Спосіб виділення поліморфноядерних лейкоцитів з крові людини

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной и клинической иммунологии и может быть использовано для выделения полиморфноядерных лейкоцитов из крови человека, используемых для проведения нитросинететразолиевого теста. Известен способ получения чистой популяции нейтрофилов [1], согласно которому брали 10,0 мл крови в пробирку, содержащую 500 ЕД гепарина (50 ЕД/мл) и инкубировали при температуре 37°С в течение 30 мин для оседания эритроцитов, плазму со взвешенными в ней лейкоцитами подвергали центрифугированию при 800 оборотов в минуту в течение 10 мин. Осадок лейкоцитов трижды отмывали средой 199, клетки ресуспендировали в 1 мл среды 199, лейкоциты разделяли на градиенте фиколл: верографин с плотностью 1,077 г/см в центрифужной пробирке при 1500 об/мин в течение 30 мин. Осевшие на дно эритроциты и нейтрофилы ресуспендировали в 0,87% растворе хлорида аммония. Для достижения полного лизиса эритроцитов, суспензию оставляли на 10 мин при комнатной температуре, затем центрифугировали 30 мин при 1500 об/мин на градиенте фиколл/верографин. Полученный осадок нейтрофилов дважды отмывали средой 199. Недостатки данного способа состоят в том, что при обработке одного образца затрачивается 3-3,5 часа, за это время падает иммунологическая активность полиморфно-ядерных лейкоцитов, кроме того, среда 199 окрашена феноловым красным, что затрудняет цветную реакцию. Известен способ выделения полиморфноядерных лейкоцитов их малых объемов крови человека [2], заключающийся в том, что гепаринизированную кровь смешивают с физиологическим раствором в соотношении 2:1, наслаивают на смеси 6% раствора декстрана-500 и 33,9% раствора гипака в соотношении 1:2, причем объем градиента должен составлять 3/4 объема крови. Использовали силиконизированные пробирки с внутренним диаметром 12-14 мм. По- лученная смесь отстаивается в течение 30-40 мин для оседания эритроцитов. Супернатант наслаивается на двойном градиенте фиколл-гипак. II-раствор - 10 частей 33,9% гипака и 24 части 9% фиколла, плотность 1,077 г/см 3. I раствор - плотность 1,119 г/см 3: 10 частей 50% гипака и 20 частей 9% фиколла. Использовали по 3,0 мл каждой смеси, после этого центрифугировали при скорости 800 g в течение 15 мин при 20°С. Полученные полиморфноядерные лейкоциты разводили десятикратно раствором Хенкса, после чего дважды отмывали при 1550 об/мин в течение 15 мин. К недостаткам этого способа следует отнести длительность процессов выделения полиморфноядерных лейкоцитов, обусловленную необходимостью проведения двойного наслаивания, что может привести к снижению иммунологической активности полиморфноядерных лейкоцитов, а также использование дорогостоящих реактивов, таких как раствор Хенкса. Известен способ выделения полиморфноядерных лейкоцитов из крови [3], который заключается в том, что гепаринизированная кровь 5,0 (25 ЕД/мл) наслаивалось на двойном градиенте плотностью 1,082, и 1,114 г/см 3 в пластических трубах 15x105 мм. Эти трубы центрифугировали при 200 g в течение 20-30 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали в среде Хенкса дважды и ресуспендировали в 1,0 мл среды Хенкса. Недостатки данного способа состоят в длительности выделения полиморфноядерных лейкоцитов и использовании в качестве буфера дорогостоящего раствора Хенкса, который затрудняет цветную реакцию. В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа выделения полиморфноядерных лейкоцитов из крови человека, в котором изменением среды выделения и проведением реакции при сниженной температуре обеспечивается сокращение времени фракционирования клеток крови и за счет этого сохраняется функциональная активность полиморфноядерных лейкоцитов, сокращается процесс выделения, уменьшается стоимость эксперимента. Поставленная задача решается тем, что в способе выделения полиморфноядерных лейкоцитов из крови человека, включающем гепаринизэцию крови, наслаивание ее на двойном градиенте плотности, центрифугирование, отбор фракции полиморфноядерных лейкоцитов, ее двойное отмывание в физиологической среде и доведение до необходимой концентрации, согласно изобретению, при наслаивании крови используют о хлажденный до температуры 1-4°С градиент фиколл:верографин и отмывание фракции клеток производят в охлажденном фосфатном буфере (1-4°С). Использование при наслаивании крови охлажденного до 1-4°С двойного градиента фиколл-верографина дает возможность проведения центрифугирования смеси при больших скоростях, а именно 3000 об/мин, что позволяет