Спосіб одержання мічених антитіл

Д Л Я СЛУЖІ Б Н О Г О П О Л Ь З О В А Н И Я Э К З N9) Q 0 0 U 0 СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЄСПУБЛИН 33/53 ГОСУЛАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГННТ СССР К АВТОРСКОМУ (21) 4395425/30-14 (?2) 09.02.88 t (7)) Институт биохимии им. Палладина и Институт органической химии (72) С В . Комиссаренко, Г.Н. Фомовт екая, 0ЛІ. Левч^к, А.Н. Борисевич, М.О. Лозинский и Н.И. Мирян (.53) 615* 375(088.8) (56) Патент CU1A fr 4323546, кл. А 61 К 43/00, 1982. (Ь4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕНЫХ АНТИТЕЛ (57) Изобретение относится к способам получения меченых антител для определения специфических антигенов. Цель изобретения - интенсификация способа и повышение выхода целевого продукта. Специфические антитела обрабатывают периодатом натрия в изотоническом растворе при молярном соотношении 1:100, после хроматографии антитела Изобретение относится к способам получения меченых антител для качественног о и количественного определения специфических антигенов. * Целью изобретения является интенсификация способа и повышение выхода целевого продукта. Способ осуществляют следующим образом. Предварительно проводят активацию углеводной компоненты антител методом лериодатного окисления в 0,852 растворе хлористого натрия, рН 4,5, при молярном соотношении антитела к периодату 1:100, в течение 20 мин. Избыток периодата удаляют хромато^.,_ 31-90 коньюгируют с бисфосфонатами в изотоническом растворе, рН 8-9, при соотношении 1:500-1000, затем кон ью-* гат инкубируют с 1-3 мМ кальцием или восстановленным 9 9 m технецием с активностью 8-9 ЇІБК в изотоническом растворе, рН 7-9, при молярном соотношении ] :1 *10^ в течение 1-3 мин, с последующей хроматографией. В качестве бисфосфонатов используют 1,1аминометилен-1-1-бисфосфоновую кислоту, мононатриевую соль 3-амиио-I-ок~ оипропилидена бисфосфоновог! кислоты, мононатриевую соль 4-амино-і-оксибу— тилидена бисфосфоновой кислоты, мононагриевую соль 4-гуанидино~1-оксибутилиден-I-1"бисфосфоновой кислоты. Выход целевого продукта увеличивается на 20% и сокращаеася время его получения на 22 ч. графически на колонне с сефадексом 6~25 в течение 15 мин. Коннотации антител осуществляют с аминобисфосфонатами в Физиологическом растворє, рН 8,0-9,0, при молярном соотношении белка к бнофосфонату 1:500-1000 в течение 120 мин. Heсвязавшийся бисфосфонат удаляют хроматографически на колонке с сефадексом G-25 в течение 15 мин. В качестве биофосфоната используют следующие соединения : 1,1-аминометилен-1,1~бисфосфоновая кислота (БФ 1) НгОгР-С-РО3Н2 NH-» СЛ эо 00 1588137 мононатриевые соли З-амино-1-оксипропилиден (БФП) H 2 O a P-C-PO 3 HNa 4-амино-1-оксибутилиден (БФШ) ОН 4-гуанидино-1-оксибутилиден (БФ IV) ОН NH вацию антител проводят идентично примеру 1. IgG кролика (антитела) протиі IgG мыши (антигены) коньюгируют с БФ III (мононатриевой солью 4-амино-1-оксибутилиден-1,1-бисфосфоновой кислоты). После хроматографической очистки измеряют радиоактивность антитеп. 10 и вычисляют* что с 1 мкг антител связано 36 нмоль Са. Получено 10 мл меченых антител с концентрацией 1,37 мг/мл, выход 91,3%. П р и м е р З . Взято 0,3 мл анти- * тел с концентрацией 12 мг/мл. Активацию антител проводят аналогично примеру 1. IgG кролика (антитела) против IgG мыши (антигены) коньюгируют с БФ IV (мононатриевой солью 4-гуанидино-1-оксибутштден-1 ,1-бис 20 фосфоновой К И С Л О Т Ы ) . Антитела, конъюгированные в с бисПосле хроматографической очистки фосфонатом, инкубируют 1-3 мин в фиизмеряют радиоактивность антител и зиологическом растворе с 1-3 мм ра2 вычисляют, что с 1 мкг антител свядио акти в но г о Са*' или с восстановлен25 зано 30 нмоль Са. ным SnCI? " " Т с , выделенным из Получено 8 мл меченых антител " М о / 5 9 № Тс - генератора, объемная с концентрацией 0,39 мг/мл, выход активность 8,4 МБк, рН 7 , 0 - 9 , 0 . 