Спосіб кріоконсервування суспензії клітин ембріональної нервової тканини

Спосіб крюконсервування суспензії клітин ембріональної нервової тканини, який включає інку бацію суспензії при 0°С з крюпротектором диметилсульфоксидом і заморожування до температури рідкого азоту, який відрізняється тим, що крюпротектор беруть у концентрації 7%, а заморожування здійснюють за такою програмою: від 0°С до -4,5 - -5,0°С охолоджують зі швидкістю 1,0-1,5 град/хв , при -4,5 - -5,0°С проводять температурну ініціацію, далі охолоджують до -50° •- -60°С зі § швидкістю 1,5-2,0 град/хв., після чого занурюють у рідкий азот. Корисна модель належить до галузі крюбюлопі і крюмедицини і може бути використана для виготовлення клітинних препаратів. Відомий спосіб крюконсервування клітинної суспензії ембріональної нервової тканини щурів [1]. Суспензію заморожують з 10% диметилсульфоксиду (ДМСО) від кімнатної температури до 80°С зі швидкістю 1 град/хв, після чого занурюють у рідкий азот. Відігрівання здійснюють на водяній бані при 32°С. Недоліком способу є те, що після відігрівання життєздатність клітин складає усього лише 8,2% [1]. Найбільш близьким до способу, що заявляється є спосіб крюконсервування ембріональної нервової тканини [2], ВІДПОВІДНО до якого суспензію клітин змішують з 10% розчином ДМСО, інкубують протягом ЗО хв на льоду, заморожують зі швидкістю охолодження 20-30 град/хв до -25Х, витримують при цій температурі протягом 20 хв. після чого занурюють у рідкий азот Недоліком способу є низька життєздатність клітин нервової тканини після відігрівання - не вище ЗО %, а також високий вміст у клітинах ДМСО, що знижує якість одержуваних препаратів. В основу корисної моделі поставлена задача створити такий спосіб крюконсервування суспензії ембріональних клітин нервової тканини, у якому б, шляхом зміни умов заморожування, забезпечувалася можливість підвищення життєздатності клітин при одночасному зниженні в них концентрації ДМСО. Ця задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування суспензії ембріональних клітин нервової тканини, що включає інкубацію суспензії при 0°С з крю протектором ДМСО і заморожування до температури рідкого азоту, ВІДПОВІДНО ДО корисної моделі крюпротектор беруть у концентрації 7%, а заморожування здійснюють за такою програмою від 0°С до -4,5оС--5,0°С охолоджують зі швидкістю 1,0-1,5 град/хв, при -4,5°С^-5,0°С проводять температурну ініціацію, далі охолоджують до -50°- -60°С зі швидкістю 1,5-2,0 град/хв, після чого занурюють у рідкий азот. Концентрація крюпротектора ДМСО 7% є оптимальною для клітин ембріональної нервової тканини. Так, після 10 хвилин еквілібрацм при 0°С з 10% розчином ДМСО життєздатність клітин ембріональної нервової тканини щурів складає 60,53±1,5 %, з 7%-70,12±1,1%, а з 5% 65,23±2,8%. Заморожування з повільними швидкостями охолоджування {1-2 град/хв) забезпечує оптимальний баланс між процесами зневоднення клітин і утворенням кристалів льоду. Температурна ініціація при -4,5°С •• -5,0°С, тобто різке зниження тем* ператури на 30-40°, забезпечує зняття переохолодження біооб'єкту, що заморожується, і підвищення його життєздатності. Оптимізація режиму заморожування і використання більш низької концентрації ДМСО дозволя CO см ю 4523 ють удвічі підвищити життєздатність клітин {до 6570 %) Крім того, за рахунок зниження концентрації крюпротектора зменшується токсичність суспензії. Сутність корисної моделі пояснюється таким прикладом Суспензію клітин ембріональної нервової тканини одержували з мозку ембріонів щурів 11-14 доби гестаци Вихідна життєздатність клітин, яку оцінювали методом суправітального фарбування трипановим синім, складала 72,5±2,8% від загальної КІЛЬКОСТІ клітин у суспензії У суспензію клітин по краплях додавали 7% розчин ДМСО, після чого розливали по крюпробіркам фірми "Nunc" (Голландія) і витримували при 0°С на льоду Заморожування здійснювали за такою програмою від 0°С до -4 5 - -5,0°С охолоджували зі швидкістю 1,0-1,5 град/хв, при -4,5 - -5,0°С проводили температурну ініціацію, після чого охолоджували до -50° - -60°С зі швидкістю 1,5-2,0 град/хв і занурювали у рідкий Комп'ютерна верстка А Крулевский азот Життєздатність розморожених клітин визначали методом фарбування трипановим синім Вона склала 66% Таким чином, крюконсервована заявленим способом суспензія клітин ембріональної нервової тканини є малотоксичною і містить великий відсоток життєздатних клітин, що дозволяє підвищити якість одержуваних з неї лікувальних препаратів Джерела інформації 1 Negishi Т , ISII Y Kawamwa S et al Cryopreservation of brain tissue for primary culture // Exp Anim -2002 -Vol51,№4 - p.383-390. 2. Плачинта М С , Сукач А.Н., Безрукова KB Влияние гипотермического хранения эмбриональной нервной ткани крыс на жизнеспособность клеток после замораживания-отогрева // Пробл криобиологии -2002 -№3 -с.82-84 Підписне Тираж 37 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1 м Київ-42, 01601