Спосіб оцінки рослин озимої м’якої пшениці з ррd-d1а генотипом

Спосіб оцінки рослин озимої м’якої пшениці з Ррd-D1а генотипом, що включає ідентифікацію Ppd-D1a генотипів, який відрізняється тим, що домінантні гомозиготи за Ppd-D1a детектують по відсутності продукту реакції величиною 350 п. н. нуль-алель 350(-). (19) (21) u200503565 (22) 15.04.2005 (24) 17.04.2006 (46) 17.04.2006, Бюл. № 4, 2006 р. (72) Сиволап Юрій Михайлович, Балашова Ірина Анатоліївна (73) ПІВДЕННИЙ БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ЦЕНТР У РОСЛИННИЦТВІ 3 Виділення рослинної ДНК. ДНК виділяли з етиольованих триденних паростків. Паростки (100мг) розтирали в епендорфі з 0,5мл лізуючого буферу (1,4 Μ NaCl; 20 niM Na3EDTA; 100mM TrisHCl, pH 8,0 (25°С); 2% СТАВ). Інкубували на водяній бані протягом 1 години при 60°С Депротеїнізацію проводили рівним об'ємом суміші хлороформізоаміловий спирт (24:1). Центрифугували протягом п'яти хвилин у центрифузі Eppendorf 5415 при 12000об/хв, водяну фазу (не зачіпаючи інтерфази) переносили в інший епендорф. ДНК екстрагували рівним об'ємом ізопропанолу з наступним центрифугуванням протягом п'яти хвилин при 12000 об/хв. Надосадову рідину обережно зливали. Осад промивали 1 мл 70% етанолу. Отриманий осад ДНК розчиняли в 500 мкл розчину ТЕ (10mM TrisHCl, pH 8,0; 1mM Na3EDTA) з 1мкг/мл РНК-азою А. Концентрацію ДНК вимірювали на флуориметрі ТКО Hoefer-ЮО у розчині 1 х ΤΝΕ (10mM Tris-HCl pH 7.4 (25 °С); 100 mMNaCl; lmMNa3EDTA)3 100 мкг/мл інтеркалюючого барвника Hoechst'33258. Умови ПЛР, гель-електрофорез, візуалізація ампліконів. Реакційний буфер для ампліфікації методом ISSR-ПЛР містив: 50mM KC1; 20тМ ТрисНСІ, рН8,4; 2,0mM MgCl2; 0,01% Tween-20; 0,15mM кожного dNTP; 0,2 mkM праймера; 20нг ДНК і 1 од. Taq-полімерази. ПЛР проводили при температурі відпалу 58°С. Кількість циклів ампліфікації для всіх ПЛР-методів - 35. Для тестування продуктів ампліфікації застосовували 2,0% агарозні гелі та 6% ПААГ.Агарозні гелі з ПЛР-продуктами забарвлювали бромистим етидієм і фотографували в УФсвітлі на фотоплівку «Мікрат 300». Продукти ампліфікації, що фракціонували у 6% ПААГ, візуалізували фарбуванням гелів сріблом. Реакцію ампліфікації проводили на приладах «Терцик», Росія, Москва . Вихідною теоретичною передумовою для використання ПЛР-методів є поліморфізм ДНК пшениці та можливість отримання ДНК-маркерів, які щільно зчеплені з конкретними генами. Наявність ДНК-маркерів не залежить від факторів середовища, від особливості тканин з яких вилучається ДНК (паростки, листя, коріння). ДНК—маркером може слугувати як наявність поліморфного амплікону, так і'відсутність одного з продуктів реакції нуль-алель. Для виявлення поліморфних фрагментів ДНК, що є потенційними маркерами до генів Ppd, проведено ПЛР-аналіз заміщених за другою групою хромосом ліній, створених у генофоні сорту Мегсіа. За методом ISSR-аналізу отримано маркер до гена Ppd-Dla, з відсутністю продукту ампліфікації у зоні 350 п.н., що позначений як нуль 13467 4 алель 350(-). Отримані результати мають підтвердження при проведенні ампліфікації з праймером (AG)6C на ДНК заміщених за 2D хромосомами ліній, створених як від різних рекурентних батьків, так і від різних донорів 2D хромосом. Аналізували лінії: Avalon / 2D Сіапо 67, Avalon / 2D RCM 71, Norman / 2D RCM 71, Brimstoun / 2D RCM 71, Brigand / 2D RCM 71, Rendezvous / 2D RCM 71 та ДНК рекурентів. Електрофореграми продуктів реакції показують міжсортовий поліморфізм ДНК рекурентів у зоні 600-800 п. н., в той час, як у низькомолекулярної частині спектра, зокрема у 400300 п. н., поліморфізм відсутній. Показано, що в усіх заміщених лініях (носії Ppd-Dla), що підлягали ПЛР-аналізу, реєструється нуль-алель 350().Таким чином, за допомогою ISSR-маркера - нульалель 350(-) проведено відбір носіїв гена Ppd-Dla у домінантно гомозиготному стані. Маркер позначено як SBC 350. Встановлено зчеплення SBC 350 з геном Ppd-Dl. