Спосіб вибору кордової крові як джерела стовбурових клітин для алогенної трансплантації

Винахід відноситься до медицини, зокрема гематології та онкології, і може бути підставою для вибору кордової крові як джерела стовбурових клітин для алогенної трансплантації. Відомий спосіб вибору стовбурових гемопоетичних клітин, що отримані з різних джерел, зокрема з кордової крові, який полягає у необхідності підрахунку кількості CD34+ клітин в крові (L.К.McNiece, G.B.Stoney, B.P.Kern, R.A.Briddell. CD34+ cell selection frozen cord blood products using the 300i and CliniMacs CD34 selection devices // Journal of Hematotherapy.-1998.-№7. -P.457-461). Недоліком цього способу є кількісна оцінка гемопоетичних стовбурових клітин без врахування їх функціональної активності, багатоетапність проміжних операцій, необхідність використання коштовних реактивів та обладнання. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб вибору стовбурових клітин за оцінкою їх клоногенного та реплікаційного потенціалу в довготривалій культурі, який полягає у можливості тривалого функціонування цих клітин (А.Н.Гольцев, Т.А.Калиниченко. Пуповинная кордовая кровь человека как источник гемопоэтических клеток для клинического применения // Проблемы криобиологии. -1998. - №1. - С.3-23.) Недоліком цього способу є відсутність можливості враховувати появу колоній на ранніх строках клонування стовбурових клітин, дорожнеча процесінгу, необхідність створення умов для підтримки тривалої культури. Технічною задачею є створення способу вибору кордової крові як джерела стовбурових клітин для алогенної трансплантації, із виключенням необхідності постановки довготривалої культури. Технічна задача вирішується за рахунок оцінки строків появи перших колоній та ефективності колонієутворення гемопоетичних клітин в короткостроковій культурі in vitro. Заявлений спосіб здійснюється таким чином. Забір кордової крові проводять під час пологів у здорових жінок віком від 20 до 30 років. Клітини кісткового мозку отримують у людини при проведенні стернальної пункції. Стовбурові клітини отримують з лейкоконцентрату донора, для чого 4мл суспензії клітин периферичної крові змішують з 1мл 3% трилона В. Клітинну суспензію в об'ємі 5мл вміщують в стерильну пробірку з розчином гепарину у середовищі Iscove's фірми Sigma у розрахунку 40-50од/мл. Після 30-хвилинного відстоювання збирають надосадову рідину з суспензії клітин, центрифугують в градієнті щільності 1,049г/мл і 1,077г/мл лім-фопрепа фірми Serva протягом 30хв. при кімнатній температурі, двічі відмивають фосфатнобуферним розчином фірми Flow (Великобританія). Для постановки культуральних досліджень використовують поживне середовище Iscove's, 20% фетальну телячу сироватку Serva (США), рекомбінантний гранулоцитарно-макрофагальний фактор у концентрації 30нг/мл (Sigma), 3,3% агар Difco (США), 10ммоль/л Hepes, 2ммоль/л глютаміну, 5 x105/моль/л 2меркаптоетанола, антибіотики (пеніцилін і стрептоміцин по 50од/мл). Культивування стовбурових клітин проводять в стерильних 24-коміркових планшетах фірми Nunc (Данія) з розрахунку 4 комірки на зразок. В останню чергу вносять клітини (щільність посіву 1x105 на 1мл). Культивування проводять в умовах абсолютної вологості при 5% концентрації СО2 і температурі 37°С Спостереження за розвитком клонів проводяться щоденно. Враховуються строки появи перших колоній та їх число. Як показали результати досліджень зразків стовбурови х клітин, перші агрегати в культурах кісткового мозку і кордової крові виявлялись на другу добу культивування, перші колонії з'являлись на 4-5 добу. Колонії з стовбурови х клітин, отриманих з периферичної крові, з'являлись на 6-8 добу. Це свідчить про те, що процеси проліферації і диференціювання попередників із периферичної крові в культурі in vitro мають довший Lagперіод. Показник середньої ефективності клонування гемопоетичних клітин-попередників (кількість гемопоетичних клітин на 1x105 експлантованих клітин), отриманих з різних кровотворних джерел, був більшим в кордовій крові, де він становив 113,0±6,6, проти 68,9±0,5 з кісткового мозку і 8,5±2,5 з периферичної крові. Перевагою способу є його інформативність. На відміну від першого аналога спосіб дозволяє оцінити не тільки кількість, а також функціональний стан стовбурових клітин. На відміну від прототипу спосіб враховує строки появи перших колоній та ефективність клонування стовбурових клітин в короткостроковій культурі. Приклади. Приклад 1. Стовбурові клітини, отримані з периферичної крові, утворюють перші колонії в культурі in vitro на 6-8 добу. Ефективність клонування гемопоетичних клітин становить 8,5±2,5 на 1x105 експлантованих клітин. Стовбурові клітини, отримані з кордової крові, утворюють перші колонії в культурі in vitro з другої доби. Ефективність клонування гемопоетичних клітин становить 113,0±6,6 на 1х105 експлантованих клітин. Приклад 2. Стовбурові клітини з кордової крові утворюють перші колонії в культурі in vitro з другої доби. Ефективність клонування гемопоетичних клітин становить 113,0±6,6 на 1x105 експлантованих клітин. Стовбурові клітини, отримані з кісткового мозку, також утворюють перші колонії в культурі in vitro з др угої доби, але ефективність клонування гемопоетичних клітин становить 68,9±0,5 на 1x105 експлантованих клітин. Запропонований спосіб вибору кордової крові як джерела стовбурових клітин може застосовуватись у онкогематологічних відділеннях при алогенній трансплантації.