Спосіб експрес-діагностики кровопаразитарних захворювань овець з використанням люмінесцентної мікроскопії

Спосіб експрес-діагностики кровопаразитарних захворювань овець з використанням люмінесцентної мікроскопії, яка полягає в тому, що мазки крові від овець, щодо яких є підозра на наявність у них змішаної форми кровопаразитарної інвазії, фарбують розчином акридинового помаранчевого 1:10000 протягом 5 хвилин, досліджують за допомогою люмінесцентного мікроскопа та диференціюють паразитів за кольором світіння. (19) (21) a200507429 (22) 25.07.2005 (24) 17.07.2006 (46) 17.07.2006, Бюл. № 7, 2006 р. (72) Оніщенко Наталья Григорівна, Волколупова Валентина Аркадіївна, Пасунькіна Марія Олександрівна, Пінчук Віктор Андрійович (73) Кримська дослідна станція Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини 3 Отримані препарати крові фіксували за допомогою метилового спирту 3-5 хвилин після висушування на повітрі. Для фарбування використовували маточний розчин акридинового помаранчевого 1:100, з якого безпосередньо перед фарбуванням готували розчин в розведенні 1:10000. Для виготовлення розчинів використовували 0,1н НСІ. Фарбування фіксованих мазків проводили впродовж 5-10 хвилин. В якості контролю слугували мазки від здорових тварин. Огляд препаратів проводили на люмінесцентному мікроскопі «Люмам ИЗ» с ртутною лампою ДРШ 250-3 під імерсійною системою. В результаті проведених спостережень встановлено, що Anaplasma ovis в препаратах крові хворих тварин після фарбування акридиновим помаранчевим світяться яскравим золотистозеленим світлом, паразити крупніші, ніж в препаратах фарбованих за Романовським-Гимза (Фіг.1). У Babesіа ovis при фарбуванні впродовж 1030сек. ядро приймало зеленуватий колір, а протоплазма світилась помаранчевим світлом. Найбільша інтенсивність світіння паразитів спостерігалась при експозиції 5-10 хвилин при цьому паразит рівномірно світився яскравим злотистопомаранчевим кольором. Лейкоцити мали яскраве помаранчеве забарвлення, але відрізнялись значними розмірами. Одержаний ефект пояснюється утворенням комплексів акридинового помаранчевого з нуклеїновими кислотами. Так, на Фіг.2 наведено зображення мазків крові від вівці хворої на змішану форму анаплазмозно-бабезіозної інвазії через п'ять годин після введення азидину у лікувальній дозі. Відрізнити анаплазм від бабезій на Фіг.2 (фарбування за Романовським-Гимза) неможливо, в той час при фарбуванні акридиновим помаранчевим - Фіг.3 маємо можливість констатувати наявність змішаної інвазії. Зелена люмінесценція характерна для комплексів акридинового помаранчевого з дволанцюговими ділянками нуклеїнової кислоти, якою у більшості випадків є ДНК, та розташована, як правило в ядрі паразита. [9] Червоне світло мають комплекси акридинового помаранчевого з одно ланцюговими ділянками нуклеїнової кислоти, зазвичай РНК, найбільша кількість якої спостерігається у протоплазмі паразитів. Завдяки відсутності нуклеїнових кислот у зрілих еритроцитах, вони в препаратах залишалися темними та були помітні тільки їх контури. Лейкоцити можуть слугувати контролем якості фарбування, тому що вони мають у своєму складі ДНК та РНК [10]. 15429 4 Паразити продовжували інтенсивно світитися при зберіганні мазків в темному місті впродовж місяця. При подальшому зберіганні люмінесценція паразитів значно слабшала. Яскравість сяйва при фарбуванні фіксованих мазків, що зберігалися тривалий час, не відрізнялась від свіже виготовлених. Використання методу люмінесцентної мікроскопії для діагностики кровопаразитарних захворювань має наступні переваги: - Економія часу для виготовлення препаратів. - Паразити самі стають джерелом світіння на темному фоні препарату, що дозволяє швидко визначати навіть незначну кількість паразитів. - Диференціація паразитів по кольору дозволяє встановити наявність змішаної форми інвазії. - Значна достовірність отриманих результатів. Перелік використаних джерел 1. Микроскопическая диагностика малярии: ВОЗ, Европейское региональное бюро. - Копенгаген, 2000. - 88с. 2. Попов А.Ф., Попова Н.И. Экспресс-методы диагностики тропической малярии //Мед. Паразитол. - 2000. - №2. - С.38-39. 3. Локтева И.М. Лабораторная диагностика малярии. // Лабораторная диагностика. - 2003. №2. - С.58-67. 4. De Robertis E., Epstein B. Electron microscope. Study of anaplasmosis in bovine red blood cell. Proceed, of the Soc. For Exp. Biol. and Med., vol.77, №2, 1951. 5. Ristic M. Anaplasmosis. // Adv. Vet. Sci, 6 (1961), pp.111-192. 6. Ristic M. and Pritchard W.R. Morphological and serological characteristics of Anaplasma marginale as observed by electron microscopy and fluoresce in labeled antibody techniques. // XVIth Intern. Vet. congr. Madrid, 1959, v.11, pp.555-556. 7. Ristic M., White F.H. and Sander D.A. Detection of Anaplasma marginale by means of fluorescent - labeled antibody.// Amer. J. Vet. Res., 1957, 18, 924-928. 8. Kreier J.P. and Ristic M. Morphologic, antigenic and pathogenic characteristics of Eperythrozoon ovis and Eperythrozoon Wenyoni.// Am. J. vet. res. Vol 24. 1963. 9. Полякова О.А. Применение метода люминесцентного анализа в ветеринарной микробиологии. // Бюллетень Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии. Выпуск 7, Москва 1970, с.72-81. 10. Гришаева Т.И. Методы люминесцентного анализа. Учебное пособие для вузов. СПб.: АНО НПО «Профессионал», 2003. - 226с. 5 Комп’ютерна верстка М. Мацело 15429 6 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601