Спосіб мікроклонального розмноження лядвенцю

Спосіб мікроклонального розмноження лядвенцю, що включає експлантацію стерилізованих паростків на поживне середовище, культивування їх до утворення калюсу, розділення його на окремі сегменти, перенесення їх на середовище для регенерації пагонів, культивування окремих пагонів на середовищі для укорінення, який в і д р і з н я є т ь с я тим, що на всіх етапах клонування використовують агаризоване середовище МурасігеСкуга, експлантацію стерилізованих паростків і культивування їх до утворення калюсу здійснюють на середовищі з концентрацією 6-бензиламінопурину 0,95-1,05 мг/мл і нафтилоцтової кислоти до 10' 4 -10 6 мг/мл, регенерацію пагонів здійснюють на середовищі з концентрацією нафтилоцтової кислоти 0,45-0,55 мг/мл, культивування окремих пагонів для укорінення здійснюють на безгормональному середовищі, при цьому як матеріал для наступного розмноження використовують отримані рослини-регенеранти. CO Винахід відноситься до галузі біотехнології, а саме до культури ізольованих органів та тканин, що може бути використано для отримання рослин in vitro. Відомий спосіб отримання рослин-регенерантів лядвенцю з культури протопластів (Ahuja P.S., Hadiuzzaman S., Davey V.R., Cocking E.C. Prolific plant regeneration from protoplast-derived tissues of Lotus corniculatus L. (birdsfoot trefoil). - Plant Cell.Rep. - 1983. - 2. - P. 101-104). Останні культивували з метою одержання калюсу на агаризованному середовищі Мурасіге-Скуга, що містило 6-бензиламінопурин (БАП) у концентрації 0,2 м г * л и . Окремі пагони, утворені з морфогенного калюсу, переносили на середовище Му расіге-Скуга, що містило сахарозу, без гормональних домішок. Недоліком способу є отримання нездатного до регенерації пагонів калюсу. Найбільш подібний за технічною сутністю та результатом, що досягається, є спосіб отримання рослин лядвенцю рогатого in vitro, описаний у (Maclean N.Z., Grant W.F. Evaluation of birdsfoot trefoil (Lotus corniculatus) regenerated plants following in vitro selection for herbicide tolerance. Can.J.Bot. - 1987. - §. - P. 1275-1280). Спосіб заключається у пророщуванні стерильного насіння на агаризованому середовищі В5, отриманні калюсу з гіпокотилів семиденних проростків на агаризованому середовищі В5М, отриманні з нього сус 00 00 о 18188 пензійних культур на агаризованому сеП р и к л а д . Експлантацію проростредовищі В5М з домішками бензиладеніну ків здійснюють на середовище з концентра1 у концентрації 0; 0,1; 0,5; 1,0 мг-л" і цією БАП 1 мг л 1 і НОК 10- 4 -10 6 мг х 1 нафтилоцтової кислоти 0; 0,5; 1,0 мг «л , х Л"1. При цьому відбувається утворення наступному культивуванні життєздатного 5 морфогенного калюсу, на якому через 2калюсу на В5М середовищі з концентра3 тижні після експлантації проростків закцією бензиладеніну 0; 0,25; 0,5; 0,75 мг х ладається багато меристемних ініціалей, з х л \ диференціації пагонів на В5М сереостанніх на тому ж середовищі починається довищі з 0; 0,1; 0,2; 0,3 мг-л° бензиладиференціація пагонів до 40-50 і більше. деніну. Молоді пагони відокремлюють від 10 При повній відсутності НОК у поживному калюсу і переносять у культуральний посередовищі для досягнення аналогічного суд з В5М середовищем без регуляторів результату необхідний довший термін ( 4 росту. Пагони висотою 1 -3 см відрізають 5 тижнів). біля основи і переносять на середовище Морфогенний калюс розділяють на окВ5М з 0,2 мг*л° нафтилоцтової кислоти 15 ремі сегменти (3-5 мм) і переносять на для індукції коренеутворення. Всі культури середовище з домішкою 0,5 м г ' Л 1 НОК, утримують у ростовій камері при постійній що приводить до масової регенерації патемпературі 26 ± 2°С і 16-ти годинному гонів у 100% випадків, одночасно у 45% фотоперіоді (флуоресцентні лампи холодвипадків досягається коренеутворення. ного денного освітлення). 