Спосіб кріоконсервування гемопоетичних клітин людини

Спосіб крюконсервування гемопоетичних клітин людини, що включає додавання до суспензії клітин крюпротектора, багатоетапне заморожування з наступним відтаюванням, який відрізняється тим, що застосовують концентрації крюпротектора 0,4 - 1,45 мол/л, заморожування здійснюють в три етапи, при цьому на першому етапі заморожування здійснюють з швидкістю 0,7 1,2°С/хв до мінус 8,5 - мінус 10,5°С з застосуванням сидингу при температурі мінус 3,5 - мінус 4°С, на другому етапі - зі швидкістю 1,0 -4,5°С/хв до мінус ЗО - мінус 40°С, при цьому після другого етапу здійснюють температурну зупинку при мінус ЗО мінус 40°С протягом 3 - 5 хв , а на третьому етапі зі швидкістю 10 - 12°С/хв до мінус 130 - мінус 196°С Винахід відноситься до біологи та медицині і може бути використаний для крюконсервування гемопоетичних клітин людини Відомий спосіб крюконсервування тромбоцитів (дивись заявку Роси 99126524/14, МПК A01N1/02, дата публ заявки 2001 08 27) який передбачає крюконсервування у гофрованих алюмінієвих контейнерах з видаленням надлишку плазми центрифугуванням і наступним ресуспендуванням суспензії і додаванням крюпротектора, в якому підготовку до консервування здійснюють у полімерному контейнері, який поміщають у дюралевий пенал-холдер, а заморожування проводять до температури -80°С, зберігання здійснюють у цій же тарі Недоліком даного способу є те, що зазначений режим заморожування травматичний для гемопоетичних клітин людини тому, що швидке зниження температури викликає зріст великих кристалів, які порушують оболонки клітин Це призводить до зменшення періоду збереження та зменшення КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин після періоду збереження Відомий спосіб крюконсервування та підготовки до трансфузії гемопоетичних клітин кордової крові, (див патент України № 42599 МПК A01N1/00, A01N1/02 В, А61К35/14) що включає розведення цільної крові стабілізатором крові у співвідношенні 4 1, видалення еритроцитів, виділення надетою клітинної зависі, додавання рівного об'єму крюконсерванта на основі полівшілпіролідону з подальшим програмним заморожуванням та розморожуванням суміші в якій видалення еритроцитів проводять після розведення цільної кордової крові стабілізуючим розчином, обробкою розведеної кордової крові розчином пдроксіетилкрохмалю для осадження еритроцитів, після чого осад видаляють, вільний від еритроцитів надстій клітинної зависі концентрують, а крюконсервант додають до концентрату клітинної зависі Недоліком даного способу є його багатоетапність, що ускладнює спосіб та погіршує умови стерильності Невизначений режим заморожування гемопоетичних клітин людини не дозволяє отримати прийнятні результати тому, що життєздатність клітин забезпечується лише у вузькому інтервалі зниження температури Це призводить до зменшення періоду збереження та зменшення КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин після періоду збереження Відомий спосіб крюконсервування кісткового мозку (див патент Роси № 2144290, МПК A01N1/02, дата публ 2000 01 20) якій здійснюють шляхом поетапного заморожування в присутності крюзахисного розчину, при якому суспензію кліток, залиту в м'який однократного використання контейнер до заповнення на 10 - 30%, розміщений у металевому пеналі, що забезпечує товщину шару суспензії 6 - 8мм, на першому етапі поміщають у рідкий холодоагент із температурою мінус 26 30°С и витримують 15 - 25хв, на другому етапі поміщають у сховище-холодильник з температурою мінус 40 - 50°С Недоліком зазначеного способу є те що зазна (46) 15 05 2002, Бюл № 5, 2002 р (72) Лобинцева Галина Степанівна (73) Лобинцева Галина Степанівна СО 1^ (О (О 46673 чении режим заморожування травматичний для гемопоетичних клітин людини тому що температура зберігання за способом -40, -50°С недостатня для довготривалого зберігання