Спосіб виготовлення антигену для виявлення антитіл до сальмонел в сироватці крові

Спосіб виготовлення антигену для виявлення антитіл до сальмонел в сироватці крові, який включає культивування штаму сальмонел, знешкодження мікробних клітин, відокремлення бактерійної маси, ресуспендування, консервування, стандартизацію, який відрізняється тим, що як консервант використовують етиловий спирт, а стандартизацію проводять за аглютинуючою активністю Передбачуваний винахід відноситься до ветеринарної мікробіологи, зокрема до способів виготовлення антигенів для виявлення в сироватці крові аглютинуючих антитіл до сальмонел з метою прижиттєвої діагностики сальмонельозів Існують способи виготовлення корпускулярних сальмонельозних антигенів для серологічної діагностики, які передбачають культивування виробничих штамів сальмонел на щільних або рідких живильних середовищах, відокремлення мікробних клітин від живильного середовища, виготовлення інактивованих суспензій з вмістом 10 125млрд мікробних клітин сальмонел в 1см3 Термін зберігання таких антигенів становить 8-9 МІСЯЦІВ при температурі 2 - 15°С Дані способи виготовлення антигенів є близькими за технічним рішенням до заявляемого об'єкту (Ветеринарные препараты Справочник/ Сост Ю Ф Борисович, Л В Кириллов, под ред Д Ф О с и д з е - М Колос 1981 С 230-231) Недоліком зазначених способів виготовлення препаратів є те, що використання формаліну, який застосовують як консервант, призводить до руйнування О-антигенів сальмонел, що скорочує термін придатності, а стандартизація антигенів за КІЛЬКІСТЮ мікробних клітин в І см призводить до варіювання аглютинуючої активності препаратів різних серій Прототипом може бути спосіб виготовлення антигену кольорового для діагностики пулорозутифу птиці (Ветеринарные препараты Справочник / Сост Ю Ф Борисович, Л В Кириллов Под ред Д Ф О с и д з е - М Колос 1981 - С 231 -232) Цей спосіб передбачає культивування виробничих штамів сальмонел в бульйоні Хоттінгера до максимального накопичення бактеріальної маси, знешкодження її формаліном, осадження центрифугуванням, відмивання фізіологічним розчином, фарбування розчином кристал-вюлету або іншою стійкобарвною речовиною, ресуспендування в фізіологічному розчині до концентрації 12 12,5млрд, мікробних тіл в 1 см3, консервування формаліном Термін придатності антигену 8 МІСЯЦІВ з дня виготовлення у разі зберігання в темному сухому приміщенні при температурі 2 - 15°С В основу винаходу, що передбачається, поставлено завдання знайти спосіб одержання антигену, який зберігає активність і специфічність протягом більшого терміну Поставлене завдання вирішується шляхом культивування штаму сальмонел, знешкодження мікробних клітин, відокремлення бактерійної маси, ресуспендування, консервування, стандартизації, при цьому в якості консерванту замість формаліну, який руйнує О-антигенну детермінанту, що перешкоджає аглютинації мікробних клітин сальмонел О-антисироваткою, використовують етиловий спирт (останній не руйнує Оантигени), а стандартизацію проводять за аглютинуючою активністю Приклад 1 Культивування виробничого штаму Для виготовлення антигену застосовують S ententidis Агарову культуру мікроорганізму висівають у флакони з 100 - 150см3 м'ясо-пептонного бульйону (МПБ), збагаченого 0,5 - 0,7% глюкози (в о го переліку на суху речовину) або на бульйон Хоттінгера і культивують при (37,5 ± 0,5)°С протягом 18 20 годин Отриманою матричною культурою засівають 5 - 20-літрові ємності з МПБ або бульйоном Хотінгера Вирощування виробничих об'ємів бактеріальної