Спосіб визначення вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в культурі клітин

1. Спосіб визначення вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в культурі клітин, що включає 3 24577 повинні бути регенеровані. Використання методу з азотнокислою редуктазою потребує багато коштів і часу [Patton C.G., Fischer A.E., Campbell W.H. Corn leaf nitrate reductase - a nontoxic alternative to cadmium for photometric nitrate determinations in water samples by airsegmented continuous-flow analysis // Environmental Science & Technology. - 2002. - №36. -P.729-735]. Досить досконало вирішується проблема визначення вмісту нітритів і нітратів у діалізатах тканин за допомогою реактиву Грісса методом Гріна в модифікації О.А.Орловой [Орлова Е.А. Анализ нитратов и нитритов в ткани при экспериментальной острой почечной недостаточности // Український журнал екстремальної медицини. - 2002. -Т.3. №1. -С.79-82]. Цей спосіб найбільш ефективний з існуючих і тому обраний нами в якості прототипу. Але даний спосіб використовується лише для тканин і біологічних рідин, а також потребує досить значної кількості реактивів. Метою корисної моделі було створення способу визначення вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в культурі клітин. Поставлене завдання вирішується тим, що мононуклеарні клітини попередньо культивують протягом 24, 48 і 72 години та до 1мл діалізату клітин додають 0,1 мл реактиву Гріса, а до 0,5мл діалізату додають 0,03г реактиву на основі цинкового пилу. Запропонований спосіб дозволяє визначити вміст оксиду азоту в культурі клітин, не потребує додаткових витрат на устаткування та оснащення, а також простий в постанові та не займає значного часу. Дослідження проводиться з використанням культури мононуклеарних клітин, наприклад здорових донорів. Клітини культивують у середовищі Ігла MEM з додаванням L-глутаміну, 10% ембріональної телячої сироватки та антибіотиків при 37°С. Концентрацію клітин визначають у камері Горяєва та повним середовищем доводять до 2×106 клітин на 1мл. Життєздатність виділених клітин оцінюють за даними тесту з трипановим синім. Клітини культивують 24, 48 і 72 години. Оскільки ми маємо тільки клітини, без залишкової тканини, після культивування клітини гомогенізу Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко 4 ють в 1мл розчину, що є в 10 разів менше ніж при визначенні нітратів і нітритів в тканинах. Проводять діаліз протягом 2 годин, після чого в пробах проводять осадження білків 5% розчином КОН і 5% розчином сульфату цинку в об'ємному співвідношенні 2:5. Потім для визначення вмісту нітритів відбирають 1мл діалізату, а для нітратів - 0,5мл останнього. Для визначення вмісту нітритів, оскільки для дослідження беруть 1мл діалізату, усі реактиви зменшують в 10 разів, тобто додають 0,1мл реактиву Грісса, пробірки струшують 2 хвилини та залишають при температурі 4°С на 13 хвилин, у результаті чого в пробах розвивається рожеве забарвлення. Вимірювання оптичної щільності проводять на СФ-46 при λ=540нм. Для визначення вмісту нітратів, також реактиви зменшують в 10 разів та до 0,5мл діалізату додають 0,03г реактиву на основі цинкового пилу (сульфат барію - 100г, сульфат марганцю - 10г, цинковий пил - 2г, лимонна кислота - 75г, сульфанилова кислота - 4г, альфа-афтиламін - 2г) та 5мл оцтової кислоти. Реакцію проводять в аналогічних умовах протягом 10 хвилин. Проби центрифугують, відбирають супернатант. Вимірювання оптичної щільності проводять проти холостої проби на СФ-46 при λ=540нм. Концентрації стабільних метаболітів оксиду азоту розраховують за формулою: (NO - ) B ´ X1 2 = (NO3 ) A ´ X 2 , де: В - вміст нітрит-аніонів (нітрат-аніонів), розрахований за калібрувальними кривими в μМ; А - об'єм зразку в мл; Х1 - загальний об'єм фільтрату в мл; Х2 - об'єм фільтрату, взятий на аналіз в мл (1,0 або 0,5 відповідно). Таким чином, запропонований спосіб є оптимальним для визначення вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в культура х клітин при різних строках культивування. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601