Спосіб підвищення регенераційного потенціалу в культурі пиляків озимої м`якої пшениці

Корисна модель належить до біотехнології і може бути використана для масового отримання гомозиготних форм пшениці. Для розширення масштабів застосування культури пиляків в селекційно-генетичних роботах існує необхідність подальших розробок по підвищенню ефективності даної біотехнології. Актуальним є цілеспрямоване керування формуванням новоутворень із компетентних мікроспор та їх регенерацією. Застосування фітогормонів як для попередньої обробки донорних рослин, так і при додаванні їх у живильне середовище, є одним з підходів до збільшення виходу гаплоїдів [1]. На наш погляд, особливий інтерес представляє абсцизова кислота (АБК). Встановлена її важлива роль як одного з основних фіто гормоніврегуляторів у процесах морфогенезу в к ультурі in vitro [2, 3]. Найбільш близьким до запропонованого способу є процедура попередньої холодової обробки донорного матеріалу, яка викладена у [авторефераті дисертації Игнатовой С.А. "Биоте хнологические основы получения гаплоидов, отдаленных гибридов и соматических регенерантов зерновых и бобовых культур в различных системах in vitro" - Автореф. дис. д-ра биол. наук: 03.00.20 /Ялта, 2004. -47с.]. Автором визначені оптимальні умови для формування новоутворень та регенерації (для пшениці - температурна передобробка донорного матеріалу +2-4°С, експозиція 4-7 діб). Даний винахід вибрано як прототип. Але важливу роль в індукції андрогенезу in vitro при культивуванні пиляків мають фізіологічно активні речовини. В основі гіпотези наших досліджень, результатом яких є патент, що пропонується, є статті окремих авторів [2, 3, 5], які надали аналіз фітогормональних особливостей індукції андрогенезу in vitro при культивуванні пиляків ярої м'якої пшениці. Підкреслюється, що перехід програми розвитку мікроспор з гаметофітного на спорофітний шлях залежить від балансу екзогенних та ендогенних фітогормонів. Автори вважають, що саме ендогенна АБК є гормоном-регулятором внутрішньоклітинних процесів при індукції андрогенезу in vitro. Головним чином, дослідження що до впливу АБК на ембріоїдогенез in vitro проводили на калусній культурі, отриманій із незрілих зародків [6-8]. У зв'язку з цим ціль дослідження - вивчення ролі екзогенної АБК у процесах формування новоутворень та регенерації рослин в культурі пиляків озимої м'якої пшениці з метою удосконалення етапів біотехнології отримання рослин-регенерантів. Поставлена задача вирішуються в способі попередньої обробки пагонів з колоссям пшениці водним розчином абсцизової кислоти разом із холодовою обробкою в період коли мікроспори в пиляках донорних рослин знаходяться на сильновакуолізованій стадії розвитку. Спосіб забезпечує отримання більшої кількості морфогенних пиляків та новоутворень, підвищення регенераційної здатності новоутворень та як результат - збільшення регенерації зелених рослин. Причинно-наслідковий зв'язок між передобробкою донорних пагонів розчином абсцизової кислоти та досягнутим результатом (підвищення кількості отриманих новоутворень та зелених рослин-регенерантів) можна пояснити наступним чином. Фітогормони, та безпосередньо АБК, відіграють головну роль у відповіді рослин на стресові умови. Стресові фактори призводять до різкого збільшення рівня АБК в клітинах рослин. Напевно, при цьому здійснюється переключення усіх життєви х процесів рослинного організму на новий рівень, пов'язаний з виживанням в екстремальних умовах. Відбувається захисне уповільнення метаболізму клітин та зміни в експресії генів [9]. Порушення цілісності рослинного організму (зрізання