Спосіб оцінки рослин озимої м’якої пшениці з vrd1 генотипом

Спосіб оцінки генотипів озимої м’якої пшениці з Vrd1 генотипом, що включає ідентифікацію Vrd1 генотипів, який відрізняється тим, що зазначені генотипи детектуються за допомогою ДНКмаркера, яким є відсутность фрагмента ДНК розміром 280 п. н. - нуль-алель 280(-). (19) (21) u200503564 (22) 15.04.2005 (24) 17.04.2006 (46) 17.04.2006, Бюл. № 4, 2006 р. (72) Сиволап Юрій Михайлович, Балашова Ірина Анатоліївна, Завіша Євгенія Костянтинівна (73) ПІВДЕННИЙ БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ЦЕНТР У РОСЛИННИЦТВІ 3 13466 Відмінними від прототипу ознаками в корисній моделі, що заявляється, є: - для гібрідологічного аналізу використується ДНК рослин пшениці, - вирощування рослин, що аналізуються, можно проводити будь в яких кліматичних умовах, - на маркерну ознаку не впливає дія інших генів швидкості розвитку - Vrd1 генотипи визначаються за наявністю ДНК-маркерів до зазначеного гена. Невідємною умовою реалізації даного способу є використання ДНК, яку виділяли з різних тканин пшениці (паростки, зелене листя, насіння), та аналіз ДНК за методом SSR-ПЛР. Автори способу вперше рекомендують використання SSR-ПЛР з праймерами до мікросателітного локусу ORS2 для відбору рослин пшениці з Vrd1 генотипом (раннєстиглі). Виділення рослинної ДНК. ДНК виділяли з етиольованих п'ятидобових паростків, або з зеленого листя. Паростки (100 мг), або зелене листя, гомогенізували у епендорфі з 0,5мл лізуючого буферу, що містить: 1,4М Nad; 20 mM NasEDTA; 100 тМ Tris-HCl, pH 8,0 (25°С); 2 % СТАВ. Інкубацію проводили на водяній бані протягом 1 години при 60°С. Депротеїнізацію проводили рівним об'ємом суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1). Центрифугували протягом п'яти хвилин у центрифузі Eppendorf 5415 при 12000об/хв, водяну фазу 4 (не зачіпаючи інтерфази) переносили в інший епендорф. ДНК екстрагували рівним об'ємом ізопропанолу з наступним центрифугуванням протягом п'яти хвилин при 12000об/хв. Надосадову рідину зливали, осад промивали 1 мл 70% етанолу. Отриманий осад ДНК розчиняли в 500мкл розчину ТЕ (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM Na3EDTA) з 1 мкг/мл РНК-азою А. Концентрацію ДНК вимірювали на флуориметрі ТКО Hoefer-100 у розчині 1 х TNE (10 mM Tris-HCl pH 7.4 (25°С); 100 mM NaCl; ImM Na3EDTA) з 100мкг/мл інтеркалюючого барвника Hoechst 33258. Умови ПЛР, гель-електрофорез, візуалізація ампліконів. Реакційний буфер для ампліфікації методом SSR-ПЛР містив: 50mM KC1; 20mM ТрисНСl, pH 8,4; 2,0mM MgCl2; 0,01 % Tween-20; 0,15mM кожного dNTP; 0,2 mkM праймера; 20нг ДНК і 1од. Taq-полімерази. SSR-ПЛР за локусом ORS2 проводили при температурі відпалу 55°C. Кількість циклів ампліфікації - 35. Для тестування продуктів ампліфікації застосовували 2,0 % агарозні гелі та 8% ПААГ. Агарозні гелі з ПЛРпродуктами забарвлювали бромистим етидієм і фотографували в УФ-світлі на фотоплівку «Мікрат 300». Продукти ампліфікації, що фракціонували у 8% ПААГ, візуалізували фарбуванням гелів сріблом. Реакцію ампліфікації проводили на приладах «Терцик», Росія, Москва (табл.1). Таблиця 1 Локус ORS2 Послідовність прямого (П) т зворотнього (З) праймерів (5' –3') П З ТTCACGCAGTTCACTCTTGA TATTTGATCAAAAGCATCGGC Вихідною теоретичною передумовою для використання ПЛР-методів є поліморфізм ДНК пшениці та можливість детекції цього поліморфізму у генотипів, що відрізняються один від одного за алельним станом одного гену. Наявність поліморфизму дає змогу отримання ДНК-маркерів, які щільно зчеплені з конкретними генами. Детекція ДНК-маркерів не залежить від біотичних чи абіотичних факторів середовища, від особливості тканин з яких виділяється ДНК (паростки, листя, коріння). ДНК-маркером може слугувати як наявність поліморфного амплікону, так і відсутність одного з продуктів реакції, що позначається як нуль-алель. Для виявлення, потенційних маркерів (поліморфні фрагменти ДНК) до генів Vrd, проведено ПЛРаналіз ізогенних за Vrd генами ліній, створених на основі рецесивних за vrd