гемопоетичних клітин людини Все це призводить до зменшення періоду збереження та зменшення КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин після періоду збереження Найбільш близьким до заявленого за ознаками є спосіб збереження при кріогенній температурі тканини (переважно шкіри) ссавців (див патент США № 5891617, МПК А01 N001/02, дата публікації 06 04 99 р ), що передбачає занурення зазначеної тканини в розчин крюконсерванта, який являє собою 1,5 - 2,5 М гліцерин у середовищі Duibecco's Modified Eagte's MediuM (DMEM), перемішування зазначеного розчину крюконсерванта і зазначеної зануреної тканини, внесення зародків льоду в позаклітинний простір крюконсерванта і перфузійованої тканини, охолодження зазначеної тканини зі швидкістю приблизно -10°С/хв до температури біля -6°С, або проводять заморожування зі швидкістю -1°С/хв до температури біля -8°С, продовжують охолодження при швидкості від -0,3 до -0,02°С до температури біля -70°С Недоліком зазначеного способу є те, що ініціація кристалоутворення здійснюється шляхом внесення зародків льоду в позаклітинний простір, що ускладнює спосіб та погіршує умови стерильності середовища Застосування середовища Duibecco's Modified Eagte's MediuM в більшості країн не дозволено для внутрівенного використання і тому клітини отримані за таким способом не можна використовувати в більшості випадків лікування Зазначені режими заморожування травматичні для гемопоетичних клітин людини тому, що швидке зниження температури на першому етапі викликає зріст великих кристалів, які порушують оболонки КЛІТИН Низька швидкість заморожування на завершуючій стадії охолодження суттєво затягує процес виконання способу Температура за способом біля 70°С недостатня для довготривалого зберігання гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини Завдяки тому, що спосіб передбачає використання великої КІЛЬКОСТІ крюпротектора, отримані за способом клітини перед використанням слід відмивати від крюпротектора, що ускладнює способ та здійснює негативний вплив додаткових дій на клітини Зазначені недоліки призводять до зменшення періоду збереження та зменшення КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин після періоду збереження Завданням винаходу є створення способу крюконсервування гемопоетичних клітин людини в якому шляхом зміни режимів способу крюконсервування, знайдених емпіричним шляхом забезпечується спрощення способу, покращання умов стерильності, збільшення періоду збереження та підвищення КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин після періоду збереження Для цього спосіб крюконсервування гемопоетичних клітин який передбачає додавання до суспензії клітин крюпротектору, багатоетапне заморожування з наступним відтаюванням Новим в способі є те, що застосовують крюпротектор концентрації 0,4 - 1,45 мол/л, заморожування здійснюють в три етапи, при цьому на першому етапі з швидкістю 0,7 - 1,2°С/хв до -8,5 - 10,5°С, із застосуванням сідінгу при температурі 3,5 - -4°С, на другому етапі зі швидкістю 1,0 4,5°С/хв до -ЗО - -40°С, після другого етапу здійснюють температурну зупинку при -ЗО - - 40°С протягом 3 - 5 хв , а на третьому етапі зі швидкістю 10 -12°С/хв до-130--196°С Внаслідок застосування нової сукупності ознак способу ініціація кристалоутворення здійснюється без додаткового контакту з клітинною суспензією, що спрощує спосіб та покращує умови стерильності середовища Застосовані в способі середовища дозволено для внутрівенного використання Зазначені режими заморожування не травматичні для гемопоетичних клітин людини тому, що емпірично підібраний режим зниження температури не викликає зріст великих кристалів які можуть порушити оболонки клітин Зазначені переваги, призводять до збільшення періоду збереження та збільшення КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин після періоду заморожування Для