Застосування продуктів із сої як інгібіторів нейрамінідазної активності вірусу грипу та репродукції вірусу грипу

Корисна модель належить до області медицини, вірусології, молекулярної вірусології, конкретно до категорії біологічно активних сполук в продуктах харчування, які можуть бути використані в якості засобів лікування інфікованих грипом людей. Відомі в теперішній час інгібітори нейрамінідази оселтамівір (таміфлю) [1, 2] та занамівір (4-гуанідин-2,3-дегидро-N-ацетилнейрамінова кислота), які інгібують репродукцію вірусу грипу. Але ці препарати мають побічні явища, такі як підвищення температури, бронхоспазми, блювота. До недоліків цих препаратів відноситься висока вартість курсу лікування - 5 діб (44-53$). Механізм антигрипозної дії здійснюється шляхом інгібіції нейрамінадазной активності вірусу грипу. Запропоновані препарати - продукти харчування: соєва суспензія, соєве борошно, соєвий сироподібний продукт. Серед великого різноманіття нових засобів дієтичного лікування особливе значення набули продукти переробки сої. Унікальні лікувально-профілактичні властивості яких відомі на протязі певного часу. Так, ще в 30-і роки «соєве молоко» призначалось при виразковій хворобі шлунка та 12-палої кишки, холециститі, цирозі печінки, гіпертонії, анемії, цукровому діабеті, набряках, гіпертермії, виснаженні. Останні роки соєва дієтотерапія широко призначається в нефрології при лікуванні хронічної ниркової недостатності, ендокринології при лікуванні цукрового діабету, ожирінні, профілактиці та лікуванні атеросклерозу, в терапії опіків. Таке значне використання продуктів переробки сої в раціональному харчуванні обумовлено тим, що соя - це цінне джерело білка з унікальним складом незамінних амінокислот (АК). Соя містить, приблизно, 38% білка (9,5% альбуміни і 75,8% глобуліни), 9% вуглеводів, 17% жирів. Засвоєння організмом соєвого білка складає 77-92%, вуглеводів - 94-99%, жирів, приблизно, 80%. Великою перевагою соєвого білка є його гіпоалергенність, швидке включення в обмінні процеси. АК його ідентичні АК білкам тваринного походження. Також слід зазначити, що до складу сої входять такі біологічно активні сполуки, як ізофлавони та інгібітори протеаз, які в переважній більшості випадків і визначають її лікувально-профілактичні властивості. В роботах було показано, що деякі флавоноїди володіють противірусною активністю, в тому числі і по відношенню до ретровірусів [3]. Встановлено, що деякі флавоноїди мають здатність інгібувати зворотну транскриптазу цих вірусів та інших ферментів, як клітинних, так і вірусних, що може бути одним з механізмів їх антивірусної і антипроліферативної дії. Із сої виділені сіалоспецифічні лектини. Тому, цілком логічно було припустити, що продукти із сої можуть взаємодіяти з нейрамінідазою вірусу грипу. Нейрамінідаза вірусу грипу приймає участь в процесі взаємодії з чутливими клітинами на етапах адсорбції і зливання оболонок вірусу і клітини, та виходу вірусів грипу із клітин, тому завданням корисної моделі було виявити чи є соєві продукти (соєва суспензія, соєве борошно) інгібіторами нейрамінідазної активності вірусу грипу. Поставлені завдання вирішуються шляхом виготовлення препаратів соєвої суспензії та борошна. Борошно одержували шляхом подрібнення сої, соєву суспензію - згідно патенту [4]. Визначення нейрамінідазної активності проводили за методом Aminoff [5]. До розведень нейрамінідази (0,1мл) додавали 0,1мл препаратів - соєвої суспензії в розведені 1:10, соєвого борошна - 1мг/мл, інкубували 1 годину при 37°С, додавали фетуїн і залишали при 37°С на 1 годину. Потім в кожну пробірку вносили по 0,25мл перйодату калію і інкубували 30 хвилин. Після цього додавали 0,4мл арсеніту натрію, струшували і вносили по 2мл тіобарбітурової кислоти. Кип'ятили на протязі 7,5 хвилин, охолоджували на льоду. Потім додавали 5мл підкисленого бутанолу, струшували, центрифугували 10 хвилин при 1500об/хв. Активність нейрамінідази виражали в одиницях УФ-поглинання при довжині хвилі 549нм або в процентах при порівнянні досліджуваних зразків. Антинейрамінідазну активність соєвої суспензії і соєвого борошна вивчали на прикладі інгібування нейрамінідаз