Спосіб діагностики псороптозу овець

Корисна модель відноситься до ветеринарії, зокрема, до паразитології і може бути використана у діагностиці псороптозу овець. Традиційна методика діагностики - комплексна, базується на аналізі клінічних ознак та лабораторному досліджені зскібків шкіри. Лабораторні методи діагностики псороптозу овець можуть бути біотичні та абіотичні. Біотичними методами досліджують зскрібки на наявність в них живого збудника хвороби, частіше за все їх досліджують візуально. Абіотичні методи направлені на пошук в зскрібках під мікроскопом мертвих кліщів чи їх фрагментів (яйця, проміжні стадії розвитку). Реакцію непрямого твердофазного імуноферментного аналізу було розроблено у Швейцарії провідними фахівцями [Ochs Н., Lonneux J. - F., Losson B.J., Deplases P. Diagnosis of psoroptic sheep scab with an improved enzyme linked immunosorbent assay //Vet. Parasitol. - 2001. - Vol. 96. - P.233242. Wassal D.A., Kirkwood A.C., Bates P.G., Sinclair I.J., Enzyme - linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to the sheep scab mite Psoroptes ovis //Res. Vet. Sci. - 1987. - Vol. 43. - P.34-35]. Недоліком відомого методу діагностики є підвищена трудомісткість, низька ефективність діагностики, небезпека при роботі з живим збудником хвороби, збільшення кількості контамінованих агентів - факторів передачі інвазії. В основу корисної моделі покладено задачу створення максимально ефективного методу для діагностики інвазії, зведення до мінімуму контактування зі збудником хвороби. Поставлене корисною моделлю завдання досягається тим, що у способі діагностики псороптозу овець, що включає проведення реакції непрямого твердофазного імуноферментного аналізу (ІФА), згідно корисній моделі на дно чарунок планшета адсорбують антитіла хворого на псороптоз кроля, блокують незв'язану адсорбційну поверхню планшету; для проведення реакції (ІФА) виготовляють розчин антигену для чого механічно збирають збудника захворювання, поміщають у пробірку, додають фосфатно-буферний розчин (рН7,4) при +4°С та обробляють на ультразвуковому дезінтеграторі 3х протягом 1хв., отриману рідину центрифугують при 4000об/хв. протягом 30хв., отриману надосадову рідину фільтрують; вносять до чарунок приготовлений розчин антигену розведений до концентрації 5мг/мл в фосфатно-буферному сольовому розчині, після чого сироватку крові дослідної тварини розведену 1:200 в фосфатно-буферному сольовому розчині з гемоглобіном великої рогатої худоби вносять в кожну чарунку по 100мкл та інкубують 60хв. при 37°С, після інкубації чарунки промивають розчином NaCl-Tween і вносять до чарунок 100мкл кон'югату розведеного 1:1000 в фосфатно буферному розчині з гемоглобіном, планшет інкубують протягом 60хв. при температурі 37°С, після інкубації чарунки промивають розчином NaCl-Tween, та додають субстрат розчин фосфатази в кількості 100мкл, реакцію зупиняють після 10хв. інкубації при температурі 37°С з додаванням 3М NaOH, в кількості 50мкл. Сутність корисної моделі полягає в тому, що на спеціальному планшеті для ІФА будується молекулярний ланцюг. При позитивному випадку реакції після додавання стоп-реагенту змінюється колір рідини та збільшується оптична густина дна лунки. Фіг.1 Схематичний вигляд молекулярного ланцюга збудованого на дні лунки при позитивній реакції де: 1 дно лунки з блокованими ділянками, 2 антитіло хворого на псороптоз кроля, 3 антиген, 4 антитіло хворої на псороптоз вівці, 5 кролячий антиовечий імуноглобулін G (ціла молекула), 6 фермент. Науковий дослід був проведений на 30 тваринах, з них було сформовано 3 дослідні групи. Перша група тварини хворі на псороптоз (діагноз підтверджено клінічними ознаками та лабораторними методами). Друга група - тварини з неблагополучного щодо псороптозу стада без видимих клінічних ознак хвороби. Третя група - клінічно здорові тварини без виражених клінічних ознак хвороби, з благополучного щодо захворювання стада. Для проведення реакції виготовляли розчин антигену. Для цього механічно збирали збудника