Спосіб експресного визначення здатності грибів роду fusarium продукувати т-2 токсин

Спосіб експресного визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати Т-2 токсин, що включає тонкошарову хроматографію екстрактів з досліджуваних культур із бюавтографічним проявленням хроматограм за допомогою чутливого тест-мікроорганізму, який відрізняється тим, що вміст Т-2 токсину визначають безпосередньо в культурі гриба в пробірці на агаризованому середовищі Чапека після скороченого терміну культивування - 7 днів при 24°С і 2 дні при температурі 4°С. Корисна модель належить до галузі мікотоксикології і може використовуватися при токсикологічних дослідженнях культур Fusarium sp., виділених із зернових субстратів при діагностиці аліментарних мікотоксикозів сільськогосподарських тварин і дозволить прискорити процес дослідження і постановки діагнозу Токсичність культур грибів визначають у випадку встановлення токсичності кормів при мікотоксикологічних дослідженнях для з'ясування ролі грибів в етіології мікотоксикозів. Відомо, що токсичність культур грибів можна визначати прискореним методом з використанням найпростіших Paramecium caudatum, а також методом шкіряної проби на кролях [1] та мікробіологічним методом [3] Проба на найпростіших дозволяє виявити лише водорозчинні токсичні речовини, для чого з колоній грибів готують водні екстракти і вивчають характер їх дії на Paramecium caudatum. Для визначення токсичності грибів роду Fusarium пробою на шкірі кроля спочатку отримують їх чисті культури. Потім гриби висівають на стерильні зволожені зернові субстрати в колбах і культивують при температурі 25-27°С протягом 10 днів, а потім ще додатково витримують при пониженій температурі 5-7°С 15-30 діб Мікробіологічний метод передбачає використання чутливої тест-культури дріжджеподібного мікроорганізму Candida pseudotropicalis шт 44пк Окремої методики визначення вмісту Т-2 токсину в культурах грибів до цього часу немає. Існує метод [2] кількісного визначення вмісту Т-2 токсину в зразках кормів тонкошаровою хроматографією із наступним біоавтографічним проявленням хроматограми за допомогою високочутливого до Т-2 токсину мікроорганізму Candida pseudotropicalis шт.44пк. Цим способом можна визначати токсичність культур грибів роду Fusarium, вирощених на стерильних зернових субстратах, які культивують 10 днів при 25-27°С і 1530 днів при 5-7°С. Спосіб був обраний нами за прототип, оскільки він є достатньо ефективним і використовується в лабораторній практиці. Разом з тим, тривалий час інкубації фузаріїв (майже місяць) значно подовжує термін дослідження. З огляду на це нами був розроблений оптимальний режим культивування грибів роду Fusarium, який забезпечує значне накопичення Т-2 токсину в короткий термін. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб експресного визначення Т-2 токсину в культурах грибів Fusarium sp., що виділяють із зразків зернових кормів при мікологічному дослідженні Спосіб включає вирощування чистої культури гриба в пробірці на скошеному агарі Чапека протягом 7 днів при 24"С і витримуванні 2 дні при 4СС (в холодильнику), що сприяє накопиченню Т-2 токсину в культурі і поживному субстраті, Важливим моментом є те, що екстракцію токсину проводять безпосередньо з культури гриба в пробірці Юмкл О) 4794 етилацетату протягом однієї години, оминаючи тривалий час культивування гриба на стерильному зерновому субстраті. Отриманий екстракт із культури гриба фільтрують через паперовий фільтр, випаровують в тоці повітря і розчиняють у 200мкл етилацетату. На стартову лінію хроматографічної пластини на відстані 1,5см від нижнього краю і 2см один від одного наносять 2, 5 і Юмкл досліджуваного екстракту і для контролю - 2мкл розчину Т-2 токсину в етилацетаті (100мкг/мл) як речовини-свідка Пластину хроматографують в системі розчинників етилацетат-талуол (3:1) і висушують. На поверхню горизонтально розміщеної хроматографічної пластини наносять 12мл розплавленого сусло-агару і після застигання середовища його поверхню засівають 2-Змл суспензії тест-мікроорганізму Candida pseudotropicalis шт.44пк. Залишки вологи видаляють і пластину розміщують у вологій камері і витримують в термостаті при температурі 28-ЗСГС протягом 14-16год. Вміст Т-2 токсину встановлюють за наявністю зон пригнічення росту тестмікроорганізму з Rf, яке дорівнює Rf стандарту Т-2 токсину. Приклад Токсичність 5 штамів Fusanum sporotrichiella v. tricinctum та 2 штамів Fusarium sporotrichiella v poae визначали мікробіологічним методом [3] з використанням агарових блоків та паперових дисків 3 них 6 токсичних давали зони затримки росту тест-культури Candida pseudotropicalis шт.44пк Комп'ютерна верстка Д. Шеверун діаметром від 22 до 27мм, а один- слабо токсичний утворював зону затримки росту в 13мм Наявність Т-2 токсину встановили методом тонкошарової хроматографії з послідуючим автобіографічним проявленням хроматограм в екстрактах із зазначених фузаріїв, вирощених на стерильному зерні кукурудзи на протязі 10 днів при 25-27Х і 15 днів при 5-7°С. Поряд з цим, Т-2 токсин продукуючі властивості встановлювали у вищезгаданих штамів, вирощених в пробірках із скошеним агаром Чапека на протязі 7 днів при 24°С І 2 дні при 4°С. Вміст Т-2 токсину у токсичних штамів становив від 2 до 4,18мкг на пробірку, а у слабо токсичного 1,2мкг на пробірку. Отже, запропонований спосіб визначення Т-2 токсину в культурах фузарив дозволяє значно скоротити термін проведення дослідження. Джерела інформації1 1. Визначення токсичності культур грибів // Методичні вказівки по санітарно-мікологічній оцінці та поліпшенню якості кормів. - Київ, 1998 - С.24-27. 2 Методичні вказівки по якісному та кількісному визначенню Т-2 токсину в зерні І комбікормах // Методичні вказівки по санітарно-мікологічній оцінці та поліпшенню якості кормів. - Київ, 1998 - С 63-67 3. Методика микробиологического определения токсичности культур грибов // Лабораторные исследования в ветеринарии. Биохимические й микологические исследования. Агропромиздат М., 1996.-С. 115-116. Підписне Тираж 37 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 42, 01601