Спосіб одержання препарата специфічних антитіл до антигенів паразита

Изобретение относится к области биохимии и иммунологии, а именно к способам выделения чистых препаратов бактериальных антител к микоплазмам из биологических жидкостей. Наиболее близким по технической сущности к заявляемому объекту является способ получения специфических антител к антигенам паразита, в частности, ларвоцист эхинококка. По известному способу источником антител является сыворотка крови кроликов, предварительно иммунизированных цельной жидкостью эхинококковых ларвоцист. Для выделения антител используют неорганический сорбент - силохром, обработанный g-аминопропилтиэтоксисиланом и глутаровым альдегидом. Сорбент инкубируют с нормальной бараньей сывороткой, промывают и далее вводят во взаимодействие с сывороткой иммунизированного кролика с образованием иммунных комплексов, после чего истощенную сыворотку сливают. Иммуносорбент промывают забуференным физиологическим раствором (ЗФР). Антитела элюируют HCl-глициновым буфером. Выделенные антитела используют для иммунохимического анализа антигенных препаратов и для получения эритроцитарного диагностикума. Однако недостатком известного метода получения специфических антител является то, что он сложный и малоэффективный. Причиной этого служит использование и создание в прототипе самого иммуносорбента, технология его приготовления сложная, трудоемкая и многоступенчатая. Кроме того, источником получения антител в прототипе является использование сыворотки крови, предварительно иммунизированных животных. Такая сыворотка содержит множество неспецифических антител, которые также фиксируются на сорбенте, и от них затем сложно избавиться. Существенным недостатком известного способа является то, что выход антител, где источником служит гипериммунная сыворотка, очень низкий по той причине, что они обладают с адсорбированным антигеном очень высокой авидностью, т. е. сильным притяжением и удерживанием. Поэтому антитела трудно элюируются из таких иммунных сорбентов. Задача изобретения - упрощение способа получения препарата специфических антител к микоплазмам и повышение его эффективности использования. В основу изобретения положено исключение из процесса иммуносорбента; изменение процесса подготовки антитела путем использования референтного штамма микоплазм; замены источника антител. Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения препарата специфических антител к микоплазмам, включающем подготовку антигена, инкубирование антигена с источником антител, выделение образовавшихся иммунных комплексов и элюирование из них антител HCl-глициновым буфером, согласно изобретению, антиген готовят формалинизацией культуры референтных штаммов микоплазм, патогенных для крупного рогатого скота; в качестве источника антител используют g-глобулин, выделенный из молозива первого удоя коров, носителей микоплазм; антиген инкубируют с g-глобулином, образовавшиеся иммунные комплексы с целью выделения видимого осадка обрабатывают 6% - ным раствором полиэтиленгликоля в фосфатном буфере, центрифугируют, а из осадка элюируют антитела. Для осуществления способа используют культуру референтного штамма микоплазм, а именно: Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovigenitalium. Установлено, что в результате осуществления изобретения в объеме его существенных признаков, возможно исключить использование иммуносорбентов, благодаря использованию культур референтных штаммов микоплазм, выбранных из указанной группы штаммов. Это обуславливает возможность образования иммунных комплексов микоплазменного антигена с g-глобулином. g-Глобулин, полученный из молозива первого удоя коров, носителей микоплазм, богат антителами к микоплазмам, но не содержит неспецифических антител и белков, затрудняющих полноценное выделение образующихся при инкубации иммунных комплексов. Иммунные комплексы, в состав которых входят антитела из g-глобулинов молозива, легко диссоциируют за счет низкой авидности. Выделение образовавшихся иммунных комплексов возможно лишь при использовании 6% - ного раствора полиэтиленгликоля в фосфатном буфере, который дает возможность получить видимый осадок с последующим его