Спосіб кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів

Корисна модель відноситься до класу сільського господарства, безпосередньо до репродуктивної біотехнології і може бути використана для одержання та застосування кріоконсервованих у рідкому азоті епідидимальних гамет кнурів. При цьому сперматозоїди вилучають із хвостової частини сім'яника кастрованих самців. Такі кріоконсервовані гамети можна використовувати для штучного осіменіння свиней, запліднення дозрілих in vitro яйцеклітин, збереження і поповнення генофонду. Скороспілість, багатоплідність свиней та інших свійських тварин надає галузі провідної ролі у забезпеченні населення м'ясом і м'ясними продуктами. Інтенсифікувати розвиток галузі можливо при максимальній реалізації генетичного потенціалу шляхом системного застосування біотехнологічних методів розмноження. Комплексне використання технологій і біологічних особливостей цього виду сільськогосподарських тварин забезпечує використання цінних плідників не лише шляхом збільшення їх спермопродукції, раціонального дозування еякульованої сперми кнурів, а і застосування епідидимальних сперматозоїдів. У ссавців рухливі епідидимальні гамети вилучають із хвоста придатка сім'яника. Встановлено, що в хвості епідидиміса сперматозоїди депонуються до еякуляції. Сперматозоїди із найбільш дистальної частини тіла епідидиміса і всього хвоста функціонально повноцінні. В нормі 3 зрілих сперматозоїдів знаходяться у 4 хвостовому відділі епідидиміса [Данилова Л.В., Габер Е.С., 1983; Доронин Ю.К. и др., 2004]. Аналогом корисної моделі є вилучення епідидимальних сперматозоїдів від самців диких парнокопитних тварин [М.С. Бутарин. «Отдаленная гибридизация в животноводстве». Алма-Ата: Наука, 1964, с.22-23], яким передбачено відділення сім'яників у забитих баранів, транспортування сім'яників не більше декількох годин у лабораторію, відділення хвостової частини епідидиміса, звільнення звитих канальців від оболонки епідидиміса, руйнування капілярів і відмивання крові у фізіологічному розчині, подрібнення звитих канальців у розбавнику, фільтрування отриманої суміші сперматозоїдів через марлю, оцінка гамет та використання їх для штучного осіменіння. Недоліком аналога є обмежений термін транспортування придатків перед їх заморожуванням, зниження життєздатності гамет через тривалий час їх вилучення, зниження рівня стерильності роботи. Найбільш близьким за технічними характеристиками до заявленого способу є спосіб: - одержання епідидимальних сперматозоїдів від зубрів [патент Російської Федерації RU 2092129]. Спосіб ґрунтується на відділенні сім'яників від тулуба тварини, транспортування їх протягом доби в термосі з холодоагентом, відділення хвостової частини епідидиміса, звільнення звитих канальців, подрібнення їх в розбавнику до однорідної суспензії, витримування 15-20хв. до повного переходу сперматозоїдів у розбавник, фільтрування суспензії з допомогою скляного фільтру з діаметром пор 100-120мкм, оцінки гамет, підготовки і виконання їх глибокого заморожування. Недоліки прототипу полягають у обмеженості часових параметрів доставки сім'яників до 1 доби, фільтруванні подрібненої маси звитих канальців через скляний фільтр, що негативно впливає на життєздатність гамет, а також порушує стерильність вилучення сперматозоїдів. Заявлений нами спосіб кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів усуває недоліки прототипу і забезпечує життєздатність кріоконсервованих гамет. В основу корисної моделі покладено завдання якісного вилучення сперматозоїдів кнурів із хвостової частини епідидиміса після доставки сім'яників, їх заморожування у формі відкритих гранул, яке б усувало негативний вплив на життєздатність гамет тривалого транспортування (до 3 діб) сім'яників, було простим у виконанні і застосуванні. Цим зумовлена ефективність методу. Поставлене завдання вирішене тим, що спосіб кріоконсервування сперматозоїдів кнурів із придатків сім'яників включає відділення сім'яників, транспортування їх до місця кріоконсервування в охолодженому вигляді, відділення хвостової частини епідидиміса, проведення її розрізання, відбір суміші виділених гамет та їх заморожування, відповідно до корисної моделі. Транспортування сім'яників здійснюють з обкладанням їх льодом, що тане, звільнення хвостової частини епідидиміса здійснюють з попередньою стерильною обробкою, проводяться паралельні щільні розрізання хвостової частини епідидиміса з мінімальним руйнуванням кровоносних судин. Спосіб заморожування епідидимальних сперматозоїдів містить ознаки, що відрізняють заявлену корисну модель від прототипу: відсутність негативного впливу на життєздатність гамет 3 діб зберігання сім'яників тварин, уникнення