Спосіб насінного асимбіотичного розмноження орхідних in vitro

Корисна модель відноситься до біотехнології і стосується мікророзмноження рослин, зокрема, способів розмноження in vitro культури насіння рідких і зникаючих видів наземних орхідей. Насінне розмноження орхідей in vitro широко поширено для одержання сіянців красивоквітучи х тропічних орхідей [Черевченко Т.М., Кушнир Т.М. Ор хідеї в культурі. -Київ: Наукова думка, 1986. - 198с]. Однак цей спосіб потребує підбору спеціального живильного середовища і умов культивування для кожного окремого виду. При цьому, як правило, відсоток проростання насіння украй низький. У ряді випадків методи були ефективні при використанні в складі живильного середовища дорогих компонентів [Андронова Е.В., Золотухина Н.О., Батыгина Т.Б. Репродуктивная биология и биотехнологические методы размножения редких видов орхидных. Матер. Міжнар. наук, конф. "Охорона і культивування орхідей", Київ: Наукова думка, 1999, - С.26]. Інші автори вказують, що обробка насіння перед посадкою впливає на відсоток схожості насіння орхідних in vitro [Чудаковская Е.А. Прорастание семян и формирование проростков Orchidaceae in vitro // Вестник ХНУ, Харьков, 2003. - С.49-52], цей прийом підвищує схожість насіння, але сповільнює процес протокормоутворення. Відомий більш універсальний спосіб проростання насіння дикоростучи х наземних орхідей помірної зони, що забезпечує більш високу схожість, доступне і дешеве за складом живильне середовище, обраний нами як прототип [патент РФ №93028737, Способ семенного размножения наземных орхидей. МКИ 6: А01Н4/00. Батыгина Т.Б., Маковейчук А.Ю.]. Запропонований за прототипом спосіб включає посадку стерилізованого зрілого насіння на живильне середовище для пророщення насіння і одержання протокормів, перенос протокормів на вихідне середовище, але з додаванням фітогормонів, культивування протокормів на цьому модифікованому середовищі до одержання сіянців. Недоліком даного способу є той факт, що спосіб пророщення насіння орхідних ефективний для обмеженого числа видів, а відсоток схожості залишається низьким. В основу даної корисної моделі поставлена задача створення ефективного, недорогого й уніфікованого способу насінного асимбіотичного розмноження орхідних для масового одержання посадкового матеріалу в умовах in vitro. Суть корисної моделі полягає в тім, що спосіб насінного асимбіотичного розмноження орхідних in vitro, який включає посадку стерилізованого зрілого насіння, одержання протокормів, перенесення протокормів на середовище з добавками для індукції пагонів з наступним культивуванням їх до одержання сіянців, згідно корисної моделі, що стерилізацію проводять перекисом водню протягом 3-5 днів, після стерилізації насіння обробляється розчином янтарної кислоти, при цьому проростання насіння і одержання протокормів здійснюють на стандартному середовищі Кнудсона, а одержання сіянців - на модифікованому середовищі Кнудсона. Так як ряд авторів указують на низьку проникність насінної оболонки орхідних [Burgeff, 1936, Андронова, 1985, Шевцова, 1986], то тривале (3-5 днів) використання перекису водню порушує цілісність насінної оболонки, що поліпшує надходження речовин живильного середовища до зародку. Янтарна кислота використовується для активізації ферментативних процесів, сприяє збільшенню проникності клітинних мембран і стимуляції процесу дихання, що, у свою чергу, стимулює ростові процеси й активно впливає на ріст протокормів і молодих проростків. Таким чином синхронізується процес проростання всього посіяного на живильне середовище насіння, підвищується енергія їхнього проростання і відсоток схожості. При цьому стерилізацію насіння необхідно проводити до обробки янтарною кислотою. За деякими літературними даними обробка насіння регуляторами росту значно впливає на їхню схожість [Христева Л.