пагонів донорних рослин і наступна холодова обробка) є сильним стресовим фактором для мікроспор пшениці. Можливо, обробка розчином абсцизової кислоти у цей період сприяє вмиканню адаптивних реакцій рослинних клітин. На думку Mei Wang та ін. (2000), ефекти АБК викликані, принаймні, двома різними процесами: 1 - запобігання гибелі мікроспор, через збільшення числа життєздатних мікроспор під час перед обробки; 2 - пригнічення подальшого розвитку мікроспор до зрілого пилку. В наслідок чого, при культивуванні пиляків на штучному живильному середовищі збільшується кількість життєздатних мікроспор в пиляках, які далі розвиватимуться за спорофітним шляхом. Спосіб здійснюється таким чином. В якості вихідного матеріалу використовували озиму м'яку пшеницю - сорти Фантазія, Ніконія та гібридну форму 1140. Донорні рослини вирощували в польових умовах. Пагони із колоссям зрізали коли більшість мікроспор в пиляках знаходилась на сильновакуолізованій фазі розвитку мікроспори.Проводили холодову передобробку пагонів у водному розчині абсцизової кислоти (0,5мг/л) при температурі +2°С у темряві на протязі 4 діб. Колосся стерилізували насиченим розчином гіпохлориту кальцію. Виділені пиляки висаджували на первинне середовище 190-2 [10] у модифікації із доданням 1,5мг/л 2,4-Д, 90г/л сахарози, 400мг/л проліну, 400мг/л глютаміну та 0,5мг/л кінетину. Культивували перші 3 доби у темряві при температурі +30°С, далі при +24°С до появи новоутворень. Отримані макроструктури для проходження темпової фази культивування пересаджували на живильне середовище MS у модифікації: 30г/л сахарози, 0,5мг/л кинетина, 200мг/л пролина, 200мг/л глютаміну [11]. Культивували новоутворення у темряві до появи на їх поверхні віз уально спостерігаємих центрів регенерації. Надалі макроструктури культивували при 16-годинному фотоперіоді та температурі +24°C. Кількість морфогенних пиляків та кількість новоутворень визначали як відсоток від кількості висаджених пиляків для кожного генотипу. Статистичну обробку отриманих даних проводили за методикою Рокицького [12]. Приклад 1. Проводили оцінку ефективності запропонованого способу на перших етапах гаплопродукційного процесу. Дослідження показали, що при застосуванні попередньої обробки пагонів пшениці водним розчином АБК у концентрації 0,5мг/л, кількість морфогенних пиляків збільшилась до 6-12 відсотків, а кількість новоутворень до 15-28 відсотків в залежності від генотипу. Тоді як, при холодовій передобробці пагонів без АБК (контроль) відсоток морфогенних пиляків складав від 4 до 5, а відсоток новоутворень - від 6 до 8, залежно від генотипу (Табл.1, 2). Приклад 2. Здійснювали оцінку ефективності запропонованого способу щодо отримання рослин-регенерантів при культивуванні пиляків озимої м'якої пшениці. Дослідження показали, що при попередній обробці пагонів водним розчином АБК, кількість отриманих рослин-регенерантів в залежності від генотипу коливалась від 6 до 9 відсотків від кількості висаджених пиляків. Тоді як, відсоток регенерантів при холодовій передобробці без АБК складав від 2 до 5 залежно від генотипу (Табл.1, 2). Таблиця 1 Аналіз прототипу та запропонованого способу підвищення регенераційного потенціалу новоутворень в культурі пиляків озимої м'якої пшениці Ознаки та технічні результати Культура Об'єкт дослідження Спосіб підвищення регенераційного потенціалу в культурі пиляків м'якої пшениці Ефективність способу Прототип Triticum aestivum L. Андрогенез в культурі пиляків пшениці Проводили холодову попередню обробку пагонів із колоссям у воді при температурі +2-4°С у темряві на протязі 4 діб. Запропонований