подрібнення та змішування тканин звитих канальців епідидиміса із сперматозоїдами із наступною фільтрацією суміші, забезпечення високої стерильності роботи. Основні етапи технологічного процесу наступні: відділення сім'яників кнурів при кастрації кнурів, розміщення їх в негерметичну ємність із підтримання температури льоду, що тане (+4-5°С). В лабораторних умовах виконується відділення хвостової частини епідидимісів, обробка їх поверхні 70° етиловим спиртом і проведення паралельних щільних розрізань звитих канальців стерильним скальпелем. При цьому розрізи виконуються повільно, з мінімальним руйнуванням кровоносних судин. Суміш гамет, що виділяється, збирається за допомогою стерильного наконечника одноканальної піпетки змінного об'єму [«Ленпипет Колор», кат. №40270302] і переноситься в стерильну посудину. Із хвостових частин двох епідидимісів одного кнура можна отримати до 1,5мл суміші гамет, яка містить 7-8 млрд. сперматозоїдів з рухливістю 8-9 балів. Концентрація гамет визначається за допомогою камери Горяєва, розбавлення сперматозоїдів згідно загальноприйнятої методики [Ожин Ф.В. и др., 1983]. Для кріоконсервування використовується розбавник «Біоконсан» [автор, свідоцтво №82839 Держкомвинаходів СРСР] доповнений 10% гліцерину і 10% жовтка курячого яйця. Заморожування виконується на фторопластовій пластині. Об'єм гранул - 0,2мл з 15-20млн. гамет. Корисна модель може бути використана у селекційних центрах, господарствах різних форм власності, науково-дослідних установах, ВУЗах для здійснення кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів, використання їх для штучного осіменіння свиней, одержання ембріонів поза організмом, збереження генофонду, поглиблення знань репродуктивного розвитку ссавців і тому відповідає критерію корисної моделі «промислова придатність». Для оцінки ефективності заявленого способу кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів було проведено досліди. Дослід 1. Використано сім'яники кнура великої білої породи 3-річного віку. Після кастрації сім'яники були розміщені для зберігання до 3 діб у холодильнику при +5°С. Після закінчення зберігання видаляли оболонку сім'яника і епідидиміс. Хвіст епідидиміса був відпрепарований від тіла. Показано, що зразу після виділення із хвостової частини придатка сім'яника лише поодинокі сперматозоїди виявляють коливальні рухи. Після культивування при кімнатній температурі протягом 10хв. спостерігається 65-70% рухливих гамет. Після розморожування рухливість гамет була на рівні 20%. При проведенні процедури „спливання" (swim-up) для відбору лише рухливих гамет встановлено, що протягом 15хв. можливо відібрати сперматозоїди кнура в кількості, достатній для запліднення яйцеклітин свинок поза організмом (250тис./мл). Дослід 2. Незрілі ооцит-кумулюсні комплекси свиней отримували із яєчників тварин (107гол.) і культивували поза організмом 46год. Видалення розріджувача та відбір рухливих епідидимальних сперматозоїдів кнура проводили в модифікованому середовищі TALP без іонів Са2+ [Katska L., е.а., 1993]. В дослідженнях використано гамети від 6 кнурів великої білої породи, отримані шляхом кастрації самців. Епідидимальні сперматозоїди спільно інкубували поза організмом із яйцеклітинами (18 год.) в середовищі TALP-IVF [Katska L., e.a., 1993] з додаванням суміші РНЕ (20мкМ пеніциламіну, 10мкМ гіпотаурину та 1мкМ епінефрину) і розчину гепарину (10мкг/мл). Зиготи культивували in vitro у середовищі NCSU-23 [Gajda В., 1998]. Культивування ембріонів свиней in vitro проводили протягом 5-6 днів. Результати відображені в таблиці. Таблиця Ефективність отримання зародків свиней in vitro при використанні кріоконсервованих епідидимальних сперматозоїдів кнурів Кількість запліднених яйцеклітин in vitro 735 зигот 418(56,9±2,4) Кількість (%) отриманих зародків 2-6 - клітинних морул-бластоцист 353 (48,0±2,7) 113(15,4±3,4) Дослід 3. Для перевірка запліднювальної здатності кріоконсервованих епідидимальних сперматозоїдів кнурів було виконано штучне осіменіння свиноматок (Прилуцький р-н, Чернігівська обл.). В досліді використано гамети лінійного плідника Бистрого-523 (Дніпропетровський державний аграрний університет). Як контроль - еякульована сперма кнурів, підготовлена для штучного осіменіння. Осіменіння свиноматок проводилось однократно на 3-й день статевого циклу згідно «Інструкції із штучного осіменіння свиней» (2003p.). Результати відображені в таблиці. Таблиця Ефективність запліднювальної здатності епідидимальних сперматозоїдів кнурів Гамети кнурів Еякульовані свіжі Епідидимальні кріоконсервовані Кількість осіменених свиноматок 26 15 Заплідненість, n (%) Опоросилось, n (%) 18(69,2) 10(66,7) 18(100,0) 8 (80,0)