порівняння прототипу та запропонованого способу здійснювали спосіб за прототипом та запропонованим на зазначених нижче прикладах 1 64 В прикладах здійснювали такі Незалежно від джерела одержання (кістковий мозок, кордова кров, ембріональна печінка, периферична кров) приготування клітинної суспензії за прототипом та запропонованим способом здійснювали однаково В таблиці 1 зазначені режими виконання прикладів 1 - 8 за прототипом При ПІДГОТОВЦІ КЛІТИН до низькотемпературного консервування за прототипом, в отриману завісь клітин, що призначені для крюконсервування, через ін'єкційну голку по краплині додавали такий же об'єм крюконсерванта, який являв собою 1,5 - 2,5 моль/л гліцерину у середовищі Dutbecco's Modified Eagte's MediuM при легкому перемішуванні завісі шляхом похитування пробірки За допомогою шприцу через ін'єкційну голку гемопоетичні клітини розливали по 1мл в поліетиленові крюампули об'ємом 1,8мл фірми Nunc (CryoStore Boxes) Крюампули герметично закривали кришками і маркували Заморожування здійснювали при різних режимах зазначених в Таблиці 1 Заморожування гемопоетичніх клітин за прототипом виконували за допомогою програмного заморожувача, який дозволяє варіювати швидкість зниження температури на різних етапах Для ініціалізації кристалоутворення додатково вносили в крюампули зародки льоду в позаклітинний простір крюконсерванта і клітин Зберігали крюконсервовані гемопоетичні клітини в низькотемпературному сховищі при -70°С протягом двох МІСЯЦІВ Процедуру відмивання клітин від крюпротектора здійснювали шляхом додавання розчину, який містить удвічі меншу концентрацію крюпротектора, розчин центрифугували при швидкості 2000 об/хвил протягом 10 хвилин Потім надосадок знімали, ще раз додавали удвічі меншу концент 46673 рацію крюпротеїсгора, повторювали процес касетами центрифугування Над осадок знімали, до осадку Зберігали крюконсервовані гемопоетичні клідодавали розчин фізіологічного розчину, до досягтини в низькотемпературному сховищі при мінус нення початкового об'єму суспензії 130 - 196°С протягом трьох МІСЯЦІВ В таблиці 2 зазначені режими виконання приЕфективність режимів зазначених в прикладах кладів 9 - 64 за пропонованим способом оцінювали шляхом перевірки життєздатності клітин, яку оцінювали методом наступного культивуВ прикладах 9 - 22, таблиця 2а використовування в агаровому середовищі клітин заморожевали гемопоетичні клітини ембріональної печінки, них за режимами зазначеними в прикладах 1 - 8 в прикладах 23 - 36, таблиця 26 гемопоетичні кліпісля двомісячного зберігання, а в прикладах 9 тини кордової крові, в прикладах 37 - 50, таблиця 64 - після тримісячного зберігання при кінцевій 2с гемопоетия клітини периферичної крові, в притемпературі охолодження зазначеної в прикладах кладах 51-64, "таблиця 2д гемопоетичні клітини Ефективність методу також оцінювали проведенкістяного мозку ням бактеріологічного контролю крюконсервоваПідготовка клітин до низькотемпературного них гемопоетичних клітин консервування за запропонованим способом Крюпротектор д и мети л сульфоксид (далі Бактеріологічний контроль крюконсервованих ДМСО) - 7,0 мол/л концентрації розводили до 0,8 і гемопоетичних клітин на відсутність грампозитив2,9 мол/л концентрації, а потім додавали до клітин ноі і грамнегативної флори здійснювали згідно у співвідношенні 1 1 до одержання 0,4 - 1,45 «інструкції з контролю стерильності консервованої мол/л кінцевих концентрацій В отриману завісь крові, и компонентів, препаратів, консервування клітин, що призначені для крюконсервування, чекісткового мозку, кровозамінювачів, консервуючих рез ін'єкційну голку по краплині додавали такий же розчинів та умов їх заготівлі», затвердженої МОЗ об'єм 0,4 - 1,45 моль/л диметилсульфоксиду (далі України в 1996 р ДМСО) при легкому перемішуванні завісі шляхом З цією метою сателіт вилучали з низькотемпепохитування пробірки