маси здійснюють при (37,5 ± 0,5)°С протягом 22 - 24 годин Приклад 2 Виготовлення антигену Зрощену бактеріальну масу S ententidis осаджують центрифугуванням при 200 - ЗООд (3500 5000об/хв) протягом 15 хвилин, відмивають від компонентів живильного середовища 1/15М фосфатним буфером (рН7,2 -7,4), виготовленим на фізіологічному розчині хлористого натрію, тричі в зазначеному вище режимі центрифугування З осаду відмитої бактеріальної маси готують матричну суспензію ресуспендують у фосфатному буфері до концентрації 80млрд, мікробних клітин в 1см3 за оптичним стандартом каламутності Матричну суспензію розводять фосфатним буфером в співвідношеннях 1 2, 1 4, 1 8, 1 32 і 1 64 Отримані розведення матричної суспензії досліджують в краплинній реакції аглютинації (РА) з Окомплексними сальмонельозними сироватками №1 і №5 з "Набора сывороток сальмонеллезных О-комплексных и монорецепторных О- и Нагглютинирующих для экспресс-идентификации 47310 сальмонелл в РА на стекле" Краснодарської бюфабрики ВІДПОВІДНО ДО настанови Таким чином встановлюють найбільше розведення матричної суспензії, в якому спостерігається позитивна РА Матричну суспензію розводять суспензійним середовищем у співвідношенні в 4 рази меншому, ніж встановлене за допомогою розгорнутої РА До розведеної матричної суспензії додають 0,05% кристал-вюлету і рівний об'єм етилового спирту ректифікованого Приклад 3 Визначення стерильності, специфічності і активності антигену Стерильність антигену визначають за діючим ДОСІ 28085 - 89 Специфічність антигену визначають в РА на склі з О-комплексними сироватками для експресідентифікацм сальмонел №1 - №8 Антиген вважають специфічним, якщо він позитивно реагує з О-комплексними сальмонельозними сироватками №1 і №5 (09) Активним визнають антиген, який позитивно реагує в Р А в розведенні 1 2 і більше Антиген для виявлення в сироватці крові антитіл до сальмонел групи Д , виготовлений за запропонованим способом, зберігає активність і специфічність протягом 21 місяця, як при температурі 2 10°С, так і при кімнатній (18 - 35°С) (таблиця) Таблиця Визначення терміну зберігання і специфічності сальмонельозного антигену Сальмонельозний антиген, дата виготовлення Пулорний еритроцитарний, 06 96 Сальмонельозний кольоровий, с 1/96, 05 96 Сальмонельозний групи Д (дослідний), 07 96 Сальмонельозний групи Д (дослідний), 07 96 Пулорний еритроцитарний, 06 96 Сальмонельозний кольоровий, с 1/96, 05 96 Сальмонельозний групи Д (дослідний), 07 96 Сальмонельозний групи Д (дослідний), 07 96 Пулорний еритроцитарний, 06 96 Сальмонельозний групи Д (дослідний), 07 96 Сальмонельозний групи Д (дослідний), 07 96 Сальмонельозний групи Д (дослідний), 01 07 97, с 1/97 Сальмонельозний групи Д (дослідний), 02 07 97, с 2/97 Сальмонельозний групи Д (дослідний), 03 07 97, с 3/97 Сальмонельозний групи Д (до Реакція аглютинації з комплексними сальмонельозними сироватками Зберігання температура, тривалість збері°С гання, МІСЯЦІ 1 2 3 4 5 6 7 8 10 9 10 10 10 8 + + к 8 + + 10 12 10 13 10 12 + + к 12 + + 10 16 10 16 + + к 16 + + к 21 + + к 21 + + к 21 + к 21 + + 47310 слідний), 03 07 97, с 4/97 Сальмонельозний групи слідний), 01 07 97, с 1/97 Сальмонельозний групи слідний), 02 07 97 Сальмонельозний групи слідний), 02 07 97, с 2/97 Сальмонельозний групи слідний), 03 07 97, с 3/97 Сальмонельозний групи слідний), 03 07 97, с 4/97 Д (доД (доД (доД (доД (до 10 21 + + 10 21 + + 10 21 + + 10 21 + + 10 21 + + Примітка К - кімнатна температура (від 18 до 35°С) ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71