Спосіб диференціальної діагностики артеріальної гіпертензії

Спосіб диференціальної діагностики артеріальної гіпертензії, що включає дослідження крові, який відрізняється тим, що визначають рівні стабільних метаболітів оксиду азоту та ендотеліну-1 і на основі цих показників виводять коефіцієнт K=ET-1/(NO2+NO5), де ЕТ-1 - рівень ендотеліну в плазмі крові; NO2 - рівень нітриту азоту в плазмі крові; NO3 - рівень нітрату азоту в плазмі крові. Корисна модель відноситься до медицини, зокрема, кардіології і може бути використана як додатковий диференціально-діагностичний критерій при вирішенні питання про генез артеріальної гіпертензії - есенціальна чи нефрогенно обумовлена артеріальна гіпертензія. На даний час відсутні біохімічні способи для диференціальної діагностики артеріальної гіпертензії. Відомий біохімічний спосіб диференціальної діагностики артеріальної гіпертензії полягає в тому, що в КЛІНІЧНІЙ практиці використовують визначення в крові рівнів сечовини та креатиніну, які при есенціальній артеріальній гіпертензії підвищуються в III стадії захворювання, а при нефрогенній артеріальній гіпертензії - є ранніми маніфестними ознаками даного захворювання [Й.Е. Тареева. Справочник по нефрологии. - 2000г.]. Однак, при гіпертонічній хворобі підвищення рівнів сечовини та креатиніну відбувається через 10-20 років від початку захворювання, а при нефрогенній артеріальній гіпертензії на більш ранніх строках - через 5-10 років. При артеріальній гіпертензії спостерігається дисбаланс вазодилатуючих та вазоконстриктори их факторів, який може бути охарактеризований коефіцієнтом ET-1/(NO2+NO3). В основу корисної моделі "Спосіб диференціальної' діагностики артеріальної гіпертензії" поставлено завдання шляхом визначення коефіцієнту ЕТ-1/(Г\І0г+М0з) прискорити та підвищити точність диференціальної діагностики при артеріальних гіпертензіях різного генезу. Поставлене завдання здійснюється способом, що передбачає дослідження крові, в якому згідно з корисною моделлю визначають рівні стабільних метаболітів оксиду азоту (NO2 і NO3) та ендотеліну-1 (ЕТ-1) і на основі цих показників виводять коефіцієнт - ET-1/(NO2+NO3). У практично здорових осіб цей коефіцієнт дорівнює, в середньому, 0,3±0,05од., при есенціальній артеріальній гіпертензії - 1,38±0,06од., а при артеріальній гіпертензії нефрогенного генезу - 2,85±0,04од. Персентильний статистичний аналіз значень коефіцієнту показав, що референтні його значення у практично здорових осіб складали 0,17-0,52од., у хворих на гіпертонічну хворобу - 0,99-1,77од., у хворих з нефрогенною артеріальною гіпертензією - 2,123,58од. Встановлено такі диференціальнодіагностичні критерії: при значеннях коефіцієнту менше 2,0од. у хворих з артеріальною гіпертензією можна думати про гіпертонічну хворобу, значення коефіцієнту - 2,0од. і більше свідчать про нефрогенний генез артеріальної гіпертензії. Спосіб здійснюється таким чином: Вміст оксиду азоту (NO) визначали за концентрацією його стабільних метаболітів - нітриту (NO2) та нітрату (NO3) в цитратній крові " спектрофотометричним методом з реактивом Гріса з сульфаніловою кислотою та 1 - нафтоламіном. Визначення нітрит-аніону (NO2) в плазмі крові спектрофотометричним методом Гріна з використанням реактиву Гріса. Реактиви: - свіжо приготовлена плазма людини; - 30% розчин сульфату цинку; - реактив Гріса (сухий порошок 500мг в ЮОмл дистильованої води. До свіжої плазми крові об'ємом 1,5мл додавали 1 мл 30% сульфату цинку для де протеїн і за ції і CM о> о 11092 ретельно перемішували. Відцентрифуговували плазму