86,7%. От несвязавшегося металла антитеП р и м е р 4. Взято 0,5 мл антила очищают хроматографически в т е ч е - 30 тел с концентрацией 30 мг/мл. Активацию проводят, инкубируя с 2 мг NalO^ ние 15 мин. Общее время осуществлев 250 мкл физраствора, рН 4,5. Антиния способа около 3 ч . тела ко^ньюгируют с 19 мл мг 1,1-амиП р и м е р 1. Взято 0,5 мл (с нометилен'1,1~бисфосфоновой кислоты концентрацией 12 мг/мл иммуноглобуі'БФІ) в 2 мл физраствора, рН 8,0 линов С) IgG кролика (антитела) про35 (0,019%), при соотношении 1:1000, тив IgG мыЬш (антигены). Их активизатем инкубируют с раствором пертехруют в физиологическом растворе нетата натрия, выделенным из 93 Мо/ рН 4 , 5 , смешивая с 0,8 мг NalO^. в /93 Гс-генератора, объемная актив100 мкл физиологического раствора, ность 8 МБК (мегабаккерелей), восстамолярное соотношение белка к периодановленного SnCl 2 , молярное соотношсту составляет 1:100, t ° - 20°С, в р е f ние коньюгат: металл 1; 10 , рН 7,0, мя активации 20 мин, после чего пров течение 1 мин. водят конъюгацию активированных антител - 3 мл антител с концентрацией После хроматографической очистки 1,98 мг/мл ~ с бисфосфонатом - моно- 45 измеряют радиоактивность меченых антинатриевой солью З-амино-1-оксипропител. Она составляет 1 , 2x106 имп. /мин на лиден-1,1-бисфосфоновой кислоты, 1 мкг IgG. Получено 10 мл мече5,5 мг БФ I I в 0,5 мл (0,011%-ный ных антител с концентрацией 1,39 мг/мл, р~р) , при молярном соотношении 1:500, выход 92,6%. рН 8,0, затем инкубируют с 1 м растМ вором ( 4 5 С а ) СаС1 г , рН 7,0, в т е ч е - 50 С помощью предлагаемого способа ние I мин. После хроматографической достигается увеличение выхода целеочистки измеряют радиоактивность анвого продукта на 20% (выход продукта тител и вычисляют, что с 1 мкг антипо предлагаемому способу 97%, по протел связано 56 нмолъ 4 Ч а . тотипу - 77%), а также сокращение ь Получено 10 меченых антител с кон- 55 времени его получения на 22 ч (по предлагаемому способу длительность центрацией 0,53 мг/мл, выход 88,3%. процесса составляет 3 ч, по протоП р и м е р 2. Взято 0,5 мл антитипу - 25 ч ) . тел с концентрацией 30 мг/мл, Акти 5 • 1588 37 * 4f кальцием, хлсридом или 99 * тех* Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я нецием с объемной активностью 8-9 мегабакерелей в изотоническом раствобпособ получения меченых антител ре, рН 7-9, при молярном соотношении путем инкубации антител с р а д и о а к т и в 1:1*10* в течение 1-3 мин, в качестным металлом с последующей хроматове бисфосфонатов используют 1,1графией ц е л е в о г о продукта, о т л и аминометилен-1-1-бисфос^новую кисч а ю щ и й с я тем, ч т о , с целью лоту или мононатриевую соль 3-аминоинтенсификации способа и повышения выхода целевого продукта, а н т и т е л а JQ -1-оксипропилиден бисфосфоновоЙ кислоты, или мононатриевую соль 4~аминоперед инкубацией обрабатывают перио-1-оксибутилиден бисфосфоновоЙ кисдатом натрия в изотоническом р а с т в о лоты, или мононатриевую соль 4-гуани* ре при молярном соотношении 1:100, дино-1-оксибутилиден-ї-і-бис.фосфозатем - бисфосфонатом в и з о т о н и ч е с ком р а с в т о р е , рН 8-9, в соотношении 15 но во.й кисло ты. 1 : .500-1000, инкубируют с 1-3 мМ Редактор Л. Пашкова Составитель Б. Литовченко Техред М.Дидык Корректор Э.Лончакова " Заказ 2736/ДСП Тираж 462 Подписное ВНИИИИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-3 5, Раушская наб., д. А/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101