Спосіб отримання ліпосоми із медичної пиявки

Изобретение относится к медицине и может применяться в гематологии, биохимии, медицинской и биохимической промышленности. Известен способ получения дестабилазы из медицинской пиявки, взятый нами в качестве прототипа [1], при котором сырье обрабатывают, очищают методом аффинной хроматографии, элюируют целевой продукт, нейтрализируют и лиофилизируют. Однако связывание с лизином связывающих участков дестабилазы, подобно "кринглом" плазминогена приводит к получению дестабилазы, нестабильной при прогревании 80°C в течение 15мин, т.е. происходит выпадение в осадок дестабилазы (денатурация) и снижение содержания простагландина. Дестабилаза претерпевает конформационное изменение, в результате чего белковая часть ее теряет способность к комплексообразованию с гидрином и ингибитором калликреина. Липосома, продуцируемая медицинскими пиявками, представляет собой прочный комплекс гирудина, пиявочных простагландинов, дестабилазы и ингибитора калликреина плазмы крови, при соотношении 1 : 1 : 1 : 1. В основу изобретения поставлена задача создания способа получения липосомы из медицинской пиявки, в котором обеспечивается получение стабильного комплекса, при агрегировании мономеров которого образуется прочная, термостабильная липосома. Поставленная задача решается тем, что согласно изобретению аффинную хроматографию проводят на L-глутамине, иммобилизированном на водонерастворимом носителе. Липосома проявляет свои свойства как в водных, так и в органических растворителях, т.е. пространственно изменяет свою ориентацию, экспонируя или гидрофильную, или гидрофобную часть. Гидрофобные свойства липосомы обусловлены липидным компонентом простагландинами, тогда как гидрофильные белковой структурой дестабилазы, гирудина и ингибитора калликреина [2]. Мономер липосомы - комплекс с ММ 2500Да, стабилен при различных биохимических обработках, выдерживает прогревание при 80°C в течение 15мин. Мономеры имеют агрегаторную способность, что приводит к образованию липосомы. Способ осуществляют следующим образом. В качестве сырья используют секрет слюнных желез пиявок или экстракт лиофильно высушенных пиявок, или гомогенаты отдельных частей тела пиявок. Аффинную хроматографию проводят на L-глутамине, иммобилизованном носителе (L-глутамин-агароза, L-глутамин сефароза) и элюируют целевой продукт буферными растворами с pH 3,0 - 5,0 и pH 8,0 10 (с прототипом одна элюция - pH 3,0 - 5,0), нейтрализуют полученные элюаты, соединяют и лиофилизируют. Последовательность элюирующи х буферов на вы ход целевого продукта не влияет. Пример 1. Колонку, наполненную 20мл Lглутамин-агарозы, уравновешивают дистиллированной водой. Наносят 10мл секрета слюнных желез пиявок, далее промывают от несвязавшихся компонентов дистиллированной водой. Первую элюцию проводят раствором уксусной кислоты с pH 3,2. Собирают элюат. Вторую элюцию проводят 0,05М Трис-HCl буфером pH 8,3. Собирают элюат, объединяют элюаты, нейтрализуют pH и лиофилизируют. Конечный продукт обладает фибринолитической активностью, блокирует агрегацию тромбоцитов, ингибирует тромбин и каллекреин плазмы крови (таблица). Пример 2. На колонку, наполненную 20мл Lглутамин-агарозы наносят 30мл водного экстракта порошка лиофильно высушенных медицинских пиявок. Промывают колонку дистиллированной водой. Первую элюцию проводят 0,05М Трис-HCl буфером pH 9,8, промывают дистиллированной водой затем элюируют раствором уксусной кислоты pH 5,0. Собирают элюаты, нейтрализуют и определяют активность конечного продукта (таблица). Пример 3. Все процедуры проводят, как указано в примере 2. Элюирование конечного продукта осуществляют раствором уксусной кислоты с pH 2,5 и 0,05М Трис-HCl буфером pH 7,8. Конечный продукт не обладает активностью (таблица). Для тестирования целевого продукта использованы методы: 1. Спектрофотометрическое определение концентрации белка [3]; 2. Фибринолитическая активность на пластинах стабилизированного фибрина [4]; 3. Тромбиновое время [5]; А, Время рекальфикации плазмы крови 5. Агрегация тромбоцитов [7]. Данный способ позволяет получить препарат, обладающий не только тромболитическим но и защитным противотромботическим действием, эффективным не только при внутривенном, но и при пероральном введении. Таким образом, при обработке конечного продукта, связанного с глутамин-агарозой, раствором уксусной кислоты при pH меньше 3,0 происходит инактивация дестабилазы на 50%, простагландинов на 85%, гирудина на 100% и ингибитора калликреина на 90%. То же самое происходит при использовании элюирующего буфера с pH более10. Применение элюирующи х буферов со значениями от 5,0 до 8,0 не приводит к разрушению связи между конечным продуктом и глутамином, иммобилизованном на водонерастворимом носителе.