захворювання, поміщали у пробірку, додавали фосфатно-буферний розчин (рН 7,4) при +4°С та обробляли на ультразвуковому дезінтеграторі 3х на протязі 1хв. Потім отриману рідину центрифугували при 4000об/хв. протягом 30хв. Отриману надосадову рідину фільтрували та утримували при температурі -20°С. Концентрація протеїну 0,25мг/мл (з 1000 паразитів). Кров для дослідження брали з яремної вени, в кількості 5мл, потім її витримували в термостаті при +37°С протягом 1 години. Після цього проводили відокремлення тромбу від стінок пробірки та поміщали пробірку в холодильник (4°С-8°С) на 2год. для ретракції згустка крові. При такому способі приготування сироваток, кров на дослідження методом імуноферментного аналізу можна зберігати при -5°-20°С кілька місяців, але після трьох заморозок сироватка стає непридатною. Першим етапом для постановки реакції є адсорбція антитіла 2 хворого на псороптоз кроля на дно лунки 1. Для цього сироватку крові розводять 1:200 у карбонатному сольовому буфері (NaHCO3 70mM, Na2CO3 30mМ; рН 9,6), та добавляють 100мкл в чарунки. Потім планшет залишають на 12год. при 4°С. Після цього планшет промивають двічі розчином NaCl-Tween (0,9% NaCl, 0,3% Tween 20). Обов'язковим етапом є блокування незв'язаної адсорбційної поверхні планшету, для цього використовують фосфатно-буферний сольовий розчин з гемоглобіном (NaCl 138mM, Na 2HPO4 8mМ, КС1 2,5mМ, КН2РО4 1,5mМ, MgCl2 1mМ, 0,5мг/мл гемоглобін великої рогатої худоби, 0,3% Tween 20; рН 7,2). В чарунки додають 300мкл блокуючого розчину та інкубують 30хв. при температурі 37°С. Після інкубації чарунки двічі промивають розчином NaCl-Tween. Другим етапом є внесення до чарунок приготовленого розчину антигену 3, виготовлений екстракт антигену розводять до концентрації 5мг/мл в фосфатно-буферному сольовому розчині (NaCl 138mM, Na2HPO4 8mM, KC1 2,5mМ, КН2РО4 1,5mM, MgCl2 1mМ, 0,3% Tween 20; рН 7,2) та 100мкл вносять до чарунок. Інкубують протягом 60хв. при температурі 37°С. Після інкубації чарунки промивають двічі розчином NaCl-Tween. Наступним етапом для проведення ІФА потрібно внести сироватку крові дослідної тварини. Для цього кожну сироватку розводять 1:200 в фосфатно-буферному сольовому розчині з гемоглобіном великої рогатої худоби. В кожну чарунку вносять 100мкл та інкубують 60хв. при 37°С. Після інкубації планшету з дослідною сироваткою крові чарунки промивають розчином NaCl-Tween. Наступним етапом ІФА є внесення до чарунок 100мкл кон'югату (кролячий антиовечий IgG (H+L) 5 зв'язаний з лужною фосфатазою 6) розведеного 1:1000 в фосфатно буферному розчині з гемоглобіном. Планшет інкубують на протязі 60хв. при температурі 37°С. Після інкубації чарунки промивають розчином NaCl-Tween, та додають субстрат розчин (субстрат фосфатази 1мг/мл, (Sigma 104), NaHCO3 35mM, Na 2CO3 15mM, MgCl 2 1mM; pH 9,8) в кількості 100мкл. Реакцію зупиняють після 10хв. інкубації при температурі 37°С додаючи 3М NaOH, в кількості 50мкл. Облік реакції проводять за результатами оптичної густини, яку виміряють на спектрофотометрі при довжині хвилі 405нм. Для тварин першої групи використовували чарунки ряду «А», для тварин другої та третьої групи ряд «В» та «С» відповідно. Оптична густина дна планшету тварин першої групи, з яскраво вираженими клінічними ознаками на псороптоз дорівнювала 0,717±0,028. Оптична густина дна планшету тварин третьої групи, без виражених ознак захворювання дорівнювала 0,105±0,004. Планшет для дослідження (схематичний вигляд) А В С D Е F G Н 1 0,832 0,713 0,101 2 0,625 0,611 0,099 3 0,591 0,591 0,121 4 0,731 0,814 0,102 5 0,799 0,113 0,093 6 0,713 0,614 0,091 7 0,811 0,115 0,093 8 0,633 0,095 0,123 9 0,691 0,131 0,119 10 0,741 0,714 0,112 11 12 Проведені досліди дають підставу стверджувати, що тварини першої групи виявились серопозитивними при проведенні імуноферментного аналізу, оптична густина виявилась в 7 разів вищою ніж оптична густина контрольної групи. Це свідчить про 100% ефективність методу імуноферментного аналізу для діагностики на псороптоз овець.