Спосіб отримання химерних ембріонів

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к микрохирургии эмбрионов млекопитающих. Известен способ получения химерных эмбрионов (Биология развития млекопитающих. Ме тоды: Пер. с англ./Под ред. М.Манк. - М.: Мир. – 1990 - С.155-156), при котором эмбрионы освобождают от прозрачных оболочек химическим путем. Полученные эмбрионы без прозрачной оболочки объединяют по два или более в одной капле культуральной среды для агрегации, сближают их иглой и инкубируют в течение 12 часов. Все манипуляции с эмбрионами проводят в изотонических условиях. Однако при таком способе получения химерных эмбрионов эмбриональный материал подвергается неблагоприятному химическому воздействию при освобождении эмбрионов от прозрачных оболочек, Кроме того, процедура агрегации усложняется тем, что эмбрионы необходимо несколько раз подталкивать друг к другу и при этом нарушать условия культивирования. К тому же, эта процедура длится несколько часов и может пагубно повлиять на жизнеспособность эмбрионов. Также следует заметить, что при агрегации в один химерный эмбрион двух или более целых эмбрионов не рационально используется эмбриональный материал. Известен также способ получения химерных эмбрионов, который принят в качестве прототипа (Эрнст Л.К., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. - М.: Агропромиздат, 1989. С.253-254). Этот способ включает проведение следующи х операций в изотонических условия х: извлечение эмбрионов из прозрачных оболочек, разделение эмбрионов на части и помещение частей разных эмбрионов в пустую прозрачную оболочку для агрегации. Однако при таком способе получения химерных эмбрионов не удается достичь достаточно высокой сохранности эмбрионального материала на различных этапах способа. Так, из-за малого размера перивителлинового пространства и ограниченности оперативного доступа к эмбриону внутри прозрачной оболочки существует вероятность деформации и повреждения эмбрионов при извлечении их из прозрачных оболочек. Также возможны повреждения и потеря отдельных эмбриональных клеток при разделении извлеченных эмбрионов на части. Это происходит потому, что связи между отдельными клетками эмбриона могут быть очень сильными и при попытке их разрыва при помощи микроинструмента (микроиглы) могут разрушаться сами клетки и образовывать между частями эмбриона вместе с межклеточными структурами трудноразделимые тяжи. При дальнейших манипуляциях по разделению этих тяжей может происходить нарушение связей между клетками и отторжение отдельных клеток от частей эмбриона. Аналогичные повреждения могут возникать и при помещении частей разных эмбрионов в прозрачную оболочку вследствие деформации, которой подвергается эмбриональный материал в процессе этой операции. Эти повреждения отрицательно влияют на агрегацию частей эмбрионов и снижает жизнеспособность химерных эмбрионов. Также следует заметить, что такой способ получения химерных эмбрионов достаточно трудоемкий. В основу изобретения поставлена задача усовершенствовать способ получения химерных эмбрионов путем комбинирования растворов разной тоничности на различных этапах способа, что позволяет управлять размерами и формой эмбрионального материала и за счет этого увеличить его сохранность при проведении микрохирургических операций, а также повысить технологичность получения химерных эмбрионов. Поставленная задача решается тем, что в способе получения химерных эмбрионов, включающем извлечение эмбрионов из прозрачных оболочек, разделение эмбрионов на части, помещение частей разных эмбрионов в пустую прозрачную оболочку для агрегации, согласно изобретения, извлекают эмбрионы из прозрачных оболочек в гипертонических условиях, разделяют эмбрионы на части в гипотонических условиях, помещают части разных эмбрионов в пустую прозрачную оболочку в гипертонических условиях и затем помещают объединенные в одной прозрачной оболочке части разных эмбрионов в изотонические условия для агрегации. Проведение извлечения эмбрионов из прозрачных оболочек в гипертонических условиях позволяет за счет уменьшения объеме клеточной массы эмбриона вследствие выхода из клеток воды и увеличения размера перивителлинового пространства, а значит, и оперативного доступа к эмбриону внутри прозрачной оболочки, которая не обладает свойствами избирательной проницаемости и не изменяет своих размеров в растворах разной тоничности, уменьшить деформацию эмбрионального материала и степень связанных с ней повреждений (разрушение клеток, нарушение межклеточных связей), отторжение от клеточной массы отдельных эмбриональных клеток) при выполнении этой операции, а значит повысить сохранность извлекаемых из прозрачных оболочек эмбрионов. Проведение разделения эмбрионов на части в гипотонических условиях позволяет за счет уменьшения