Спосіб визначення сенсибілізації лейкоцитів

Изобретение относится к медицине, в частности иммунодиагностике аллергических состояний. Наиболее близким в заявляемому является способ сенсибилизации лейкоцитов. согласно которому образцы помещают в пробирки, добавляют аллерген на 5%-ном растворе цитрата натрия, инкубируют при 45°С. готовят мазки и подсчитывают содержание измененных нейтрофилов [1]. Недостатком способа является невысокая чувствительность, обусловленная тем, что клетки, наиболее поврежденные антигеном, разрушаются в процессе приготовления мазков. В основу изобретения поставлена задача создания такого способа определения сенсибилизации лейкоцитов, в котором новая методика приготовления препарата позволяла бы сохранить максимальное количество поврежденных антигеном клеток. и тем самым повысить чувствительность способа. Эта задача решается тем, что в способе определения сенсибилизации лейкоцытов, включающем их инкубацию с антигеном, приготовление препарата и оценку результатов согласно изобретению, инкубацию проводят в изотонической среде на предметном стекле, после чего неприлипшие клетки смывают и высушенный препарат обрабатывают реактивом Дунгера в течение 3-4 минут, а оценку сенсибилизации осуществляют по изменению размера сегменто-ядерных лейкоцитов по сравнению с контролем. При обследовании данным способом наблюдается повреждение 100% клеток при дозе в 8 раз меньшей, чем в прототипе, т. е. чувствительность способа на порядок превышает чувствительность способа по прототипу. Высокая чувствительность способа обусловлена тем, что исследование проводится с популяцией наиболее функционально активных клеток - прилипающих. Способ осуществляется следующим образом. 5 мл венозной крови набирают в силико-иированную пробирку, содержащую гепарин из расчета 5 ед. на 1 мл крови. Пробирку помещают в термостат и выдерживают под углом 60° в течение 60 мин при 37°С. На чистые обезжиренные стекла наносят рамку из расплавленного парафина, ограничивающую квадрат 2 х 2 см. На подготовленное ложе наносят 0,4 мл среды 199, рабочую дозу коммерческого аллергена (0.0025, 0,005, 0,001) и 0,1 мл плазмы, обогащенной лейкоцитами. На стекло контрольного препарата наносят среду 199 и плазму в таком же количестве. Инкубационную смесь размешивают покачиванием на стекле или продуванием воздуха из пипетки, соединенной с резиновой грушей. С текла помещают в эксикатор, на дно которого наливают небольшой объем воды для создания влажной камеры, закрывают и помещают на 60 мин в термостат при 37°. Через час препаратысливают, смывают неприлипшие клетки и тромбоциты теплой средой 199 (рН 7,2), содержащей 5 ед гепарина в 1 мл. Препараты высушивают на воздухе, после чего на поверхность высушенных прилипших клеток наносят реактив Дунгера и выдерживают 3-4 мин. Препараты быстро сливают, высушивают в вертикальном положении. Окрашивание препарата водным раствором 2% азура осуществляют п утем погружения его в краситель на 1-2 сек., после чего препарат быстро ополаскивают водой. После высушивания препаратов производят их иммерсионную микроскопию, сопоставляя размерысегментноядерных лейкоцитов контрольного и опытного образцов. Пример. Больной Р., диагноз: облитерирующий эндартериит левой нижней конечности, трофические язвы, микробная экзема. Проведено определение сенсибилизации лейкоцитов крови к стрептококковому и стафилококковому аллергенам. 5 мл крови, полученной из вены стандартным методом, помещали в силиконированную пробирку, содержащую 25 ед. гепарина. На поверхность чистых и обезжиренных предметных стекол наносили рамку из парафина, ограничивающую квадрат 2 х 2 см. На подготовленное ложе контрольного препарата наносили 0,4 мл среды 199 и 0,1 мл плазмы. Опытные препараты готовили путем добавления к среде коммерческих аллергенов гемолитического стафилококка и стрептококка в дозах 0,0025, 0,005 и 0,01, после чего добавляли по 0,1 мл плазмы. Смесь размешивали покачиванием стекол, затем помещали в эксикатор, содержащий на дне небольшой объем воды, эксикатор закрывали и помещали в термостат. Инкубацию осуществляли 60 мин при 37°С. После инкубации препараты сливали, смывали неприлипшие клетки теплой средой 199 (рН 7,2), физраствором, содержащим гепарин (5 ед/мл). Препараты высушивали, наносили реактив Дунгера на 3 мин, после чего высушивали в вертикальном положении. Докрашивание сухи х препаратов осуществляли погружением в 2%-ный водный раствор азура. Препараты смывали, высушивали и исследовали под микроскопом, В контрольных препаратах клетки не были изменены, имели сохранные ядра, четкую азурофильную зернистость, сохранные і мембраны. В опытных препаратах уже в дозе антигенов 0,0025 мл были клетки бесформенные, увеличенные в размерах, ядра не определялись. Результат оценен как резко положительный (100% измененных клеток). При обследовании этого больного способом по прототипу в контрольном препараты отмечалось 10% поврежденных клеток, в опытном препарате, содержащем аллерген стрептококка - 15%, стафилококка - 34%. 15 - 10 Индекс сенсибилизации лейкоцитов для стрептококкового аллергена = 0,05 , для ста филококкового 100 15 - 10 = 0,24 . 100 Таким образом, при обследовании способом по прототипу сенсибилизация лейкоцитов к стрептококковому аллергену ничтожна (индекс 0,05), к стафилококковому - умеренная (индекс 0,24).