Спосіб визначення антитіл у сироватці крові за допомогою імуноферментного аналізу при хворобах курей

Винахід відноситься до імунодіагностики і може бути використаний в методах імуноферментного аналізу в імунодіагностиці хвороб курей, експериментальній імунохімії та біотехнології. Популярність імуноферментного аналізу (ІФА) пояснюється безпечністю (використовується інактивований вірус) та зручністю роботи, а також широким розповсюдженням приладів - спектрофотометрів, за допомогою яких за кілька секунд можна виміряти поглинання світла в 96 лунках мікроплати із оптично прозорого полістиролу, що дозволяє значно збільшити кількість проведених аналізів. Існують способи визначення антитіл до вірусу інфекційного ларинготрахеїту, бронхіту к урей (Методические указания по определению антител к вирусу инфекционного ляринготрахеита кур в сыворотках крови птиц иммуноферментным методом. Гусев А.А., Борисов А.В. и др., г. Владимир, 1998г.). (Методические указания по определению антител к вирусу инфекционного бронхита кур в сыворотке крови птиц иммунофнерментным методом. Старов С.К., Гусев А.А., г. Владимир, 1997г.). Основним недоліком відомих способів є їх дороговартість. Найбільш близьким до заявленого способу є спосіб визначення антитіл до вірусу ньюкаслської хвороби курей (Методические указания по определению антител к вирусу Ньюкаслской болезни в сыворотках крови птиц иммуноферментным методом. Гусев А.А., Старов С.К. и др., г. Владимир, 1997г.). Суть способу полягає в тому, що після внесення на тверду фазу антиген у, розведеного в карбонатному буфері для розведення кон'югату пероксидази хрону з антивидовим імуноглобуліном використовують тріс, хлористий натрій та воду. Цей спосіб може бути прототипом. Недоліком цього способу є те, що до його складу входить дороговартісний реактив - тріс. В основу винаходу, що передбачається, поставлено задачу розробити спосіб визначення антитіл у сироватці крові за допомогою ІФА при хворобах курей, що включає внесення антигену, розведеного в карбонатному буфері, інкубацію, відмивання лунок сольовим розчином NaCl, шляхом використання як розчинника сольового фосфа тного буферу мас.% Na2HPO4x12H2O 0,20-0,38 NaH2PO4x2H2O 0,10-0,19 NaCI 0,01-0,06 Твін-20 0,009-0,04 Вода решта За результатами дослідів по виявленню антитіл до вірусів інфекційного бронхіту курей, хвороби Ньюкасла за допомогою антигенів визначено, що розведення компонентів запропонованим фосфатним буфером дозволяє уникнути неспецифічних реакцій, збільшити чутливість імунохімічних реакцій, уніфікувати склад буферу і, разом з тим знизити вартість аналізу. Приклад Для експериментальної перевірки заявленого способу був приготовлений фосфатний буфер: Na2HPO4х12Н2O - 5,16г розчиняли в 72мл Н 2O NaH2PO4х2Н2O - 0,9г розчиняли в 28мл Н 2O Обидва розчини об'єднували, додавали 11,6г NaCl і після його розчинення доводили об'єм буферу до 2000мл дистильованою водою. Результати, щодо використання сольового фосфатного буферу при постановці імуноферментного аналізу (розведення компонентів, відмивання лунок) та його переважності в порівнянні з прототипом наведені в таблиці 1. Для проведення досліджень використовували полістиролові планшети, розчин антигена, позитивні сироватки крові птиці, які утримували б антитіла до антигену, кон'югат антивидових антитіл із пероксидазою хрону. Спосіб виконується таким чином. В лунки полістиролових планшетів вносили антиген, розведений в карбонатному буфері з рН9,5-9,6, інкубували протягом 18 годин при 4 0С. Компонент, що не сорбувався, відмивали запропонованим фосфатним буфером і розчином, що використовується в прототипі. Далі вносили по 0,1мл 10% - конячої сироватки і витримували 1 годину при кімнатній температурі. Потім у лунки вносили контрольні та дослідні сироватки у відповідних розведеннях з використанням запропонованого фосфатного буферу та розчину, що використовують у прототипі та витримували 2 години при 370С. Після інкубування лунки планшетів 3-4 рази відмивали запропонованим розчином та розчином, що використовували в прототипі. Виявлення комплексу антиген-антитіло проводили шляхом внесення в лунки кон'югату антивидових антитіл з ферментом пероксидазою хрону, інкубували 1 годину в термостаті і відмивали. Потім в лунки планшету додавали по 0,1мл субстратно-індикаторної суміші, яку готували таким чином: у 10мл 0,2моль/л цитратно-фосфатного буферу розчиняли 1мг ортофенілендіаміну і вносили 0,001мл 30% розчину H2O2. Планшети ви тримували 15 хвилин у темному місці при кімнатній температурі. Реакцію зупиняли внесенням у кожну лунку по 0,05мл 10% сірчаної кислоти. Облік результатів проводили інструментально за допомогою спектрофотометра (Рідер) PR 2100ф. Sanori при довжині хвилі 492нм. Як видно із даних таблиць N 1, 2,показники запропонованого фосфатного буферу перевищують показники розчину прототипу (тріс буферу) за чутливістю. На підставі одержаних результатів можна зробити висновок, що спосіб визначення антитіл у сироватці крові за допомогою ІФА з використанням сольового фосфатного буферу як розчинника є більш чутливим та недороговартісним. Таблиця N 1 АВС+ D+ Е F 1 0.150 0.155 0.500 0.540 0.075 0.060 2 0.160 0.160 0.540 0.540 0.060 0.060 3 0.150 0.140 0.300 0.300 4 0.120 0.120 0350 0.340 5 0.080 0.080 0.200 0.200 6 0.045 0.040 0.150 0.120 7 0.035 0.030 0.080 0.090 8 0.020 0.020 0.075 0.075 9 0.020 0.025 0.050 0.050 10 0.020 0.020 0.030 0.030 11 0.015 0.015 0.020 0.020 12 0.015 0.020 0.020 0.015 G H 0.065 0.070 0.065 0.070 Таблиця N 2 АВС+ D+ Е F G H 1 0.135 0.140 0.320 0.350 0.080 0.085 0.075 0.080 2 0.160 0.160 0.340 0.340 0.085 0.085 0.075 0.080 3 0.150 0.140 0.300 0.300 4 0.100 0.120 0.250 0.240 5 0.070 0.080 0.200 0.200 6 0.030 0.030 0.100 0.120 7 0.035 0.030 0.080 0.090 8 0.025 0.020 0.070 0.075 9 0.030 0.025 0.040 0.050 10 0.025 0.020 0.030 0.030 11 0.020 0.020 0.020 0.020 12 0.015 0.020 0.020 0.015