А., Галушка А.М.. Черевченко Т.М. Рекомендации по применению, производственной оценке гумата калия., Днепропетровск, 1981; Stella W.K. (1995), Am.Orchid Soc.Bull.,5.382-391]. Проте використання янтарної кислоти для орхідних невідомо. Важливу роль у проведених дослідженнях має момент обробки насіння після стерилізації янтарною кислотою в концентрації 0,2-0,3мг/л. Так, насіння оброблені цими речовинами до стерилізації мали низьку схожість. Це пояснюється вимиванням янтарної кислоти і послабленням її дії після стерилізації. Найкращі результати були отримані при використанні перекису водню 9% (до 5 днів замочування) і янтарної кислоти 0,25мг/л після стерилізації. Спосіб здійснюють таким чином. Зріле насіння, що зберігається у холодильнику, піддають стерилізації 9% ним перекисом водню на протязі 5 днів з наступним триразовим промиванням стерильною водою і поміщають в розчин янтарної кислоти (0,25мг/л) на добу ). Початковим живильним середовищем є стандартне середовище Кнудсона. Простерилізоване насіння поміщають у чашки Петрі з стерильним середовищем. Матеріал поміщають у холодильник, де насіння піддається холодовій обробці при температурі 5-7°С на протязі 1,5-2 місяців. Потім чашки Петрі переносять у термостат та інкубують при 20-25°С в темряві протягом 1-2 місяців до появи протокормів. Протокорми переносять у культуральні судини із середовищем Кнудсона, до якого додають ІОК (0,5мг/л) і БАР (0,25мг/л). Культуральні судини з протокормами орхідей поміщають на стелажі з регульованим освітленням (500-600лк) і фотоперіодом 16 годин при 25°С. Через 4-6 місяців з'являються сіянці, придатні для пересадження в субстрат. Приклади конкретного виконання. Приклад 1. Насіння замочували в 0,2-0,3% розчині янтарної кислоти на 24 години, потім відмивали однократно стерилізованою водою і поміщали їх у 9% розчин перекису водню Н 2О2 на 4 дні. Трикратно відмивали дистильованою водою і переносили на живильне середовище Кнудсон (стандартне). Через 4-8 тижнів відсоток схожості складав 3-12% відповідно. На думку заявника, це пояснюється вимиванням янтарної кислоти й ослабленням її дії. Приклад 2. Насіння поміщали в 9% розчин перекису водню Н2О2 на 3 дні, 5 днів, 7 днів. Відмивали дистильованою водою, поміщали в 0,25 мг/л розчин янтарної кислоти на 24 години, а потім переносили на живильне середовище Кнудсон (стандартне). Через 3-4 тижні відсоток схожості насіння складав до 43%, через 6-8 тижнів - до 82%. Така послідовність процедур підвищила схожість насіння і їхню енергію проростання майже в 7 разів. Таким чином, передпосівна обробка насіння орхідних (тривала стерилізація і янтарна кислота) підвищує схожість, енергію проростання і скорочує строк проходження фаз онтогенезу. Використання агентів, що стерилізують, тривалий час (5 днів) дозволяє оздоровити рослини орхідних, більшість з яких мають бактеріальну інфекцію [Лаврентьева А.Н., Ва хрушкин В.С, Ковальская Л.А. Биологический вестник,2003, т.7, №1-2, с.39-42]. Крім того, описаний спосіб розмноження орхідних у культурі насіння in vitro дозволяє значно (до 90%) підвищити схожість насіння Bletilla striata, Anacamptis pyramidalis, Ophris oestridera, одержати життєздатні сіянці, здатні до росту в нестерильних умовах; здешеви ти вартість процесу насінного розмноження за рахунок зменшення витрат компонентів живильних середовищ і використання більш доступних речовин; уніфікувати спосіб одержання посадкового матеріалу й одержати масову кількість рослин-регенерантів. Запропонований спосіб дає можливість розмножувати в культурі насіння in vitro рідкісні, ендемічні та зникаючі види орхідних флори Криму й України, що сприяє їхній активній охороні, репродукції, репатріації, а також розробити біотехнологію промислового розмноження з метою комерційної реалізації красиво квітучи х генотипів.