площади межклеточных контактов и ослабления связей между клетками, обусловленного приобретением клетками при набухании сферической формы, облегчить выполнение этой операции, уменьшить при этом вероятность разрушения и потери отдельных клеток, а значит повысить сохранность получаемых частей эмбрионов. Проведение помещения частей разных эмбрионов в пустую прозрачную оболочку в гипертонических условиях позволяет за счет уменьшения объема частей эмбрионов уменьшить деформацию и связанные с ней повреждения при выполнении этой операции, а значит повысить сохранность объединяемых в прозрачной оболочке частей разных эмбрионов. Кроме того, проведение извлечения эмбрионов из прозрачных оболочек и помещения частей разных эмбрионов в пустую прозрачную оболочку в гипертонических условиях позволяет за счет уменьшения объема эмбрионального материала использовать в этих операциях инъекционные микропипетки меньшего диаметра, что в значительной степени облегчает проникновение этого инструмента внутрь прозрачной оболочки и сокращает время проведения операций, а значит делает способ получения химерных эмбрионов более технологичным. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Для извлечения из прозрачной оболочки эмбрион помещают в гипертонический раствор NaCI осмолярностью 1,5 осм, выдерживают в течение 1 мин. За это время уменьшается объем эмбриона и увеличивается размер перивителлинового пространства. Затем эмбрион фиксируют при помощи удерживающей микропипетки (микроприсоски), разрезают микроскальпелем прозрачную оболочку или перфорируют ее при помощи заточенной инъекционной микропипетки, вводят микропипетку в перивителлиновое пространство, засасывают эмбрион в микропипетку, выводят микропипетку с эмбрионом из прозрачной оболочки и выдувают из нее эмбрион. Извлеченный из прозрачной оболочки эмбрион помещают в гипотонический раствор NaCI осмолярностью 1,5 осм выдерживают в течение 1 минуты. За это время эмбрион набухает, объем его клеток увеличивается, они приобретают сферическую форму и связи между клетками ослабляются. После этого эмбрион разделяют без фиксации на две или более частей при помощи стеклянной микроиглы. Для помещения в пустую прозрачную оболочку части разных эмбрионов переносят в гипертонический раствор NaCI осмолярностью 1,5 осм. После выдержки в течение 1 мин. уменьшившиеся в объеме части разных эмбрионов поочередно засасывают в инъекционную микропипетку и инъекцируют в п устую прозрачную оболочку, зафиксированную при помощи микроприсоски. Затем объединенные в одной прозрачной оболочке части разных эмбрионов помещают в изотонические условия для агрегации. Таким образом, предлагаемый способ позволяет за счет проведения извлечения эмбрионов из прозрачных оболочек в гипертонических условиях, разделения эмбрионов на части в гипотонических условиях и помещения частей разных эмбрионов в прозрачную оболочку в гипертонических условиях повысить сохранность эмбрионального материала при проведении этих микрохирургических операций и технологичность получения химерных эмбрионов. Возможность осуществления предлагаемого способа получения химерных эмбрионов подтверждена примером. Пример. Эмбрионы коровы получали нехирургическим путем на 5 день после осеменения. В работе использовали эмбрионы отличного и хорошего качества. Отмывали эмбрионы два раза в изотоническом физиологическом растворе Дюльбекко. Переносили по одному эмбриону на предметное стекло в каплю гипертонического раствора NaCI осмолярностью 1,5 осм, фиксировали эмбрион микроприсоской, микроножом разрезали прозрачную оболочку, вводили в разрез инъекционную микропипетку и извлекали эмбрион из прозрачной оболочки. Переносили его в гипотонический раствор NaCI осмолярностью 0,2 осм, где он увеличивал свой объем. Проводили бисекцию эмбриона стеклянной микроиглой без фиксации. По одной половинке от двух разных эмбрионов переносили вместе в одну каплю гипертонического раствора NaCI осмолярностью 1,5 осм, где части эмбрионов уменьшались в объеме. Инъекционной микропипеткой помещали половинки разных эмбрионов в пустую прозрачную оболочку. После этого объединенные в одной прозрачной оболочке части разных эмбрионов переносили в фосфатно-солевой буфер осмолярностью 0,29 осм с добавкой 20% фетальной сыворотки теленка и антибиотиков и культивировали при 38,5°С для агрегации. Успешно агрегированные химерные эмбрионы продолжали культивировать для определения их способности к дальнейшему развитию in vitro. В качестве контроля проводили получение химерных эмбрионов в изотоническом растворе. Результаты эксперимента представлены в таблице. Результаты эксперимента показывают, что использование гипер- и гипотонического растворов при получении химерных эмбрионов позволяет повысить сохранность эмбрионов и их частей и увеличить число химерных эмбрионов.