ратурного банку і розморожували у водяній бані (плюс 40 ± 0,5°С) і здійснювали скрінінг За допомогою шприцу через ін'єкційну голку гемопоетичні клітини розливали по 1мл в поліетиЯКІСНІ характеристики отриманих за відомим ленові крюампули об'ємом 1 - 1,8мл фірми Nunc способом продуктів зазначені, в таблиці 1, в конк(CryoStore Boxes) Крюампули герметично закриретних прикладах Як видно з результатів більвали кришками і маркували шість зразків має контамінацію різними видами мікрофлори, що свідчить про порушення стерильЗаморожування гемопоетичніх клітин виконуності при внесенні кристалів льоду вали за допомогою програмного заморожувача, який дозволяє варіювати швидкість зниження темВ прикладах 9 - 64 в таблиці 2а, 26, 2с, 2д заператури на різних етапах крюконсервування і значено КІЛЬКІСТЬ колоній та кластерів (на 10 поавтоматично здійснювати ініціювання процесу саджених у культуру клітин) на 8 - 10 добу Прикристалізації (СІДІНГ) за певної температури, шляклади 9 - 64 характеризуються відсутністю хом разового пропуску рідкого азоту через відповігрампозитивної і грамнегативної флори в отримадну трубку ному продукті При заморожуванні клітинної суспензії в ампуЯк видно з отриманих результатів запропонолах використовували спеціальні укладки, в які ваний спосіб має кращі результати збереження вставляли контейнери вертикально і укладку розклітин міщували в теплообмінну камеру заморожувача на Ініціація кристалоутворення в цьому способі відповідному пристрої, що виконує ініціацію крисздійснюється автоматично без додаткового контаталоутворення кту з клітиною суспензією, що спрощує спосіб та покращує умови стерильності середовища Заморожування клітин виконували за трьохетапною програмою На першому етапі від кімнатЗастосовані в способі середовища дозволено ної температури (20 ± 4°С) зі швидкістю (0,7 для внутрівенного використання і тому клітини 1,2°С) на хвилину до (мінус 8,5 - 10,5°С), На проотримані за таким способом можна використовутязі першого етапу заморожування, при досягненні вати в більшості випадків лікування температурі -3,5 -4°С здійснювали захолоджуванЗазначені режими заморожування не травманя (СІДІНГ) ОДНОГО боку контейнера із клітинною тичні для гемопоетичних клітин людини тому, що суспензією, шляхом разового пропускання через емпірично підібраний режим зниження температунього рідкого азоту, завдяки чому, при ВІДПОВІДНІЙ ри не викликає ріст великих кристалів які можуть температурі автоматично відбувалася ініціація порушити оболонки клітин кристалоутворення Завдяки тому, що спосіб передбачає викорисНа другому зі швидкістю - (1,0 - 4,5°С) на 1 тання зменшеної концентрації крюпротектора, хвилину до (мінус ЗО - 40°С) і на третьому - зі швиотримані за способом клітини можна використовудкістю 10 - 12°С на 1 хвилину до (мінус 130 вати зразу після розморожування без відмивання 196°С) Конкретні зазначені в таблиці 2 Концентвід крюпротектора, що спрощує спосіб та зменшує рація крюпротектора складала 0,4 - 1,4 моль/л негативний вплив додаткових дій на клітини Після замороження контейнери за допомогою ліЗазначені переваги, як показують приклади, щат вилучали із укладки і переносили в рідкий призводять до збільшення періоду збереження та азот в спеціальне сховище біологічних продуктів збільшення КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин після (марки СБ-0,5), обладнане чарунками зі змінними періоду заморожування 46673 Таблиця ї Таблиця 26 1& 0,02 6,3 ембріональна печшка -7в -7» Викутая одо 0,02 Викути КІСТКОВИЙ мочок КІСТКОВИЙ 0,02 мозок Таблиця 2а Та&пщя 2с =< ч з 0,8 1,3 і -за,в -ЗВ,6 3,5 11,4 -163 11,6 0,9 і 3,6 0,7 3,9 -33,6 4,1 3,7 10,6 І -1*4 1,2 3,9 10,7 0,4 3,5 -10.1 0,9 S,8 3,5 -31,4 -18,4 4,3 ' -35,7 -36,7 -8,2 1,1 0,9 г,з 2,3 -32,1 -9,9 1 3,7 3,9 -37,1 10,4 -37,1 -37,1 ' 4,8 46673 10 Таблиця 2д ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71