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Аналіз популяцій F2 та F3, що розщеплюються. Аналізу підлягали 104 рослини популяції F2, створеної від схрещування фотонейтральної лінії Avalon / 2D Сіапо 67 {Ppd-Dla, раннє колосіння) χ фоточутливий сорт Одеська 16 (рецесив за. Ppd, пізнє колосіння). ISSR-аналіз ДНК індивідуальних рослин дозволяє поділити популяцію за алельним станом ISSR-докусу 350(-) / 350(+) на два класси у 2 співвідношенні 1:3 за критерієм χ , що свідчить про моногенний контроль фотоперіодичної чутливості (табл.1). Нуль-алель 350(-) виявлено у слабо чутливої до фотоперіоду батьківської лінії Avalon /2D Ciano 67 та 22-х аналізованих рослин F2, в основному з найбільш раннім .терміном колосіння. Генетичні ефекти генів Ppd свідчать, що раннє колосіння є характерною ознакою домінантних гомозигот за Ppd у порівнянні з гетерозиготами. Електрофореграми ДНК інших 82 рослин та їхнього фоточутливого батька показують присутність продукта ампліфікації розміром 350 п. н. Для кожної з рослин популяції проводили аналіз швидкості розвитку. Гібридологічний аналіз підтвердив, що різниця між заміщеною лінією і сортом Одеська 16 за Ppd контролюється одним геном. Розщеплення у комбінації схрещувана Avalon/2D Ciano 67 (рання) х Одеська 16 (пізня) на раннє : пізнє колосіння рослин та співвідношення розщеплення за алельним станом ISSR-локусу 350(-)\350(+) Таблиця 1. Розщеплення у комбінації схрещувана Avalon/2D Ciano 67 (рання) х Одеська 16 (пізня) на раннє : пізнє колосіння рослин та співвідношення розщеплення за алельним станом ISSR-локусу 350(-)\350(+) 2 Метод аналізу Фактично спостережене Теоретично очікуване х Генетичний 77 : 27 78:26 0,05* ISSR- PCR 22 : 82 26:78 0,82** Примітки: * 23:1 < 3,84 при df = 1 ** 23:1 < 3,84 при.df = 1 5 Результати ISSR-аналізу індивідуальних рослин популяції F2 показують можливість маркування домінантних гомозигот за Ppd-Dl. Для підтвердження отриманих результатів проводили аналіз за швидкістю розвитку рослин популяції F3. Необхідність проведення цього аналізу обумовлена тим, що у деяких випадках період колосіння домінантних гомозигот та гетерозигот може бути однаковий. Насіння F3 вирощували сім'ями: домінантні гомозиготи (відбір за результатами ISSR-PCR), гетерозиготи та рецесивні гомозиготи. Серед ліній F3, що охарактеризовані як домінантні гомозиготи, за одиничним винятком, розщеплення за терміном колосіння не виявлено. Приклад 2. Використання ДНК-маркера для встановлення Ppd-Dla генотипа у сортів озимої та ярої пшениці. 13467 6 Апробацію використання маркера до гена PpdDla проведено на ДНК 20 сортів озимої та 8 сортів ярої пшениці. Маркер до гену Ppd-Dla (нуль-алель 350-) детектовано у семи озимих та трьох ярих сортів пшениці (Фіг., табл.2). На Фіг. представлено електрофореграми ISSR-ПЛР з праймером (AG^C ДНК деяких сортів озимої пшениці: доріжки 3, 8, 9, 11 - спектри продуктів ампліфікації ДНК сортів моногено домінантних за Ppd-Dla (сорти Danica, Yerek 79, Erin, Леля); доріжки 2, 4, 5, 6, 7, 10 - спектри продуктів ампліфікації ДНК сортів, у яких моногено домінантний Ppd-Dla генотип не встановлено (сорти Миронівська 808, Одеська 16, Одеська 51, Федорівка, Norin I, Triple Dirk С, відповідно). Маркером молекулярної ваги є ДНК pUC18/Mspl (доріжки 1, 12). За результатами ISSR-аналізу моногенно домінантний Ppd-Dla контроль встановлено для десяти сортів м'якої пшениці. Таблиця 2 ISSR-аналіз сортів озимої пшениці різних еколого-географічних зон. Встановлення Ppd-Dla генотипів Ppd-Dla ISSR-ампликон 350 (+) Сорт, лінія Країна оригинатор /350(-) Миронівська 808 Україна + Одеська - 51 Україна + Федорівка Україна + Тіра Україна Ніконія Україна Леля Україна H87CFH10-1675 Франція + Cappelle-Desprez Франція + Комсомольська Казахстан + Ерітроспермум 80 Киргізія + Norin 1 Японія + Erin США Triple Dirk С Австралія + Seri Мексика Bassvood Мексика + Danica Югославія Yerek 79 Туреччина YUMA-131 Кітай + XIA0YAN6 Кітай + Новосибірська 67 Росія + AHK18A Росія Ерітроспермум 841 Росія + Sonalika Індія + Santa Catalina Аргентина + Beacon Кенія Frontana Мексика Kentana 48 Бразілія За цим методом неможливо виявити присутстність гена Ppd-Dla у сортів, які знаходяться під дігеним Ppd контролем, у зв'язку з особливостями використуємого маркера. 7 Комп’ютерна верстка Д. Дорошенко 13467 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601