Спосіб кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові

98H5993 СПОСІБ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ КРОВОТВОРНИХ КЛІЇИН КОРДОВОЇ КРОВІ Винахід відноситься до галузі медицини і може бути використаний для консервування кровотворних клітин кордової /пуповинної / крові з метою їх подальшої трансплантації . Найближчим до заявленого є спосіб кріоконсервування кровотвор них клітин кордової крові , який полягає в тому , що клітини змішують з крі©консервантом, який містить 10% диметнлсульфоксіду /Мер^О/ \ та 10% декстрину з молекулярною масою ^ЮООО /декстран-АО /, охолоджують зі швидкістю І -4°С/хвил. до -7°С, далі ініціюють кристалоут ворення шляхом упорскування рідкого азоту в камеру заморожування . Після цього відігрівають до -7°С і далі суспензію клітин заморо ( жують/І-4 С/хвил/до -196 С Розморожування здійснюють на водяній бані при температурі 37°С. Після вїдігріву видаляють кріопротектор шляхом двократного центрифугування /І/. * -Недоліком цього способу є те, що він потребує великих витрат н праці та часу - Це пов язано з тим , що у способі використовується складний і тривалий режим заморожування , а Ме^О, який входить до складу кріоконсерванта , потребує видалення . В основу винаходу поставлено завдання створення такого способу кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові , в якому за рахунок змінений режиму заморожування І використання крїопротекто ру, який не потребує відмивання , було б досягнуто спрощення спо собу І скорочення часу його здійснення . * Де завдання вирішується тим , що в способі кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові , який включав змішування клітин з кріоконсервантом , що вмішує декстран,охолодження зі швидкістю І Л°С/хвил і подальше заморожування до -І96°С, клітини охолоджують до -2£. ,.-28°С І витримують при цій температурі впродовж 15-20 хв, після чого занурюють в рідкий азот , а як декстран використовують декстран э молекулярною масою 60000 /декстран -60/ /2/в концентрації Повільне /І-4°С/хв охолодження клітин до температури -26..,-28°С з подальшою температурною зупинкою забезпечують завершення процесу кристалізації та стабілізації клітинних структур і процесів в умовах низьких температур . Декстран -60 має більш виражені кріоза хисні властивості , ніж декстран-40. Таким чином , режим заморожуван ня» який заявляється , та декстран -60, який використовується як кріопротектор , забезпечують високу збереженість клітин без викори стання MepSO, який є токсичним для клітин І тому потребує відмивання . Більш простий режим заморожування та виключення процедури вида лення кріопротектору значно спрощують спосіб та скорочують час його здійснення втричі /таблицяі /. їалиця І Витрачений час для здійснення способу , що заявляється , та прототипу. Прототип Етапи 1 1. Еквїлібрація з кріопротектором Час, ІХВХЛ. Заявлений Етапи їхвил 15-16 2. Охолодження зі швид7 кістю І -4°С/хв до -7°С 3. Ініціація кристало3-6 утворення Охолодження зі швидкістю ІЛ^С/хв до -26. ..-28°С Температурна зупинка 4. Підвищення температури до -? С 40-45 Заморожування до -196 С 6- Відігрів при +37°С 2-3 Відігрів на водяній бані при +4І°С 15-20 2-3 5. Заморожування зі швидкістю 1-4 С/хв до -І96°С 12 7. Видалення Ме^О Разом: 1-2 25-30 94-110 Разом 29-36 -ЗПриклад І. З кордової крові, яку брали від донорів без патології вагітності виділяли кровотворні клітини і плазму . В плазму вводили декстран-60 в кінцевій концентрації 1,2%, після чого її додавали до клітин. Контейнери з суспензією ядерних клітин заморожували за допомогою програмного заморожувала УОП -6 виробництва СКЗ?Б з ДП ІПК і К НАНУ. Заморожування здійснювали від кімнатної температури до -26. .-28°С зі швІдкістю І-Л°С/хв. Витримували при цій температурі впродовж І5-20хв і далі занурювали в рідкий азот /-І96°С/. Розморожений здійснювали на водяній бані при температурі +4І°С. Кількість збережених ядерних клітин після розморожування визначали за методом суправітального забарвлення трипановим синім . Кількість життєздатних кровотворних клітин-попереднкків /КУОк/ в суспензіях нативних /контроль/ і кріоконсервованих клітин визначали за методом культивування в агарі /З/. Результати наведені в таблиці 2 у порівня ні з прототипом. Таблиця 2. Кількість збережених та життєздатних ядерних кровотворних клітин після кріо консервування способом,що заявляється , та по прототипу / І О / Спосі* НЯ Заявлений 97,1 І 1,5 79,4 І 2,3 Прототип 96,5 і 0,8 76,8 І 1,7 З таблиці 2 видно, що спосіб, який заявляється,забезпечує кількість збережених та життєздатних кровотворних клітин кордової крові на рівні прототипу. -4Приклад 2. Спосіб здійснювали подібно до приклад ? І за винятком того, що клітини заморожували з різними концентраціями декстрину -- 60Результати наведені в таблиці З Таблиця З* Кількість збережених та життєздатних ядерних кровотворних клітин після заморожування з різними концентраціями декстрану-60 /л»І0/ 1 ! Концентрація декстр»- ї Кількість збережених І Кількість К70к віднос ну-60 в плазмі,ЇЙ ї клітин,% !но контролю,$ ________________________________ ї _____________________ ї____________________ 0,8 89,3 - 0,8 5*-,8 І 2,3 1,0 96,2 І 0,7 72,2 І 1,7 1,2 97 ,1 ± 1 ,5 79,4 і 2,3 ІД 97,3 І 0,8 73,7 - 1,5 1,6 98 ,1 ± 0 ,5 69,8 І 2,1 З таблиці 3 видно, що оптимальна концентрація декстрану-60 в плазмі є 1,2%. Джерела Інформації: І.Методическое руководство.- detvtyxk P>tccd i L n cuacL СцюргсЫфЫс/г РьєіоаЖ U*rt# tfa 2.Кочетыгов Н.И., Булавин О.Н., Селиванов Е.А., // Советская медицина. - М., 1979 - №9. - с.51-55. Tfu teetftk в?