини культури цетавлоном (алкілтриметиламонію бромід, CAS №7192-88-3), екстрагували 0,5 М розчином гідроксиду натрію при температурі 3 °C, нейтралізували і потім очистили 3 циклами преципітації 80 %-м етиловим спиртом. Останню стадію очистки проводили 90 %-м холодним фенолом з рН 6,8 для преципітації забруднюючих білків, відновлюючи водну фазу центрифугуванням. Очищений хондроїтин вилучили з водної фази преципітацією 80 %-м етиловим спиртом та сушкою у вакуумі. Для того, щоб встановити природу продукованого хондроїтину, використали кілька аналітичних підходів. Перший підхід грунтувався на присутності або відсутності фруктози у продукті, вилученому з культури після кислотного гідролізу, проведеного 0,2М розчином трифтороцтової кислоти упродовж 1 години при температурі 99 °C. Для того щоб кількісно визначити фруктозу, що присутня у вилученому продукті, визначили вільну фруктозу до й після гідролізу. Кількісне визначення фруктози проводили ферментативним шляхом, використовуючи набір EnzyPlus (цукроза/D-глюкоза/D-фруктоза), що поставляється компанією BIOCONTROL (BioControl Systems Inc., США, 98005 штат Вашингтон, м. Беллевью, Південно-східна 32-а вулиця, 12822). Різницю між вільною фруктозою, присутньою після гідролізу, і фруктозою, присутньою до гідролізу, приймали як фруктозу, зв'язану з вихідною молекулою К4. Продукт, вилучений з культури Е. coli DSM23644, показав відсутність зв'язаної фруктози, підтверджуючи тим самим, що цей штам продукує полісахарид, який не містить фруктозу. Відсутність зв'язаної фруктози у полісахариді, вилученому з культури Е. coli DSM23644, як описано вище, була підтверджена ферментативним зброджуванням хондроїтиназою ABC. Було також продемонстровано, що хондроїтин, очищений зброджуванням хондроїтиназою ABC, дав ненасичений А-дисахарид (Adi-OS), типовий для зброджування хондроїтину, як підтверджено капілярним електрофорезом за допомогою способу міцелярної електрокінетичної хроматографії (МГ-КХ) (фіг. 3). Підтвердження структури di-0S було одержано шляхом використання відповідного стандартного зразка А-дисахариду (еквівалентна електрофоретична елюція). Кількісне визначення одержаного di-0S було досягнуто за допомогою кривої зовнішнього калібрування. Наприкінці, очищений полісахарид хондроїтин, продукований Е. coli DSM23644, 13 охарактеризували за допомогою С ЯМР (фіг. 4). Цей спосіб показав, що даний продукт в частині спектру ідентичний продукту, одержаному після видалення фруктози з нативного полісахариду К4 кислотним гідролізом. Приклад 4 Опосередкована плазмідою комплементація функції kfoE Для того щоб перевірити функцію kfoE як гена, що кодує К4 для фруктосилгранферазної активності, була побудована та введена в штам Е. coli K4 (kfoE) рекомбінантна плазміда, що несла нуклеотидну послідовність дикого (не мутантного) типу kfoE, щоб опосередковувати комплементацію втраченої функції. Ген kfoE було ампліфіковано з використанням наступних олігонуклеотидів: OL172: acaacatgttactaataatgtctggttcctatgttc (SEQ ID N15); OL173: actggatccttatcatactgcagcctcctta (SEQ ID N16). Для введення ампліфікованого та очищеного гелем гена kfoE (1569 п.о.) в відповідні сайти клонування використовували плазміду pTrcHis (4400 п.о. - виробник корпорація Invitrogen Corporation, штат Каліфорнія, м. Карлсбад. поштова а/с 6482, Ван-Ален-Уей, 5791). 70 нг вектора pTrcHis, збродженого ферментами рестрикції Ncol і ВаmHI, і 75 нг гена kfoE, який мав порівняні зброджені кінці РсіІ/ВаmНІ, піддали реакції літування при температурі 25 °C упродовж 15 хв. Потім 50 мкл компетентних кліток Escherichia coli DH5 (виробник корпорація Invitrogen Corporation, штат Каліфорнія, м. Карлсбад, поштова а/с 6482, Ван-Ален-Уей, 5791) піддали електропорації з 5 мкл суміші літування, і п'ять трансформантів вибрали при температурі 37 °C на планшетах, що містили 100 мкг/мл ампіциліну. Після очистки колонії побудовану плазміду pTrcHis-kfoE екстрагували та збродили ферментом рестрикції Mfe І, який був здатний вирізати структуру ДНК у вставній послідовності kfoE. За допомогою аналізу методом гель-електрофорезу 3 з 5 трансформант після зброджування ферментом рестрикції Mfe І показали очікувану довжину 5887 п.