Спосіб експрес-індикації сальмонел птиці

Спосіб експрес-індикації сальмонел птиці, що включає виконання імуноферментного аналізу, який відрізняється тим, що при імуноферментному аналізі застосовують нітроцелюлозні мембранні фільтри. Корисна модель, відноситься до ветеринарної' медицини, а саме до способів діагностики сальмонельозу птиці та виявлення сальмонел в продукції тваринництва. Широко використовуються у лабораторіях світу авідін-бютиновий метод (Avidin-biotin complex ABC) для детекції антигенів, який має високу специфічність і чутливість, але для цього способу необхідне спеціальне обладнання [Sachsenweger О., Lohr J Е., Kosters J. Evaluation of three commercial ELISA test kits for the detection of antibodies against Salmonella enteritidis // Tierarztl. Prax. -1994, №22 (4). - P.350-357]. Існує спосіб, що дозволяє виявити антигени сальмонельозу [SU №1558180, от 04 03.88, кл G01 N33/531 "Способ получения антигена сальмонелл"]. За цим рішенням тільки можливо визначити антиген. Незважаючи на те, що метод є високочутливим, специфічним, його не можливо використовувати для індикації сальмонел. При діагностиці сальмонельозу широко використовують імуноферментний сорбційний метод (ІФА), який дозволяє виявляти антитіла в сироватках крові тварин. Недоліком є те, що за його допомогою неможливо виявити мікроорганізми, при наявності яких не завжди спостерігається підвищення титрів антитіл [Steinbach G , Staak C , Bahn P. Possibilities for standartization of ELISA for detection of Salmonella antibodies in sera and meat juices of pigs // Beri. Munch. Tierarztl. Wochenschr 2000, №113 (9). - P.331-334]. Це рішення може бути прототипом. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб експрес-індикації сальмонел птиці, що включає використання імуноферментно го аналізу шляхом застосування нітроцелюлозних мембранних фільтрів. Заявлений якісний метод крапкової імунодетекці'і (КІД), розроблений на основі непрямого методу імуноферментного аналізу (ІФА), простий у постановці, економічний, не потребує спеціального обладнання, а також дозволяє уникнути недоліків, що мають місце при використанні полістиролових планшетів. Компоненти реакції включають. - протисальмонельозні антитіла (позитивний контроль); - негативну сироватку крові кролів (негативний контроль); - аитивидовий імунопероксидазний кон'югат проти Ig G кролів; - забуферений фізіологічний розчин (ЗФР), рН7,3 для розведення альбуміну, позитивних і негативних сироваток, антивидового кон'югату і міжетапних промивань1 8г NaCI; 0,2г КН2РО4; 2,9г Na2HPO4x12H2O, ю ю - детергент ТВІН-20; - 3% розчин бичого сироваточного альбуміну (БСА), - субстрат: 0,03% розчин бензидину у ЗФР і 0,3% розчин Н2Ог. Спосіб виконується таким чином. Реакція ТІД проводиться у чашках Петрі на нітроцелюлозних мембранних фільтрах і постановка її включає декілька етапів. Дослідний матеріал засівають у співвідношенні не менш, ніж 1-5 на накопичувальне цитратносольове середовище. Через 6 годин або більше (до 24 години) вирощування при температурі 37-38°С для дослідження використовується рідка частина середовища, що містить мікроорганізми. О) У чашках Петрі на нітроцелюлозні фільтри на3 носять по краплі (не більше як 0,01см ) досліджуваний матеріал та контрольні культури ентеробактерій. Після всмоктування фільтри з нанесеними матеріалом та контролем підсушують у сушільній шафі при 37"С протягом 15 хвилин. Фільтри обробляють 3% розчином бичого сироваточного альбуміну (БСА) при температурі 37"С на протязі ЗО хвилин. Після підсушування на повітрі їх 6-разово (на протязі трьох хвилин у кожній порції) відмивають у забуференому фізіологічному розчині (рН7,2). Наносять розчин специфічних антитіл та негативну сироватку у розведенні 1:10; інкубують в цих розчинах при 37°С ЗО хвилин. Після 6-разового відмивання фільтрів у ЗФР наносять розчин антикролячих імуноглобулінів, мічених пероксидазою у робочому титрі і інкубують 30 хвилин при 37°С. Фільтри відмиваються у шести порціях ЗФР протягом трьох хвилин у кожній порції'. На фільтри наносять субстратну суміш, витримують при температурі (20±3)°С на протязі однієї хвилини. Фільтри промивають одноразово ЗФР протягом трьох хвилин та висушують на повітрі. Облік результатів проводять візуально. В місцях нанесення зразків, що містять бактерії" роду сальмонела, з'являється забарвлення синього кольору. При постановці КІД необхідні слідуючі контролі: 1) реакція з відомими сероварами сальмонел (серогруп В, С, D) - виражена позитивна реакція в місцях нанесення контрольних молодих культур, 2) реакція з відомими штамами ентеробактерій, що не відносяться до роду сальмонела - відсутність зафарблення такої інтенсивності, як при позитивній реакції в місцях нанесення контрольних молодих культур Аналіз рівня техніки щодо патентних та науково-технічних джерел інформації дозволив зробити Комп'ютерна верстка В Мацело 10553 висновок - рішення, яке заявляється, відповідає критерію „новизна". Приклад 1. При постановці реакції ТІД з використанням культури Salmonella typhimurium у дозі 9 3 10 мікробних клітин у 1см на фільтрі у місці нанесення сальмонели спостерігали зафарблення інтенсивного синього кольору, тобто позитивну реакцію, тоді як в місці нанесення культури ешеріхій та стафілококу у відповідній дозі зафарблення такої інтенсивності було відсутнє. Цей дослід показав, що даний метод специфічний по відношенню до інших ентеробактерій, які мають спільні із сальмонелою антигени. Приклад 2 При постановці реакції КІД з використанням культури Salmonella typhimurium у до6 3 зах від 10 до 10 мікробних клітин у 1см на фільтрах в місцях нанесення сальмонел спостерігали зафарблення інтенсивного синього кольору, тобто позитивну реакцію, тоді як в місцях нанесення культур ешеріхіи та стафілококу у відповідних дозах зафарблення такої інтенсивності було відсутнє. Цей дослід показав, що даний метод дозволяє виявляти сальмонели у кількості не менше, ніж 106 мікробних клітин у 1см , тобто, високочутливий Приклад 3. При постановці реакції ТІД з використанням культур S.enteritidis, S heidelberg, S.virchow, S.dublin у дозах від 10 6 до 10 9 мікробних клітин у 1см3 на фільтрах в місцях нанесення сальмонел спостерігали зафарблення інтенсивного синього кольору, тобто позитивну реакцію, тоді як в місцях нанесення культур ешеріхіи та стафілококу у відповідних дозах зафарблення такої інтенсивності було відсутнє. При цьому тривалість реакції не перевищувала трьох годин. Спосіб, що заявляється є експресним, а також дозволяє виявляти сальмонели епідеміологічно значимих сероварів Спосіб простий у постановці, економічний, специфічний, високочутливий прискорений метод, який не потребує спеціального обладнання. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова? 1, м. Київ - 42, 01601