генами сортів Миронівська 808 та Еритроспермум 604. Донорами домінантних алелів генів Vrd слугували сорти Norin 1 та Бригантина (Vrd1) і сорт Чайка (Vrd2). Оскільки ізогенні лінії відрізняються від сорту-рекуренту, в основному, тільки алельним станом гена, що маркується, кожний поліморфний амплікон ДНК може розглядатись у якості молекулярного маркера. Наявність однакової картини спектрів продуктів реакції ДНК двох ізогенних за Vrd1 геном ліній, отриманих від різних сортів-донорів та створених на основі двох сортів-рекурентів дозволяє вважати Кількість нуклеотидів 20 21 нуль-алель 280 (-) маркерною ознакою генотипів моногено домінантних за Vrd1 (Фіг.1). На Фіг.1 представлено електрофореграми SSR-PCR за локусом ORS2 ДНК сортів озимої м'якої пшениці: доріжка 1- ДНК сорту Norin 1 (Vrdl генотип); доріжка 2 - ДНК сорту Чайка (Vrd2 генотип); доріжка 3 ДНК сорту Еритроспермум 604 (рецесив за vrd). Маркер позначено як SBC 280. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Аналіз популяцій Р2,що розщеплюються. Аналізу підлягали 111 рослини популяції F2, створеної від схрещування сорту Еритроспермум 604 (рецесив за vrd) х Triple Dirk С (Vrd1). Методом SSR-ПЛР показано, що у спектрі продуктів ампліфікації ДНК Triple Dirk C ідентичні спектрам інших генотипів моногено домінантних за Vrd1. Аналіз рослин популяції за фенотипом, зокрема наявність колосіння: відсутність колосіння, дозволяє поділити популяцію на два класи у співвідношенні 3:1 (моногений контроль). ДНК-аналіз за алельним станом SSR- локусу ORS2 - 280(-) / 280(+) також дає змогу поділити популяцію на два класи у співвідношенні 1:3 за критерієм 2, що свідчить про моногений Vrd1 контроль рослин даної популяції, (табл.2). 5 13466 6 Таблиця 2 Розщеплення у комбінації схрещуваня Еритроспермум 604 (рецесив за vrd) \ Triple Dirk С (Vrd1 ) за ознаками колосіння : відсутність колосіння рослин та за алельним станом SSR-локусу 2800(-)\2800(+) Фактично спостере- Теоретично очікува2 Метод аналізу жене не Генетичний 81 :30 83,2 : 27,8 0,92* SSR- PCR 32:79 27,8 : 83,2 0,85** Примітки: * 2 3:1 < 3,84 при df = 1 ** Результати SSR-аналізу індивідуальних рослин популяції F3 показують можливість маркування домінантних гомозигот за Vrd1 за допомогою маркерної ознаки - відсутність продукту 280 п. н. при проведенні ПЛР за локусом ORS2. Приклад 2. Встановлення сортів озимої м'якої пшениці з Vrdlгенотипом. Значною проблемою сучасної генетики рослин є відсутність широкого набору сортів з встановленим Vrd генотипом. Методами генетичного аналізу встановлено Vrd- генотипи декількох сортів. Апробацію використання маркера до гену Vrd1 проведено на ДНК 40 сортів озимої пшениці. Маркер до гену Vrd1 (нуль-алель 280(-) детектовано у 11 озимих сортів пшениці (Фіг.2, табл.3)). На Фіг.2 2 3:1 < 3,84 при dr = l представлено електрофореграми SSR-PCR за локусом ORS2 ДНК деяких сортів озимої озимої м'якої пшениці: доріжки 1,2,3,5,7 - ДНК сортів, які не мають моногено домінантного Vrdl контролю (Одесская 16, Одесская 132, Обрий, Одом, Знахидка, відповідно); доріжки 6, 8, 9, 10 – ДНК сортів моногено домінантними за Vrdl (Безостая 1, Ольвия, Скороспелка 36, Куяльник, відповідно). Маркером молекулярної ваги (доріжка 4) є ДНК pUC18/Msp1l. Свідчення, щодо Vrd1 контролю зазначених сортів озимої пшениці, які отримані методом ПЛР, знайшли підтвердження за результатами класичного генетичного аналізу. Таблиця 2. SSR-аналіз сортів озимої пшениці різних еколого-географичних груп Встановлення Vrd1 генотипу Сорти SSR-ампликон 280 (+) /280(-) Vrd1-генотип Миронівська 808 + Бригантина Vrd1 Ніконія Vrd1 Cappelle-Desprez + Одеська 132 + Безоста 1 Vrd1 Ольвія Vrd1 Скороспелка 3б Vrd1 Norm 1 Vrd1 Triple Dirk С Vrd1 Обрій + Куяльник Vrd1 Альбатрос + Знахідка + Кавказ Vrd1 За цим методом неможливо виявити присутстність гену Vrd1 у сортів, які знаходяться під дігенним Vrd контролем, у зв'язку з особливостями використуємого маркера. 7 Комп’ютерна верстка Д. Дорошенко 13466 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601