крові при 3000об/хв. 15 хвилин. Супернатант зливали, до нього додавали рівний об'єм реактиву Гріса і ретельно перемішували. При кімнатній температурі залишали на 40-45хв. до появи рожевого забарвлення. Вимірювали при довжині хвилі 540нм. Калібровочна крива - відомі величини NaNO2. Визначення нітрат-аніону (NO3) спектрофотометричним методом з використанням сухого відновлювача. Реактиви; - 30% розчин сульфату цинку; - сухий відновлювач (100г сульфату барію, 10г сульфату марганцю, 2г цинкового пилу, 75г лимонної кислоти, 4г сульфанілової кислоти, 2г Lнафтиламіну фірми "Merck"); - 12% розчин оцтової кислоти. В свіжу плазму крові (1,5мл) додавали 1мл 30% сульфату цинку для депротеїнізації, ретельно перемішували, відцентрифуговували плазму крові при 3000об/хв. 15 хвилин. Супернатант зливали і до нього додавали ЮОмг сухого віновлювача, ретельно перемішували і залишали на 10хв. в кімнаті. Далі додавали 1,5мл 12% оцтової кислоти, ретельно перемішували І залишали на 15хв. при кімнатній температурі. Відцентрифуговували при 3000об/хв. 15хв. Надосадову рідину зливали в пробірки. Вимірювали при довжині хвилі 540нм. Калібровочна крива - відомі величини NaNCb. Рівень ЕТ-1 в плазмі визначали Імуноферментним методом. Забір крові у хворих робили зранку натщесерце у кількості 5мл з додаванням 5мг ЕДТА. Відцентрифуговували кров при 1600д на протязі 15 хвилин при 0°С. Переносили плазму в нову поліпропіленову пробірку. Хроматографічні реагенти: 1. Буфер А: 1% розчин TFA (для HPLC) в дистильованій воді 2. Буфер В: 60% ацетонітрил (для HPLC), 1% TFA і 39% дистильованої води. Процедура екстракції: 1. Добавити рівну кількість буферу А до плазми. Відцентрифуговувати при 6000-17000д напротязі 20 хвилин при 4°С. Комп'ютерна верстка В. Мацело 2. Обробити розподільний картридж, який містить 200мг С18 (Кат. - № R1K-SEPCOL1), 1мл 100% ацетонггрилу (буфер D, один раз) або 1мл 60% ацетонітрилу (буфер В, один раз), після чого обробити картридж Змл буферу А (3 рази). 3. Помістити суміш зразка з буфером в оброблений картридж С18. Повільно промити картридж три рази Змл буферу А, видалити рідину. 4. Повільно елюювати білок Змл буферу В (один раз), зібрати ельоат в поліпропіленову пробірку. 5. Випарити рідину до висушування зразку в центрифужному концентраторі. 6. Зберігати сухий екстракт при -20°С. Об'єм рідини для розведення осаду визначається очікуваною концентрацією білку в зразку. Якщо в ході аналізу значення концентрації білку не потрапляє в лінійний діапазон калібровочної кривої набору, необхідно розведення або концентрація зразку. Приклад І. Хвора В., 47 років. Діагноз: Гіпертонічна хвороба II стадії. Гіпертрофія лівого шлуночку. Гіпертонічна ангіопатія сітківки. Неускладнені гіпертонічні кризи. Серцева недостатність НА стадії. Рівень ендотеліну-1 в плазмі крові 14,94пг/мл, рівень (NO2+NO3) - 10,46мкмоль/л. Коефіцієнт ET-1/(NO2+NO3) складає 1,4од. Так як значення коефіцієнту менше 2,0од., можна діагностувати у хворої есенціальну артеріальну гіпертензію. Приклад II. Хвора А., 55 років. Діагноз: Хронічний гломерулонефрит, сечовий варіант в стадії загострення. Хронічна ниркова недостатність І ступеню. Анпопатія судин сітківки. МіокардІодистрофія. Серцева недостатність І стадії. Рівень ендотеліну-1 в плазмі крові 37,01 пг/мл, рівень (NO2+NO3) -15,46мкмоль/л. Коефіцієнт ET-1/(NO2+NOa) складає 2,4од. Так як коефіцієнт ET-1/(NO2+NO3) знаходиться в межах 2,12-3,58од., ми можемо діагностувати артеріальну гіпертензію нефрогенного генезу. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601