Спосіб імуногістохімічної діагностики сальмонельозу курей

Спосіб імуногістохімічної діагностики сальмонельозу курей, що включає інкубування зрізів моноклональними антитілами, візуалізацію, забарвлення, який відрізняється тим, що інкубують поліклональними кролячими імуноглобулінами G (видовим кон'югатом) та обробляють зрізи тканин і імунних органів досліджуваної птиці антикролячими імуноглобулінами кози, кон'югованими з пероксидазою хрону (антивидовим кон'югатом). (19) (21) u200703489 (22) 30.03.2007 (24) 27.08.2007 (46) 27.08.2007, Бюл. № 13, 2007 р. (72) Красніков Генадій Андрійович, Стегній Борис Тимофійович, Шутченко Павло Олександрович (73) НАЦІОН АЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" 3 25815 наносять 100мкл діамінобензидіну з метою візуалізації антигенів збудника протягом 5-10 хвилин. Після промивання дистильованою водою забарвлюють зрізи гематоксиліном 2-5 хвилин, знову промивають дистильованою, а потім водопроводною водою. Обробляють зрізи 96° етиловим спиртом і ксилолом. Останнім етапом наносять краплю полістиролу і накривають покривним склом. При застосуванні цього способу можна використовувати органи, фіксовані у забуференому формаліні протягом тривалого часу (до 1 року), що відповідає критерію "Новизна". Приклад 1 Отримання поліклональних антитіл. Для розробки імуногістохімічного способу з метою діагностики сальмонельозу курей застосовували 5 кролів. Процес отримання складав з декількох етапів: гіперімунізація кролів, отримання сироватки крові кролів, виділення імуноглобуліну класу G і маркування його пероксидазою хрону. Для гіперімунізації готували суспензію з наступних складових: 1мл сальмонельозного антигену, 19мл фосфатно-сольового буферу, 0,6мл (3 об'ємних відсотки) димексиду. Доза по білку становить 3мл/кг живої ваги. 500млн бактерійних тіл дорівнюються до 1мл бактерійного білку. Кожну тварину гіперімунізували в крайову вушну вену дотримуючись наступної схеми: 1-ша ін'єкція - 0,5мл суспензії з димексидом; 2-га ін'єкція - через 4-5 днів 0,7мл без димексиду; 3-тя ін'єкція - через 4-5 днів 1мл без димексиду. Через 5-10 днів після останнього ін'єкування перевіряли результат гіперімунізації в кровокрапельній реакції аглютинації на наявність антитіл. В усіх 5-ти пробах одержано позитивний результат. Кролів обезкровлювали, кров відбирали у стерильні пробірки і відстоювали у термостаті протягом 1,5 години за температури 37°С. Потім ставили у холодильник на 12 годин. Після чого стерильними пастерівськими піпетками сироватку відбирали у стерильні флакони. Синтез кон'югату пероксидази хрону з IgG проводили за методом Накане. Для цього до розчину, який містить 4мг пероксидази хрону в 1мл води, додавали 0,2мл свіжовиготовленого 0,1М розчину NaIO4 та перемішували протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Отриманий розчин діалізували проти 0,001М натрій-ацетатного буферу, рН 4,4, протягом ночі при 4°С. До модифікованої пероксидази хрону додавали 20мкл 0,2М натрій карбонатного буферу, рН 9,5 і 8мг IgG в 2мл того ж буферу. Реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при кімнатній температурі, додавали 0,1мл свіжоприготовленого водного розчину NaBH4 (4мг/мл) і перемішували протягом 2 годин за температури 4°С. Отриманий кон'югат або осаджували насиченим розчином (NH4)2SO4 і потім діалізували, або хроматогКомп’ютерна в ерстка А. Крулевський 4 рафували на колонці (1,6 х 35см) з сефадексом G200, збираючи фракції, які відносяться до першого піку. Для стабілізації кон'югату додавали 50% гліцерин і зберігали за температури 4°С. Приклад 2 Зараження курчат Salmonella enteritidis. Для проведення першої серії досліджень було сформовано дві групи курчат по 50 голів у кожній. Першу групу курчат заражали суспензією Salmonella enteritidis оральним шляхом за допомогою приєднаного гнучкого катетеру у дозі 0,2мл на тварину (1 х 105 мікробних тіл на тварину). Для цього використовували штам S. enteritidis дикого типу - М №8. Штам культивували на звичайному МПА, режим культивування 48 годин за температури 37°С. Культуру змивали з агару стерильним фізіологічним розчином. Готували суспензію з концентрацією 5 x 105(500000) мікробних тіл в 1см 3 у відповідності з оптичними стандартами мутності. Робоче розведення готували на стерильному МПБ. Друга група - контроль (інтактні тварини). Для проведення другої серії дослідів було сформовано також дві групи курчат по 35 голів у кожній. Зараження проводили внутрішньом'язево тією ж суспензією, але у дозі 0,1мл на тварину. Курчат забивали на 5-у, 8-у, 10-у, 13-у, 15-у, 17-у, 21-1 та 51-у добу після зараження (в першій серії дослідів), та на 15-у, 30-у і 45-у добу (у другій серії дослідів). Від курчат відбирали тимус, бурсу Фабриціуса, селезінку, залозистий шлунок, печінку, сліпу кишку, червоний та білий м'язи. Органи фіксували у забуференому формаліні з подальшим виготовленням гістологічних препаратів. Приклад 3 Випробування запропонованого способу в лабораторних умовах. Перед постановою реакції проводили розведення компонентів реакції. Спочатку розводили видовий кон'югат (кролячі імуноглобуліни G, мічені пероксидазою хрону) фізіологічним розчином - до 1мкл видового кон'югату додавали 2мл фізіологічного розчину. Потім розводили антивидовий кон'югат (козячі антикролячі імуноглобуліни G, мічені пероксидазою хрону) розчинником для антитіл (Antibody diluent) - до 1мкл антивидового кон'югату додавали 200мкл розчиннику для антитіл. Після цього проводили розведення діамінобензидіну (DAB), для чого до 20мкл DAB додавали 1мл субстратного DAB буферу. Наступним етапом після процедури розведення компонентів була постанова самої імуногістохімічної реакції, яка описана вище. Запропонований спосіб імуногістохімічної діагностики сальмонельозу курей є новим та ефективним. Його можна рекомендувати для впровадження у практику ветеринарної медицини (діагностичні лабораторії ветеринарної медицини). Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601