20 Окремі пагони довжиною 1,5-2,0 см Недоліками методу, крім отримання на відрізають при основі і переносять на сепроміжних етапах нежиттєздатного калюредовище без регуляторів росту для укосу, є багатостадійність розмноження, а рінення. Частка укорінених пагонів скла1 також зна - на тривалість повного циклу отдає 85%. римання рослин-регенерантів. 25 Загальна тривалість процесу отриманВ основу винаходу поставлена задача ня повністю сформованих рослин-регенепідвищення виходу рослин-регенерантів рантів складає 1,5-2 місяці. Культивувань лядвенцю та скорочення строків їх вироня на всіх етепах мікроклонального розмщування in vitro. ноження відбувається у ростовій при темВирішення поставленої задачі дося- 30 пературі 23-25°С і освітленні люмінесцентгається тим, що пропонується спосіб мікними лампами при 8-10 годинному фотороклонального розмноження лядвенцю, періоді. що включає експлантацію стерилізованих Результуюча дія інших концентрацій репроростків на поживне середовище, кульгуляторів росту на органогенез лядвенцю при тивування їх до утворення калюсу, розді- 35 культивуванні стерилізованих проростків, частлення його на окремі сегменти і перенеково диференційованого калюсу та окремих сення їх на середовище для регенерації пагонів відповідно наведена у таблиці. пагонів, культивування окремих пагонів на Як матеріал для наступного розмносередовищі для укорінення, згідно з виження використовують отримані рослининаходом, що на всіх етапах клонування 40 регенеранти. При цьому окремі пагони кульвикористовують агаризоване середовище тивують на середовищі з домішкою БАП Мурасіге-Скуга, експлантацію стерилізодля досягнення бічного галуження, що дозваних проростків здійснюють на середоволяє протягом трьох тижнів отримати в вищі з концентрацією 6-бензиламінопусередньому 30-35 нових експлантів. рину 0,95-1,05 мг• л ' і нафтилоцтової кис45 Аналіз науково-технічної літератури по лоти до 10' 4 -10 6 м г - л 1 , регенерації павирощуванню рослин in vitro показав, що гонів досягають на середовищі з конзастосування вказаної сукупності ознак нецентрацією нафтилоцтової кислоти 0,45відомо. и 0,55 мг» л , культивування окремих пагоТаким чином, пропонується нова сунів для укорінення здійснюють на безгор50 купність суттєвих ознак, що дозволяє значмональному середовищі, при цьому як но підвищити вихід рослин-регенерантів матеріал для наступного розмноження вилядвенцю та скоротити строки їх вирощукористовують отримані рослини-регеневання in vitro. ранти. Винахід може бути застосований у Використання на всіх етапах клону- 55 сільськогосподарському виробництві, а тавання агаризованого середовища Мурасікож у науково-дослідних лабораторіях біоге-Скуга дає можливість прискорити темлогічних закладів, що спеціалізуються на пи отримання повністю сформованих росстворенні нових сортів, для отримання лин-регенерантів і підвищити коефіцієнт значної кількості генетично одноманітного розмноження. рослинного матеріалу. 5 18188 6 Вплив регуляторів росту на органогенез лядвенцю Концентрація в Регулятор поживноросту му середовищі, мг/л БАП (у присутності НОК 0,95 ю'4-ю-6 МГ'Л*1) НОК 1.0 1,05 0,25 0,45 0,5 0,55 0,75 1.0 Результуюча дія, %, при культивуванні стерилізованих проростків культивуванні частково диференційованого калюсу культивуванні мікроживців Утворення частково диференційованої калюсної культури з багаточисленними мерисистемами (80) - " - (95) - " - (85) Переродження у неморфогенний калюс (100) Коренеугворення (20) Регенераи}я пагонів (80) Коренеутворення (40) Масова регенерація Коренеутворення (45) пагонів (100) Коренеутворення (45) Регенерація пагонів (95) Коренеутворення (40) Регенерація пагонів (90) Утворення неморфо- Переродження у немор- Заростання неморфогенного калюсу (70) фогенний калюс (40) генним калюсом (95) Коренеутворення (10) Коренеутворення (40) Коренеутворення (ЗО) Упорядник Техред М. Келемеш Коректор О. Обручар Замовлення 544 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 1