Спосіб корекції функціонального стану лімфоцитів периферійної крові

Спосіб корекції функціонального стану лімфоцитів периферійної крові, що включає вплив фармакологічних речовин, який відрізняється тим, що як фармакологічну речовину використовують тканинні пептиди з широким спектром біологічно активних ефектів, а ефекти визначають діапазоном доз, що використовують Винахід відноситься до галузей біологи й медицини та може бути використаний для фармакологічної корекції патологічних станів людини та тварин, що супруводжуються підсиленням або гальмуванням процесів апоптозу лімфоідних клітин Порушення плину апоптотичних процесів може призвести до розвитку багаточислених захворювань, серед яких є рак, вірусні інфекції, аутоімунні розлади та імунні дефіцити [Ярилин А А Апоптоз Природа феномена и его роль в целосном организме// Патол физиол и эксперим терапия 1998 -№2 -С 38-48] Експериментальне підтвердження отримали припущення про те, що в основі багатьох аутоімуних та лімфопроліферативних захворювань лежить процес порушення клітинного апоптозу за типом блоку негативних наслідків активації, в результаті чього виникає нестримувана клітинна проліферація [Чередеев А М , Ковальчук Л В Апоптоз как важный этап оценки иммунной системы по патогенетическому принципу// Клиническая лабораторная диагностика -1997 -№7 С 31-35] signaling, induced apoptosis of rheumatoid arthritis synovial cells/'/Aim Pheum Dis -I998 57 495-499], етопозиду [Butenko Z A , Zavelevich M P , Smirnova I A et all Different etoposide - induced apoptotic response of human malignant lymphoid cell hnel // Experimental oncology-2000-v 22,N 1-2- P 2631] Вказані способи дозволяють змінювати функціональний стан лімфоцитів периферійної крові шляхом індукції апоптозу, але не дозволяють його блокувати Найбільш близьким до способу, що заявляється є спосіб корекції функціонального стану лімфоцитів периферійної крові з використанням дексаметазону для індукції апоптозу [ Ковальчук Л В и соавт Анализ фармакологических средств на модели апоптоза лимфоцитов человека in vitro в норме и при иммунопатологии//Аллергология и иммунология -2000 -т 1 №1 -С 24-30] Для його здійснення мононуклеарні клітини в концентрації 2х106/мл культивували в об'ємі 2мл в 24-луночних планшетах в присутності ФГА (10мкг/мл) і дексаметазону 10 Змг/мл Культивування проводили в середі RPMI1640 з 10% ембріональної телячої сироватки, 2мМ глютаміну, з додаванням бактеріостатичних концентрацій антибіотиків, при температурі 37°С, в вологій атмосфері з 5% СОг Виявляли наявність 50% апоптичних клітин через 72 години інкубації Суттєвими недоліками відомого способу є те, що не можливо провести оцінку дії фармакологічної речовини на вихідний стан клітин (не акивовані клітини), ВИЯВИТИ ЗМІНИ функційного стану лімфоцитів периферійної крові на початкових етапах розвику апоптозу, внаслідок тривалої інкубації клітин (72 години), запобігти розвитку процесів апоптозу, внаслідок односпрямованності ефектів дек В теперішній час ВІДОМІ способи впливу на апоптоз лімфоцитів периферійної крові з використанням дексаметазону [Дранник Г Н , Гриневич Ю А , Дизик Г М Иммунотропные препараты Кшв"3доров"я*' -1994 -288с ], цисплатша [Чехун В Ф Фармакокорекція диференціювання та апоптозу клітин при злоякісному процесі//Журн АМН України -1999 -т5,№3 -С 442-452], актиноміцину [Hiromichi Noda, Hiroshi Sakagami, Fumio Kokubu et all Iduction of apoptosis in human eosinophihc leukemic cell line (EOL-1)/ Int Arch Allergy Immunol I997, 114 84-88], цераміду [Mizushima N, Kqhsaka H , Miyasaka N Ceramide, a mediator of mterleukm 1, tumor necrosis factor a, as well as Fas receptor 1 00 48797 саметазону, в напрямку його індукції, неможливість точного дозування фармакологічної речовини, що може привести до погіршення досліджуємих показників функційного стану лімфоцитів периферійної крові В основу винаходу поставлено завдання створити спосіб коррекцм функціонального стану лімфоцитів периферійної крові шляхом удосконалення відомого способу, з використанням тканинних пептидів з широким спектром їх ефектів та діапазоном доз, досягти стандартизації часу інкубації, який дозволяє вивчати вплив пептидів на різних етапах розвитку апоптозу, з урахуванням вихідного стану клітин, та забезпечити підвищену ефективність способу Поставлене завдання вирішують створенням способу корекції функційного стану лімфоцитів периферійної крові, що включає вплив фармакологічних речовин, який відрізняється тим, що в якості фармакологічної речовини використовують тканинні пептиди з широким спектром біологічно активних ефектів, а ефекти визначають діапазоном доз, що використовують Спосіб здійснюють слідуючим чином Мононуклеарні клітини виділяли з периферійної крові донорів шляхом центрифугування на шарі фіколверографін Клітини 4-7Х10 6 /МЛ культивували в середовищі RPMI1640 з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки, ЮмМ HEPES та гентаміцину 100мкг/мл в 96-лунковому планшеті Пептидний комплекс тимусу-тімалін та поліпептидний комплекс нирок додавали до суспензії клітин в кінцевій концентрації 0,01мкг/мл, 0,1мкг/мл, 0,12мкг/мл, 1мкг/мл, 10мкг/мл та шкубували 24 години при 37°С в вологій атмосфері з 5% СОг Нами були досліджені процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов і при модуляції активності їх внутрішньоклітинних регуляторних систем та при станах, що супруводжуються гальмуванням процесів апоптозу Експериментальні дані свідчать по те, що за фізіологічних умов в лімфоцитах периферійної крові існує базальний рівень апоптозу, який може бути пов"язаний з фізіологічною загибеллю клітин імунної системи При цьому при морфологічному дослідженні у суспензії інтактних лімфоцитів спостерігалась наявність клітин з фрагментацією ядра і гіперхромією хроматину (таб 1) За фізіологічних умов в лімфоцитах периферійної крові контроль блокади та активації апоптозу знаходяться в динамічній рівновазі, про що свідчить майже однаковий рівень експресії р53 і bcl-2, та наявність клітин з експресією CD95 і фрагментацією хроматину Відношення експресії ЬсІ-2/р53 показник СТІЙКОСТІ клітин до апоптозу, у периферійних лімфоцитів забеспечує їх підвищену СТІЙКІСТЬ до апоптоз-індукуючих факторів Дослідження дії тімаліну і ППКН показали, що тканинні пептиди за фізіологічних умов діють на периферичні лімфоцити як активуючий сигнал, при цьому підвищується готовність клітин до апоптозу, що призводить до зростання відсотку клітин з експресією CD95, підвищується КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН З гі перхромією хроматину (таб 1) Таблиця 1 Морфологічні ознаки апоптозу за фізіологічних умов та при дії тималіну і ППКН Фрагментація ядер, % Інтакт 5,1±0,6 Групи впливу Ті мал і н 7±0,5 6,6±0,3 Конденсація хроматина, % 2,9±0,7 5,6±0,4* 4,2±0,4 Показники Примітка * - р