Середовище єгорова для кріоконсервування сперматозоїдів собаки

Корисна модель належить до кріобіології і може бути використаний для створення кріобанків сперми собак з метою оберігання цінних порід та ведення селекційної роботи. Для кріоконсервування сперматозоїдів собаки традиційним є середовище, яке містить жовток курячих яєць та кріопротектор гліцерин [1]. Недоліком цього середовища є те, що до його складу входить яєчний жовток, який, по-перше, не може бути стандартизований, а по-друге, може спровокувати розвиток інфекції у статеви х шляха х самки при штучному заплідненні. Для запобігання інфікування необхідно проводити центрифугування суспензії відігрітих сперматозоїдів, що веде до ушкодження частини клітин. Крім того, за нашими даними, жовток курячих яєць у тій концентрації (20% w/v), в якій він застосовується в цьому середовищі, знижує рухливість сперматозоїдів собаки на 10-15% ще на етапі підготовки клітин до кріоконсервування. Найбільш близьким до середовища, що заявляється, є середовище для кріоконсервування сперматозоїдів собаки [2], до складу якого входять: фосфа тний буфер (рн 7,0) 0,02М розчин рінгера 0,09М фр уктоза 0,062М бичій сироватковий альбумін 0,4% жовток курячих яєць 20% (v/v) глицерин 8% (v/v) Недоліком цього середовища є те, що після кріоконсервування значно знижується рухливість сперматозоїдів собак. Це обумовлено такими факторами. Середовище містить гліцерин, який, як відомо [3], провокує осмотичний шок. Це повязано з його низькою проникністю крізь мембрани сперматозоїдів. Крім того, гліцерин проникає до внутрішнього середовища сперматозоїдів собаки крізь водні канали, що уповільнює стабілізацію (зрівняння) системи внутрішнього та зовнішнього середовищ за рахунок складання конкуренції для води під час виходу її з клітин. Цей вплив може бути суттєвим, тому що сперматозоїди собаки мають дуже низький, відносно сперматозоїдів інших видів тварин, коефіцієнт проникності для води (0,0029мкм/хв.атм) [4]. У фосфатного буфера вже при температурах близько нуля знижується рН за рахунок зменшення розчинності солей, які входять до його складу, тому він змінює рН середовища і, відповідно, рН суспензії сперматозоїдів. Бичій сироватковий альбумін має велику молекулярну масу, тому негативно впливає на запліднюючу здібність сперматозоїдів тварин, знижуючи її ще до кріоконсервування [5]. В основу корисної моделі поставлено задачу створити таке середовище для кріоконсервування сперматозоїдів собаки, яке б забезпечувало можливість підвищення рухливості розморожених сперматозоїдів. Ця задача вирішується тим, що середовище, яке містить, буферний розчин, фруктозу, альбумін, та кріопротектор, згідно з корисною моделлю, як буферний розчин містить трисоксиметиламінометан, як альбумін яєчний альбумін, а як кріопротектор - N,N-диметилформамід (ДМФА), при такому співвідношенні компонентів, мас.%: трісоксиметиламінометан 3% фр уктоза 1% яєчний альбумін 0,5% ДМФА 7% вода дистильована Решта. ДМФА відноситься до класу амідів низькомолекулярних аліфатичних кислот, М.м. 73,1; dp20 0,945г/см 3; Ткіп 152°С, гарно розчинний у воді. ДМФА має значно вищій коефіцієнт розподілу (0,233 проти 0,005 у гліцерина) в системі вода-неполярна фаза, що дає йому можливість проходити у вн утрішнє середовище сперматозоїдів крізь ліпідний бішар клітин, а не крізь водяні канали [6]. Завдяки цьому він має можливість дуже швидко проникати крізь мембрани клітини, не викликаючи осмотичний шок. Буфер трисоксиметиламінометан, на відміну від фосфатного, являє собою органічну речовину, яка гарно розчиняється у воді в широкому інтервалі температур. Тому він не випадає в осадок, не змінює рН середовища, зберігає свою буферну ємність в області субнульових температур, що дозволяє ефективно стабілізувати рН у суспензії сперматозоїдів. Яєчний альбумін, на відміну від бичього сироваткового альбуміну, має більш низьку молекулярну масу, тому має мембранотропну дію, завдяки якої справляє більш позитивний ефект на життєздатність клітин. Він абсолютно нетоксичний і використовується у кондитерській промисловості. Крім того, він більш доступний, тому що в декілька разів дешевше інших альбумінів. Середовище Єгорова дозволяє підвищити рухливість сперматозоїдів собак, у порівнянні з найближчий аналогом, на 22% (див. таблицю). Приклад: Еякулят собаки центрифугували, збирали надосадок, а клітини змішували у співвідношенні 1:1 з середовищем, яке містило буфер трисоксиметиламінометан - 0,2М, фруктозу - 0,05 М, яєчний альбумін - 1% і дистильовану воду. С успензію сперматозоїдів охолоджували до температури 4°С впродовж 10хв., після чого суспензію сперматозоїдів змішували у співвідношенні 1:1 з також охолодженим кріозахисним середовищем Єгорова, яке містило: трисоксиметиламінометан - 0,1М, фруктозу - 0,025М, яєчний альбумін - 0,5%, кріопротектор ДМФА - 2,0 М, воду дистильовану - решта. Концентрація кріопротектора ДМФА в суспензії після змішування складала 1,0М. Після цього проводили кріоконсервування сперматозоїдів в парах рідкого азота до температури 196°С [1]. Відігрівали на водяній бані при 40°С. Дослідження рухливості сперматозоїдів після відігріву проводили за допомогою лабораторного лічильника ЛЛ-1 і світлового мікроскопу МБІ-10. Дані наведені в таблиці. Таблиця Показники рухливості сперматозоїдів собаки в залежності від середовища, яке використовувалось під час кріоконсервування (n=6, M±m) Середовище За найближчий аналогом За винаходом до кріоконсервування, % 75 74±12 Рухливість після кріоконсервування, % 33,3 55±8 Джерела інформації: 1. England G.С.W. Cryopreservation of dog semen: a review. // J. Reprod Fertil. SuppL - 1993. - V.47. - P.243-255. 2. Martin I.С.A. The Freezing of Dog Spermatozoa to -79°С // Res. Vet. Sci. - 1963. - V.4. - P.304-314. 3. Songsasen N., Murton I.Yu., S., Paccamonti D.L., Eilts B.E., Godke R.A., Leibo S.P. Osmotic sensitivity of canine spermatozoa // Cryobiology. - 2002. - V.44. - P.79-90. 4. Sreedhar Thirumata, Maria S. Ferrer, Abdul Al-Jarrah, Bruce E. Eilts, Dale L. Paccamonti, and Ram V. De vireddy. Cryopreservation of canine spermatozoa: theoretical prediction of optimal cooling rates in the presence and absence of cryoprotective agent // Cryobiology - 2003. - V.47. - P.109-124. 5. Watson P.E. Problems in the Cryopreservation of mammalian spermatozoa // Cryobiology. - 1986. - V.23. - P.547. 6. Липник Т. П. Амиды алифатических кислот - эффективные криопротекторы. I. Физико-химические свойства соединений ряда амидов // Проблемы Криобиологии. - 1998. - №3. - С.21-28.