о., а аналіз послідовностей підтвердив правильну інсерцію гена kfoE. 7 UA 111723 C2 5 10 15 Перевірену структуру pTrcHis-kfoE використали для трансформації методом електропорації рекомбінантної Е. coli DSM23644, і на планшетах, що містили 100 мкг/мл ампіциліну, вибрали трансформанти. Вибрані трансформанти культивували відповідно до умов, описаних у прикладі 3, полісахарид К4 очистили відповідно до Родрігес та Джанн (Eur. J. Biochem., Vol. 177, 117-124, October 1988)". Для того щоб кількісно визначити фруктозу, присутню у вилученому продукті, вільну фруктозу визначили до й після гідролізу 0,2М розчином трифтороцтової кислоти упродовж 1 години при температурі 99 °C. Кількісне визначення фруктози проводили ферментативним шляхом, використовуючи набір EnzyPlus (цукроза/D-глюкоза/D-фруктоза). Різницю між вільною фруктозою, присутньою після гідролізу, і фруктозою, присутньою до гідролізу, брали як фруктозу, зв'язану з вихідною молекулою К4. Продукт, вилучений з культури Е. соlі DSM23644, яка трансформована структурою pTrcHiskfoE, показав присутність зв'язаної фруктози, підтверджуючи тим самим, що у цьому штамі втрата фруктосилтранферазної активності комплементувалася плазмідою. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 30 35 40 45 50 55 1. Рекомбінантний мікроорганізм, продукуючий хондроїтин, визначений як лінійний глікозамінглікан, утворений переміжними залишками D-глюкуронової кислоти (GlcUA) і Nацетил-D-галактозаміну (GalNAc), зв'язаними глікозидними зв'язками β1-3 (GlcUA → GalNAc) і β1-4 (GalNAc → GlcUA), який відрізняється тим, що зазначений рекомбінантний мікроорганізм одержаний з Escherichia coli 05:K4:H4 й у зазначеному рекомбінантному мікроорганізмі ген kfoE, первісно присутній, що кодує фермент, відповідальний за додавання залишків фруктози до остова лінійного хондроїтину, інактивований делецією або заміною повністю або частково зазначеного гена або руйнуванням шляхом інсерції додаткової нуклеотидної послідовності, і тим, що зазначений ген kfoE кодує білок, вибраний з групи, що складається з наступного: (A) білок, що містить послідовність амінокислот SEQ ID NO: 2; (B) білок, що містить послідовність амінокислот SEQ ID NO: 2, модифіковану делецією, заміною або інсерцією однієї або кількох амінокислот, і має фруктозилтранферазну активність; і (C) білок, що містить послідовність амінокислот, маючу ідентичність принаймні 50 % з послідовністю амінокислот SEQ ID NO: 2, і має фруктозилтранферазну активність. 2. Рекомбінантний мікроорганізм за п. 1, який відрізняється тим, що інактивований ген kfoЕ являє собою ДНК, вибрану з групи, що складається з наступного: (a) ДНК, що містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 1; (b) ДНК, що гібридизує з ДНК, яка містить нуклеотидну послідовність, комплементарну до SEQ ID NO: 1, і кодує білок, маючий фруктозилтранферазну активність; і (c) ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, яка має ідентичність принаймні 50 % з нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 1, і кодує білок, маючий фруктозилтранферазну активність. 3. Рекомбінантний мікроорганізм за одним із пп. 1 і 2, який відрізняється тим, що ген kfoE інактивується, повністю або частково, його заміною касетою стійкості до канаміцину і її подальшим видаленням з одержанням у результаті повної або часткової делеції гена kfoE. 4. Рекомбінантний мікроорганізм за п. 3, одержаний з Escherichia coli 05:K4:H4, штам U1-41. 5. Рекомбінантний мікроорганізм за одним з пунктів 1-4, яким є Escherichia coli DSM23578 або Escherichia coli DSM23644. 6. Рекомбінантний мікроорганізм за п. 5, яким є Escherichia coli DSM23644. 7. Спосіб біотехнологічного продукування хондроїтину, який відрізняється тим, що використовують рекомбінантний мікроорганізм за одним з пунктів 1-6. 8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що рекомбінантним мікроорганізмом є Escherichia coli DSM23644. 9. Спосіб біотехнологічного продукування хондроїтину, який включає наступні стадії: a) стадію, на якій культивують у придатному середовищі рекомбінантний мікроорганізм за одним з пунктів 1-6; b) стадію, на якій хондроїтин, присутній у мікробній культурі, вилучають й очищують. 10. Спосіб біотехнологічного продукування хондроїтину за п. 9, який відрізняється тим, що рекомбінантним мікроорганізмом є Escherichia coli DSM23578 або Escherichia coli DSM23644. 11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що рекомбінантним мікроорганізмом є Escherichia coli DSM23644. 8 UA 111723 C2 9 UA 111723 C2 10 UA 111723 C2 11 UA 111723 C2 12 UA 111723 C2 13 UA 111723 C2 14 UA 111723 C2 15 UA 111723 C2 16 UA 111723 C2 Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 17