Тест-система на виявлення антитіл проти вірусу епштейна-барр “іфа – атвеб – стрип”

1. Імуноферментна тест-система на виявлення антитіл проти вірусу Епштейна-Барр, що містить антиген, яка відрізняється тим, що як антиген містить лізат лімфобластоїдних клітин, а як кон'югати - антивидові антитіла, мічені пероксидазою хрону. 2. Імуноферментна тест-система за п. 1, яка відрізняє ться тим, що як антиген містить лізат лімфобластоїдних клітин В 95-8. 3. Імуноферментна тест-система за п. 1, яка відрізняється тим, що лізат лімфобластоїдних клітин містить вірусні антигени EBNA, ЕА, VC A. Ю (13) 40966 (11) UA нантних білків та багатоступінчатість виявлення анти тіл проти ві русу Епштейна-Барр і, як наслідок, високу ціну та ких тест-систем. В Україні не існує вітчизняних імуноферментних тест-систем на виявлення антитіл проти ВЕБ. В основу даного винаходу поставлена задача створити просту і надійну в роботі імуноферментну тест-систему, яка б дозволяла одночасно виявляти імуноглобуліни класів G та М (IgG, IgM) в крові інфі кованих осіб, що дало б змогу визначити стадію захворювання та призначити ефективне лікування. Поставлена задача вирішується тим, що для приготування тест-системи на виявлення антитіл проти вірусу Епштейна-Барр як анти ген використовують лізат лімфобластоїдних клітин В 95-8, а як кон'югати - антивидовi антитіла, мічені пероксидазою хрону. Між сукупністю ознак запропонованого винаходу і те хнічним результатом, якого можна досягти, існує такий причинно-наслідковий зв'язок. Лізат лімфобластоїдних клітин В 95-8, як було встановлено нами, містить повний спектр білків вірусу Епштейна-Барр, а саме: EBNA, ЕА, VC A. Це дозволяє при використанні його як сенсибілізатора плашок одночасно виявляти ранні та пізні білки ВЕБ, а використовуючи два кон'югати виявляти імуноглобулі ни класів G та М. Що, в свою чергу, (19) Винахід відноситься до медицини та може бути використаний для проведення імунологічних досліджень, зокрема діагностичних аналізів інфікованих осіб та скринінгових досліджень населення на виявлення антитіл до вірусу Епштейна-Барр (ВЕБ). Вірус Епштейна-Барр є представником родини герпесвірусів. Його роль у патології людини пов'язують з розвитком деяких форм лімфопроліферативних захворювань - лімфо ми Беркіта, назофарингіальної карциноми, лімфоми Ходчинга, посттрансплантантного синдрому. ВЕБ відноситься до СНІД-асоційованих вірусів і вно сить значний вклад в розвиток цього симптомокомплексу. Існують до кази, що первинна інфекція, спричинена ВЕБ, це інфекційний мононуклеоз - досить розповсюджене тяжке захворювання дитячого ві ку, з ураженням лімфатичної системи, гепатоспленомегалією, ангіною. Ця хвороба може супроводжуватися досить тривалим і можливо пожиттєвим збереженням вірусу в ла тентному стані (1). Відомі тест-системи західних фірм «Behring ELISA», «Biotest ELISA», «Organon Teknika ELISA», «Sanofi diagnostics Pasteur S.A» для виявлення анти тіл проти ВЕБ в сироватках та плазмі крові людини. Як антигени в цих тест-систе мах використовують ся рекомбінантні білки, які дозволяють виявляти лише певні типи антигенів. До недоліків прототипу слід віднести складність технологічного процесу одержання рекомбі А ____________________ 40966 допоможе визначити стадію захворювання та призначити ефективне лікування. Крім того, застосуван ня в запропонованому винаході не рекомбінантних білків, а лізату значно здешевить та кий діагностичний засіб, оскільки не потребуватиме додаткових технічно складних ста дій очистки білків. Що, водночас, зробить спосіб приготування зазначеної імуноферментної тест-системи більш простим і доступним. Облік результатів