центрифугированием. Низкая авидность комплексов обеспечивает полное элюирование иммунных комплексов, высокий выход, чистоту и специфичность препарата антител к микоплазмам. Способ осуществляется следующим образом. Пример 1. Культуру Mycoplasma bovis выращивают в объеме 800мл при 37°C в течение 72 - 96 часов в бульоне Хоттингера. Выросшую бакмассу микоплазм очищают на центрифуге 30мин при 6 - 7тыс. об/мин. И трижды отмывают забуференым физиологическим раствором (ЗФР) pH 7,2 - 7,4 от компонентов среды. Из осадка микоплазм готовят 20млрд. взвесь и добавляют формалин до 0,5% - ной концентрации. Формалинизацию микоплазм проводят в течение трех суток при 4°C, после чего трижды отмывают от формалина ЗФР pH 7,2 - 7,4 с промежуточным центрифугированием 30 минут при 6 - 7тыс.об/мин. Из молозива первого удоя от коров, титр сыворотки крови которых к микоплазмам составил 1 : 512 и выше, готовят g-глобулин; 2мл молозивного g-глобулина добавляют к осадку формалинизированных микоплазм, оставляют при комнатной температуре на 5 часов, а затем для ускорения процесса образования иммунных комплексов ставят на 2 часа в термостат при 37°C. После этого к смеси добавляют 2мл 6% - ного раствора полиэтиленгликоля в 0,02М фосфатном буфере pH 7,4 и смесь выдерживают 12 часов при 4°C. 6% - ный раствор ПЭГа добавляют с целью образования видимого осадка иммунных комплексов. Затем из смеси отделяют осадок центрифугированием и. промывают его ЗФР один раз с промежуточным центрифугированием. Элюирование иммунных комплексов проводят HCl-глициновым буфером pH 3,0, для чего осадок ресуспендируют в 2мл буфера, выдерживают на холоде 10 минут и центрифугируют в течение 30мин при 6 - 7тыс.об/мин. Элюцию можно провести еще раз. Надосадочную жидкость нейтрализуют сухим бикарбонатом натрия до pH 7,0 - 7,2. Для установления титра антител в элюатах, их перепроверяют в реакции непрямой агглютинации с антигеном Mycoplasma bovis. При использовании 500мг осадка формалинизированных микоплазм получают чистые антитела в титре 1 : 32, что является достаточным для приготовления антительного диагностикума. Пример 2. Используют культуру Mycoplasma bovirhinis, как это описано в примере 1. Далее опыт проводили аналогично. Получают чистые антигена в титре 1 : 4. Пример 3. Используют культуру Mycoplasma bovigenitalium, выращенную аналогично примеру 1. Получают чистые антитела в титре 1 : 4. Уровень белка в элюатах определяют на спектрофотометре. Титр антител в элюатах составляет от 1 : 4 до 1 : 64, в зависимости от количества осадка формалинизированных микоплазм, введенного в реакцию образования иммунных комплексов. Чистоту и специфичность полученных антител подтверждают биохимическими и мерологическими исследованиями. В реакции непрямой агглютинации (РНБА) и РЗГА, вирусными антигенами ИРТ, рота-, коронавирусами. В исследуемых образцах титр антител к этим антигенам отсутствовал. Для проверки специфичности поставлена реакция агглюнации с набором бактериальных антигенов. Титры исследуемых образцов чистых антител представлены в табл.2. Полученные данное позволяют утверждать, что при реализации способа с успехом могут быть использованы именно вышеуказанные референтные штаммы микоплазм, патогенные для крупного рогатого скота. Образующиеся в результате проведения опытов иммунные комплексы, по заявляемому способу, при взаимодействии антигена формалинизированных микоплазм и молозивного g-глобулина извлекаются за счет осаждения с применением 6% - ного полиэтиленгликоля в фосфатном буфере pH 7,4. Полученные затем антитела отличаются высокой чистотой и специфичностью. Таким образом, заявляемый способ получения препарата специфических антител к миколпазмам позволяет выделить антитела без применения иммуносорбента. Полученные антитела чисты от неспецифических белков и не требуют какой-либо дополнительной очистки. Проведение процесса по заявляемому способу прост и не требует дополнительных затрат на гипериммунизацию животных и забор крови не нужен. Исключаются также потери, обычно имеющие место при элюировании иммунных комплексов, так как получаемые в процессе реализации заявляемого способа иммунные комплексы легко диссоциируют за счет низкой авидности.