різних типів вірусів грипу та референс-препарат із Astrobacter ureafaciens (1 unit Calbiochem) у розведеннях відповідно 103 і 51,5 γ/мл/хв., розчинами соєвих продуктів в концентрації 1мг/мл. Результати наведені в таблиці 1. Проведені дослідження показали, що соєва суспензія та борошно повністю інгібують нейрамінідазну активність вірусів грипу та референс-препаратів нейрамінідази з бактерій. Для визначення антивірусної активності соєвих продуктів в умовах in vitro використовували добову перещеплювану культуру клітин MDCK (клітини нирки собаки) із суцільним шаром. Клітини вирощували в плашках на середовищі RPMI-1640 + 10% фетальної сироватки (Nunclon, Surface, Denmark) при температурі 37°С в термостаті з подачею 5% СО2. Середовище росту зливали, до клітин додавали соєву суспензію в розведенні 1:10 або вірус грипу, в залежності від модифікації експерименту. Через 1год контакту вірус, що не адсорбувався, видаляли й в лунки вносили підтримуюче середовище (живильне середовище без сироватки). Наступного дня в лунки плашок, що інкубувалися із соєвою суспензію, вносили вірус грипу в дозі 100 ІД50 (профілактична схема), а в лунки, що були інфіковані вірусом, вносили соєву суспензію в розведені 1:10 (лікувальна схема). Культури інкубували в термостаті з подачею СО2 протягом 3 діб, щодня контролюючи за допомогою мікроскопу. Через 72год інкубації клітин культуральну рідину збирали і в ній визначали активність гемаглютиніну (ГА) і інфекційний титр вірусу грипу з титруванням в культурі клітин. Використовували вірус грипу, штам A/FM/1/47(H1N1) інфекційний титр в МДСК - 4,0 1g ІД50 Вивчення антигрипозної активності соєвої суспензії in vitro показало, що продукт при профілактичній і лікувальній схемах введення пригнічує репродукцію вірусу грипу A/FM/1/47(H1N1) на 3,0 1g ІД50 (табл. 2). Вивчення антигрипозної активності соєвих продуктів in vivo проводили в експерименті на мишах, заражених адаптованим до них вірусом грипу A/FM/1/47 (H1N1), інфекційний титр 4,0-4,5 1g LD50. Тварини були розділені на 4 групи: 1-а (контроль І-грип) - миші, інфіковані вірусом грипу, що не одержували соєвий продукт; 2-а (соя + грип) - миші, що одержували соєвий сироподібний продукт, який щодня додавали до раціону віварію в кількості 3-5г/кг протягом 3-х тижнів до зараження вірусом грипу і до закінчення експерименту; 3-я (грип + ремантадин) - миші, що одержували ремантадин після інфікування вірусом грипу; 4а (соя + грип + ремантадин) -миші, що одержували соєвий продукт протягом 3-х тижнів до зараження вірусом грипу, а після зараження - соєвий продукт і ремантадин. Контрольними (контроль II - соя) були також тварини, що одержували соєвий продукт, але не були інфіковані вірусом грипу (n=5). Результати дослідження антигрипозної активності сироподібного соєвого продукту (табл. 3) показали, що годування продуктом на протязі 3-х тижнів до інфікування, та після інфікування захищало мишей від грипозної пневмонії на рівні 66,7% та знижувало репродукцію вірусу грипу в легеневій тканині. Харчування експериментальних тварин соєвим сироподібним продуктом на фоні лікування антигрипозним препаратом ремантадин ефективно підвищувало захисну дію препарату та впливало на репродукцію вірусу в легеневій тканині. Література 1. Balasingam S. et al. Antiviral Activity of Oseltamivir Carboxylate Against a Human Isolate of the current H5N1 chiken Strain. 44th ICAAC Wachington D.C., 30 oct.-2 Nov Poste#3839, 2004. 2. Treanor J.J. et al. Efficacy and safety of the oral neuraminidase inhibitor Oseltamivir in treating acute influenza: a randomized, controlled trial. JAMA, 2000; 283: 1016-24. 3. Rybalko S. et al. Proteflasid: composition of natural flavonoids. Mechanisms of antiviral activity. Abstr.from the 6th AFMC International Medicinal Chemistry Symposium July 8-11, 2007, Istambul, Turkey. PA-46 4. Боровський B.P., Ратушняк B.B., Колычев B.I., Бурушкина Т.М. Спосіб одержання водних соєвих дисперсій», Патент на корисну модель №21498 від 15.03.07р. 5. Aminoff D. Methods for the quantitative estimation od N-acetylneuraminic acid and their applicationto hydrolysatea of sialomucoids, - Biochem.J., 1961, 81, p.384-389/