реакції здійснюють шляхом кількісного визначення оптичної густи ни досліджуваної сироватки та порівняння одержаного показника з показниками сироваток позитивного та негативного контролю, які входять до складу тестсистеми. Запропонований винахід - імуноферментна тест-систе ма («ІФА-АтВЕБ-стрип») дозволяє диференційне визначення імуноглобулінів класу IgG та ІgМ до ВЕБ в си роватках крові хво рих, що є перевагою даного діагностичного засобу над існуючими аналогами таких тест-систем. Приклад 1. Визначення анти тіл проти вірусу Епштейна-Барр в сироватці хворого N, 1990 p. народження. Визначення проводили за відомою методикою (2) твердофазного імунофер ментного аналізу (ТІФА). 20 мкл сироватки хворого вносили в планшет-імуносорбент, сенсибілізований специфічним анти геном (лізатом лімфобластоїдних клітин В958, який містить суміш вірусних білків). Планшет інкубували протягом 60 хв. В термостаті при температурі 37° С, відмивали 5 разів і вносили в усі заглиблення планше та по 100 мкл міченого пероксидазою хрону антивидового кон'югату до IgG та ІgМ людини. Планшет ви тримували при 37° С в термостаті протягом 40 хв. і промивали 5 разів. Далі в усі лунки планше та вносять по 100 мкл барвника (ОФД). Витримували у темряві 20-30 хв і ферментативну реакцію зупиняли сірчаною кислотою. Облік результатів проводять на спектрофотометрі. Відомо, що значення оптичної густини зразка прямо пропорційне кількості антитіл у сироватці. За результатами дослідження ця сироватка була визнана позитивною, що містить високий рівень ІgМ до ВЕБ. Кількість антитіл у си роватці хворого, визначену з застосуванням пропонованої тест-систе ми, порівнювали з даними, отриманими при застосуван ні відомих тест-систем фірм «Sanofi diagnostics Pasteur S.A.» ви робництва Франції та «Sigma diagnostics» США (3,4). Таким чином, досліджену сироватку ідентифіковано як позитивну на наявність антитіл проти вірусу Епштейна-Барр. У хворого були визначені анти тіла класу Іg М і діагнасто вана рання стадія інфекційного мононуклеозу. Приклад 2. Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи. З використанням названих тест-систем досліджували сироватки хворих на інфекційний мононуклеоз з клініки Інституту епідеміології та інфекційних захворювань МОЗ України та донорів із станції переливання крові (15 достеменно позитивних та 20 достеменно негативних сироваток). Усі сироватки досліджували у 4-х повторностях кожною тест-системою за описаною методикою. Усі 15 позитивних сироваток показали наявність антитіл IgG проти ВЕБ, що становить 100% чутливості. 20 негативних сироваток виявились справді негативними (100 % специфічності) в пропонованій та у порівняльних тест-системах. Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл проти ВЕБ. Вона надійна, проста в роботі і проявляє високу специфічність та чутливість. Використана література 1. Juy De-The M.D. Epidemiology of EpsteinBarr virus and Associated Disseases in Men - The Herpes viruses Edited by B. Roiznan - Vol.1, 1992, p.25-103. 2. А.Т.Ми хайлов, В.Н.С мирский. Методы иммунологического анализа в биологии развития. М.: Наука, 1981. 3. Інструкція до тест-системи «Platelia EBV EBNA IgG and Platelia EBV EBNA IgM for detection of human antibodies to Epstein-Barr virus in serum or plasma samples by enzyme immunology» - Sanofi diagnostics Pasteur S.A. -1999. 4. Інструкція до тест-системи «SIAtm EPSTEIN-BARR EBN A IgG and SІАtm EPSTEIN-BARR EBNA Ig M for detection of human antibodies to Epstein-Barr virus in serum or plasma samples by enzyme immunology» - «Sigma diagnostics» - 1999. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03 2