Спосіб виявлення інфікованості шлунку мікроорганізмами helicobacter pylori

Изобретение относится к медицине, в частности к способам диагностики заболеваний человека, и может быть использовано для выявления инфицированности Helicobacter pylori (HP), которая по данным многочисленных исследований выявляется в большинстве случаев заболеваний хроническим гастритом и язвенной болезнью желудка и широко распространена среди населения. Установлено, что HP часто является причиной хронического гастрита и язвенной болезни желудка. Известно также, что спонтанное исчезновение HP не наблюдается. Способы выявления инфицированности HP известны. К их числу относится способ гистологического исследования слизистой оболочки желудка или слизи желудка с окрашиванием бактерий по Граму, Гимза или серебросодержащими красителями и исследованием препарата под микроскопом. Обнаружение под микроскопом S-образной палочки диаметром 0,8 мкм и средней длиной 2,9 мкм свидетельствует об инфицированности HP. [Григорьев П. Я., Исаков В. А., Яковенко Э. П. Хронический гастрит: современные представления о патогенезе, клинике и лечении // Тер. арх. - 1989. - №2. - С. 142-152]. Однако этот метод не позволяет определить жизнеспособность бактерий, что является важным, а также дает иногда ложноотрицательные результаты. Известен способ посева биологического субстрата и выращивание на микробной среде при содержании кислорода 5-10%, температуре 35-37°С и pH 5,5-8,5. Через 3-4 дня после высевания на элективной среде образуются небольшие блестящие колонии HP. Этот способ длителен и сложен [Warren I. R. Lancet. - 1983. P. 1273]. Известен экспресс-метод определения HP в биоптате слизистой оболочки, полученном непосредственно во время гастроскопии. Метод основан на способности живого микроорганизма осуществлять определенные биохимические реакции, сопровождающиеся изменением окраски среды, в которую помещают исследуемый биоптат. В полученной среде желтого цвета содержится мочевина и вещество-индикатор pH, который в щелочной среде, возникающей при расщеплении мочевины уреазой, выделяемой HP, дает красное окрашивание. Результат считывают в течение 24 ч. Такой коммерческий тест (CLO-тест), промышленно выпускается фирмой "Дельта" (Австралия) малоприменим из-за сложности приобретения. Наибольшее распространение получили способы серодиагностики, основанные на выявлении в крови исследуемого циркулирующих антител к антигенам HP. К их числу относятся способы, основанные на гемагглютинации, бактериальной агглютинации, латекс-агглютинации, а также способ, основанный на фиксации комплемента и способ иммуноферментного твердофазного анализа. Однако все эти способы являются недоступными с коммерческой точки зрения. Известен способ выявления инфицированности HP (проточный микросферный флуоресцентный иммуноанализ - ПМФИА). При этом способе в качестве источника антигена используют полистероловые микросферы с нанесенными HP на их поверхность. При данном способе на приготовленный антиген наносят сыворотку крови исследуемого, инкубируют в течение 30-60 мин при комнатной температуре, проводят отмывку забуференным физраствором (ЗФР), pH 7.4 трехкратно в течение 5 мин, наносят меченные флуорохромом антитела к иммуноглобулину G человека (Ig G), проводят повторную отмывку и оценивают результаты исследования с помощью проточного цитофлуорометра с компьютером. При наличии флуоресценции диагностируют инфицированность HP [S. Vedhnyzen van Zanten et al. Irich G. of Medical Sci. 1992. - Vol. 161, -Suppl. 10. - P. 28]. Данный способ принят за прототип. Недостатком прототипа является сложность приготовления антигена, труднодоступность полистероловых микросфер, изготовляемых в заводских условиях, высокая стоимость проточных цитофлуорометров с компьютером, сложность их приобретения, в результате чего сдерживается широкое применение способа в лечебно-оздоровительных учреждениях. В основу изобретения поставлена задача разработать такой способ выявления инфицированности HP, который был бы точным и доступным для широкого использования в условиях здравоохранения и за счет этого повысить выявляемость инфицирования HP, а следовательно, повысить эффективность