спосіб Triticum aestivum L. Андрогенез в культурі пиляків пшениці Проводили холодову попередню обробку пагонів із колоссям у водному розчині абсцизової кислоти (0,5мг/л) при температурі +2-4°С у темряві на протязі 4 діб. Кількість морфогенних пиляків (з Кількість морфогенних пиляків складає 6новоутвореннями) складає 4-5%; 12%; відсоток новоутворень -15-28%; відсоток новоутворень - 6-8%; відсоток регенерації - 6-9% від числа відсоток регенерації - 2-5% від висаджених пиляків. числа висаджених пиляків. Таблиця 2 Вплив попередньої обробки АБК на формування новоутворень та регенерацію рослин в культурі пиляків озимої м'якої пшениці Генотип Гібридна форма 1140 сорт Фантазія сорт Ніконія Частота регенерації Кількість Кількість Кількість Концентрація морфогензелених альбіносів загальна пиляків, новоАБК, мг/л них пиляків, утворень, шт. шт. % шт. % % % H2O 481 4,99±0,99 8,32±1,26 19 4,16±0,91 7 1,56±0,57 5,61±1,05 0,5 713 12,05±1,15# 27,85±1,59# 45 6,31±0,91 18 2,52±0,59 8,84±1,06* Н2О 488 3,89±0,88 6,56±1,12 10 2,05±0,64 1 0,20±0,2 2,25±0,67 0,5 153 11,76±2,6* 15,03±2,89# 7 4,58±1,69 3 1,96±1,12 6,53±1,99** Н2О 92 1,09±1,08 1,09±1,08 0,5 172 5,88±2,33 13,72±3,40# Достовірно при: *Р > 0,05; **Р > 0,01; #Р > 0,001. Список літератури 1. Гурецкая B.C. Роль биологически активных соединений в индукции гаплоидов в культуре пыльников ячменя. //Тез. докл. междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотенология». Минск, 1998. - С.170-171. 2. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Куксо П.А. Морфогенез в культуре изолированных пыльников: роль фитогормонов //Успехи соврем, биол. - 1999. -Т.199, Вып. 6. - С.567-577. 3. Mei Wang, Sandra Van Bergen, and Bert Van Duijn. Insights into a Key Developmental Switch and its importance for efficient plant breeding //Plant Physiol. - October 2000, vol.124. - P.523-560. 4. Игнатова С.А. Биотехнологические основы получения гаплоидов, отдаленных гибридов и соматических регенерантов зерновых и бобовых культур в различных системах in vitro: Автореф. дис. д-ра биол. наук: 03.00.20 /Ялта, 2004.- 47с. 5. Горбунова В.Ю., Кр углова Н.Н., Абрамов С.Н. Индукция андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы. Баланс экзогенных и эндогенных фитогормонов //Известия РАН. Серия биологии. - 2001, №1. - С.31-36. 6. Зайнутдинова Э.М., Шаяхметов И.Ф. Роль абсцизовой кислоты в формировании морфогенного каллуса пшеницы //VII International Conference. The biology of plant cell in vitro and Biotechnology. Abstracts, (Saratov, September 9-13). -2003.- P.377. 7. Катасонова А.А., Шаяхметов И.Ф., Круглова Н.Н. Этапы биотехнологии получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы путем эмбриоидогенеза в каллусной культуре in vitro //Известия Челябинского научного центра, вып.2 (32), 2006/ 8. Malik M. Rafi, Robert S. Effects of abscisic acid on wheat callus cultures //Cereal research communications. 1995. - Vol.23, №4. - P.375-382. 9. Байлиев А.Х., Мантниязов Р.Г., Гималов Ф.Р. Экспрессия гена аланин-богатого белка капусты при различных условия х акклиматизации //Физиология растений. -1999. -Том 46, №4. - С.605-609. 10. Wang X., Hu H. The effect of potato II medium for triticale anther culture //Plant Sci. Lett. - 1984. - Vol.36. P.237-239. 11. Лобанова K.I., Жосонар М.В., Ігнатова С.О. Шляхи реалізації регенераційного потенціалу в культурі пиляків у різних генотипів озимої м'якої пшениці //Вісник українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2006. -Том 4, №1.- С.52-57. 12. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. - Минск: Изд-во Минского ун-та, 1973.- 316с.