сократить время центрифугирования до 10-15 мин, исключив при этом прогревание смеси и потерю иммунологической активности выделенных ПМЯЛ. Проведение отмывки в охлажденном до 1-4°С фосфатном буфере также позволяет сократить время проведения данной операции и избежать инактивирования НАДФ×Н2-оксидазы. Использование в качестве физиологической среды для отмывки фосфатного буфера взамен дорогостоящего раствора Хенкса позволяет уменьшить стоимость эксперимента, улучши ть цветную реакцию пробы. Охлаждение используемых растворов осуществляют в обычном холодильнике. Способ осуществляют следующим образом. Для получения чистой популяции полиморфноядерных лейкоцитов одноразовым пластиковым шприцом в стерильных условиях берут из локтевой вены 5,0 мл крови в пластиковую пробирку, содержащую 50 ЕД гепарина (10 ЕД/мл). В другую пластиковую пробирку с диаметром 15 мм последовательно наслаивают 3 мл холодного (4°С) раствора плотностью 1,119 г/мл, состоящего из 10 частей 50% верографина и 20 частей 9% фиколла, затем 3 мл холодного (4°С) раствора плотностью 1,078 г/мл, состоящего из 10 частей 33,9% верографина и 24 частей 9% фиколла. На поверхность растворов наслаивают 5 мл крови. Проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 10-15 мин препаратов в этих градиентах, что позволяет фракционировать элементы крови и разделить полиморфноядерные от моноядерных клеток и эритроцитов. Целесообразно для этих целей использовать рефрижераторную центрифугу. Центрифугирование препаратов приводит к появлению 3 клеточных слоев. Верхний слой содержит предшественники гранулоцитов (миелобласты, промиелоциты, миелоциты), если они присутствуют в пробах крови, моноциты и лимфоциты. На дне пробирки оседают тяжелые лимфоциты и эритроциты. Средний слой состоит из 95-98% чистых гранулоцитов, соотношение нейтрофилов, базофилов и эозинофилов пропорционально представительному этих клеток в крови донора. Этот слой клеток отбирают силиконизированной пипеткой Пастера, а затем дважды отмывают в фосфатном буфере и ресуспендируют в буфере в конечной концентрации 1,5-2,0×106/мл. Общий вы ход нейтрофилов составляет 42±15%, контаминацией эритроцитами можно пренебречь (0,1%). Жизнеспособность клеток после такого выделения (более 96%) определяют с помощью окраски смесью (1:1) 0,1 % раствора трипанового голубого в дистиллированной воде и 0,1% раствора водорастворимого зазина в растворе Рингера двойной концентрации. Пример. Больной 3., 41 г. Производят выделение полиморфноядерных лейкоцитов для нитросинететразолиевого теста. В стерильных условиях одноразовым шприцом, содержащим 50 ЕД гепарина берут из кубитальной вены 5 мл крови. В отдельную пластиковую пробирку с диаметром 15 мм последовательно наслаивают 3 мл холодного (4°С) плотностью 1,119 г/мл, состоящего из 10 частей 50% верографина и 20 частей 9% фиколла, затем 3 мл холодного (4°С) раствора полностью 1,078 г/мл, состоящего из 10 частей 33,9% верографина и 24 частей 9% фиколла. На поверхность растворов наслаивают 5 мл крови. Проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 14 мин препаратов в этих градиентах, что позволяет фракционировать элементы крови. Центрифугирование приводит к появлению 3 клеточных слоев. Верхний слой, который содержит моноциты, лимфоциты и тромбоциты - сливают. Силиконизированной пипеткой Пастера отбирают средний слой клеток. Суспензию полиморфноядерных лейкоцитов отмывают в фосфатном буфере рН 7,2-7,4 (состав фосфатного буфера: Nа2НРО3 2,0; КН2РO4 0,3; NaCI 7,0 и бидистиллированная вода до 1 л) дважды центрифугирование при 1500 об/мин по 5-7 мин. Затем осадок полиморфноядерных лейкоцитов ресуспендируют в 0,5 мл фосфа тного буфера. Подсчет клеток производят в камере Горяева, доводят концентрацию до 2,0×106 клет/мл. Выход нейтрофилов составил 2,1×106 кл/мл. Контаминация эритроцитов меньше 0,08%. Жизнеспособность клеток определяют с помощью окраски смесью (1:1) 0,1% раствором трипанового голубого в дистиллированной воде и 0,1% раствором водорастворимого эозина в растворе Рингера двойной концентрации: более 97%. Клеточная суспензия используется для постановки нитросинететразолиевого теста. Заявляемый способ выделения полиморфноядерных лейкоцитов позволяет исключить сложные предварительные процедуры обработки крови, сократить более чем в 2 раза время выделения, существенно повышает точность иммунологических тестов целевого продукта, обладает хорошей воспроизводимостью, стабильностью тест-системы, может применяться в клинической практике для динамического наблюдения за больными.