лечебнооздоровительных мероприятий. Поставленная задача решается путем использования в качестве антигена слизи желудка, содержащей HP, нанесенной тонким слоем на предметное стекло, слизь желудка, по данным специальных исследований, является для HP естественной средой обитания [Hezell S. L, Lee А. et. al/J Infect., 1986. - Vol. 153. - P. 658663]. Такой носитель антигена может быть заготовлен заранее, а также может храниться длительное время. В заявляемом способе для выявления антител HP используют протеин А, меченный флуорохромом. Оценку результатов вместо малодоступного проточного цитофлуорометра с компьютером, используемых в прототипе, осуществляют с помощью флуоресцентного микроскопа. Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Слизь желудка, содержащую HP, наносят тонким слоем на предметное стекло, высушивают и в дальнейшем используют в качестве антигена. Сыворотку обследуемого разбавляют в 10 раз забуференным физраствором, pH 7.4. Берут 50-70 мкл разбавленной сыворотки и наносят на приготовленные антигены, инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин. По окончании инкубирования проводят трехкратную отмывку препарата ЗФР в течение 5 минут, после чего наносят каплю раствора протеина А, меченного флуорохромом, в концентрации 50-100 мкг/мл и выдерживают при комнатной температуре в течение 30-60 мин, проводят повторную трехкратную отмывку ЗФР в течение 5 мин, высушивают при комнатной температуре и результат оценивают под флуоресцентным микроскопом. При наличии флуоресценции антител к HP диагностицируют инфицированность HP. Пример 1. Больной П. находился на лечении в клинике заболеваний желудка НИИ гастроэнтерологии в мае 1993 г. Клинический диагноз: язвенная болезнь желудка в стадии обострения. Наряду с эндоскопическими, рентгенологическими исследованиями, в лаборатории патоморфологии выполнено исследование мазков слизи желудка, в которых при цитологическом исследовании выявлены образования, сходные с HP. Выполнено исследование по заявляемому способу. На приготовленный источник антигена слизь желудка, содержащую HP, фиксированием на предметном стекле нанесли 100 мкл сыворотки больной, разбавленной ЗФР в 10 раз, инкубировали 60 мин, затем провели трехкратную отмывку препарата ЗФР в течение 5 мин. После отмывки нанесли каплю раствора протеина А в концентрации 100 мкг/мл, меченного флуорохромом, выдержали при комнатной температуре в течение 60 мин, провели повторную трехкратную отмывку ЗФР по 5 мин и препарат высушили. При исследовании препарата под флуоресцентным микроскопом выявлена флуоресценция антител к HP, что подтверждает инфицированность больной HP. В результате проведенного антибактериального лечения язва желудка зарубцевалась через 3 недели. При контрольном исследовании после выписки больного в желудочной слизи HP не выявлены. Однако в крови выявлены антитела к HP. Пример 2. Больная Ш., 52 лет, находилась на лечении в клинике заболеваний желудка НИИ гастроэнтерологии в ноябре 1992 г. Клинический диагноз: хронический гастрит с секреторной недостаточностью. При исследовании сыворотки крови по способу, изложенному выше (пример №1), выявлены антитела к HP. В лечение внесены коррективы. Состояние больной улучшилось. При контрольном обследовании в крови выявлены антитела к HP, а в мазках желудочной слизи HP не обнаружены. Заявляемый способ выявления инфицированности HP использован в лаборатории патоморфологии НИИ гастроэнтерологии при обследовании 38 больных с хроническими заболеваниями желудка, из них 11 больных с язвенной болезнью с локализацией язвы в желудке, 15 - с локализацией язвы в двенадцатиперстной кишке и 12 - с хроническим гастритом. Результаты исследования сопоставлены с таковыми, полученными при гистологическом способе и исследовании слизи желудка и слизистой оболочки, окрашенными по ГимзаРомановскому, и представлены в таблице. Из представленной таблицы видно, что заявляемый способ не уступает высокоточному цитологическому способу выявления инфицированности HP. Способ может быть использован в лечебных учреждениях как в стационаре, так и в условиях поликлиники. Его выполнение не связано с приобретением дефицитных материалов и оборудования.